CN113736842B - 一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，涉及生物酶催化技术领域，解决现有制备牛磺熊去氧胆酸的方法转化率低、成本高、反应时间长、不易进行工业化生产等技术问题，所述制备方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，所述混合酶溶液为含酶全细胞，本发明采用含酶全细胞不仅保证了酶的活性，还大大降低了酶的成本；引入微反应理念，反应时间缩短至30min，节约了时间；本发明所提供的制备方法精简了制备过程、对酶循环回收利用，节约了成本，也显著提高了制备效率，所制备得到的TUDCA产物的含量及纯度都较高，达到了98％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶催化技术领域，更具体的是涉及一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法技术领域。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，化学名称为3α，7β二羟基胆烷酰-N-牛磺酸，是由熊去氧胆酸(UDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。1902年自熊胆中发现，为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。
目前的TUDCA的工业化生产普遍为化学工艺，虽然近些年工艺不断优化改进，但总体来说化学法工艺复杂，收率低，成本高，环保和安全性差，这也是TUDCA价格居高不下的直接原因，这几年随着国内酶催化市场的普及，不少厂家及科研单位开始尝试酶催化生产TUDCA，但目前公开的文献和专利大部分仅是酶催化工艺的初步尝试，距离工业化生产还有不少距离。
发明专利CN107287272A公开了一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其分别构建含有7α-类固醇脱氢酶和7β-类固醇脱氢酶的表达载体或二者的共表达载体，在培养基中加入底物，发酵的同时进行转化，将牛磺鹅去氧胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，此种方法底物浓度低、转化率低，反应中间体牛磺7-酮石胆酸含量高，转化周期长，不易进行工业化生产；针对后期纯化的方法中，专利CN107287272A采用了传统的萃取工艺，无法去除脂溶性杂质，又采用减压浓缩去除有机溶剂，不利于放大生产。
发明专利CN102994604B公开了一种两步酶促法制备结合态熊去氧胆酸的方法，采用重组酶7α-HSDH和7β-HSDH对胆汁/粉中的结合态CDCA(包括TCDCA)进行原位催化生成结合态UDCA(包括TUDCA)，该方法没有使用辅酶再生系统，加入了大量的NADP+和NADPH，成本非常高，而且其实施例中转化率在55％～60％之间，转化率太低，后提取难度大，收率低，不具备放大生产条件；针对后期纯化的具体方法中，专利CN102994604B采用了多次超声处理，同时又使用了高速离心机以及旋蒸蒸发仪，涉及仪器设施昂贵，且操作复杂，不利于放大生产。
发明专利CN109402212A公开了一种生物转化制备牛磺熊去氧胆酸的方法及其应用，其第一步用的乳酸脱氢酶催化和α-酮酸生成乳酸，同时将NADPH转化成NADP+，第二步利用葡萄糖脱氢酶将葡萄糖转化成葡萄糖酸钠，同时将NADP+转化成NADPH，这两步生成大量的乳酸和葡萄糖酸钠，无法循环利用且不易回收，对后期污水处理产生很大压力，既不经济也不环保；针对后期纯化的具体方法中，专利CN109402212A使用了高速离心机以及旋蒸蒸发仪，涉及仪器设施昂贵，且操作复杂，不利于放大生产。
发明专利CN112391419A公开了一种牛磺熊去氧胆酸的生物催化制备方法，其利用有机溶剂参与两步酶法催化生成TUDCA，该方法使用酶的用量和超滤范畴的0.1μm膜过滤器大大增加生产成本，且实施例中反应时间超过了15h，生产效率较低；针对后期纯化的具体方法中，专利CN112391419A采用了离心机、真空浓缩有机溶剂与一般工艺雷同，又使用了0.1μm膜过滤器，按照可工业化理论，该膜系统已涉及超滤范畴，使用、维护成本较高。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决上述技术问题，本发明提供一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法。
本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，所述制备方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，所述混合酶溶液为含酶全细胞。所述混合酶溶液是通过分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及黄素还原酶的微生物发酵液，将混合的微生物发酵液通过30μm的陶瓷膜进行浓缩过滤得到。
进一步地，所述混合酶溶液与底物牛磺酸鹅去氧胆酸反应完成后再次采用30μm的陶瓷膜进行过滤浓缩，得到二次含酶全细胞的混合酶溶液和含TUDCA的水溶液，回收所得到的二次混合酶溶液又充当所使用的混合酶溶液返回至酶与牛磺酸鹅去氧胆酸的反应中。
进一步地，所述采用多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法具体步骤如下：
1)分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及黄素还原酶三种酶的微生物发酵液，发酵结束后分别检测发酵液中相应酶活力，并按照酶含量比例把三种发酵液进行混合，得到发酵液混液；
2)将步骤1)得到的发酵液混液通过陶瓷膜Ⅰ进行过滤浓缩，得到混合酶浓缩液，向得到的混合酶浓缩液中加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液后得到混合酶溶液，所述水溶液包括水，磷酸缓冲盐，葡萄糖，NAD+四种组分。
3)按照混合酶溶液体积下酶活力值对应的可投牛磺酸鹅去氧胆酸量，将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水按照比例进行混合配制得到牛磺酸鹅去氧胆酸溶液，同时用氨水将牛磺酸鹅去氧胆酸溶液调节至pH＝8，将pH＝8的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与步骤2)得到的混合酶溶液泵入反应器中进行反应。
4)步骤3)中的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液反应完毕后，将反应液导入陶瓷膜Ⅱ中进行浓缩过滤后分别得到二次混合酶浓缩液及含TUDCA的水溶液，此时步骤2)中的陶瓷膜Ⅰ仍然在浓缩新鲜的混合酶溶液。
5)向步骤4)得到的二次混合酶浓缩液中加入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又返回至牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的反应中继续提供酶与底物进行反应；
6)将步骤4)得到的含TUDCA的水溶液导入非极性树脂的树脂柱进行吸附，含TUDCA的转化产物吸附在树脂柱上，向完成吸附后的树脂柱中通入混合解析剂对含TUDCA的转化产物进行解析，得到含TUDCA的解析液；
7)用5％的盐酸溶液调节步骤6)中得到的含TUDCA的解析液pH至4～5，调节完毕后，搅拌养晶2h，后采用真空抽滤或者3000rpm离心处理，得到TUDCA湿成品及滤液，将TUDCA湿成品进行干燥即得到TUDCA含量大于98％的成品。
优选地，所述采用多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法还包括：
8)向步骤7)得到的滤液中加入氢氧化钠固体，使该滤液pH恢复至7.0～8.0，并将该滤液回流至步骤7)中的混合解析剂中，该操作实现了对混合解析剂进行重复利用。
优选地，步骤1)中所述酶含量比例为100：80：1。
优选地，步骤2)中所使用的水溶液的组成为：水：磷酸缓冲盐：葡萄糖：NAD+＝100：0.3：4：0.01，所使用的磷酸缓冲盐为钠盐或者钾盐。
优选地，步骤3)中所述将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水进行混合的比例为1：4：0.1。
优选地，步骤3)中所述牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液在反应器中的反应时间为30min。所述牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液泵入反应器中的速率控制为30min/次。
优选地，所述步骤4)中牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的反应时间为30min。
优选地，步骤6)中所述混合解析剂具体成分为甲醇：丙酮：乙腈：水：氯化钠＝10：3：1：3：0.1～0.5，pH＝7.0～8.0。
优选地，步骤7)中所述调节过程为30min。
进一步地，步骤6)中经吸附之后的清液回流进入所述步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液体系中，如此实现该水溶液的循环使用。
进一步地，所述步骤6)中所用到的树脂柱的吸附与解析为连贯操作，对转化产物的吸附与解析是一个循环操作过程，其具体循环过程如下：步骤4)中经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液经过步骤6)中树脂柱Ⅰ进行吸附，吸附完成后，对吸附有转化产物TUDCA的树脂柱Ⅰ进行解析操作，此时，循环系统中再次经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液则经过树脂柱Ⅱ进行吸附操作，此时树脂柱Ⅰ进行解析操作，树脂柱Ⅱ则同时进行吸附操作，当树脂柱Ⅰ完成解析、树脂柱Ⅱ完成吸附操作之后，则经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液再次经过树脂柱Ⅰ进行吸附，此时对树脂柱Ⅱ进行解析操作，如此往复循环，通过树脂柱Ⅰ、第二个树脂交替完成含TUDCA的水溶液的吸附及含目标转化产物TUDCA的解析的循环、连贯操作。所述树脂柱Ⅰ、树脂柱Ⅱ在制备牛磺熊去氧胆酸的过程中是同时交替进行吸附、解析操作的。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明所提供的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，采用含酶全细胞作为所需酶系统，通过发酵生产所需酶系统，所需酶均属于胞内酶，通过30μm陶瓷膜过滤实现多种混合全细胞的分离，采用含酶全细胞作为所需酶系统直接与底物TCDCA进行反应，不仅保证了酶的活性，还大大降低了酶的成本，其次，该发明引入微反应理念，实现反应时间缩短至30min，结合持续加入底物，最终大大提高了生产效率；
(2)在本发明所提供的制备方法中，相比现有采用破碎细胞获取酶的方式，采用含酶全细胞进行反应降低了纯化的费用以及对酶的损伤，单纯的采用酶进行反应，对反应环境要求会更高(如PH、温度等)，否则会导致酶失活，而本发明采用的是含有相应酶的全细胞，对反应环境的稳定性要求更低，细胞还可以进行自我调节，范围更广，且现有技术中大多数都没有对反应中的酶进行回收，因为要保持酶的活性要求很高，回收难度也比较大，这样也会导致整个成本加大，而本发明中采用的是全细胞，且在制备过程中也实现了对反应过程中的酶进行了回收利用，因为含酶全细胞对其保持活性的环境要求没有那么苛刻；
(3)本发明所提供的多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，采用30μm陶瓷膜过滤，既能回收含酶全细胞，又能解除后续反应底物抑制，其次采用了离子交换树脂吸附将目标物吸附，同时其它原反应体系中的小分子物质又回到了反应体系而进行下一次辅助反应，第三使用混合溶剂解析，同时将树脂恢复可吸附目标物的状态，最后利用目标物在混合体系中的等电点，将目标物析晶出混合溶液，简易抽滤后，进行干燥得到含量为98％、纯度为98％的TUDCA目标产物；
(4)本发明所提供的多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，整个过程是一个循环体系，在该循环反应体系中，30μm的陶瓷膜Ⅰ一直在对新鲜的混合发酵液进行含酶全细胞的过滤与分离，底物与酶的反应也是一个一直在持续不断进行的过程，每隔30min泵入一次牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和混合酶溶液，相应地，每隔30min导出一次牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和混合酶溶液进行反应后的反应液；反应液经过30μm的陶瓷膜Ⅱ过滤浓缩之后，就分离得到了二次混合酶浓缩液和含TUDCA的水溶液，二次混合酶溶液又返回至牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和酶的反应过程中，该步骤对整个反应过程的含酶全细胞实现了回收利用，含TUDCA的水溶液经过树脂柱进行吸附、解析，经吸附之后的清液回流进入水溶液体系，该步骤实现了该水溶液的循环使用，所以，本发明所提供的制备牛磺熊去氧胆酸的方法实现了酶及水溶液体系的循环利用，降低了整个制备过程的成本，节约了时间，精简了制备过程，也显著提高了制备效率，所制备得到的TUDCA产物的含量及纯度都较高。
附图说明
图1是本发明一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法的制备流程图；
图2是本发明利用多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的酶催化反应示意图；
图3是本发明实施例2中使用的反应底物牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)的高效液相色谱图；
图4为本发明实施例2制备所得到的反应液样品的高效液相色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，在所述方法中所使用的产7α-HSDH酶，7β-HSDH酶、黄素还原酶三种酶的发酵菌种及工艺均来源于申请人合作单位中国科学院天津工业生物技术研究所，具体内容参照专利CN112852911A、CN110591990A，本发明所使用的分别产7α-HSDH酶，7β-HSDH酶、黄素还原酶三种酶的对应的三种工程发酵菌种及相应的工艺均属于现有技术，也是目前生物领域比较成熟的技术，所以在实施例中不予列举。
本发明提供了一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，该制备方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，混合酶溶液为含酶全细胞。所述混合酶溶液是通过分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及黄素还原酶的微生物发酵液，将混合的微生物发酵液通过30μm的陶瓷膜进行浓缩过滤得到。所述混合酶溶液与底物牛磺酸鹅去氧胆酸反应完成后再次采用30μm的陶瓷膜进行过滤浓缩，得到二次含酶全细胞的混合酶溶液和含TUDCA的水溶液，回收所得到的二次混合酶溶液又充当所使用的混合酶溶液返回至酶与牛磺酸鹅去氧胆酸的反应中。
实施例1
一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，混合酶溶液为含酶全细胞。该方法具体步骤如下：
1)分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及黄素还原酶的三种微生物发酵液，发酵结束后分别检测酶活力，并按照酶含量比例100：80：1进行混合，得到发酵液混液；
2)将步骤1)得到发酵液混液通过30μm的陶瓷膜Ⅰ进行过滤浓缩，得到浓缩倍数为4倍的混合酶浓缩液，向得到的混合酶浓缩液中加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液后得到混合酶溶液，所使用的水溶液的组成为：水：磷酸缓冲盐：葡萄糖：NAD+为100：0.3：4：0.01，所使用的磷酸缓冲盐为钠盐或者钾盐。
2)按照混合酶溶液体积下酶活力值对应的可投牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)量(见表2)，将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水按照比例1：4：0.1进行混合配制得到牛磺酸鹅去氧胆酸溶液，同时用氨水将牛磺酸鹅去氧胆酸溶液调节至pH＝8，将PH＝8的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与步骤1)得到的混合酶溶液以一定的速率泵入反应器中进行反应，TCDCA溶液的速率体现在反应器可停留时间为30min。
3)步骤2)中的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液在微反应器中反应完毕后，反应时间为30min，将反应液导入陶瓷膜Ⅱ中，此时陶瓷膜Ⅰ仍然在浓缩新鲜的混合酶溶液，反应液导入陶瓷膜Ⅱ中进行浓缩过滤后得到二次混合酶浓缩液，并得到含TUDCA的水溶液。
4)向步骤3)得到的二次混合酶浓缩液中加入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又泵送至微反应器中继续进行酶与底物的反应；将得到的含TUDCA的水溶液导入含蓝晓科技非极性树脂的树脂柱Ⅰ或树脂柱Ⅱ中进行吸附，含TUDCA的水溶液在树脂柱中的吸附方向是从下向上进行吸附，转化的目标产物吸附在树脂柱上，经吸附之后的清液回流进入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液体系，如此实现该水溶液循环使用。
5)向步骤4)中完成吸附后的树脂柱Ⅱ或树脂柱Ⅰ中通入混合解析剂对目标产物TUDCA进行解析，得到含TUDCA的解析液，混合解析剂具体成分为甲醇：丙酮：乙腈：水：氯化钠＝10：3：1：3：0.1～0.5，pH＝7.0～8.0。
具体说明，步骤4)和步骤5)中所用到的树脂柱Ⅰ、树脂柱Ⅱ为连贯作业，形成目标产物的吸附与解析的循环操作，具体如：经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液经过树脂柱Ⅰ进行吸附，吸附完成后，对吸附有目标产物的树脂柱Ⅰ进行解析操作，此时，循环系统中再次经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液则经过树脂柱Ⅱ进行吸附操作，此时树脂柱Ⅰ进行解析操作，树脂柱Ⅱ进行吸附操作，当树脂柱Ⅰ完成解析、树脂柱Ⅱ完成吸附操作之后，则经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液再次经过树脂柱Ⅰ进行吸附，此时对树脂柱Ⅱ进行解析操作，如此往复循环，通过树脂柱Ⅰ、树脂柱Ⅱ完成含TUDCA的水溶液的吸附及含目标转化物TUDCA的解析的循环、连贯操作。
6)用5％的盐酸溶液匀速、缓慢地在搪瓷反应釜中常温、低速搅拌下调节步骤5)中得到的含TUDCA解析液的pH至4～5，该过程为30min，调节过程中可明显发现有白色晶体析出，调节完毕后，搅拌养晶2h，后真空抽滤或者3000rpm离心，得TUDCA湿成品及滤液，将TUDCA湿成品进行干燥即得到TUDCA含量大于98％的成品。
7)向步骤6)中得到的滤液中加入氢氧化钠固体，使该滤液pH恢复至7.0～8.0，并将该滤液回流进入步骤5)中的混合解析剂，如此对混合解析剂进行重复利用。
实施例2
该实施例结合附图1及附图2，进一步说明本发明提供的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法的实施方式。
如图1所示，一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法具体实施方式如下：
1)分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)、7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)及黄素还原酶的三种微生物发酵液，发酵结束后分别检测酶活力，并按照7α-HSDH：7β-HSDH：黄素还原酶三种酶含量比例100：80：1进行混合，得到三种发酵液混液；
2)将步骤1)得到发酵液混液通过30μm的陶瓷膜Ⅰ进行过滤浓缩，得到浓缩倍数为4倍的混合酶浓缩液，向得到的混合酶浓缩液中加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液后得到混合酶溶液，所使用的水溶液的组成为：水：磷酸缓冲盐：葡萄糖：NAD+＝100：0.3：4：0.01，所使用的磷酸缓冲盐为钠盐或者钾盐。
3)如表2所示，按照混合酶溶液体积下酶活力值对应的可投牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)量，将TCDCA、水及双氧水按照比例1：4：0.1进行混合配制得到牛磺酸鹅去氧胆酸溶液，同时用氨水将牛磺酸鹅去氧胆酸溶液调节至pH＝8，将PH＝8的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与步骤1)得到的混合酶溶液以一定的速率泵送入微反应器中进行反应，牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的在微反应器中单次反应的时间为30min，在实际的工艺制备过程中，通过输送泵控制牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的速率，速率体现在微反应器种底物可停留时间为30min，速率为30min/次。
4)步骤3)中的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液在微反应器中反应30min后，将反应液导入30μm的陶瓷膜Ⅱ中，此时陶瓷膜Ⅰ仍然在浓缩新鲜的混合酶溶液，反应液导入陶瓷膜Ⅱ中进行浓缩过滤后得到二次混合酶浓缩液及含TUDCA的水溶液，二次混合酶浓缩液中加入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又泵送至微反应器中继续进行酶与底物的反应；将得到的含TUDCA的水溶液导入含蓝晓科技非极性树脂的树脂柱Ⅰ或树脂柱Ⅱ中进行吸附，含TUDCA的水溶液在树脂柱中的吸附方向是从下向上进行吸附含TUDCA的转化产物吸附在树脂柱上，经吸附之后的清液回流进入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液体系，如此实现该水溶液循环使用。
5)向步骤4)中完成吸附后的树脂柱Ⅱ或树脂柱Ⅰ中通入混合解析剂对目标产物TUDCA进行解析，得到含TUDCA的解析液，混合解析剂具体成分为甲醇：丙酮：乙腈：水：氯化钠＝10：3：1：3：0.1～0.5，pH＝7.0～8.0。
具体说明，步骤4)和步骤5)中所用到的树脂柱Ⅰ、树脂柱Ⅱ为连贯、交替作业，形成转化产物的吸附与解析的循环连续操作，具体循环过程如下：因反应液每隔30min就会导出一次，每次导出的反应液都会经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤浓缩，经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液经过树脂柱Ⅰ进行吸附，吸附完成后，对吸附有目标产物的树脂柱Ⅰ进行解析操作，此时，从微反应器中导出的反应液经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液则经过树脂柱Ⅱ进行吸附操作，此时树脂柱Ⅰ进行解析操作，脂柱Ⅱ进行吸附操作，当树脂柱Ⅰ完成解析、树脂柱Ⅱ完成吸附操作之后，则经过陶瓷膜Ⅱ进行过滤得到的含TUDCA的水溶液再次经过树脂柱Ⅰ进行吸附，此时对树脂柱Ⅱ进行解析操作，如此往复循环，通过树脂柱Ⅰ、树脂柱Ⅱ完成含TUDCA的水溶液的吸附及含目标转化物TUDCA的解析的循环、连贯操作。
6)用5％的盐酸溶液匀速、缓慢地在搪瓷反应釜中常温、低速搅拌下调节步骤5)中得到的含TUDCA解析液的pH至4～5，该过程为30min，调节过程中可明显发现有白色晶体析出，调节完毕后，搅拌养晶2h，后真空抽滤或者3000rpm离心，得TUDCA湿成品及滤液，将TUDCA湿成品进行干燥即得到TUDCA含量大于98％的成品。
7)向步骤6)中得到的滤液中加入氢氧化钠固体，使该滤液pH恢复至7.0～8.0，并将该滤液回流进入步骤5)中的混合解析剂，如此对混合解析剂进行重复利用。
上述步骤2)及步骤3)属于底物与酶的前序反应，该过程一直在持续不断的进行，每隔30min泵入一次牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和混合酶溶液，相应地，每隔30min导出一次牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和混合酶溶液进行反应后的反应液；反应液经过30μm的陶瓷膜Ⅱ过滤浓缩之后，就分离成二次混合酶浓缩液和含TUDCA的水溶液，二次混合酶浓缩液加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又返回至牛磺酸鹅去氧胆酸溶液和酶的反应过程中，该步骤对整个反应过程的含酶全细胞实现了回收利用，含TUDCA的水溶液经过树脂柱进行吸附、解析，经吸附之后的清液回流进入步骤1)中所加入的3倍体积的pH＝7.5的水溶液体系，该步骤的设计实现了该水溶液的循环使用。
在实际工艺制备运用中，依据表1(混合酶酶活力通过陶瓷膜收率与对应可转化TUDCA表)、表2(混合酶酶活力30min可转化TUDCA与TUDCA底物抑制)对应数据重复步骤2)至步骤7)，微反应器总运行8次总耗时4h，共计投料7次，对应1L混合酶液共计可制备TUDCA为1275g，选择30μm的陶瓷膜也是经过多次试验得出的制备TUDCA效率最高的选择。
对于说明书附图1中的箭头指向，即为利用本发明所提供的方法制备TUDCA的工艺流程走向。
表1混合酶酶活力通过陶瓷膜收率与对应可转化TUDCA量
| 循环次数 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 收率％ | 95 | 93 | 90 | 85 | 80 | 74 | 66 | 57 |
| 酶活力100u/ml | 95 | 88 | 79 | 67 | 54 | 40 | 26 | 15 |
| 取可转化TUDCA量g/l | 275 | 275 | 235 | 200 | 140 | 75 | 75 | 0 |
表2混合酶酶活力30min可转化TUDCA与TCDCA底物抑制量
| 酶活力100u/ml | 100 | 85 | 70 | 55 | 40 | 25 |
| 30min可转化TUDCA量g/l | 300 | 275 | 235 | 200 | 140 | 75 |
| TCDCA底物抑制量g/l | 400 | 380 | 350 | 330 | 310 | 300 |
试验例3
为了进一步验证本发明所提供的本发明所提供的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法的可行性及有效性，该试验例将本发明所提供的多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法(实施例2)与现有技术CN107287272A、CN102994604B、CN109402212A、CN112391419A进行了对比，具体如下：
表3牛磺熊去氧胆酸现有催化技术与本发明的数据对比
表4酶法牛磺熊去氧胆酸现有纯化技术与本发明的数据对比
从表3、表4中可以看出，本发明所提供的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法与现有技术CN107287272A、CN102994604B、CN109402212A、CN112391419A相比较，本发明所提供的方法反应时间更短，只需要30min，TCDCA/酶之间的用量也远超于现有技术，较大的节约了成本，提高了反应效率；从表中可以看出，本发明所提供的方法中对产物的纯化只需要三步，从设备的选用上成本也更低，本发明采用的是30μm的陶瓷膜，且通过本方法制备所得到的含量和收率都远高于所比较的现有技术。
该试验例进一步将本发明实施例2中反应底物牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)与反应液样品进行了HPLC检测分析；
HPLC检测分析方法如下：取反应液样品或牛磺酸鹅去氧胆酸60mg，于10ml容量瓶，加2ml甲醇溶解，再加流动相稀释定容至刻度，用0.22μm滤膜过滤。色谱柱MG-II C18(5μm，4.6mm×250mm)，使用示差检测器对转化产物进行分析，流速为0.8mL/min，进样量为75μL，柱温40℃，RID温度35℃，流动相为乙腈：磷酸二氢钠(PH3.0)：甲醇＝30：37：40，进行洗脱，运行时间70(min)。HPLC色谱图的结果如附图3、附图4所示，色谱图的具体数据如表5、表6所示。
表5牛磺酸鹅去氧胆酸进行HPLC检测分析的色谱图对应的峰表
表6反应液样品进行HPLC检测分析的色谱图对应的峰表
结合附图3及表5，TCDCA的检测过程中出现了3个峰，TCDCA对应峰3，峰3的峰面积为98.9174％；
结合附图4及表6，反应液样品检测过程中出现了4个峰，反应液样品中TUDCA对应峰2，其峰面积为99.5886％，通过本发明所提供的制备方法制备得到的反应液样品中TUDCA含量大于98％，高效液相色谱法检测纯度大于98％，所得到的目标产物TUDCA的纯度较高。
Claims (6)
1.一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述方法以牛磺酸鹅去氧胆酸为底物，采用混合酶溶液作为反应过程中所需要的酶系统直接进行反应，制备牛磺熊去氧胆酸，所述混合酶溶液为含酶全细胞，所述混合酶溶液是通过分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶、7β-羟基甾体脱氢酶及黄素还原酶的微生物发酵液，将混合的微生物发酵液通过30μm的陶瓷膜进行浓缩过滤得到；
所述方法包括如下步骤：
1)分别培养产7α-羟基甾体脱氢酶、7β-羟基甾体脱氢酶及黄素还原酶三种酶的微生物发酵液，发酵结束后分别检测发酵液中相应酶活力，并按照酶含量比例把三种发酵液进行混合，得到发酵液混液；
2)将步骤1)得到的发酵液混液通过陶瓷膜I进行过滤浓缩，得到混合酶浓缩液，向得到的混合酶浓缩液中加入3倍体积的pH＝7.5的水溶液后得到混合酶溶液，所述水溶液包括水、磷酸缓冲盐、葡萄糖和NAD+四种组分；
3)按照混合酶溶液体积下酶活力值对应的可投牛磺酸鹅去氧胆酸量，将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水按照比例进行混合配制得到牛磺酸鹅去氧胆酸溶液，同时用氨水将牛磺酸鹅去氧胆酸溶液调节至pH＝8，将pH＝8的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与步骤2)得到的混合酶溶液泵入反应器中进行反应，反应时间为30min，所述牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液泵入反应器中的速率控制为30min/次；
4)步骤3)中的牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液反应完毕后，将反应液导入陶瓷膜II中进行浓缩过滤后分别得到二次混合酶浓缩液及含TUDCA的水溶液，此时步骤2)中的陶瓷膜I仍然在浓缩新鲜的混合酶溶液；
5)向步骤4)得到的二次混合酶浓缩液中加入步骤2)中所加入的3倍体积的pH=7.5的水溶液之后得到二次混合酶溶液，二次混合酶溶液又返回至牛磺酸鹅去氧胆酸溶液与混合酶溶液的反应中继续提供酶与底物进行反应；
6)将步骤4)得到的含TUDCA的水溶液导入非极性树脂的树脂柱进行吸附，含TUDCA的转化产物吸附在树脂柱上，向完成吸附后的树脂柱中通入混合解析剂对含TUDCA的转化产物进行解析，得到含TUDCA的解析液，经吸附之后的清液回流进入所述步骤1)中所加入的3倍体积的pH=7.5的水溶液体系中，如此实现该水溶液的循环使用；
7)用5％的盐酸溶液调节步骤6)中得到的含TUDCA解析液的pH至4~5，调节过程时间为25~35min，调节完毕后，搅拌养晶2h，后采用真空抽滤或者3000rpm离心处理，得到TUDCA湿成品及滤液，将TUDCA湿成品进行干燥即得到TUDCA成品；
步骤1)中所述酶含量比例为100：80：1；
步骤3)中所述将牛磺酸鹅去氧胆酸、水及双氧水进行混合的比例为1：4：0.1；
所述反应器为微反应器。
2.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述混合酶溶液与底物牛磺酸鹅去氧胆酸反应完成后再次采用30μm的陶瓷膜进行过滤浓缩，得到二次含酶全细胞的混合酶溶液和含TUDCA的水溶液，回收所得到的二次混合酶溶液又充当所使用的混合酶溶液返回至酶与牛磺酸鹅去氧胆酸的反应中。
3.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，所述多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法还包括：步骤8)向步骤7)得到的所述滤液中加入氢氧化钠固体，使所述滤液pH恢复至7 .0~8 .0，并将该滤液回流至步骤7)中的混合解析剂中，实现对混合解析剂进行重复利用。
4.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤2)中所述水溶液的组成及混合比例为：水：磷酸缓冲盐：葡萄糖：NAD+为100：0.3：4：0.01，所使用的磷酸缓冲盐为钠盐或者钾盐。
5.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤6)中所述混合解析剂具体成分为甲醇：丙酮：乙腈：水：氯化钠为10：3：1：3：0 .1~0 .5，pH=7.0~8.0。
6.根据权利要求1所述的一种多细胞高效制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，步骤6)中所用到的树脂柱的吸附与解析为连贯操作，对转化产物的吸附与解析是一个循环操作过程，其具体循环过程如下：步骤4)中经过陶瓷膜II进行过滤得到的含TUDCA的水溶液经过步骤6)中树脂柱I进行吸附，吸附完成后，对吸附有转化产物TUDCA的树脂柱I进行解析操作，此时，循环系统中再次经过陶瓷膜II进行过滤得到的含TUDCA的水溶液则经过树脂柱II进行吸附操作，此时树脂柱I进行解析操作，树脂柱II则同时进行吸附操作，当树脂柱I完成解析、树脂柱II完成吸附操作之后，则经过陶瓷膜II进行过滤得到的含TUDCA的水溶液再次经过树脂柱I进行吸附，此时对树脂柱II进行解析操作，如此往复循环，通过树脂柱I、第二个树脂交替完成含TUDCA的水溶液的吸附及含目标转化产物TUDCA的解析的循环、连贯操作，所述树脂柱I、树脂柱II在制备牛磺熊去氧胆酸的过程中是同时交替进行吸附、解析操作的。
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