CN111849959A - 一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于催化技术领域，本发明提供了一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，包括如下步骤：将β‑葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液、木糖苷酶进行反应，得到共固定双酶；用共固定双酶和黄芪甲苷进行催化反应，得到环黄芪醇。本发明的方法克服了现有技术采用两步反应制备环黄芪醇工艺中中间体的提取分离问题，同时本发明的共固定双酶可以回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产。本发明的共固定双酶对黄芪甲苷的转化率基本达到100％，底物黄芪甲苷完全转化成环黄芪醇。本发明得到的环黄芪醇的产品纯度可达78.3％以上。
Description
技术领域
本发明涉及催化技术领域，尤其涉及一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。
背景技术
多酶工艺在生物转化和生物医学工程中占有重要地位，被认为是生产药品、生物燃料和精细化学品的替代品。最初只是从微生物中纯化出单一的酶进行体外生物转化反应。目前，以多酶复合物的形式组装而成的多酶级联反应整合了多种酶的转化过程，可以消除反应中间体的不易分离和纯化的问题，从而显著降低了成本，节约了能源。更少的单元操作、更短的循环时间、更小的反应器体积和更好的时空产率也带来了更好的经济效益，实现了可持续性和绿色合成。
环黄芪醇主要由于其具有抗衰老作用而被广泛关注，它是目前世界上唯一已被证明的可以激活端粒酶活性的活性分子，能够有效抑制端粒的减少，有巨大的抗衰老药用潜质。环黄芪醇的制备主要以黄芪甲苷为底物，现有技术报道了利用合成的两种游离的重组酶，打通了黄芪甲苷到环黄芪醇的清洁制备工艺，可以实现两步法制备环黄芪醇。但是由于涉及中间体的分离，而且游离酶使用后无法实现回收再利用，从而提高了生产成本，大大限制了生产效率。
发明内容
本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液、木糖苷酶进行反应，得到共固定双酶；
2)用共固定双酶和黄芪甲苷进行催化反应，得到环黄芪醇。
作为优选，所述β-葡萄糖苷酶的浓度为0.5～2.5mg/mL；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，pH值为7.0～8.0；Fe3O4溶液的浓度为3～8mg/mL；氯化铜溶液的浓度为150～250mM；木糖苷酶的浓度为0.5～2.5mg/mL。
作为优选，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液和木糖苷酶的体积比为4～8：60～180：8～12：8～12：4～8，所述反应的时间为20～50h。
作为优选，其特征在于，步骤1)所述的反应为β-葡萄糖苷酶、部分磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液和氯化铜反应，得到磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶；
磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶与木糖苷酶、剩余的磷酸盐缓冲溶液反应，得到共固定双酶；
所述部分磷酸盐缓冲溶液和剩余的磷酸盐缓冲溶液的体积比为7～8:9～10。
作为优选，步骤1)所述的反应为β-葡萄糖苷酶、木糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液和Fe3O4溶液反应后再与氯化铜溶液反应。
作为优选，步骤2)所述的进行催化反应的共固定双酶为沉淀物。
作为优选，步骤2)所述催化反应在磷酸盐缓冲溶液中进行，所述催化反应的温度为20～40℃，时间为36～60h，pH值为7.0～8.0。
作为优选，步骤2)所述黄芪甲苷在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为1～3mg/mL，共固定双酶在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为50～200μg/mL。
作为优选，所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液。
作为优选，步骤2)所述催化反应结束后，对得到的产物混合物进行洗脱，所述洗脱用的洗脱剂为氯仿、甲醇和水的混合物。
本发明的有益效果包括以下几点：
1)本发明的方法克服了现有技术采用两步反应制备环黄芪醇工艺中中间体的提取分离问题，同时本发明的共固定双酶可以回收再利用，降低了生产成本，工艺简单，经济节约，非常适合于大规模工业化生产。
2)本发明的共固定双酶对黄芪甲苷的转化率基本达到100％，底物黄芪甲苷完全转化成环黄芪醇。本发明得到的环黄芪醇的产品纯度可达78.3％以上。
附图说明
图1为实施例1所得共固定双酶的TEM图；
图2为HPLC测定实施例1的环黄芪醇产品中环黄芪醇的纯度图；
图3为EI-MS对实施例1的环黄芪醇产品的鉴定图。
具体实施方式
本发明提供了一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，包括如下步骤：
1)将β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液、木糖苷酶进行反应，得到共固定双酶；
2)用共固定双酶和黄芪甲苷进行催化反应，得到环黄芪醇。
本发明所述β-葡萄糖苷酶的浓度优选为0.5～2.5mg/mL，进一步优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL；所述Fe3O4溶液的浓度优选为3～8mg/mL，进一步优选为4～6mg/mL，更优选为5mg/mL；氯化铜溶液的浓度优选为150～250mM，进一步优选为170～220mM，更优选为180mM；木糖苷酶的浓度优选为0.5～2.5mg/mL，进一步优选为0.5～1.5mg/mL，更优选为1mg/mL。
本发明所述磷酸盐缓冲溶液优选为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，磷酸盐缓冲溶液的pH值优选为7.0～8.0，进一步优选为7.4；所述磷酸氢二钠的浓度优选为0.1～0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L；所述柠檬酸的浓度优选为0.05～0.15mol/L，进一步优选为0.1mol/L；所述磷酸氢二钠和柠檬酸的体积比优选为17～22:0.6～1.2，进一步优选为19.15:0.85。
本发明所述β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液和木糖苷酶的体积比优选为4～8：60～180：8～12：8～12：4～8，进一步优选为5～7：80～150：9～11：9～11：5～7，更优选为6：120：10：10：6。
本发明步骤1)所述反应优选在室温下进行，所述反应的时间优选为20～50h，进一步优选为24～40h，更优选为30h。
本发明步骤1)所述的反应优选为β-葡萄糖苷酶、部分磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液和氯化铜反应，得到磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶；所述磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶与木糖苷酶、剩余的磷酸盐缓冲溶液反应，得到共固定双酶；所述磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶优选为经过处理后得到的沉淀物；所述部分磷酸盐缓冲溶液和剩余的磷酸盐缓冲溶液的体积比优选为7～8:9～10，进一步优选为7.4:9.4。
本发明步骤1)所述的反应还优选为β-葡萄糖苷酶、木糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液和Fe3O4溶液反应后再与氯化铜溶液反应。
本发明步骤2)所述的进行催化反应的共固定双酶优选为经过处理后得到的沉淀物。
本发明步骤2)所述催化反应优选在磷酸盐缓冲溶液中进行，所述催化反应的温度优选为20～40℃，进一步优选为30℃；催化反应的时间优选为36～60h，进一步优选为40～50h，更优选为48h；催化反应的pH值优选为7.0～8.0，进一步优选为7.0～7.4。
本发明步骤2)所述黄芪甲苷在磷酸盐缓冲溶液中的浓度优选为1～3mg/mL，进一步优选为2mg/mL；所述共固定双酶在磷酸盐缓冲溶液中的浓度优选为50～200μg/mL，进一步优选为80～150μg/mL，更优选为100～120μg/mL。
本发明所述磷酸盐缓冲溶液优选为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，所述磷酸氢二钠的浓度优选为0.1～0.3mol/L，进一步优选为0.2mol/L；所述柠檬酸的浓度优选为0.05～0.15mol/L，进一步优选为0.1mol/L；所述磷酸氢二钠和柠檬酸的体积比优选为17～22:0.6～1.2，进一步优选为19.15:0.85。
本发明步骤2)所述催化反应结束后，优选进行蒸发处理，得到干燥的产品后再加入溶剂溶解、过滤、旋干得到硅胶柱层析上样样品，所述硅胶柱层析上样样品优选进行洗脱，得到环黄芪醇产品，所述洗脱用的洗脱剂优选为氯仿、甲醇和水的混合物，所述氯仿、甲醇和水的体积比优选为10～15:3～6:1～3，进一步优选为13:4:2。
共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的具体反应原理如下(本反应针对如下结构的黄芪甲苷进行催化反应)：
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
由浓度为0.2mol/L，体积为19.15mL的磷酸氢二钠和浓度为0.1mol/L，体积为0.85mL的柠檬酸混合制备磷酸盐缓冲溶液，将浓度为1mg/mL、体积为60μL的β-葡萄糖苷酶加入到1mL磷酸盐缓冲溶液(取部分配制好的磷酸盐缓冲溶液)中。再加入浓度为5mg/mL、体积为100μL的Fe3O4溶液进行混匀，然后加入浓度为180mM、体积为100μL的氯化铜溶液进行反应，室温下静置24小时后使用磁铁收集沉淀，将收集的沉淀与1mg/mL木糖苷酶，磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)进行反应，木糖苷酶和磷酸盐缓冲溶液的体积分别为60μL、1.2mL。室温下静置24小时后用磁铁收集沉淀，去离子水洗涤沉淀，重复进行多次，直至磁铁使溶液和沉淀完全分开，得到沉淀物共固定双酶。
将黄芪甲苷、共固定双酶加入到磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)中进行催化反应，黄芪甲苷和共固定双酶在缓冲液中的浓度分别为2mg/mL、150μg/mL，催化反应的pH值为7，温度为30℃，时间为48小时，转速为160r/min。催化反应结束后用磁铁去除共固定双酶，旋转蒸发仪下蒸发得到干燥的产品混合物，然后将干燥的产品混合物加入到适量的甲醇溶液中溶解，过滤后再旋干得到硅胶柱层析上样样品，对硅胶柱层析上样样品采用氯仿、甲醇和水的混合物进行洗脱，氯仿、甲醇和水的体积比为13:4:2，干法上样，并收集200mL的馏分后将其旋干并干燥称重，得到环黄芪醇产品。
实施例1得到的环黄芪醇产品中环黄芪醇的纯度可达82％。
实施例2
由浓度为0.15mol/L，体积为23.15mL的磷酸氢二钠和浓度为0.07mol/L，体积为1.85mL的柠檬酸混合制备磷酸盐缓冲溶液，将浓度为0.5mg/mL、体积为40μL的β-葡萄糖苷酶加入到0.8mL磷酸盐缓冲溶液(取部分配制好的磷酸盐缓冲溶液)中。再加入浓度为3mg/mL、体积为80μL的Fe3O4溶液进行混匀，然后加入浓度为150mM、体积为80μL的氯化铜溶液进行反应，室温下静置18小时后使用磁铁收集沉淀，将收集的沉淀与0.5mg/mL木糖苷酶，磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)进行反应，木糖苷酶和磷酸盐缓冲溶液的体积分别为40μL、1.0mL。室温下静置18小时后用磁铁收集沉淀，去离子水洗涤沉淀，重复进行多次，直至磁铁使溶液和沉淀完全分开，得到沉淀物共固定双酶。
将黄芪甲苷、共固定双酶加入到磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)进行催化反应，黄芪甲苷和共固定双酶在缓冲液中的浓度分别为1mg/mL、100μg/mL，催化反应的pH值为7.5，温度为20℃，时间为60小时，转速为160r/min。催化反应结束后用磁铁去除共固定双酶，旋转蒸发仪下蒸发得到干燥的产品混合物，然后将干燥的产品混合物加入到适量的甲醇溶液中溶解，过滤后再旋干得到硅胶柱层析上样样品，对硅胶柱层析上样样品采用氯仿、甲醇和水的混合物进行洗脱，氯仿、甲醇和水的体积比为10:3:1，干法上样，并收集220mL的馏分后将其旋干并干燥称重，得到环黄芪醇产品。
实施例2得到的环黄芪醇产品中环黄芪醇的纯度可达78％。
实施例3
由浓度为0.2mol/L，体积为19.15mL的磷酸氢二钠和浓度为0.1mol/L，体积为0.85mL的柠檬酸混合制备磷酸盐缓冲溶液，将浓度为2.5mg/mL、体积为80μL的β-葡萄糖苷酶加入到1.6mL磷酸盐缓冲溶液(取部分配制好的磷酸盐缓冲溶液)中。再加入浓度为8mg/mL、体积为120μL的Fe3O4溶液进行混匀，然后加入浓度为250mM、体积为120μL的氯化铜溶液进行反应，室温下静置24小时后使用磁铁收集沉淀，将收集的沉淀与2.5mg/mL木糖苷酶，磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)进行反应，木糖苷酶和磷酸盐缓冲溶液的体积分别为80μL、2mL。室温下静置32小时后用磁铁收集沉淀，去离子水洗涤沉淀，重复进行多次，直至磁铁使溶液和沉淀完全分开，得到沉淀物共固定双酶。
将黄芪甲苷、共固定双酶加入到磷酸盐缓冲溶液(与上述磷酸盐缓冲溶液组成相同)中进行催化反应，黄芪甲苷和共固定双酶在缓冲液中的浓度分别为3mg/mL、200μg/mL，催化反应的pH值为7.5，温度为40℃，时间为40小时，转速为160r/min。催化反应结束后用磁铁去除共固定双酶，旋转蒸发仪下蒸发得到干燥的产品混合物，然后将干燥的产品混合物加入到适量的甲醇溶液中溶解，过滤后再旋干得到硅胶柱层析上样样品，对硅胶柱层析上样样品采用氯仿、甲醇和水的混合物进行洗脱，氯仿、甲醇和水的体积比为14:6:3，干法上样，并收集240mL的馏分后将其旋干并干燥称重，得到环黄芪醇产品。
实施例3得到的环黄芪醇产品中环黄芪醇的纯度可达80％。
实施例4
将浓度为1mg/mLβ-葡萄糖苷酶、1mg/mL木糖苷酶加入到磷酸盐缓冲溶液(与实施例1的组成相同)中得到混合溶液，β-葡萄糖苷酶、木糖苷酶、磷酸缓冲溶液的体积分别为60μL、60μL、1mL。混合溶液中加入浓度为5mg/mL、体积为100μL的Fe3O4溶液，然后加入浓度为180mM、体积为100μL的氯化铜溶液进行反应，室温下静置24小时后使用磁铁收集沉淀，去离子水洗涤沉淀，重复进行多次，直至磁铁使溶液和沉淀完全分开，得到沉淀物共固定双酶。
其他步骤与实施例1相同。
实施例4得到的环黄芪醇产品中环黄芪醇的纯度可达79％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种利用共固定双酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液、木糖苷酶进行反应，得到共固定双酶；
2)用共固定双酶和黄芪甲苷进行催化反应，得到环黄芪醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶的浓度为0.5～2.5mg/mL；所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液，pH值为7.0～8.0；Fe3O4溶液的浓度为3～8mg/mL；氯化铜溶液的浓度为150～250mM；木糖苷酶的浓度为0.5～2.5mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液、氯化铜溶液和木糖苷酶的体积比为4～8：60～180：8～12：8～12：4～8，所述反应的时间为20～50h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的反应为β-葡萄糖苷酶、部分磷酸盐缓冲溶液、Fe3O4溶液和氯化铜反应，得到磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶；
磁性纳米粒子固定β-葡萄糖苷酶与木糖苷酶、剩余的磷酸盐缓冲溶液反应，得到共固定双酶；
所述部分磷酸盐缓冲溶液和剩余的磷酸盐缓冲溶液的体积比为7～8:9～10。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的反应为β-葡萄糖苷酶、木糖苷酶、磷酸盐缓冲溶液和Fe3O4溶液反应后再与氯化铜溶液反应。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的进行催化反应的共固定双酶为沉淀物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)所述催化反应在磷酸盐缓冲溶液中进行，所述催化反应的温度为20～40℃，时间为36～60h，pH值为7.0～8.0。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述黄芪甲苷在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为1～3mg/mL，共固定双酶在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为50～200μg/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二钠和柠檬酸混合液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤2)所述催化反应结束后，对得到的产物混合物进行洗脱，所述洗脱用的洗脱剂为氯仿、甲醇和水的混合物。
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