CN104531627B - 羰基还原酶、工程菌及其应用 - Google Patents

羰基还原酶、工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种羰基还原酶、工程菌及其应用，该羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。本发明将通过半理性定点突变获得的羰基还原酶基因导入宿主细胞中构建工程菌，利用工程菌高效表达羰基还原酶LkADH，该羰基还原酶可提高不对称还原6‑氯‑3，5‑二羰基己酸叔丁酯的能力，并通过羰基还原酶LkADH的催化作用实现从6‑氯‑3，5‑二羰基己酸叔丁酯到(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯的高浓度生产；本发明采用特定反应条件以及底物恒速流加的加样方式进行(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯的制备，显著降低了副产物的积累量，提高了反应效率，产品光学纯度高，制备成本较低。

Description

羰基还原酶、工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种羰基还原酶、工程菌及其应用。
背景技术
他汀类药物是一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂药物，是目前临床上应用广泛的降血脂药物。HMG-CoA还原酶催化HMG-CoA还原成3-甲基-3，5-二羟基戊酸的反应是胆固醇的生物合成途径，他汀类药物通过抑制HMG-CoA还原酶的合成，可抑制体内胆固醇的合成，降低低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，对以胆固醇升高为主的高血脂症和冠心病有较好的疗效。在结构上，他汀类药物通常由憎水性的刚性平面结构母核和具有双手性中心的(3R，5S/R)-双羟基己酸酯组成。其中，阿托伐他汀(Atorvastatin)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)是全新第三代、全合成、高纯化、高选择性的HMG-CoA还原酶抑制剂，多年来占据降血脂药物的主要市场份额。合成阿托伐他汀的关键手性中间体是(3R，5R)-6-氰基-3，5-二羟基己酸叔丁酯，而合成瑞舒伐他汀的关键手性中间体是(3R，5S)-6-羟基-3，5-二羟基己酸叔丁酯，且这两个中间体都可以通过(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯衍生得到。(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯是一个拥有两个手性中心的化合物，可以通过已经建立好一个手性中心的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯通过不对称还原得到。因此，开展对(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的合成改进，对两种他汀类药物的制备方法研究均具有十分重要的作用。
目前，报道的制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的方法主要有两种，一种为化学酶法，即先采用一种羰基还原酶将4-氯乙酰乙酸乙酯不对称还原为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，再通过克莱森反应与醋酸叔丁酯缩合加长碳链来合成(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯；另一种是一步酶法，以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯为底物，通过一种羰基还原酶不对称还原作用直接生成(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。与前者相比，后者减少了一步反应步骤，过程更为简单，更值得深入研究。具体合成路线如下：
现有报道中，仅发现来源于Lactobacillus brevis DSM20054的R型醇脱氢酶能作用于6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，不对称还原生成(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(文献Chemistry-a European Journal，2001，21：4562-4571)。然而，该步反应的底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯在水溶液中不稳定，尤其是对热和碱敏感，且随浓度增大自发降解速率加快，主要生成一种叫呋喃酮的副产物。当以醇脱氢酶LbADH为催化剂进行8_L罐的放大反应时，采用异丙醇为共底物进行NADPH的再生，通过分批补料的方式流加底物，达到终浓度为9_g/L，副产物呋喃酮的累积量为6mol％，整个反应的TTN数为96(文献Bioprocessand Biosystems Engineering，2008，3：183-191)。该放大工艺的终底物浓度不高，TTN数较低，在氧化还原酶法不对称还原的工艺中，辅酶尤其是NADP+的价格占生产总成本的较大比例，在工业上，TTN数大于10000的工艺才是具有比较好的应用前景的。
因此，如何提高主反应的反应效率，同时控制反应副产物的量，获得更高浓度的立体异构纯的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，是亟待解决的难题。
发明内容
本发明提供了一种羰基还原酶、工程菌及其应用，该羰基还原酶具有更高的活力，能够在制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的反应中，提高TTN数，减少副产物的量以及生产成本。
本发明提供了一种羰基还原酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种编码所述的羰基还原酶的基因，碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
该羰基还原酶(简称LkADH-mut)，其基因通过PCR克隆Lactobacillus kefir DSM20587的基因组序列后突变获得，除该羰基还原酶基因外，还获得了碱基序列如SEQ IDNO.5～8所示的基因突变体及其编码的如SEQ ID NO.11～14所示的羰基还原酶。克隆Lactobacillus kefir DSM 20587的基因组序列后获得未经突变的基因的碱基序列如SEQID NO.3所示，该基因编码的羰基还原酶如SEQ ID NO.9所示。
本发明提供了一种包含所述的基因的重组载体，具体地，载体为pET30-30a(+)。
本发明还提供了一种包含所述的基因的工程菌，具体地，宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
本发明还提供了所述的工程菌在制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用。
本发明还提供了一种生产(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的方法，包括：
(1)制备权利要求4所述工程菌的静息细胞悬液；
(2)往静息细胞悬液中添加底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯、NADP+/NADPH和氢供体，反应制得(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。
反应式如下所示：
所述的静息细胞悬液的制备方法为：将所述的工程菌接种到含卡那霉素的液体试管培养基中，摇床活化后，扩大培养至OD600值达到0.8～1.2时，加入诱导剂，继续培养，离心收集细胞，用缓冲液重悬，获得所述的静息细胞悬液。优选地，所述的诱导剂为IPTG，诱导剂浓度为0.2～0.8mM。
所述的氢供体为异丙醇。在整个反应过程中，羰基还原酶LkADH一方面催化6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯不对称还原生成立体异构纯的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，同时伴随着还原型辅因子NADPH转化为氧化型辅因子NADP+的过程；另一方面，羰基还原酶LkADH还将异丙醇氧化为丙酮，同时再生还原型辅因子NADPH，形成一个辅因子消耗与再生的闭合回路，推动主反应的进行。当以6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯为底物时，与背景技术中报道的LbADH相比较，Lactobacillus kefir羰基还原酶及其突变体比酶活是背景技术中报道的LbADH的0.3～6倍。
需要注意的是，该反应中底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯在水溶液中不稳定，尤其是高温碱性的水溶液中，易发生如下副反应生成呋喃酮：
因此，作为优选，所述的不对称还原反应的温度为18～30℃，反应液的pH为5.0～7.0。所述的辅因子为NADP+/NADPH，所述的氢供体为异丙醇，所述的羰基还原酶能利用异丙醇再生NADPH。反应液中还添加有含MgCl2的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液。
所述的底物采用恒速流加的方式进行加样。由于水溶液中高底物浓度会增大副反应速率，所以反应过程中底物6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯不是一次性加入到反应体系中，而是通过一定时间内恒速流加的方式加入，反应体系中，所述底物的浓度控制在5～100mM。
待底物流加结束后，需继续搅拌反应6～22小时，至HPLC检测底物完全耗尽。待反应结束后，用等体积的有机溶剂萃取2-4次，合并萃取相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去有机溶剂，得到黄色油状目标产物，副产物的摩尔量控制在1～40mol％，产品ee值高于99.5％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明将通过半理性定点突变获得的羰基还原酶基因导入宿主细胞中构建工程菌，利用工程菌高效表达羰基还原酶LkADH，该羰基还原酶可提高不对称还原6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯的能力，并通过羰基还原酶LkADH的催化作用实现了从6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯到(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的高浓度生产；
(2)本发明采用特定反应条件以及底物恒速流加的加样方式进行(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备，显著降低了副产物的积累量，提高了反应效率，产品光学纯度高，制备成本较低。
附图说明
图1为基因Lkadh的电泳图；
M：核酸Marker，1：基因Lkadh样品。
图2为质粒pET30-LkADH的图谱。
图3为基因工程菌EcoLkADH诱导表达的蛋白质的SDS-PAGE电泳图；
M：蛋白质Marker；1：pET-30a(+)空载质粒对照破胞上清；2：pET-30a(+)空载质粒对照破胞沉淀；3：基因工程菌EcoLkADH诱导菌体破胞上清；4：基因工程菌EcoLkADH诱导菌体破胞沉淀。
图4为6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯，(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯及副产物呋喃酮的HPLC分析标准图谱。
图5为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯衍生环化产物测ee值的HPLC分析标准图谱。
图6为6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯的1H NMR谱图。
图7为6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯的13C NMR谱图。
图8为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的1H NMR谱图。
图9为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的13C NMR谱图。
图10为副产物呋喃酮的1H NMR谱图。
图11为副产物呋喃酮的13C NMR谱图。
图12为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯衍生环化产物的1H NMR谱图。
图13为(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯衍生环化产物的13C NMR谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
本发明的整体反应式：
实施例1质粒pET30-LkADH的构建及Lactobacillus kefir羰基还原酶的定点突变
采用细菌基因组提取试剂盒从Lactobacillus kefir DSM 20587中提取其基因组。
以基因组为模板，用引物F_LkADH/R_LkADH克隆Lkadh基因，得到长度为759bp的Lkadh基因。核酸电泳验证基因大小，如图1。
引物F_LkADH的序列为：5’-CGCGGATCCA TGACTGATCGTTAAAAG-3’；
引物R_LkADH的序列为：5’-CCGCTCGAGC TTATTGAGCAGTGTATCCAC-3’。
Lkadh基因序列如SEQ No.3所示。
BamHI和XhoI双酶切Lkadh基因，回收酶切后的基因条带，BamHI和XhoI双酶切pET-30a(+)质粒，回收酶切后的质粒条带，将酶切后的Lkadh基因和酶切后的pET-30a(+)质粒，用连接酶连接，转化克隆宿主Escherichia coli DH5α。用引物F_LkADH/R_LkADH进行菌落PCR验证，转化重组子，然后提取重组质粒，进行测序。测序结果无误的重组质粒，即为重组质粒pET30-LkADH，质粒图谱如图2所示，-20℃保存备用。
以上述构建的pET30-LkADH为模板，根据设计的突变位点设计引物进行全质粒PCR定点突变，PCR后产物用Dpn I酶消化质粒DNA模板，得到突变后的重组质粒pET30-LkADH-mut，-20℃保存备用。
实施例2基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-LkADH及pET30-LkADH-mut，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_LkADH/R_LkADH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoLkADH或EcoLkADH-mut。将EcoLkADH及EcoLkADH-mut接种到含卡纳霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为37℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝1.0时，加入0.5mM IPTG(终浓度)，16℃诱导14h，10,000g离心5min收集细胞，用pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。蛋白表达情况用SDS-PAGE检测，如图3所示。
实施例3基因工程菌的构建及诱导表达
用实例1中构建的质粒pET30-LkADH及pET30-LkADH-mut，转化表达宿主Escherichia coli BL21(DE3)。用引物F_LkADH/R_LkADH做菌落PCR，验证转化的重组子。验证无误的基因工程菌即为EcoLkADH或EcoLkADH-mut。将EcoLkADH及EcoLkADH-mut接种到含卡纳霉素抗性的3～5mL液体LB试管培养基中，于37℃下摇床活化12小时，将活化后得到的培养物按1％转接量转接到含卡纳霉素抗性的液体LB摇瓶培养基中，发酵培养基中恒温震荡培养3h，培养条件为35℃，200rpm。待菌体浓度长到OD600＝1.2时，加入0.2mM IPTG(终浓度)，25℃诱导16h，10,000g离心5min收集细胞，用pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤1次后，弃上清，即得静息细胞，置于-80℃冻存。
实施例4反应过程监测方法
采用HPLC检测方法监测6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯到(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的转化，以及过程中副产物呋喃酮的累积情况。样品处理：取不同时间点反应液50μL，加入乙腈150～950μL，混匀后于12,000g离心5min，取上清用0.45μm微孔滤膜过滤待进样 检测。色谱条件为：色谱柱：PntulipsTMQS-C18(5um×4.6mm×250mm)；流动相：乙腈：10mM乙酸钠溶液(用乙酸调pH至5.5)＝55∶50(v/v)；流速：1mL/min；进样量：20μL；检测波长：225nm。HPLC图谱如图4所示。6-氯-3，5-二羰基己酸叔丁酯的保留时间为10.78min，其结构鉴定的1H谱和13C谱分别如图6和图7所示；(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的保留时间为6.66min，其结构鉴定的1H谱和13C谱分别如图8和图9所示；副产物呋喃酮的保留时间为5.85min，结构鉴定的1H谱和13C谱分别如图10和图11所示。
实施例5产物ee值测定方法
目标产物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的ee值测定方法采用两步衍生环化生成一种α，β-不饱和δ-内酯，再通过手性HPLC的方法来测定。其衍生化反应式如下：
式中A表示消旋α，β-不饱和δ-内酯的合成，B表示手性α，β-不饱和δ-内酯的合成。其两步衍生方法为：
(1)在25mL圆底烧瓶中加入溶解在5mL甲醇中的完全反应产物0.1mmol，在低温恒温槽-5℃条件下，缓慢滴入0.11mmol溶于2mL水的NaBH4，滴加约15min，结束后再在该温度下搅拌反应1小时。然后保持-5℃，滴加约2mLlN HCl调pH至3-4，至反应液中无气泡产生。取出圆底烧瓶，旋蒸除甲醇，再用乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，用饱和NaHCO3和饱和NaCl各洗涤一次，无水硫酸钠干燥除水，过滤，旋蒸除溶剂。
(2)将上步得到的二羟基酯溶于10mL甲苯中，加微量TsOH作催化剂，于115℃下加热回流反应2小时，待反应液冷却后，加乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，用饱和NaHCO3和饱和NaCl各洗涤一次，无水硫酸钠干燥除水，过滤，旋蒸除溶剂，残留物溶于2mL色谱级无水乙醇，待HPLC检测。
合成的α，β-不饱和δ-内酯的结构鉴定1H谱和13C见图12和图13。
手性HPLC分析条件如下：色谱柱：CHIRALCEL OB-H(0.46cm I.D.×25cm L×5μm)；流动相：正己烷/异丙醇＝80/20(v/v)；流速：1.0ml/min；进样量：5μL；检测波长：215nm。消旋样的HPLC图谱如图5所示。(S)构型的保留时间为44.73min，(R)构型的保留时间为39.13min。
实施例6(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.4)静息细胞，用pH5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应16小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.87g浅黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为5.1mol％，TTN数为4266，ee＞99.5％。
其中呋喃酮的摩尔分数定义为产物HPLC检测中呋喃酮的摩尔数与呋喃酮和(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯摩尔数之和的比值。TTN数为反应结束中体系中产物(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的摩尔浓度(mM)与加入的NADP+(mM)的比值。
实施例7(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.4)静息细胞，用pH 5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入4.7g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.025mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将2g底物溶解在6mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加16h。流加结束后继续搅拌反应22小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得1.72g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为6.0mol％，TTN数为16221，ee＞99.5％。
对比例1(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH(SEQ No.3)静息细胞，用pH 7.0的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于30℃恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应12小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.65g深黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为31.5mol％，TTN数为2860，ee＞99.5％。
对比例2(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH(SEQ No.3)静息细胞，用pH 5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM 的NADP+，然后置于20℃恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.67g深黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为18.6mol％，TTN数为3478，ee＞99.5％。
对比例3(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH(SEQ No.3)静息细胞，用pH5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加4h。流加结束后继续搅拌反应18小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.67g深黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为40.2mol％，TTN数为2490，ee＞99.5％。
对比例4(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.5)静息细胞，用pH 5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应18小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.80g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为9.0mol％，TTN数为3966，ee＞99.5％。
对比例5(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.5)静息细胞，用pH5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入4.7g干重/L的LkTADH静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.025mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1.5g底物溶解在4.5mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加12h。流加结束后继续搅拌反应14小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得1.28g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为7.2mol％，TTN数为10784，ee＞99.5％。
对比例6(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.6)静息细胞，用pH 5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.76g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为16.4mol％，TTN数为3750，ee＞99.5％。
对比例7(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.7)静息细胞，用pH5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.78g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为12.1mol％，TTN数为3879，ee＞99.5％。
对比例8(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的制备
取一定量的实施例2工程菌EcoLkADH-mut(SEQ No.8)静息细胞，用pH 5.5的150mM的柠檬酸-磷酸氢二钠-NaOH缓冲液重悬。在50mL的三口圆底烧瓶中加入1.2g干重/L的LkADH-mut静息细胞，加上述缓冲液补至总体积为20mL，再预加500μL的异丙醇和终浓度为0.05mM的NADP+，然后置于20℃低温恒温水浴槽中，搅拌均匀。将1g底物溶解在3mL异丙醇中，采用蠕动泵恒速流加8h。流加结束后继续搅拌反应20小时，HPLC检测底物完全消耗，加NaCl至饱和，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相萃取液。无水硫酸钠除水，抽滤，减压浓缩，可得0.74g黄色油状液体。产物中副产物呋喃酮摩尔分数为15.3mol％，TTN数为3766，ee＞99.5％。

Claims (6)

1.一种工程菌在制备(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯中的应用；
所述工程菌包含编码羰基还原酶的基因；所述羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示，编码羰基还原酶的基因的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种生产(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，包括：
(1)制备权利要求1所述工程菌的静息细胞悬液；
(2)往静息细胞悬液中添加底物6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯、NADP+/NADPH和氢供体，反应制得(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的氢供体为异丙醇。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为18～30℃，反应液的pH值为5.0～7.0。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的底物采用恒速流加的方式进行加样。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，反应体系中，所述底物的浓度控制在5～100mM。
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