CN112359028B - 一种托莫西汀中间体的生物合成方法及羰基还原酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶工程技术领域，尤其是一种托莫西汀中间体的生物合成方法及羰基还原酶，该羰基还原酶产酶菌株为Escherichia coli TM1908，菌种保藏编号CCTCC NO：M2019714。进行托莫西汀中间体生物合成，在辅酶、辅酶循环酶、助溶剂、缓冲液的存在下，经该羰基还原酶催化转化为托莫西汀中间体化合物I。

Description

一种托莫西汀中间体的生物合成方法及羰基还原酶
技术领域
本发明涉及酶工程领域，具体领域为一种托莫西汀中间体的合成方法。
背景技术
托莫西汀(atomoxetine)是一种高度选择性去甲肾上腺素再摄取抑制(norepinephrine reuptake inhibitor，NRI)，通过选择性地与神经突触前膜上的去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)再摄取转运体结合，抑制NE再摄取，而与其他神经递质亲和力极低。对于中枢神经兴奋剂治疗有严重不良反应或者治疗无效的患者，亦有了可选择的途径，可以试用托莫西汀治疗。托莫西汀作为第一个被用于治疗注意缺陷多动障碍(attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)的非兴奋性药物，2002年获得美国FDA批准，2003年在美国正式上市，目前已经在包括我国在内的多个国家上市并应用。
托莫西汀的研究具有广阔的市场前景，吸引了国内外众多的科研工作者的兴趣，其合成方法自然也是科研工作者研究的重点。目前托莫西汀的合成路线主要以纯化学合成为主，R构型手性基团的引入是合成路线中一步关键的反应，具体路线如下：
Figure BDA0002803755870000011
托莫西汀主流的合成方法为化学法，生产技术复杂，合成反应过程繁琐，化学催化剂价格高昂，所以，需要寻找生物方法来引入手性基团，减少化学催化剂的使用，降低生产成本、减少污染、提高托莫西汀的产率，符合当今绿色化学智造的主题。
专利CN109706191A中提及一种酶催化引入手性基团的方法，方法新颖，但酶催化的底物在水相中溶解度不高，一定程度上降低了催化率。而且，酶催化对底物的选择性要求较高，经实验证实，专利CN109706191A中的羰基还原酶并不适用于本发明的底物3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮盐酸盐的酶催化。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种羰基还原酶。
本发明的第二目的在于提供一种上述羰基还原酶的制备方法。
本发明的第三目的在于提供一种托莫西汀中间体的生物合成方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种羰基还原酶，其产酶菌株为Escherichia coli TM1908。
本发明所述的羰基还原酶产酶菌株为大肠杆菌TM1908(Escherichia coliTM1908)，已经于2019年9月11日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了保藏，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮政编码：430072，登记入册编号CCTCC NO：M2019714，分类命名为：大肠杆菌TM1908(Escherichia coli TM1908)。
本发明所述的羰基还原酶的制备方法为：将Escherichia coli TM1908接种于10ml LB液体培养基，接种量为1％，培养基含1mg卡那霉素，37℃，220rpm摇床培养8h，获得种子液；
将上述种子液接入发酵产酶培养基，接种量为1～5％，发酵培养基中添加终浓度为10mg/100mL卡那霉素，37℃，220rpm摇床培养至OD600在0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，18℃诱导24h。发酵液诱导结束后，在4℃下，12000rpm离心3min，收集菌体。0.2MpH7.0的PB buffer洗菌并重悬，超声破碎后冻干，获得羰基还原酶冻干酶粉。
采用上述的羰基还原酶进行托莫西汀中间体生物合成的方法：由化合物II作为起始原料，在辅酶、辅酶循环酶、助溶剂、缓冲液的存在下，经羰基还原酶催化合成托莫西汀中间体化合物I，其反应如下所示，
Figure BDA0002803755870000031
，所述化合物II为3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮盐酸盐。
其中，所述的助溶剂为甲醇或乙醇或异丙醇或DMSO，优选为异丙醇。
其中，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.1M～1M，优选为0.1～0.2M；pH值为7.0。
其中，所述羰基还原酶和化合物II在反应体系中的质量浓度比为1:1～20，优选为1:10～20。
其中，所述化合物II的在体系中的质量浓度为1％～20％，优选为5～10％。
其中，所述辅酶为NADP+或NAD+，优选为NADP+；NADP+添加量与羰基还原酶粉的质量比例为1:10～1000，优选为1:50～400。
其中，所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶或葡糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
其中，所述助溶剂与缓冲液V/V比例为1:0.1～10，优选为1:1～10。
其中，所述化合物II经羰基还原酶催化反应时，反应温度为10～50℃，优选为20～40℃。
或者，一种托莫西汀中间体生物合成的方法，将上述化合物II替换为3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮。
本发明在提供化合物I制备方法的同时，还提供了制备化合物I所需底物(化合物II)的制备方法，二者的合成总路线如下：
Figure BDA0002803755870000032
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了托莫西汀中间体的生物合成方法，该方法解决了现有技术中托莫西汀中间体化学催化剂大量使用，合成工艺复杂等问题，提供了一种合成路线新颖，简单易行，具有减少化学催化剂使用，降低生产成本、减少污染、产品收率高、产品纯度高，原料价廉易得以及适合放大生产等优点。
同时，本发明提供了新的酶催化底物II，尤其是化合物II为盐酸盐的形式，能够增大底物的水相中的溶解性，大幅度提高酶催化效率，控制成本，在工业生产上具有更经济的应用前景。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1化合物III的制备
取30g化合物IV加入300ml丙酮，室温搅拌溶解澄清，加入106.6g碘化钠升温至回流反应，约10h，HPLC中控化合物IV未反应量小于5％，抽滤，减压浓缩滤液得49.5g化合物III，加入150ml正己烷，重结晶得33.34g，收率：72％。
实施例2化合物II的制备
取上述制备的化合物III 33g，加入132ml THF，264ml 25％一甲胺水溶液室温搅拌，TLC中控，约20h化合物III反应完全，加入减压蒸去THF，加入5.6g氢氧化钠搅拌30min，加入400ml甲苯，100ml水，搅拌分液，水相用200ml甲苯反萃，合并有机相，减压蒸干得21.75g粗品3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮。
加入60ml乙醇溶解，滴加17g 30％盐酸乙醇，有大量固体析出，0℃左右搅拌析晶5h，抽滤，烘干得17.4g白色固体，即化合物II(3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮盐酸盐)。
实施例3羰基还原酶制备
将Escherichia coli TM1908接种于10ml LB液体培养基，接种量为1％，培养基含1mg卡那霉素，37℃，220rpm摇床培养8h，获得种子液。
将上述种子液接入发酵产酶培养基，接种量为1％，发酵培养基中添加终浓度为10mg/100mL卡那霉素，37℃，220rpm摇床培养至OD600在0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的IPTG，18℃诱导24h。发酵液诱导结束后，在4℃下，12000rpm离心3min，收集菌体。0.2MpH7.0的PB buffer洗菌并重悬，超声破碎后冻干，获得羰基还原酶冻干酶粉。
实施例4化合物I的制备
在250mL锥形瓶中加入3g化合物II：3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮盐酸盐，2g上述羰基还原酶冻干酶粉，2g异丙醇脱氢酶，6mg NADP+，30mL pH7.0的浓度为0.1M PB buffer，20mL异丙醇，220rpm，35℃，震荡反应16h后，终止反应，乙酸乙酯萃取，获得产物化合物I，经液相检测，化合物I收率为92.7％，光学纯度为98％，ee值99.8％。
实施例5化合物I的制备
在250mL锥形瓶中加入3g化合物II未成盐的酶催化底物：3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮，2g上述羰基还原酶冻干酶粉，2g异丙醇脱氢酶，6mg NADP+，30mL pH7.0的浓度为0.1MPB buffer，20mL异丙醇，220rpm，35℃，震荡反应16h后，终止反应，乙酸乙酯萃取，获得产物化合物I，经液相检测，化合物I收率为73.7％，光学纯度为96.5％，ee值99.6％。
通过实施例4和实施例5的对比可以看出，未成盐的底物(3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮)也能被催化，但是反应收率明显不如采用成盐的底物(3-甲胺基-1-苯基-1-丙酮盐酸盐)的收率高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种羰基还原酶进行托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：由化合物II作为起始原料，在辅酶、辅酶循环酶、助溶剂、缓冲液的存在下，经羰基还原酶催化合成托莫西汀中间体化合物I，其反应如下所示，
Figure DEST_PATH_IMAGE002
，
所述化合物II为3-甲胺基-1 -苯基-1-丙酮盐酸盐；
所述羰基还原酶的产酶菌株为Escherichia coli TM1908，菌种保藏编号CCTCC NO：M2019714。
2.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述的助溶剂为异丙醇。
3.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液，浓度为0.2M，pH值为7.0。
4.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述羰基还原酶和化合物II在反应体系中的质量浓度比为1:10~20。
5.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述化合物II的在体系中的质量浓度为5~10%。
6.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述辅酶为NADP+；NADP+添加量与羰基还原酶粉的质量比例为1:50~400；
所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶或葡糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。
7.根据权利要求1所述的托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：所述助溶剂与缓冲液V/V比例为1:1~10；
所述化合物II经羰基还原酶催化反应时，反应温度为20~40℃。
8.一种托莫西汀中间体生物合成的方法，其特征在于：将权利要求1中的化合物II替换为3-甲胺基-1 -苯基-1-丙酮。
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CN108342418A (zh) * 2018-05-10 2018-07-31 浙江海洋大学 一种利用羰基还原酶催化生产(s)-3-氯代苯丙醇的方法
CN109706191A (zh) * 2019-01-21 2019-05-03 南京欧信医药技术有限公司 一种托莫西汀中间体的酶催化合成方法

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