CN106520855A - 羰基还原酶生物催化生产立体互补的n‑杂环醇类化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用羰基还原酶生物催化N‑杂环酮类化合物制备立体互补的手性N‑杂环醇类化合物的方法，以羰基还原酶RE‑ADH为催化剂，得到(S)构型的产物；以羰基还原酶ChKRED20为催化剂，得到(R)构型的产物。与现有技术相比，本发明所采用的方法具有催化剂易制备、反应条件温和、反应体系简单、无副反应、得到的产物光学纯度高的优点，具有极大地工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于酶与生物催化领域，具体涉及利用羰基还原酶生物催化生产立体互补的手性N-杂环醇类化合物的方法。
背景技术
N-杂环醇类衍生物，尤其是手性N-杂环醇类衍生物是一类在医药领域具有重要研究价值的化合物，作为药物合成的重要中间体，被广泛的应用于镇痛、抗精神病、抗肿瘤、抗心血管病等药物的合成。
目前，制备手性N-杂环醇类衍生物的方法主要有通过手性源环化合成法、化学拆分法和生物转化法。
手性源环化合成法，如下所示：
主要以天然的手性化合物为起始原料，经过多步的环化反应得到手性纯的3-羟基哌啶衍生物。该方法存在反应步骤繁琐，终产物的收率低，产物的光学纯度较低、生产成本较高的缺点。
化学拆分法，如下所示：
主要是将外消旋的3-羟基哌啶在手性酸的作用下成盐析出得到手性的盐，然后游离上保护基得到手性的N-取代-3羟基哌啶，该方法存在拆分收率低、操作繁琐、生产成本较高、原子经济性低的缺点。
生物转化法，如下所示：
利用磨碎的野生胡萝卜的根为生物催化剂，将不同取代的N-杂环酮类化合物还原得到(S)-N-杂环醇类化合物，该方法存在催化剂的需求量大、产物的光学纯度不够高的问题，反应效率低，生产成本高，很难被应用于工业化生产中。
发明内容
为了克服现有技术所存在的上述缺陷，本发明旨在提供一种以羰基还原酶为生物催化剂制备立体互补的手性N-杂环醇类化合物的方法，以满足工业化生产要求。具体地，本发明所用的底物为如下结构通式(I)，利用不同的高效高选择性羰基还原酶为生物催化剂，经不对称还原获得相应(S)或(R)构型手性醇。
生物催化过程可表示如下：
其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；
m在每次出现时独立地为1或2；
R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等；
进一步说，反应是将N-杂环酮类化合物用(R)-羰基还原酶还原为(R)-N-杂环醇类化合物，或用(S)-羰基还原酶还原为(S)-N-杂环醇类化合物。
进一步说，所述的(R)-羰基还原酶为ChKRED20；(S)-羰基还原酶还原为RE-ADH；
所述的羰基还原酶是由基因工程大肠杆菌通过发酵表达得到。
进一步说，所述的羰基还原酶推荐以酶粉形式或含有羰基还原酶的细胞破碎液的形式加入。
根据本领域的公共知识，本领域技术人员可通过以下方式获得生物催化剂。首先，羰基还原酶的信息(基因序列和氨基酸序列)可通过该酶的NCBI登录号查询获知，然后经基因合成公司合成获得，并以常规技术手段构建大肠杆菌表达体系，经过量表达获得上述酶作为生物催化剂。
RE-ADH在NCBI数据库的登录号为：AY161280；ChKRED20在NCBI数据库的登录号为：KC342020。
本发明的生物催化体系及反应条件：
(1)生物催化剂为羰基还原酶RE-ADH纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：
磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～7)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NADH；
或者，生物催化体系为：
磷酸盐缓冲(0.1M，pH6～7)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NAD+，异丙醇。
上述反应体系中，羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)。
优选的，底物终浓度为1～120g/l；NAD+浓度0.1～1g/l；异丙醇的浓度为5％(v/v)；NADH的摩尔浓度大于等于底物的摩尔浓度。
生物催化条件：温度20～50℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。
(2)生物催化剂为羰基还原酶ChKRED20纯酶或者粗酶时，生物催化体系为：
磷酸盐缓冲液(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物和还原型辅酶NADH；
或者，生物催化体系为：
磷酸盐缓冲(0.1M，pH6～8)、羰基还原酶、结构通式(I)底物、氧化型辅酶NAD+，异丙醇。
上述反应体系中，羰基还原酶的酶量可根据底物浓度调整，较优的浓度为纯酶0.1～10g/l，粗酶1～20g/l(以总蛋白量计)。
优选的，底物终浓度为1～40g/l；NAD+浓度0.1～1g/l；异丙醇的浓度为20～50％(v/v)；NADH的摩尔浓度大于等于底物的摩尔浓度。
生物催化条件：温度20～40℃，转速50～220rpm，转化时间为1～24h。
本发明的有益效果：
本发明公开了以羰基还原酶生物催化方法获得立体互补手性N-杂环醇类化合物，该方法的催化剂易制备，水相催化，反应条件温和，反应体系简单，无副反应，ee值绝大多数大于99％，为手性N-杂环醇类化合物生产提供了可选择的环境友好的生物催化方法，具有极大地工业应用价值。
本发明所获得的手性N-杂环醇类化合物可作为很多药物合成中的中间体。以生产5b产物为例(见实施例1和实施例27)，RE-ADH催化底物5a时，底物浓度为120g/l时,转化率为97.4％，ee值>99％，具有很强的工业应用潜力。
附图说明
图1为本发明涉及的生物催化过程示意图。其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；m在每次出现时独立地为1或2；R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等；ChKRED20为催化剂时，得到(R)-构型醇；RE-ADH为催化剂时，得到(S)-构型醇。
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发
明的限制。
实施例1：羰基还原酶的筛选
以本领域熟知的方法，将羰基还原酶基因连入pET28a(+)载体，转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，6,000rpm，4℃离心10min获得重组菌湿菌体,重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液，作为生物催化剂。筛选时，生物催化及体系为：磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)、羰基还原酶粗酶液10g/l、底物1g/l、NAD+浓度0.6g/l和异丙醇5％(v/v)。反应时间为24h，反应温度30℃，转速200rpm。
同时，将没有连入羰基还原酶基因的pET28(+)空载体同样转入大肠杆菌BL21-DE3中异源表达，重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 8.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清为空白对照转化各类底物。以下展示的筛选结果，空白对照均不能转化底物。
反应结束后，以等体积甲基叔丁基醚萃取3次，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥，而后减压旋蒸除去溶剂，加入异丙醇(HPLC级)溶解样品，高速离心后HPLC测定样品的转化率及产物ee值。(1)羰基还原酶催化还原的底物及HPLC检测条件，见表1：
表1底物及测定条件
(2)羰基还原酶催化各底物的反应转化率和产物ee值，见表2。其中，RE-ADH催化后得到(S)构型产物；ChKRED20催化后得到(R)构型产物。以下实施例的相应产物构型均相同，不再赘述。
表2两个酶对不同底物的转化率和ee值
实施例2：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物1a
取新鲜培养的羰基还原酶RE-ADH重组菌湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。
磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，羰基还原酶RE-ADH浓度10g/l(粗酶液)，底物1a浓度40g/l，异丙醇5％(v/v)，NAD+浓度0.6g/l，50℃，转化时间2h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明2h内40g/l底物就能转化完全，得到相应(S)构型醇，且产物的ee值大于99.9％。
实施例3：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物1a
取新鲜培养的羰基还原酶ChKRED20重组菌湿菌体重悬于磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，以均质机破碎细胞，13,000rpm，4℃离心20min，所得上清即为粗酶液。
磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0)，羰基还原酶ChKRED20浓度10g/l(粗酶液)，底物1a浓度40g/l，异丙醇40％(v/v)，NAD+浓度0.6g/l，40℃，转化时间10h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明10h内40g/l底物就能转化完全，得到相应(R)构型醇，且产物的ee值大于99.9％。
实施例4：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物2a
反应体系与实施例2相同，转化时间21h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明21h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例5：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物2a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例6：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物3a
反应体系与实施例2相同，转化时间21h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明21h内，40g/l底物的转化率为91.2％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例7：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物3a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为93.7％，产物的ee值为98％。
实施例8：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物4a
反应体系与实施例2相同，转化时间10h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明10h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例9：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物4a
反应体系与实施例3相同，转化时间10h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明10h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例10：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物5a
反应体系与实施例2相同，转化时间0.5h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明0.5h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例11：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物5a
反应体系与实施例3相同，转化时间6h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明6h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例12：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物6a
反应体系与实施例2相同，转化时间4h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明4h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例13：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物6a
反应体系与实施例3相同，转化时间14h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明14h内40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例14：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物7a
反应体系与实施例2相同，转化时间1.5h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明1.5h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例15：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物7a
反应体系与实施例3相同，转化时间10h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明10h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例16：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物8a
反应体系与实施例2相同，转化时间21h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明21h内，40g/l底物的转化率为87.3％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例17：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物8a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为84.5％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例18：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物9a
反应体系与实施例2相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为51.0％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例19：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物9a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为49.8％，产物的ee值为88％。
实施例20：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物10a
反应体系与实施例2相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为94.4％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例21：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物10a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为56.7％，产物的ee值为95％。
实施例22：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物11a
反应体系与实施例2相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为78.1％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例23：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物11a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物的转化率为45.6％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例24：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化40g/l底物12a
反应体系与实施例2相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例25：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化40g/l底物12a
反应体系与实施例3相同，转化时间24h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明24h内，40g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例26：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化80g/l底物5a
反应体系与实施例2相同，转化时间5h，反应过程中每一小时加入5％(v/v)的异丙醇。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明5h内，80g/l底物可实现完全转化，且产物的ee值大于99.9％。
实施例27：羰基还原酶RE-ADH粗酶液催化120g/l底物5a
反应体系与实施例2相同，转化时间7h，反应过程中每一小时加入5％(v/v)的异丙醇。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明7h内，120g/l底物的转化率为97.4％，且产物的ee值大于99.9％。
实施例28：羰基还原酶ChKRED20粗酶液催化80g/l底物5a
反应体系与实施例3相同，转化时间20h。等体积甲基叔丁基醚萃取终止反应,样品处理方法及检测方法与实施例1相同。结果表明20h内，80g/l底物的转化率为89.1％，且产物的ee值大于99.9％。
Claims (2)
1.一种羰基还原酶生物催化生产立体互补的N-杂环醇类化合物的方法，其特征为：以式(I)所示的N-杂环酮类化合物为底物，以羰基还原酶ChKRED20或者RE-ADH为生物催化剂，经生物催化获得手性醇。
生物催化过程可表示如下：
其中，n在每次出现时独立地为1、2或3；
m在每次出现时独立地为1或2；
R在每次出现时独立地选自叔丁氧羰基，苄基，苄氧羰基，或乙基氧羰基等。
2.权利要求1所述的羰基还原酶，其特征是羰基还原酶为ChKRED20时，产物的构型为(R)-醇；羰基还原酶为RE-ADH时，产物的构型为(S)-醇。
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