CN116083500B - 连续生产赤藓酮糖的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于赤藓糖醇与日本葡萄糖酸杆菌发酵体系的连续化与固定化相结合的L‑赤藓酮糖生产工艺方法,采用基于中空纤维过滤系统的灌流培养技术,构建同步分离体系,利用中空纤维过滤系统实现分离与发酵生产同步,并且进行菌体活力复苏,同时再进行菌体固定化,与滤出液中残余的赤藓糖醇反应,降低其浓度。该发明真正意义上实现了全过程赤藓酮糖的连续化生产。降低了过程废弃培养物的量,实现长时间的高细胞密度和长时间高效的连续性生产L‑赤藓酮糖(生产强度大于6g/L*h),同时降低了底物浓度对产物提纯的影响,简化了后期提纯工作,减少了生产损耗,降低了生产成本,并且提高了产物纯度,从而提升了产品价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物转化和微生物发酵领域,具体地说涉及一种连续生产L-赤藓酮糖的工艺方法。
背景技术
L-赤藓酮糖(L-erythrulose,DHB)常温下为淡黄色液体,高纯度(78~85%)的L-赤藓酮糖是黄色粘稠状液体,有甜味,其在自然界存在,但含量极少,属于稀有糖。
L-赤藓酮糖具有生物可降解性,能够食用且没有毒性,其含有酮基,理化性质活跃,能够参与并催化许多反应,因此是化工合成中重要的中间体和多性能添加剂,在食品、化工领域和制药领域应用广泛。
L-赤藓酮糖的生产目前主要以赤藓糖醇为原料,经化学法或生物发酵法获得。以赤藓糖醇为前体的化学合成法,此法比较繁琐,且产物为消旋体手性化合物,拆分困难,不利于纯化。微生物法包括了以赤藓糖醇为底物的微生物发酵法以及静息细胞转化法,其通过发酵过程中的酶促反应,可选择性生成L型产物,且该法具有操作简便,反应条件温和、过程易于控制、原料利用率及产品纯度高、绿色环保等优点。
L-赤藓酮糖生物催化生产的最大的难点在于L-赤藓酮糖难实现结晶,目前市面上主要的产品为浓度大于85%的浓缩液,如何提高L-赤藓酮糖浓缩液的纯度是产业化生产中面临的最大难点,而发酵产物中包含底物赤藓糖醇、菌体蛋白等杂质,过度催化可以降低底物赤藓糖醇浓度,但随之带来的菌体自融破碎会给发酵产物增加菌体蛋白、核酸等杂质;而单纯生物催化连续生产又无法实现底物的充分利用。会导致产物的纯度不佳,同时影响其L-赤藓酮糖的收率,使提纯成本增加。
中国专利CN201410112899.6(公开日2014年07月30日)公开了一种能微生物发酵生产L-赤藓酮糖的菌株HD385。其可利用常规氮源(如牛肉膏、玉米浆、尿素等)和赤藓糖醇等原料生物发酵制备L-赤藓酮糖,经发酵培养获得186.5g/L的L-赤藓酮糖。该工艺的反应体系中含有较多的磷酸钾、碳酸钙,不利于L-赤藓酮糖的纯化,且重复利用率低。
发明内容
在进行L-赤藓酮糖的发酵生产时,我们发现底物赤藓糖醇和产物L-赤藓酮糖的浓度对菌体生长有影响,二者浓度过高时都会抑制菌体活力,同时底物的浓度高低会影响后期L-赤藓酮糖提纯时的纯度。而L-赤藓酮糖的纯度高低会直接影响其价格,纯度越高的产品价格也越高,L-赤藓酮糖提纯工艺一直都是一个研究热点和难点。针对L-赤藓酮糖提纯难度的技术问题,本申请提出一种连续灌流催化和连续固定化细胞催化相偶联的生产方法。
本该方法可实现连续化生物催化和连续化固定化细胞,其可以提高产率,降低产物底物浓度,提高产品纯度。本发明旨在解决现有工艺反应体系复杂、产品纯化困难、生产耗损多等问题。生产L-赤藓酮糖时,我们利用中空纤维过滤系统将L-赤藓酮糖从发酵液中分离出来,从而降低L-赤藓酮糖对菌体的抑制作用,同时严格控制底物赤藓糖醇的浓度。然后利用固定化菌体消耗分离出来的L-赤藓酮糖液体中残余的赤藓糖醇,从而降低了其提纯的难度,提高了产品L-赤藓酮糖的纯度。同时对于发酵后期菌体活力的衰减,我们构建了相应的菌体复苏体系,进行了多次的优化和改进后,确定了最终的体系。该体系和中空纤维过滤系统的联合使用,可以实现连续生产L-赤藓酮糖的目的,同时可以最大限度地降低后续提纯的难度,减少多余的生产耗损,以更低的成本投入去获得更高的收益回报。
本发明连续化将赤藓糖醇流加入含有日本葡萄糖酸杆菌培养物的生物反应器中,并通过与该生物反应器连接的中空纤维过滤系统连续性收获过滤后的发酵产物赤藓酮糖;与该生物反应器连接的固定化细胞模块,在线实现排出培养物(日本葡萄糖酸杆菌)的重复有效利用,降低传统连续生产过程Bleeding细胞的浪费和处理难度,并通过固定化细胞与连续收获发酵产物的催化反应,大大降低了发酵产物赤藓酮糖中赤藓糖醇的残留量,提高了产物的浓度,大大降低了游纯化结晶的难度。
本发明的方法包括如下步骤:
S1、以含有赤藓糖醇、酵母膏的第一反应体系进行日本葡萄糖酸杆菌发酵,当第一反应体系中浓度为L-赤藓酮糖高于140g/L,同时赤藓糖醇低于5g/L时,开始向第一体系中流加赤藓糖醇,同时打开同步分离装置,利用中空纤维过滤系统循环分离发酵液,得到包含L-赤藓酮糖的滤出液;
S2循环一段时间后(通常为18-36h,如循环24小时后),停止循环与赤藓糖醇补料,取出适量发酵液,再补充等量的新鲜培养基,重新开始发酵,当赤藓糖醇低于5g/L时,再次开始流加赤藓糖醇同时打开同步分离装置,利用中空纤维过滤系统循环分离发酵液,继续生产L-赤藓酮糖;
优选的,取出发酵液时,可以取出5-20%的发酵液,比如10%的发酵液,对取出的发酵液进行检测;取出适量发酵液再补充等量的新鲜培养基可以向系统中补充充足的营养,以便细菌生长与繁殖,从而复苏菌体活力,重新开始发酵;
S3、将S2取出的发酵液离心,得到菌体和L-赤藓酮糖清液;
对菌体进行固定化处理,然后将固定化菌体加入中空纤维过滤系统所过滤出的L-赤藓酮糖滤出液中消耗其中残余的赤藓糖醇,30℃下培养,维持pH在5.8-6.2之间,通气量不高于1.2vvm,同时转速尽量维持在100rpm/min以下,反应结束后将L-赤藓酮糖清液分离出来,再次加入新的过滤液继续反应;
优选的,菌体进行固定化处理的方法为:
步骤1:按照重量比配制海藻酸钠溶液,其中海藻酸钠质量分数为3%-4%,卡拉胶质量分数为0.36%-0.4%,将菌体与海藻酸钠溶液按照重量比1:20混合,得到海藻酸钠复合材料溶液;
步骤2:按照重量比配制氯化钙溶液,其中氯化钙质量分数为4%-5%,氯化钾质量分数为0.5%-0.6%;
步骤3:将海藻酸钠复合材料溶液以5d/s的速度滴入氯化钙溶液中,于4℃浸泡0.5h-1h,再用PBS溶液清洗三遍,滤干备用。
S4、分离的L-赤藓酮糖清液经浓缩、脱色后,获得L-赤藓酮糖。
S3、重复S2-S4,直至L-赤藓酮糖生产效率大幅度下降,同时已无法再对菌体进行复苏。
优选的,第一反应体系包括赤藓糖醇80~100g/L,酵母浸膏15-20g/L,消泡剂0.4~0.6ml/L,其余为水,pH维持在5.8~6.2。
S1中先将日本葡萄糖酸杆菌在适宜温度下经0.25L摇瓶种子培养(一级种子液)、0.5L摇瓶种子培养(二级种子液)、20L发酵罐培养逐级扩大,总时间为24-36h,发酵过程中的pH不低于5.4,发酵温度为30±0.5℃。
优选的,在30℃下,培养20~24h获得一级种子,移入二级种子摇瓶;30℃下,培养10~12h获得二级种子,移入20L发酵罐;接种量5%-10%,维持pH在5.8-6.2之间,通气量不高于1.2vvm;
更优选的,于30℃,200rpm,培养16~24h后,一级种子液的OD600≥1.5时移入二级种子摇瓶;于30℃,200rpm,培养10-12h后,二级种子液的OD600≥3时移入20L发酵罐;接种量为5%-10%,通气量开始时1.0vvm,随溶氧下降逐步增至1.5vvm。罐压:开始时0.05MPa左右,随溶氧下降逐步增至0.065MPa。搅拌转速:开始时300rpm,随溶氧下降逐步增至500rpm。pH开始时6.0-6.2,后期5.8-6.2。发酵过程中pH会缓慢下降至5.4,通过补加15%的NaOH溶液使pH维持在5.8-6.2。发酵温度维持在29±0.5℃左右。
进一步的,S1中流加赤藓糖醇并时实时取样,利用HPLC监测赤藓糖醇含量,尽量控制赤藓糖醇消耗速率与补充速率一致。
当中空纤维过滤系统开始循环后,赤藓糖醇的浓度控制十分重要,控制在10g/L以下,保证流加的赤藓糖醇能及时被消耗完,使滤出液中的赤藓糖醇尽可能少,有利于后续的L-赤藓酮糖提纯分离。优选的,S2中补加新鲜培养基为第二反应体系,包括赤藓糖醇40-50g/L,酵母浸膏10-15g/L,PQQ辅酶20-25mg/L,ATP20-25mg/L,其余为水,115℃灭菌20min。优选的,第二发应体系包括赤藓糖醇50g/L,酵母浸膏10g/L,PQQ辅酶20mg/L,ATP20mg/L,其余为水。
进一步的,S4中获得的L-赤藓酮糖清液应在45-55℃下浓缩,活性炭脱色,得赤藓酮糖(L-赤藓酮糖)成品。
本发明所达到的有益效果是:
本发明建立了基于赤藓糖醇与日本葡萄糖酸杆菌发酵体系的连续化与固定化相结合的L-赤藓酮糖生产工艺方法,采用基于中空纤维过滤系统的灌流培养技术,构建同步分离体系,利用中空纤维过滤系统实现分离与发酵生产同步,并且进行菌体活力复苏,同时再进行菌体固定化,与滤出液中残余的赤藓糖醇反应,降低其浓度。该发明真正意义上实现了全过程赤藓酮糖的连续化生产。降低了过程废弃培养物的量,严格控制了底物和产物的浓度,减少了对菌体生长的抑制作用,从而实现了长时间的连续化生产。和传统发酵工艺相比,延长了发酵生产的周期,减少了前期准备工作的耗材使用和重复准备时间。该发明可以实现长时间的高细胞密度和长时间高效的连续性生产L-赤藓酮糖,同时降低了底物浓度对产物提纯的影响(生产强度高),简化了后期提纯工作,减少了生产损耗,降低了生产成本,并且提高了产物纯度,从而提升了产品价值。同时该方法还可以用于其他物质如二羟基丙酮(DHA、羟基乙酸、葡萄糖酸等)的生产。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为本发明连续生产L-赤藓酮糖的装置与流程图;
图2为本发明实施例1生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;
图3为本发明实施例2生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;
图4为本发明实施例3生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;
图5为本发明实施例4生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;
1、补料瓶,2、20L发酵罐,3、中空纤维过滤系统,4、磁力搅拌器,5、L-赤藓酮糖滤出液瓶,6、海藻酸钠与卡拉胶混合液,7、固定化反应瓶,8、氯化钙与氯化钾混合液,9、PBS液瓶,10、废液瓶,11、废弃固定化细胞收集瓶,12、L-赤藓酮糖清液收集瓶,13、在线离心机。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例1
本实施例第一反应体系进行生物发酵,当反应体系中L-赤藓酮糖浓度高于140g/L,同时赤藓糖醇含量低于5g/L时,经中空纤维过滤系统设备循环菌液分离获得L-赤藓酮糖清液,并继续进行发酵。
如图1所示,20L发酵罐2上设置有补料瓶1,20L发酵罐2中空纤维过滤系统组成回路,回路上设置有蠕动泵,中空纤维过滤系统的滤出液流入L-赤藓酮糖滤出液瓶5,20L发酵罐2还设置有发酵液抽取管路,发酵液抽取管路上设置有在线离心机13,海藻酸钠与卡拉胶混合液6通过蠕动泵与磁力搅拌器4连接,磁力搅拌器4的出液端、氯化钙与氯化钾混合液8和PBS液瓶9均流入固定化反应瓶7中;固定化反应瓶7上连接有废液瓶10,定化反应瓶7的出液端和L-赤藓酮糖滤出液瓶5均连接另一个20L发酵罐2,同时另一个20L发酵罐2上通过蠕动泵连接有L-赤藓酮糖清液收集瓶12和废弃固定化细胞收集瓶11。
首先,用接种环从甘油冷冻管中蘸取菌液于平板划线,30℃培养48h,再挑取一活化后的单菌落接种到容量为0.25L的摇瓶内,装液量为50mL,30℃,200rpm,摇床培养24h后,测定OD600≥1.5时,为一级种子液。
其次,一级种子液按5%接种量接种入装液量0.1L的0.5L种子培养基摇瓶中,种子培养基含甘油10~15g/L,酵母膏10~15g/L,pH 6.0~6.2。于30℃,200rpm,培养10-12h后,测定OD600≥3时,即为二级种子液。
最后,二级种子液按10%接种量接种入装液量10L的20L发酵罐中,发酵罐中的培养基为一反应体系;包括赤藓糖醇100g/L,酵母浸膏15g/L,消泡剂0.4-0.6ml/L,其余为水,pH维持在5.8-6.2。
发酵温度30±0.5℃,通气量开始时1.0vvm,随溶氧下降逐步增至1.5vvm。罐压:开始时0.05MPa左右,随溶氧下降逐步增至0.065MPa。
搅拌转速:开始时300rpm,随溶氧下降逐步增至500rpm。pH开始时6.0-6.2,后期5.8-6.2。发酵过程中pH会缓慢下降至5.4,通过补加15%的NaOH溶液使pH维持在5.8-6.2。
发酵期间,每4h取样一次,12000rpm/min离心10min,取上清液稀释,再用0.22的滤膜过滤除菌,采用高效液相色谱法测定:色谱条件:色谱柱:BioRad公司Aminex HPX-87C柱,(300mmx7.8mm,9μm);柱温60℃;流动相:乙腈30%;流速:0.6mL/min,进样量20μL,示差折光检测器检测赤藓糖醇和L-赤藓酮糖,检测器温度为50℃。
当L-赤藓酮糖高于140g/L后,停止补料,将赤藓糖醇消耗至5g/L以下,开始利用中空纤维过滤系统自动循环菌液并开始自动补加赤藓糖醇。循环期间每循环24h,抽取10%发酵液,再补加等量第二反应体系,第二反应体系包括赤藓糖醇50g/L,酵母浸膏10g/L,PQQ辅酶20mg/L,ATP20mg/L,其余为水,继续发酵,当赤藓糖醇浓度低于5g/L时,再次使用中空纤维过滤系统设备循环分离菌液,继续滤出L-赤藓酮糖清液。抽取的菌液离心,菌体进行固定化操作,制成固定化细胞,将其与过滤的L-赤藓酮糖重新加入另一个20L发酵罐继续反应,于30℃下培养,维持pH在5.8-6.2之间,通气量不高于1.2vvm,转速尽量维持在100rpm/min以下,每4h取样一次,监测赤藓糖醇浓度,采用高效液相色谱法测定,进而消耗其中残余的赤藓糖醇。反应结束后过滤分离L-赤藓酮糖液体和固定化细胞,固定化细胞重复利用,直至其活力降低,同时将定期抽取的发酵液中的菌体制成新的固定化细胞,加入过滤液中反应。
最终进行了338h的连续发酵生产,最终得到105L含L-赤藓酮糖的上清液,测得浓度约为153.1g/L,残余赤藓糖醇浓度为0.4g/L,共总计投入赤藓糖醇共162.4g/L,L-赤藓酮糖转化率(L-赤藓酮糖/赤藓糖醇,w/w)94.27%。
图2为本发明实施例1生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;其中,生产强度为单位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,由图2可见,发酵至100h左右时,生产强度达到最高6g/L*h,在后续的连续化生产中,生产强度一直维持在6g/L*h左右,实现了长时间的连续化高效率生产。
按照上述的方法生产L-赤藓酮糖后,进行产品的纯化与分离,除蛋白,脱盐,旋转蒸发浓缩等。将所得上清液用200nm陶瓷膜处理,再使用醇沉法去除发酵液中蛋白质。将经陶瓷膜、醇沉处理后的液体以15~20mL/min的速度分别流过阳离子和阴离子交换柱,阳阴离子交换树脂的体积为1000mL,高径比为20:1,料液走完后用去离子水洗脱阳、阴离子交换树脂,从发酵液上柱开始,每隔一段时间检测流出液中L-赤藓酮糖的浓度和电导率值。选取了732型强酸性阳离子交换树脂和D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂串联使用,使脱盐率达到96%,为了防止温度过高破坏L-赤藓酮糖,活性炭用量为1%,温度25℃,脱色时间30min。最终通过旋转蒸发去除溶液中的水,温度控制在45-55℃,得到了约15.78kg纯度93%的L-赤藓酮糖浓缩液,收率约91.3%。
实施例2
以含有赤藓糖醇、日本葡萄糖酸杆菌、酵母膏等的反应体系发酵48h生产L-赤藓酮糖。
首先,用接种环从甘油冷冻管中蘸取菌液于平板划线,30℃培养48h,再挑取一活化后的单菌落接种到容量为0.25L的摇瓶内,装液量为50mL,30℃,200rpm,摇床培养24h后,测定OD600≥1.5时,为一级种子液。
其次,一级种子液按5%接种量接种入装液量0.1L的0.5L摇瓶中,30℃,200rpm,培养10-12h后,测定OD600≥3时,即为二级种子液。
最后,二级种子液按10%接种量接种入装液量10L的20L发酵罐中,发酵罐中的培养基为一反应体系;包括赤藓糖醇100g/L,酵母浸膏15g/L,消泡剂0.4-0.6ml/L,其余为水,pH维持在5.8-6.2。
发酵温度30±0.5℃,通气量开始时1.0vvm,随溶氧下降逐步增至1.5vvm。罐压:开始时0.05MPa左右,随溶氧下降逐步增至0.065MPa。搅拌转速:开始时300rpm,随溶氧下降逐步增至500rpm。pH开始时6.0-6.2,后期5.8-6.2。发酵过程中pH会缓慢下降至5.4,通过补加15%的NaOH溶液使pH维持在5.8-6.2。发酵生产过程中,HPLC实时监测赤藓糖醇和L-赤藓酮糖浓度,每隔4h取样一次,当赤藓糖醇浓度低于10g/L时,开始流加赤藓糖醇,浓度控制在20g/L以下,保证菌体有充足的底物去发酵生产L-赤藓酮糖。
当发酵48h后,菌体活力已严重不足,赤藓糖醇消耗速率大幅度下降,停止补充赤藓糖醇,待其消耗殆尽或降低至5g/L以下时,停止发酵,停罐,8000rpm/min,15min离心所有菌液。
提前培养种子液,清洗发酵罐,按上述方法进行第二次发酵。最终一共进行了4次传统发酵,所有发酵液离心,最终得到53L含L-赤藓酮糖的上清液,测得浓度约为190.32g/L,残余赤藓糖醇浓度为0.46g/L,共总计投入赤藓糖醇共203.42g/L,L-赤藓酮糖转化率(L-赤藓酮糖/赤藓糖醇,w/w)93.56%。计算生产强度,即单位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,得到生产强度与时间曲线。总共发酵耗时345h,加菌株划线,种子培养等。对所得的上清液进行纯化与分离,同实施例1。将所得上清液用200nm陶瓷膜处理,再使用醇沉法去除发酵液中蛋白质。将经陶瓷膜、醇沉处理后的液体以15~20mL/min的速度分别流过阳离子和阴离子交换柱,阳阴离子交换树脂的体积为1000mL,高径比为20:1,料液走完后用去离子水洗脱阳、阴离子交换树脂,从发酵液上柱开始,每隔一段时间检测流出液中L-赤藓酮糖的浓度和电导率值。选取了732型强酸性阳离子交换树脂和D315大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂串联使用,使脱盐率达到96%,为了防止温度过高破坏L-赤藓酮糖,活性炭用量为1%,温度25℃,脱色时间30min。最终通过旋转蒸发去除溶液中的水,温度控制在45-55℃,最终得到约9.10kg纯度92%的L-赤藓酮糖浓缩液,收率约83%。
图3为本发明实施例2生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;其中,生产强度为位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,由图3可见,传统发酵方法生产L-赤藓酮糖时,其生产强度是先升高后下降,最高为5.1g/L*h,最低为2g/L*h,生产强度不稳定,同时其生产效率不算快。在后续的几次生产中,生产强度依旧是如此。
实施例3
以含有赤藓糖醇、日本葡萄糖酸杆菌、酵母膏等的反应体系进行灌流法催化生产L-赤藓酮糖,当反应体系中L-赤藓酮糖浓度高于140g/L,同时赤藓糖醇含量低于5g/L时,经中空纤维膜循环菌液分离获得L-赤藓酮糖清液。发酵期间,每4h取样一次,HPLC法监测赤藓糖醇与L-赤藓酮糖浓度。
当L-赤藓酮糖高于140g/L后,停止补料,将赤藓糖醇消耗至5g/L以下,开始利用中空纤维过滤系统自动循环菌液与开始自动补加赤藓糖醇。循环期间每循环24h,抽取10%菌液,再补加等量新培养基,包括赤藓糖醇50g/L,酵母浸膏10g/L,PQQ辅酶20mg/L,ATP20mg/L,其余为水。抽取的菌液离心,将菌体与过滤的L-赤藓酮糖重新加入另一个20L发酵罐继续反应,于30℃下培养,维持pH在5.8-6.2之间,通气量不高于1.2vvm,转速尽量维持在100rpm/min以下,每4h取样一次,监测赤藓糖醇浓度,采用高效液相色谱法测定,进而消耗其中残余的赤藓糖醇。反应结束后过滤、离心分离L-赤藓酮糖液体和菌体,菌体重复利用,直至其活力降低,同时将定期抽取的发酵液中的菌体加入过滤液中反应。
最终进行了337h的连续发酵生产,最终得到103L含L-赤藓酮糖的上清液,测得浓度约为154.32g/L,残余赤藓糖醇浓度为0.56g/L,共总计投入赤藓糖醇共166.3g/L,L-赤藓酮糖转化率(L-赤藓酮糖/赤藓糖醇,w/w)92.80%。计算生产强度,即单位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,得到生产强度与时间曲线。对所得的上清液进行纯化与分离,最终得到约14.70kg纯度86.3%的L-赤藓酮糖浓缩液,收率约88.4%。
图4为本发明实施例3生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;其中,生产强度为单位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量。因为实例3和实例1一样使用了中空纤维膜设备,因此由图4可见,发酵至100h左右时,生产强度最高也能达到6g/L*h左右,在后续的连续化生产中,生产强度也一直维持在6g/L*h左右。但与实例1不同的是实例3后续没有使用固定化细胞,所以实例3产品的纯度并没有实例1的高,同时其提纯时所损耗的产品和提纯成本也比实例1多。
实施例4
以含有赤藓糖醇、日本葡萄糖酸杆菌、酵母膏等的第一反应体系生产L-赤藓酮糖,当反应体系中L-赤藓酮糖浓度为170-190g/L时放罐获得菌液,菌液离心得到524g菌体和13L含量179.2g/L的L-赤藓酮糖上清液。
得到的菌体加入海藻酸钠和卡拉胶的混合溶液中混匀,其中海藻酸钠浓度为3%,卡拉胶0.36%,再将其以5d/s的速度滴入氯化钙溶液中,其中包含4%氯化钙和0.5%氯化钾。于4℃凝胶成珠1h,再用95%的生理盐水浸泡15min,PBS溶液清洗三遍,滤干。将其加入第二反应体系中,体系包括固定化菌体、30-50g/L的赤藓糖醇和水,维持pH在5.6-6.0,通气反应至体系中赤藓糖醇含量低于10g/L以下,开始进行赤藓糖醇补料。当L-赤藓酮糖浓度达到140g/L时,停止补料,待赤藓糖醇浓度低于5g/L时放罐,过滤,得到固定化菌体和12L浓度为151.22g/L的L-赤藓酮糖上清液。分离的固定化菌体重复用于赤藓糖醇的转化,重复至第5次反应时菌体活力大幅度下降,酶活只有原先的51%,停止补料,反应结束后放罐分离得到菌体和L-赤藓酮糖上清液,其中L-赤藓酮糖浓度为135.24g/L,残余赤藓糖醇浓度为4.25g/L。
固定化细胞发酵循环结束,共发酵6次,一共得到约73L的L-赤藓酮糖上清液,其中L-赤藓酮糖浓度为154.81g/L,残余赤藓糖醇浓度为2.25g/L。共总计投入赤藓糖醇共169.7g/L,L-赤藓酮糖转化率(L-赤藓酮糖/赤藓糖醇,w/w)91.23%。计算生产强度,即单位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,得到生产强度与时间曲线。总共发酵耗时349h,加前期菌株划线,种子培养等。对所得的上清液进行纯化与分离,最终得到约10.98kg纯度83.7%的L-赤藓酮糖浓缩液,收率约81.3%。
图5为本发明实施例4生产L-赤藓酮糖的生产强度-时间图;其中,生产强度为位时间内单位体积的发酵液所生产的L-赤藓酮糖总量,由图5可见,采用固定化方法生产L-赤藓酮糖时,随着固定化细胞的使用次数增加,固定化细胞的活力逐渐降低,同时其生产强度也是逐渐下降,从最高的11.4g/L*h,下降到第五次的4.75g/L*h。使用固定化方法生产时,初始生产强度很高,但是其活力下降很快,循环使用几次后需要重新制备固定化细胞,无法达到长时间的连续化高效率生产。
实施例1-4的收率,产量和纯度的比较
通过对比通过各实施例以及对比例的数据对比可知:实施例1,使用了中空纤维过滤系统和固定化细胞技术,其L-赤藓酮糖的收率和纯度都比较高,其生产价值也较高,同时其可以连续性的高产量生产,在相同时间内比传统发酵技术生产更多的产品。实施例3使用了中空纤维过滤系统技术,然后直接使用细菌消耗L-赤藓酮糖滤液中残余赤藓糖醇,比起实施例1,液体需要进行过滤和离心,而加用了固定化技术的仅需要进行过滤处理,相比之下,加用固定化技术,可以更加省力,同时其生产耗损要更少。同时,在相同的发酵时间下,使用中空纤维过滤系统的实施例1和实施例3比起实施例2和实施例4,其可以达到高产量的连续生产。实施例4使用固定化细胞进行L-赤藓酮糖的生产,后续连续化生产时因为其活力下降和分解的原因,导致其整体收率和纯度不是太理想。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,连续化将赤藓糖醇流加入含有日本葡萄糖酸杆菌培养物的生物反应器中,并通过与该生物反应器连接的中空纤维过滤系统连续性收获过滤后的发酵产物赤藓酮糖,该生物反应器连接有固定化细胞模块,在线实现排出日本葡萄糖酸杆菌的重复有效利用,具体包括以下步骤:
S1、以含有赤藓糖醇的第一反应体系进行日本葡萄糖酸杆菌发酵,反应一段时间后,当第一反应体系中L-赤藓酮糖高于140g/L,同时赤藓糖醇低于5g/L时向第一反应体系中流加赤藓糖醇,并采用中空纤维过滤系统循环分离发酵液,得到包含L-赤藓酮糖的滤出液;
S2、中空纤维过滤系统开启一段时间后,停止流加赤藓糖醇并关闭中空纤维过滤系统,
从发酵罐中取出适量发酵液,同时补充等量的新鲜培养基,重新开始发酵,当赤藓糖醇低于5g/L时,再次开始流加赤藓糖醇继续生产L-赤藓酮糖,同时打开中空纤维过滤系统循环分离发酵液,得到包含L-赤藓酮糖的滤出液;
S2中补加新鲜培养基为第二反应体系,包括赤藓糖醇40-50g/L,酵母浸膏10-15g/L,PQQ辅酶20-25mg/L,ATP20-25mg/L,其余为水,115℃灭菌20min;
S3、将S2取出的发酵液离心,得到菌体和离心液;
对菌体进行固定化处理,然后将固定化菌体加入L-赤藓酮糖的滤出液中消耗其中残余的赤藓糖醇,30℃下培养,维持pH在5.8-6.2之间,通气量不高于1.2vvm,同时转速维持在100rpm/min以下,反应结束后将L-赤藓酮糖清液分离出来,再次加入新的L-赤藓酮糖的滤出液或继续反应;
将分离出的L-赤藓酮糖清液应在45~55℃下浓缩,活性炭脱色,得赤藓酮糖;
S4、重复S2-S3,直至L-赤藓酮糖生产效率下降。
2.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,第一反应体系包括赤藓糖醇80~100g/L,酵母浸膏15-20g/L,消泡剂0.4~0.6ml/L,其余为水,pH维持在5.8~6.2。
3.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于, S1中流加赤藓糖醇并时实时取样,利用HPLC监测赤藓糖醇含量,控制赤藓糖醇消耗速率与补充速率一致。
4.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,S2中取出发酵液时,取出5%-20%的发酵液。
5.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,S2中中空纤维过滤系统开启18-36h后,停止流加赤藓糖醇并关闭中空纤维过滤系统。
6.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,S3中对菌体进行固定化处理的方法为:
步骤1:按照重量比配制海藻酸钠溶液,其中海藻酸钠质量分数为3%-4%,卡拉胶质量分数为0.36%-0.4%,将菌体与海藻酸钠溶液按照重量比1:20混合,得到海藻酸钠复合材料溶液;
步骤2:按照重量比配制氯化钙溶液,其中氯化钙质量分数为4%-5%,氯化钾质量分数为0.5%-0.6%;
步骤 3:将海藻酸钠复合材料溶液以5滴/s的速度滴入氯化钙溶液中,于4℃浸泡0.5h-1h,再用PBS溶液清洗三遍,滤干备用。
7.如权利要求1-5任一项所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法,其特征在于,
当中空纤维过滤系统开始循环后,发酵罐内的赤藓糖醇的浓度应≤10g/L。
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