CN109468346B

CN109468346B - 一种(s)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法

Info

Publication number: CN109468346B
Application number: CN201811194054.0A
Authority: CN
Inventors: 俞鑫焱; 张敬鹏; 马宗杰; 牛山坡
Original assignee: Hangzhou Xin Hai Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Xin Hai Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-01
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2038-10-12
Also published as: CN109468346A

Abstract

本发明公开了一种(S)‑1‑(2‑碘‑5‑氟苯基)乙醇的生物制备方法，以一定浓度的潜手性酮2’‑碘‑5’‑氟苯乙酮为底物，加入一定量的基因工程菌，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物；所述基因工程菌为含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌；所述羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。该方法反应条件温和、底物适应性高、环境友好，且该酶的重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化高浓度的潜手性酮的不对称还原，生成高光学纯度的手性醇(ee≥99％)，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，特别是涉及一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法。

背景技术

肺癌是全球癌症的主要死亡原因，非小细胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌患者的85％。在NSCLC患者中，ALK阳性的比例大约为3％～5％，东方人群约为4.1％，欧美人群约为2.5％，中国高达5.3％。比起现有的ALK抑制剂，劳拉替尼潜在的优势在于血脑屏障通透性更高，且对TKI耐药的ALK突变的治疗效果更好，包括克唑替尼、艾乐替尼和色瑞替尼耐药的EML4-ALK突变类型(典型如G1202R突变)。

S-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇是针对肺癌的药物劳拉替尼的手性中间体，一般化学合成法具有能耗大，产率低，手性选择性不高等缺点；生物催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。公开号为CN106399398A的中国发明专利公开了一种(R)-3,5-双(三氟甲基)苯乙醇(Ⅰ)的生物制备方法，该发明方法包括以下步骤：(a)在液态反应体系中，以式Ⅱ化合物为底物，在辅酶存在下，在羰基还原酶催化下，进行不对称还原反应，从而形成式Ⅰ化合物；其中，所述反应体系中，式Ⅱ化合物浓度为50～1000g/L；和(b)任选地从步骤(a)反应后的反应体系中分离出式I化合物，该方法比较麻烦，而且还有辅酶存在，反应体系比较复杂，成本较高。

而且，现有的生物催化远不能满足工业化生产要求，如何高产率、高效的制备S-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇是该领域至关重要的问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，该方法有着高转化率和高手性选择性的特点。

本发明是基于羰基还原酶的基因工程辅助制手性化合物。其中羰基还原酶的编码基因如SEQ ID No.1所示，羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，以一定浓度的潜手性酮2’-碘-5’-氟苯乙酮为底物，加入基因工程菌，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物；所述基因工程菌为含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌；所述羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。该羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因如SEQ ID No.4。

该方法反应条件温和、底物适应性高、环境友好，且该酶的重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化高浓度的潜手性酮的不对称还原，生成高光学纯度的手性醇(ee≥99％)，具有很好的工业化应用前景；

进一步地，所述羰基还原酶EbSDR8突变体是在羰基还原酶EbSDR8序列上进行构建的，所述羰基还原酶EbSDR8的突变体为：第78位缬氨酸突变为亮氨酸、第107位甘氨酸突变为丙氨酸、第145位组氨酸突变为丙氨酸、第204位谷氨酸突变为精氨酸。

进一步地，所述基因工程菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

进一步地，所述潜手性酮2’-碘-5’-氟苯乙酮底物初始浓度为10～800mmol/L。

进一步地，所述反应体系中基因工程菌菌体的质量用量以菌体湿重计为100～300g/L。

进一步地，所述反应体系中还包括有机溶剂。

进一步地，所述有机溶剂为二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种。

进一步地，所述有机溶剂为异丙醇，所述反应体系中异丙醇的浓度为30％。

进一步地，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液用适量体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。

进一步地，所述粗品提纯的方法为有机溶剂萃取或色谱分离或吸附分离。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供一种酶催化制备S-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，该方法反应条件温和、底物适应性高、环境友好，且该酶的重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化高浓度的潜手性酮的不对称还原，生成高光学纯度的手性醇(ee≥99％)，具有很好的工业化应用前景；

(2)本发明对2’-碘-5’-氟苯乙酮有着高转化率和高手性选择性的特点。

具体实施方式

为更好的说明本发明中的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。

一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，以初始浓度为10～800mmol/L的潜手性酮2’-碘-5’-氟苯乙酮为底物，加入一定量的基因工程菌，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物；基因工程菌为含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌；羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。本发明提供一种酶催化制备S-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的方法，该方法反应条件温和、底物适应性高、环境友好，且该酶的重组细胞能够在不外加任何辅酶的含异丙醇反应体系中高效催化高浓度的潜手性酮的不对称还原，生成高光学纯度的手性醇(ee≥99％)，具有很好的工业化应用前景；本发明对2’-碘-5’-氟苯乙酮有着高转化率和高手性选择性的特点。

具体地，反应体系(10.0mL)：含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌的湿菌体细胞2g，100mM 2’-碘-5’-氟苯乙酮，3.0mL异丙醇，5.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,PH 7.0)。于37℃，200rpm条件下反应，转化率有99.9％以上。

具体地，反应体系(10.0mL)：含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌的湿菌体细胞2g，不同浓度2’-碘-5’-氟苯乙酮，3.0mL异丙醇，5.0mL Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液(100mM,PH7.0)。于37℃，200rpm条件下反应。底物浓度为800mM/L的情况下，6h时转化率仍为99％以上。

较为优选的实施方式，羰基还原酶EbSDR8突变体是在羰基还原酶EbSDR8序列上进行构建的，羰基还原酶EbSDR8的突变体为：第78位缬氨酸突变为亮氨酸、第107位甘氨酸突变为丙氨酸、第145位组氨酸突变为丙氨酸、第204位谷氨酸突变为精氨酸。

羰基还原酶EbSDR8突变体的构建

以含有突变点的寡核苷酸片段为引物(表1)，采用QuickChangeTM方法(Stratagene,La Jolla,CA)扩增含有羰基还原酶基因的pET-30a重组质粒。

表1突变体构建引物

^a下划线标示为突变位点

PCR反应体系：

5×PrimerSTAR buffer(Mg²⁺plus)，5μL；

dNTPs(各2.5mM)，2.0μL；

上游引物(10μM),1.0μL；

下游引物(10μM),1.0μL；

重组质粒模板，15ng；

Primer STAR polymerase TM HS(2.5U/μL)，0.5μL；

加ddH₂O至总体积为25μL。

PCR程序：(1)98℃，1min；

(2)98℃，10s；

(3)55℃，10s；

(4)72℃，7min。

步骤(2)-(4)循环20次后冷却至4℃。

PCR产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶DpnⅠ进行消化以降解模板质粒。酶切反应体系及条件：17μL经清洗处理的PCR产物，2.0μL 10×缓冲液，1.0μL限制性内切酶DpnⅠ，37℃保温1h。

将上述经酶切处理的PCR产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布与含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定和测序验证，结果表明含有羰基还原酶突变体基因的重组表达载体成功转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)中。

将上述基因工程菌接种至50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，26℃诱导培养6h后，4℃、8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。

较为优选的实施方式，基因工程菌为大肠杆菌，具体地，大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

较为优选的实施方式，反应体系中基因工程菌菌体的质量用量以菌体湿重计为100～300g/L。

较为优选的实施方式，反应体系中还包括有机溶剂。具体地，有机溶剂为二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种。更为具体地，有机溶剂为异丙醇，反应体系中异丙醇的浓度为30％。

较为优选的实施方式，反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液用适量体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。

较为优选的实施方式，粗品提纯的方法为有机溶剂萃取或色谱分离或吸附分离。

对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州馨海生物科技有限公司

<120> 一种（S）-1-（2-碘-5-氟苯基）乙醇的生物制备方法

<130> 杭州馨海生物科技有限公司

<141> 2018-10-12

<150> 2018105584591

<151> 2018-06-01

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 1

atgtcaatat taaaagataa ggtagctatt gtgacaggag caagttccgg aataggtaaa 60

gctgttgcag aattgtatgc aaaagaaggt gcaaaagttg ttgtttctga tatcgatgaa 120

gaaagaggaa aagaagttgt agaacagatt aaaaaaaatg gaggagaagc catctttttc 180

aaagcggata catcatctcc cgaagagaat gaagcgttgg taaaaaaagc agttgaagtg 240

tatggaaaat tggatattgc atgtaataat gccggaatag caggtccggc tgaattgaca 300

gaagattatc ctttagacgg ttggaaaaaa gtgattgata tcaacttcaa tggtgttttt 360

tatggatgta aatatcaatt gcaggcaatg gagaaaaatg gtggaggttc tattgtgaat 420

atggcctcaa tacacggtac agtagcggct cctatgttgt ctgcttatac ttctgcgaaa 480

catggtgttg tgggacttac aaaaaatatt ggagcagagt acggttcaaa aaatatccga 540

tgcaatgctg tgggacctgg tgctatcatg acaccattgt tgtcgaataa tttgagcgca 600

gattatctag aattattggt aacgaagcat ccaataggtc gtttaggaca gcctgaggaa 660

gttgcagaat tagttttatt tctaagttct gataaagcgt cttttatgac aggaggttac 720

tatcttgtag atggaggata tacagcagtt taa 753

<210> 2

<211> 250

<212> PRT

<213> 未知()

<400> 2

Met Ser Ile Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys Ala Val Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Val Ser Asp Ile Asp Glu Glu Arg Gly Lys Glu Val Val Glu

35 40 45

Gln Ile Lys Lys Asn Gly Gly Glu Ala Ile Phe Phe Lys Ala Asp Thr

50 55 60

Ser Ser Pro Glu Glu Asn Glu Ala Leu Val Lys Lys Ala Val Glu Val

65 70 75 80

Tyr Gly Lys Leu Asp Ile Ala Cys Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro

85 90 95

Ala Glu Leu Thr Glu Asp Tyr Pro Leu Asp Gly Trp Lys Lys Val Ile

100 105 110

Asp Ile Asn Phe Asn Gly Val Phe Tyr Gly Cys Lys Tyr Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Met Ala Ser Ile

130 135 140

His Gly Thr Val Ala Ala Pro Met Ser Ser Ala Tyr Thr Ser Ala Lys

145 150 155 160

His Gly Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Ile Gly Ala Glu Tyr Gly Ser

165 170 175

Lys Asn Ile Arg Cys Asn Ala Val Gly Pro Gly Tyr Ile Met Thr Pro

180 185 190

Leu Leu Ser Asn Asn Leu Ser Ala Asp Tyr Leu Glu Leu Leu Val Thr

195 200 205

Lys His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Gln Pro Glu Glu Val Ala Glu Leu

210 215 220

Val Leu Phe Leu Ser Ser Asp Lys Ala Ser Phe Met Thr Gly Gly Tyr

225 230 235 240

Tyr Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Val

245 250

<210> 3

<211> 753

<212> DNA

<213> 未知()

<400> 3

atgtcaatat taaaagataa ggtagctatt gtgacaggag caagttccgg aataggtaaa 60

gctgttgcag aattgtatgc aaaagaaggt gcaaaagttg ttgtttctga tatcgatgaa 120

gaaagaggaa aagaagttgt agaacagatt aaaaaaaatg gaggagaagc catctttttc 180

aaagcggata catcatctcc cgaagagaat gaagcgttgg taaaaaaagc actcgaagtg 240

tatggaaaat tggatattgc atgtaataat gccggaatag caggtccggc tgaattgaca 300

gaagattatc ctttagacgc atggaaaaaa gtgattgata tcaacttcaa tggtgttttt 360

tatggatgta aatatcaatt gcaggcaatg gagaaaaatg gtggaggttc tattgtgaat 420

atggcctcaa tagcgggtac agtagcggct cctatgttgt ctgcttatac ttctgcgaaa 480

catggtgttg tgggacttac aaaaaatatt ggagcagagt acggttcaaa aaatatccga 540

tgcaatgctg tgggacctgg tgctatcatg acaccattgt tgtcgaataa tttgagcgca 600

gattatctac gcttattggt aacgaagcat ccaataggtc gtttaggaca gcctgaggaa 660

gttgcagaat tagttttatt tctaagttct gataaagcgt cttttatgac aggaggttac 720

tatcttgtag atggaggata tacagcagtt taa 753

<210> 4

<211> 250

<212> PRT

<213> 未知()

<400> 4

Met Ser Ile Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ile Gly Lys Ala Val Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Glu Gly Ala Lys

20 25 30

Val Val Val Ser Asp Ile Asp Glu Glu Arg Gly Lys Glu Val Val Glu

35 40 45

Gln Ile Lys Lys Asn Gly Gly Glu Ala Ile Phe Phe Lys Ala Asp Thr

50 55 60

Ser Ser Pro Glu Glu Asn Glu Ala Leu Val Lys Lys Ala Leu Glu Val

65 70 75 80

Tyr Gly Lys Leu Asp Ile Ala Cys Asn Asn Ala Gly Ile Gly Gly Pro

85 90 95

Ala Glu Leu Thr Glu Asp Tyr Pro Leu Asp Ala Trp Lys Lys Val Ile

100 105 110

Asp Ile Asn Phe Asn Gly Val Phe Tyr Gly Cys Lys Tyr Gln Leu Gln

115 120 125

Ala Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Met Ala Ser Ile

130 135 140

Ala Gly Thr Val Ala Ala Pro Met Ser Ser Ala Tyr Thr Ser Ala Lys

145 150 155 160

His Gly Val Val Gly Leu Thr Lys Asn Ile Gly Ala Glu Tyr Gly Ser

165 170 175

Lys Asn Ile Arg Cys Asn Ala Val Gly Pro Gly Tyr Ile Met Thr Pro

180 185 190

Leu Leu Ser Asn Asn Leu Ser Ala Asp Tyr Leu Arg Leu Leu Val Thr

195 200 205

Lys His Pro Ile Gly Arg Leu Gly Gln Pro Glu Glu Val Ala Glu Leu

210 215 220

Val Leu Phe Leu Ser Ser Asp Lys Ala Ser Phe Met Thr Gly Gly Tyr

225 230 235 240

Tyr Leu Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Val

245 250

Claims

1.一种(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，

以一定浓度的潜手性酮2’-碘-5’-氟苯乙酮为底物，加入基因工程菌，20～50℃下，于pH 5.5～10.5的缓冲液构成的转化反应体系中反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到相应产物；

所述基因工程菌为含有羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的基因工程菌；

所述羰基还原酶EbSDR8突变体编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。

2.根据权利要求1所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为大肠杆菌，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

3.根据权利要求1所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述潜手性酮2’-碘-5’-氟苯乙酮底物初始浓度为10～800mmol/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述转化反应体系中基因工程菌菌体的质量用量以菌体湿重计为100～300g/L。

5.根据权利要求4所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述转化反应体系中还包括有机溶剂。

6.根据权利要求5所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为二甲亚砜、异丙醇、甲醇中的一种或多种。

7.根据权利要求5所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为异丙醇，所述反应体系中异丙醇的浓度为30％。

8.根据权利要求1所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述反应液分离纯化方法为：反应结束后，将反应液用适量体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含相应手性醇的粗品，将粗品提纯即获得相应手性醇。

9.根据权利要求8所述的(S)-1-(2-碘-5-氟苯基)乙醇的生物制备方法，其特征在于，所述粗品提纯的方法为有机溶剂萃取或色谱分离或吸附分离。