CN113621658A - 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法 - Google Patents

一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113621658A
CN113621658A CN202110908183.7A CN202110908183A CN113621658A CN 113621658 A CN113621658 A CN 113621658A CN 202110908183 A CN202110908183 A CN 202110908183A CN 113621658 A CN113621658 A CN 113621658A
Authority
CN
China
Prior art keywords
erythrulose
reaction system
erythritol
dihydroxyacetone
content
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110908183.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113621658B (zh
Inventor
严燕兵
俞丽燕
钱敏帆
华超
胡钦
吴自成
张利坤
杨卫华
汤必成
谈聪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changxing Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Changxing Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changxing Pharmaceutical Co ltd filed Critical Changxing Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202110908183.7A priority Critical patent/CN113621658B/zh
Publication of CN113621658A publication Critical patent/CN113621658A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113621658B publication Critical patent/CN113621658B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种连续生产1,3‑二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，利用1,3‑二羟基丙酮的酵母菌反应体系的菌体废料通过硅藻土、聚乙烯亚胺、戊二醛进行包埋/交联获得固定化菌体，再建立可重复转化的赤藓酮糖生物催化反应体系，通过控制赤藓糖醇底物、补料时机和浓度，有效提高了赤藓酮糖的产量，且固定化菌体可用于连续化工业生产赤藓酮糖，并保持相当高度的酶活。

Description

一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵和生物转化领域，具体地说涉及一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法。
背景技术
1,3-二羟基丙酮(1,3-dihydroxyacetone,DHA)是一种简单酮糖，结构式如式I所示，通常状态下是白色粉末状晶体，味道具有凉甜的特征，易吸湿并分解；主要是利用微生物生长过程中产生的甘油脱氢酶，将甘油的仲羟基氧化脱氢而成。
Figure BDA0003202505260000011
1,3-二羟基丙酮的制备主要是微生物转化法，利用微生物生长过程中产生的甘油脱氢酶，将甘油的仲羟基氧化脱氢从而生成1,3-二羟基丙酮。生物转化具有反应速率快、转化条件温和、优异的化学选择性、对环境友好等优点，属于绿色加工工艺，符合目前国家提倡的低碳经济和可持续发展需要。
L-赤藓酮糖(L-erythrulose,DHB)的结构式如式II所示，常温下为淡黄色液体，其在自然界存在但含量极少，属于稀有糖，高纯度(78～85％)的L-赤藓酮糖是黄色粘稠状液体，有甜味。
Figure BDA0003202505260000012
1,3-二羟基丙酮和L-赤藓酮糖作为重要的化工原料、医药中间体和功能添加剂在国外已经得到了广泛的实际应用。
传统生产L-赤藓酮糖的方法是以赤藓糖醇为前体的化学合成法，此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难，不利于纯化。利用生物转化法制备L-赤藓酮糖具有操作简便、反应条件温和、过程易于控制、原料利用率及产品纯度高、绿色环保等优点，具有光明前景。
中国专利CN109503340A(公开日2019年03月22日)公开了一种1,3-二羟基丙酮的制备工艺，该技术将甘油水溶液、催化剂加入到高压反应釜中，密闭完全后，室温下用高纯氧气进行排空三次，然后充入1.0MPa高纯氧气，搅拌加热至70-90℃，经分离后获得1,3-二羟基丙酮，该方法能耗高、设备要求高，不利于工业化生产。
中国专利CN107141208B(公开日2021年02月09日)公开了一种1,3-二羟基丙酮的制备方法，该技术有1,3-二氯-2-丙醇、1,3-二氯-2丙酮等中间产物，反应复杂，步骤繁琐。
中国专利CN103952334B(公开日2014年07月30日)公开了一种醋酸乳杆菌和常规氮源(如玉米浆、尿素、牛肉膏等)生物发酵制备L-赤藓酮糖的技术，经二级发酵培养获得186g/L的L-赤藓酮糖。该工艺的反应体系中含有较多的碳酸钙、磷酸钾，不利于赤藓酮糖的纯化，且重复利用率低。
中国专利CN109251948B(公开日2019年01月22日)公开了一种固定化酶催化法制备D-赤藓酮糖的方法，该技术的反应体系含多种酶和辅酶，利用环氧树脂固定，阴离子交换洗脱ADP/ATP，再通过柱层析吸附磷酸，获得D-赤藓酮糖，该方法体系复杂，不利于工业化生产。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，旨在解决现有工艺中反应体系复杂、步骤繁琐、设备要求高与不利于工业化生产等问题。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的方法包括如下步骤：
(1)以含有甘油、酵母菌的第一反应体系进行生物发酵，当第一反应体系中1,3-二羟基丙酮浓度为180-220g/L时放罐获得菌液，所述菌液经分离获得1,3-二羟基丙酮清液和第一菌体；
(2)向第一菌体中添加戊二醛、聚乙烯亚胺和硅藻土获得固定化菌体；
(3)建立第二反应体系，加入所述固定化菌体、第一浓度的赤藓糖醇和水，维持pH在5.6-6.0，通气至第二反应体系中赤藓糖醇含量降至第二浓度后，开始进行赤藓糖醇补料，补料后赤藓糖醇的含量逐渐上升并维持在第三浓度；其中，所述赤藓糖醇的第三浓度为15-25g/L；
(4)当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至140-180g/L时，减少赤藓糖醇投料；当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至190-210g/L时，停止反应；
(5)分离菌液，获得赤藓酮糖清液和第二菌体，第二菌体重复用于第二体系反应的转化，赤藓酮糖清液经浓缩、脱色后，获得L-赤藓酮糖。
已知在化妆品等领域，L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮具有类似的美黑效果，故常配合使用，而现有技术鲜有将L-赤藓酮糖和1,3-二羟基丙酮的生物酶催化工艺路线结合起来的报道，传统1,3-二羟基丙酮工艺中转化后的菌体直接作为废料处理；另外，即使将1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的工艺关联起来，如何有效提高收率的同时，保证反应体系的连续化生产，往往是本领技术人员难以克服的技术困难。
本发明利用第一反应体系的酵母菌和甘油通过生物催化获得1,3-二羟基丙酮后分离出的第一菌体经固定化处理后获得“固定化菌体”，利用该固定化菌体催化赤藓酮糖的生物酶催化体系，显著提高L-赤藓酮糖含量的同时，提高了固定化菌体的重复利用率，更有利于工业化连续性生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖。作为本发明的优选方案，所述第一菌体选自甲醇营养型酵母菌，更优选地，所述第一菌体为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)。
本发明所述的第一反应体系用于生产1,3-二羟基丙酮，包括甘油35-45g/L，酵母浸膏5-10g/L，消泡剂0-0.06g/L，其余为水；补料为甘油，通过加入NaOH使pH维持在5.6-5.8。
进一步地，所述步骤(1)是在适宜温度下经2L摇瓶种子培养(一级种子液)、500L种子罐培养(二级种子液)、5000L发酵罐培养逐级扩大，总时间为18-30小时，发酵过程中的pH不低于5.6，发酵温度为29±0.5℃。
更进一步地，所述步骤(1)包括：
(1A)适宜温度下，培养10～16h获得一级种子，移入一级种子罐；
(1B)适宜温度下，培养8～10h获得二级种子，移入发酵罐；
(1C)接种量8％-10％，通气量不高于1.5vvm，维持pH在5.6-5.8之间，当反应体系中1,3-二羟基丙酮含量为180-220g/L时，放罐，菌液经分离获得第一菌体和1,3-二羟基丙酮清液。为维持第一菌体的活性，一般需置于-20℃保藏或者第一时间制成固定化菌体用于制备赤藓酮糖。
作为一种优选的实施方式，所述步骤(1)包括：于29℃，200rpm，培养10～16h后，一级种子液的OD560(2％盐酸稀释10倍)≥5时移入一级种子罐；于29-30℃，200rpm，1.3vvm下，培养8-10h后，二级种子液的OD560(2％盐酸稀释10倍)≥3时移入发酵罐；接种量为8％-10％，通气量开始时0.8vvm(20m3/h)，随溶氧下降逐步增至1.3vvm(30m3/h)；罐压：开始时0.03MPa，随溶氧下降逐步增至0.05MPa。搅拌转速：开始时150rpm(30Hz)，随溶氧下降逐步增至250rpm(50Hz)。pH消前6.0-6.2，消后5.8-6.0。发酵过程中pH会缓慢下降至5.6，通过补加NaOH使pH维持在5.6-5.8。发酵温度29±0.5℃。
补料前期，按每次补入无水甘油浓度约为20-30g/L，可维持2h左右，当进入对数生长期时，1,3-二羟基丙酮增长速度可达到15g/L·h，后逐渐减小，当1,3-二羟基丙酮含量初次达到100-140g/L时，补入20-30g/L的无水甘油可维持4-8h。具体补入量要根据残余无水甘油含量。根据目前的生产经验，采取变速流加底物的方式使甘油含量维持在20-30g/L，可使1,3-二羟基丙酮的生产速度大大提高。
当反应体系1,3-二羟基丙酮的含量升至180-220g/L时，放罐，菌液经分离获得第一菌体和1,3-二羟基丙酮清液。
对于所述步骤(1)获得的1,3-二羟基丙酮清液，在30-50℃下浓缩，等比例加入无水乙醇即可获得1,3-二羟基丙酮；获得的第一菌体通过步骤(2)制成固定化菌体，用于第二反应体系生物转化赤藓酮糖。特别地，为维持第一菌体的活性，一般需置于-20℃保藏或者第一时间制成固定化菌体用于制备赤藓酮糖。
其中，所述步骤(2)中，是先加入硅藻土和聚乙烯亚胺吸附一段时间后，再加入戊二醛进行交联反应，获得固定化菌体。作为一种优选的实施方式，所述步骤(2)具体包括：硅藻土质量浓度6～7g/L，聚乙烯亚胺体积分数2～4％，吸附1h后，再加入体积分数0.5～1％的戊二醛交联1h后，获得固定化菌体。步骤(2)采用吸附与交联固定相结合的方式，有利于提高酶回收活力和酶的重复使用率，尤其对1,3-二羟基丙酮生产后的菌渣，在赤藓酮糖转化率上取得了意想不到的进步。
进一步地，所述步骤(3)中，建立第二反应体系，加入所述固定化菌体、第一浓度的赤藓糖醇和水，维持pH在5.6-6.0，通气至第二反应体系中赤藓糖醇含量降至第二浓度后，开始进行赤藓糖醇补料，补料后赤藓糖醇的含量逐渐上升并维持在第三浓度；其中，所述赤藓糖醇的第三浓度为15-25g/L。本发明在第二反应体系生物催化过程中，对赤藓糖醇浓度的控制显得尤为重要，底物赤藓酮糖的浓度是决定酶催化反应速率的主要因素，底物浓度过高时，会因底物抑制作用造成酶反应速率下降；底物浓度很低时，酶没有全部被底物所饱和，催化反应效率受到影响。
作为优选实施方式，所述赤藓糖醇在反应初期的第一浓度为30-50g/L，更优选为35-45g/L；赤藓糖醇开始进行补料时，第二反应体系中赤藓糖醇的第二浓度为8-12g/L；最后补料至第三浓度并维持在浓度下反应，更优选地控制在16-22g/L。在第二反应体系中，赤藓糖醇浓度的控制能显著提高赤藓酮糖含量和成品收率。
步骤(4)，当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至140-180g/L时，更优选地达到150-170g/L时，减少赤藓糖醇投料；当第二反应体系中赤藓酮糖的含量达到190-210g/L，优选达到195-205g/L时，停止反应。
步骤(5)分离菌液后，获得赤藓酮糖清液在32-50℃下浓缩，活性炭脱色，得赤藓酮糖(L-赤藓酮糖)成品。而所述的第二菌体即在第二反应体系中催化过一次的固定化菌体，可用于后续的重复反应。根据生产记录，所述第二菌体重复利用20-30次后，酶活不低于80％，优选的情况下能达到85％以上。
有益效果：(1)本发明提供了基于甘油和酵母菌发酵体系连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法。(2)本发明获得的固定化菌体可以在反应釜内直接进行赤藓酮糖的生物转化，转化结束后利用离心或抽滤分离固定化菌体和转化液，得到的固定化菌体可以进行20次以上的赤藓酮糖生物转化。且由固定化菌体直接进行生物转化减少了传统工艺带来的发酵杂质，离心清液可以直接经过30-50度浓缩，即可包装，低温保存。离心分离减少了传统工艺膜过滤带来的损失，提高了赤藓酮糖的最终收率，理论收率可以达到100％。(3)传统1,3-二羟基丙酮反应终止后，第一菌体为废料，而本发明将其制备成固定化菌体后，可用于转化赤藓酮糖。
附图说明
图1为本发明连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的流程图；
图2为本发明实施例1制备的1,3-二羟基丙酮的高效液相谱图；
图3为本发明实施例3制备的赤藓酮糖的高效液相谱图；
图4为本发明实施例3重复使用次数和相对酶活的曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
如图1所示，本实施例以含有甘油、酵母菌的第一反应体系进行生物发酵，当第一反应体系中1,3-二羟基丙酮浓度为180-220g/L时放罐获得菌液，菌液经分离获得1,3-二羟基丙酮清液和第一菌体。具体方法为：
首先，用接种环从斜面挑取一环活化后的酵母菌接种到容量为2L的摇瓶内，装液量为500mL，29℃，200rpm，摇床培养12h后，测定OD560(2％盐酸稀释10倍)≥5时，即为一级种子液。
其次，一级种子液按8％接种量接入装液量200L的500L发酵罐中，29-30℃，200rpm，1.3vvm下，培养10h后，测定OD560(2％盐酸稀释10倍)≥3时，即为二级种子液；
最后，二级种子液按10％接种量接入装液量3000L的5000L发酵罐中，发酵温度29±0.5℃，起始通气量为0.8vvm(20m3/h)，随发酵过程中溶氧下降逐步增至1.3vvm(30m3/h)；起始罐压为0.03MPa，随发酵过程中溶氧下降逐步增至0.05MPa；起始搅拌速度为150rpm(30Hz)，随发酵过程中溶氧下降逐步增至250rpm(50Hz)。发酵过程中补加NaOH使pH维持在5.6-5.8，采取变速流加底物的方式使发酵罐体系中甘油含量维持在25g/L，当转化1,3-二羟基丙酮含量在200g/L时，即可放罐。菌液经膜(微滤膜截留0.1-1微米之间的物质)分离获得1,3-二羟基丙酮清液和第一菌体，1,3-二羟基丙酮清液在45℃下浓缩，等比例加入无水乙醇即可获得1,3-二羟基丙酮。1,3-二羟基丙酮采用高效液相色谱法测定：色谱条件：仪器：Aglient(安捷伦)1260高效液相色谱仪，紫外检测器；色谱柱：Lichrospher C18，250×4.5mm，5μm；流速：1mL/min；检测波长：200nm；流动相：5％甲醇水溶液(0.05％磷酸调pH至3.0)；进样量：10μL；其高效液相色谱谱图如图2所示。
实施例2
实施例1菌液经分离获得的第一菌体为酵母菌湿菌体，将500g第一菌体加到5L水中(100g/L)，制备得到菌悬液，并开启搅拌，转速为140rpm(25Hz)，向其中加入30g硅藻土(6g/L)和终体积分数为3％的聚乙烯亚胺，用磷酸溶液调节pH为8.0，交联吸附60min后，再加入终体积分数为1％的戊二醛并交联60min后，抽滤或离心分离获得的固体即为固定化菌体。整个反应过程中，温度控制在28℃，转速为150rpm。
实施例3
300mL体系：向初始200mL水中投加8g赤藓糖醇(40g/L)，加入12g通过实施例1和实施例2获得的固定化菌体(终体积4％)，通入空气，水浴温度30℃，反应过程中用20％氢氧化钠溶液控制pH在5.6～6.0之间。反应3h后(此时体系内赤藓糖醇浓度为8-12g/L)，开始流加50％赤藓糖醇溶液，速度4.8mL/h，持续补加22h后将补加速度降低到2.4mL/h，再补加6h左右(即维持体系内赤藓糖醇补料浓度为16-22g/L)，终止反应，此时反应液体积为320mL左右，赤藓酮糖含量达到200g/L左右。抽滤或离心分离固定化菌体和反应液，反应液直接45℃浓缩至固含40左右，加3％活性炭脱色1h后，再次40℃浓缩至固含68％左右得到约90mL的赤藓酮糖成品。分离的固定化菌体重复用于赤藓糖醇的转化，重复至第22次反应时赤藓酮糖含量仍可达到183g/L，酶活仍有85％以上。
实施例4
按照实施例1和实施例2的方法，在500L反应体系的1,3-二羟基丙酮发酵后收集第一菌体，加入硅藻土、聚乙烯亚胺交联吸附后，再加入戊二醛固定，制备获得固定化菌体。
300L体系：向初始200L水中投加8kg赤藓糖醇(40g/L)，12kg的上述固定化菌体，通入空气，水浴温度30℃，反应过程中用20％氢氧化钠溶液控制pH在5.6～6.0之间。反应3.5h后，开始流加50％赤藓糖醇溶液，速度4.8L/h，持续补加22h后将补加速度降低到2.4L/h，再补加6h左右，终止反应，此时反应液体积为330L左右，赤藓酮糖含量达到200g/L左右。抽滤或离心分离固定化菌体和反应液，反应液直接45℃浓缩至固含40左右，加3％活性炭脱色1h后，再次40℃浓缩至固含68％左右得到约90L的赤藓酮糖成品。分离的固定化菌体重复用于赤藓糖醇的转化，重复至第20次反应时赤藓酮糖含量仍可达到189g/L，酶活仍有85％以上。
实施例5
3000L体系：向初始2000L水中投加80kg赤藓糖醇(40g/L)，5吨罐发酵1,3-二羟基丙酮后收集菌泥制备的固定化菌体120kg(终体积4％)，通入空气，水浴温度30℃，反应过程中用20％氢氧化钠溶液控制pH在5.6～6.0之间。反应3h后，开始流加50％赤藓糖醇溶液，速度48L/h，持续补加21.5h后将补加速度降低到24L/h，再补加7h左右，终止反应，此时反应液体积为3250L左右，赤藓酮糖含量达到200g/L左右。抽滤或离心分离固定化菌体和反应液，反应液直接45℃浓缩至固含40左右，加3％活性炭脱色1h后，再次40℃浓缩至固含68左右得到约980L的赤藓酮糖成品。赤藓酮糖采用高效液相色谱法测定：色谱条件：LichrospherNH2分析柱，250×4.6mm，5μm；流速：1mL/min；检测波长：277nm；流动相：乙腈-水(体积比为9∶1)；进样量：10μL；其高效液相色谱谱图如图2所示。分离的固定化菌体重复用于赤藓糖醇的转化，重复至第24次反应时赤藓酮糖含量仍可达到174g/L，酶活仍有80％以上(如图4所示)。
试验例1游离酶与不同固定化方法对赤藓酮糖产量的影响
本试验比较了游离酶和常用的固定化方法对赤藓酮糖产量和酶活力回收率的影响，表明采用戊二醛、硅藻土、聚乙烯亚胺固定的方法，特别适用于工业化生产，极大重复转化次数并维持高酶活力。
表1游离酶与不同固定化方法的效果比较
Figure BDA0003202505260000071
Figure BDA0003202505260000081
试验例2赤藓糖醇初始浓度和补料时机对赤藓酮糖得率的影响
本发明通过对赤藓糖醇除湿浓度和补料时机的探索，进一步优化了赤藓酮糖的得率。本试验例所采用的方法与实施例3基本相同，对赤藓糖醇初始浓度、投料时机以及维持浓度进行梯度设计，如表2所示，从该表可以看出不同水平参数对赤藓酮糖产量差异的影响。
表2赤藓糖醇对赤藓酮糖转化效果的影响
Figure BDA0003202505260000082
底物赤藓糖醇溶液应控制在一定的范围之内，偏低或者偏高会影响反应的效果，使得赤藓酮糖的产率有所下降；底物赤藓糖醇的初始浓度、投料时机以及维持浓度均有最适浓度，通过自动流加系统，控制在最优的范围内。

Claims (10)

1.一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以含有甘油、酵母菌的第一反应体系进行生物发酵，当第一反应体系中1,3-二羟基丙酮浓度为180-220g/L时放罐获得菌液，所述菌液经分离获得1,3-二羟基丙酮清液和第一菌体；
(2)向第一菌体中添加戊二醛、聚乙烯亚胺和硅藻土获得固定化菌体；
(3)建立第二反应体系，加入所述固定化菌体、第一浓度的赤藓糖醇和水，维持pH在5.6-6.0，通气至第二反应体系中赤藓糖醇含量降至第二浓度后，开始进行赤藓糖醇补料，补料后赤藓糖醇的含量逐渐上升并维持在第三浓度；其中，所述赤藓糖醇的第三浓度为15-25g/L；
(4)当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至140-180g/L时，减少赤藓糖醇投料；当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至190-210g/L时，停止反应；
(5)分离菌液，获得赤藓酮糖清液和第二菌体，所述第二菌体重复用于第二体系反应的转化，赤藓酮糖清液经浓缩、脱色后，获得L-赤藓酮糖。
2.根据权利要求1所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，所述第一反应体系中包括：
甘油35-45g/L，
酵母浸膏5-10g/L，
消泡剂0-0.06g/L，
其余为水；
补料为甘油，通过加入NaOH使pH维持在5.6-5.8。
3.根据权利要求1或2所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：
(1A)适宜温度下，培养10～16h获得一级种子，移入一级种子罐；
(1B)适宜温度下，培养8～10h获得二级种子，移入发酵罐；
(1C)接种量8％-10％，通气量不高于1.5vvm，维持pH在5.6-5.8之间，当反应体系中1,3-二羟基丙酮含量为180-220g/L时，放罐，菌液经分离获得第一菌体和1,3-二羟基丙酮清液。
4.根据权利要求3所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，硅藻土质量浓度6～7g/L，聚乙烯亚胺体积分数2～4％，加入戊二醛体积分数0.5～1％。
5.根据权利要求1或4所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，第二反应体系包括固定化菌体、30-50g/L的赤藓糖醇和水，维持pH在5.6-6.0，通气反应至体系中赤藓糖醇含量为8-12g/L后，开始进行赤藓糖醇补料，补料后赤藓糖醇的含量逐渐上升并维持在16-22g/L。
6.根据权利要求5所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至150-170g/L时，减少赤藓糖醇投料；当第二反应体系中赤藓酮糖的含量至195-205g/L时，停止反应。
7.根据权利要求1或4所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，第二反应体系停止后利用离心或抽滤的方法分离固定化菌体和赤藓酮糖清液。
8.根据权利要求6所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中赤藓酮糖清液是在32-50℃下进行浓缩的。
9.根据权利要求1所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于：所述第二菌体重复用于第二反应体系的转化次数不低于20次。
10.根据权利要求9所述的一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法，其特征在于：所述第二菌体重复用于第二反应体系酶活不低于80％，所述重复次数为20-30次。
CN202110908183.7A 2021-08-09 2021-08-09 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法 Active CN113621658B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110908183.7A CN113621658B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110908183.7A CN113621658B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113621658A true CN113621658A (zh) 2021-11-09
CN113621658B CN113621658B (zh) 2023-05-02

Family

ID=78383606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110908183.7A Active CN113621658B (zh) 2021-08-09 2021-08-09 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113621658B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114994209A (zh) * 2022-06-07 2022-09-02 南京斯拜科生物科技股份有限公司 一种同时测定化妆品中的1,3-二羟基丙酮和l-赤藓酮糖的方法
CN116083500A (zh) * 2023-02-22 2023-05-09 河南大学 连续生产赤藓酮糖的工艺方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821418A (zh) * 2005-12-13 2006-08-23 浙江工业大学 微生物法生产二羟基丙酮
CN103952334A (zh) * 2014-03-25 2014-07-30 深圳市博大生物技术有限公司 一种微生物发酵生产l-赤藓酮糖的菌株hd385和方法
CN111440785A (zh) * 2020-02-28 2020-07-24 浙江工业大学 一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1821418A (zh) * 2005-12-13 2006-08-23 浙江工业大学 微生物法生产二羟基丙酮
CN103952334A (zh) * 2014-03-25 2014-07-30 深圳市博大生物技术有限公司 一种微生物发酵生产l-赤藓酮糖的菌株hd385和方法
CN111440785A (zh) * 2020-02-28 2020-07-24 浙江工业大学 一种改性硅藻土固定化含有葡萄糖异构酶细胞的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRÉDÉRIC CARLY等: "Identification and characterization of EYD1, encoding an erythritol dehydrogenase in Yarrowia lipolytica and its application to bioconvert erythritol into erythrulose", 《BIORESOUR TECHNOL》 *
KATSUSHI NISHIMURA等: "Identification of enzyme responsible for erythritol utilization and reaction product in yeast Lipomyces starkeyi", 《J BIOSCI BIOENG》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114994209A (zh) * 2022-06-07 2022-09-02 南京斯拜科生物科技股份有限公司 一种同时测定化妆品中的1,3-二羟基丙酮和l-赤藓酮糖的方法
CN114994209B (zh) * 2022-06-07 2024-05-24 南京斯拜科生物科技股份有限公司 一种同时测定化妆品中的1,3-二羟基丙酮和l-赤藓酮糖的方法
CN116083500A (zh) * 2023-02-22 2023-05-09 河南大学 连续生产赤藓酮糖的工艺方法
CN116083500B (zh) * 2023-02-22 2023-08-04 河南大学 连续生产赤藓酮糖的工艺方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113621658B (zh) 2023-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113621658A (zh) 一种连续生产1,3-二羟基丙酮和赤藓酮糖的制备方法
CN109182410B (zh) 一种(S)-N-Boc-3-羟基哌啶的酶催化制备方法
EP3255147B1 (en) Immobilized cell and preparation method thereof
Hamdi et al. A new process for red pigment production by submerged culture of Monascus purpureus
CN115851848A (zh) 一种联产d-阿洛酮糖和葡萄糖酸钠的制备方法
CN110066837B (zh) 微生物高效催化5-羟甲基糠醛生产2,5-呋喃二甲醇的方法
CN1357628A (zh) 两步微生物发酵生产1,3丙二醇的方法
CN113072599A (zh) 一种生物发酵提取制备天然橙皮苷的方法
CN106220512B (zh) 一种制备丁二胺的方法
CN111118088B (zh) 一种鼠李糖脂发酵过程中的泡沫控制方法
CN110004202B (zh) 一种微生物共培养催化碳水化合物合成己酸的方法
CN101698859B (zh) 正十六烷二元酸生产方法
FI71766C (fi) Framstaellning av etanol genom hoegeffektiv bakteriejaesning.
FI85501B (fi) Foerfarande foer framstaellning av polyoler genom pao industriell skala baserad fermentation av socker.
CN1067724C (zh) 真菌发酵生产天然脱落酸的新方法
CN110564789B (zh) 一种利用大肠杆菌发酵生产l-茶氨酸的方法
CN106755142B (zh) 米根霉菌体全细胞催化制备l-乳酸的方法
CN114686531A (zh) 一种生物转化制备1,3-丙二醇的方法
KR101204971B1 (ko) 젖산 암모늄을 포함하는 젖산 발효액으로부터 젖산을 정제하는 방법
CN114891835B (zh) 一种高产葡萄糖酸的方法
CN112481330A (zh) 一种藻源β-1,3-葡聚糖发酵生产方法
CN110684809A (zh) 一种发酵法生产的十二碳二元酸产品及其制备方法
CN111892637B (zh) 一种7-脱氢-25-羟基胆固醇的制备方法
CN115678930B (zh) 一种丙烯酰胺的制备方法
CN112359028B (zh) 一种托莫西汀中间体的生物合成方法及羰基还原酶

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant