CN104630125B - 工程菌及其在制备(3r, 5s)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种工程菌及其在制备(3R，5S)‑6‑氯‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为如SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因。本发明将SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达羰基还原酶Dkr，通过该酶的催化作用可实现将(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯不对称还原成(3R，5S)‑6‑氯‑3，5‑二羟基己酸叔丁酯，该反应条件温和，操作简便，采用异丙醇辅酶再生的方式，使反应过程中无需进行pH的实时调节，不仅避免了化学法存在的反应条件苛刻、催化剂制备复杂等问题，还对生物法进行了一定的改进，具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种工程菌及其在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
背景技术
他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药物，是目前临床上应用广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3,5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高血脂症和冠心病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R,5S/R)-双羟基己酸酯组成。
其中，阿托伐他汀(Atorvastatin)是全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀的关键中间体，在其制备方法中，利用还原酶从(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯一步还原的方法，以其高效率、高选择性的特点成为化学和制药工业界重点研究的对象。
目前，报道的制备(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法分为两种，一种为化学还原法，在现有技术中，按化学还原剂的不同主要有两种方法，其一为在硼烷及硼氢化钠作用下，采用-70℃低温还原，相关公开专利为：中国专利CN101624390、CN102180862、CN101613341、印度专利2009MU03028，该法反应条件苛刻且需大量易燃有毒的硼烷，在工艺安全方面不易控制；另一则是采用金属复合催化剂高压加氢的方法进行还原，相关公开专利为中国专利CN103483295A、日本专利2003128629，其催化剂制备工艺复杂，且反应需要保证无水无氧，不利于工业化应用。
相比较而言，生物法的应用条件更加温和，操作也相对简便。例如美国专利US20130040364 A1公开了一种利用来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羰基还原酶及其突变株不对称还原生产(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，同时美国专利US6472544B1也公开了一种利用来自木兰假丝酵母(Candida magnoliae IFO0705)的羰基还原酶来进行不对称还原的方法，这两种方法均采用添加辅助的葡萄糖脱氢酶和葡萄糖的方法来实现辅酶的原位循环。该方法虽然较化学法具有较多的优点，但其辅酶循环过程中会产生与产物等摩尔数的葡萄糖醛酸，反应过程中需要加入等摩尔数的碱以维持反应体系的pH，反应体系中产生的酸和碱在一定程度上会对酶活产生一定的影响，从而延长反应的时间。
发明内容
本发明提供了一种工程菌及其在制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，该工程菌能够不对称还原(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，产物的转化率和纯度均较高。
本发明提供了一种工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因为如碱基序列SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因。
所述的羰基还原酶基因(简称DKr)为全合成基因，基因来源于Acinetobactercalcoaceticus SC 13876的二羰基还原酶基因Dkr。
所述工程菌含有带所述羰基还原酶基因的表达载体pET30-30a(+)；宿主细胞为大肠杆菌，优选地，为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。所述羰基还原酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，使工程菌过量表达羰基还原酶。
本发明提供了一种所述的工程菌在以(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制备(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。
具体地，本发明提供了一种生产(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，包括：
(1)制备包含碱基序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶基因的工程菌；
(2)制备所述工程菌的静息细胞悬液；
(3)将静息细胞悬液和辅因子加入到底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氢供体和缓冲液的混合液中，反应制得(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯。
本发明的反应式为：
如上述反应式所示，该反应中底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯在工程菌静息细胞的催化下发生不对称还原反应生成(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，反应结束后，从反应液中分离纯化得到目标产物。
具体地，所述的分离纯化为向步骤(3)反应产物中加入乙酸乙酯，萃取，合并有机相，除水后，减压蒸馏除去有机溶剂，并用油泵彻底抽除溶剂。
所述的静息细胞悬液的制备方法为：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的液体试管培养基中，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得所述的静息细胞悬液。优选地，所述的诱导剂为IPTG，诱导剂浓度为0.2～1.0mM。
所述的氢供体为异丙醇。所述的辅因子为NADP+/NADPH。在整个反应过程中，羰基还原酶Dkr一方面催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原生成立体异构纯的(3R，5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯，同时伴随着还原型辅因子NADH转化为氧化型辅因子NAD+的过程，另一方面，羰基还原酶Dkr还将异丙醇氧化为丙酮，同时再生还原型辅因子NADPH，形成一个辅因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。
作为优选，所述反应的温度为25～37℃，反应液的pH值为6.0～7.5。所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液。具体地，所述缓冲液的浓度为100mM～200mM。
本发明将SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因导入宿主细胞构建的工程菌可表达羰基还原酶Dkr，通过该酶的催化作用可实现将(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯，该反应条件温和，操作简便，采用异丙醇辅酶再生的方式，使反应过程中无需进行pH的实时调节，不仅避免了化学法存在的反应条件苛刻、催化剂制备复杂等问题，还对生物法进行了一定的改进，具有重要的应用前景。
附图说明
图1为羰基还原酶基因DKr的电泳图；
M：核酸Marker，2：羰基还原酶基因DKr样品。
图2为质粒pET30-Dkr的图谱。
图3为基因工程菌EcoDkr诱导表达的蛋白质SDS-PAGE电泳图；
M：蛋白质Marker；1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞上清
2：基因工程菌EcoDkr诱导菌体破胞上清，
3：pET-30a(+)空载质粒对照破胞沉淀，
4：基因工程菌EcoDkr诱导菌体破胞沉淀。
图4为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯及(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的HPLC分析标准图谱。
图5为(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的1H NMR谱图。
图6为(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面结合整体反应式和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明的整体反应式为：
转化率、产率的计算公式如下：
底物转化率(％)＝(初始底物浓度–剩余底物浓度)/初始底物浓度×100％；
产物产率(％)＝产物浓度/理论产物最大浓度×100％。
实施例1.质粒pET30-Dkr的构建
全基因合成Dkr基因，得到质粒pMD18-Dkr(基因来自Acinetobactercalcoaceticus SC13876，NCBI检索号为EU273886.1)，用引物F_Dkr/R_Dkr克隆Dkr基因，得到长度为852bp的Dkr基因(SEQ ID No.3)。核酸电泳验证基因大小，如图1。
引物F_Dkr的序列为：
5’-CGCGGATCCATGACCGGCATCAC(SEQ ID No.1)；
引物R_Dkr的序列为：
5’-ACGCGTCGACTCAGTACCGGTAGAAGCCC(SEQ ID No.2)。
BamHI和SalI双酶切LkTadh基因，回收酶切后的基因条带，BamHI和SalI双酶切pET-30a(+)质粒，回收酶切后的质粒条带，将酶切后的Dkr基因和酶切后的pET-30a(+)质粒，用连接酶连接，转化克隆宿主Escherichia coli DH5α。用引物F_Dkr/R_Dkr进行菌落PCR验证，转化重组子，然后提取重组质粒，进行测序。测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pET30-Dkr，质粒图谱如图2所示，-20℃保存备用。
实施例2 基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-Dkr，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_Dkr/R_Dkr做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoDkr。将EcoDkr接种到含卡纳霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为37℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝1.0时，加入0.5mM IPTG(终浓度)，18℃诱导13h，12,000g离心5min收集细胞，用pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。蛋白表达情况用SDS-pAGE检测，如图3所示。
实施例3 基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-LkTADH，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_Dkr/R_Dkr做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoDkr。将EcoDkr接种到含卡纳霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养4h，培养条件为35℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝1.2时，加入0.2mM IPTG(终浓度)，25℃诱导16h，10,000g离心5min收集细胞，用pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。
实施例4 反应过程监测方法
采用HPLC检测方法测定(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯到(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的转化情况，同时监测反应过程中de值的变化。样品处理：取不同时间点反应液50μL，加入乙腈150～950μL，混匀后于12,000g离心5min,取上清用0.45μm微孔滤膜过滤待进样检测。色谱条件为：色谱柱:PntulipsTM QS-C18(5um×4.6mm×250mm)；流动相：乙腈：10mM乙酸钠溶液(用乙酸调pH至5.5)＝1:2(v/v)；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：210nm。HPLC图谱如图4所示。(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的保留时间为16.78min；(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的保留时间为10.773min，其结构鉴定的1H谱和13C谱分别如图5和图6所示，(3S，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的保留时间为10.071min。de的计算方法为(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯和(3S，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯峰面积的差除以两者峰面积的和。
实施例5 (3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoDkr静息细胞，用pH6.5的100mM的磷酸钠缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入3g干重/L的Dkr静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再加0.5g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，1.5mL异丙醇以及终浓度为0.1mM的NAD+，然后置于30℃恒温水浴槽中，搅拌反应20小时，至HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，真空水泵减压浓缩，并用油泵将残余溶剂抽干，可得0.42g浅黄色晶体粉末，HPLC检测产物纯度为95％，de值为97.3％。
实施例6 (3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoDkr静息细胞，用pH7.0的100mM的磷酸钠缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入3g干重/L的Dkr静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再加0.5g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，1.5mL异丙醇以及终浓度为0.1mM的NAD+，然后置于37℃恒温水浴槽中，搅拌反应24小时，至HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，真空水泵减压浓缩，并用油泵将残余溶剂抽干，可得0.40g黄色晶体粉末，HPLC检测产物纯度为90％，de值为97.1％。
实施例7 (3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoDkr静息细胞，用pH 6.5的100mM的磷酸钠缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入10g干重/L的Dkr静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再加2g底物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，6mL异丙醇以及终浓度为0.1mM的NAD+，然后置于30℃恒温水浴槽中，搅拌反应28小时，至HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，真空水泵减压浓缩，并用油泵将残余溶剂抽干，可得1.82g浅黄色晶体粉末，HPLC检测产物纯度达96％，de值为97.2％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种包含如SEQ ID NO.3所示的羰基还原酶基因的工程菌在以（S）-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物制备(3R, 5S) -6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，其特征在于，所述应用无需加入其它脱氢酶。
2.一种生产(3R, 5S) -6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括：
（1）制备包含碱基序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶基因的工程菌；
（2）制备所述工程菌的静息细胞悬液；
（3）将静息细胞悬液和辅因子加入到底物（S）-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、氢供体和缓冲液的混合液中，反应制得(3R, 5S) -6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯；所述方法无需加入其它脱氢酶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氢供体为异丙醇。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为25~37℃，反应液的pH值为6.0~7.5。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三乙醇胺盐缓冲液。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的辅因子为NADP+/NADPH。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缓冲液的浓度为100mM~200mM。
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