CN102206686A

CN102206686A - 生物催化不对称还原制备(r)-邻氯扁桃酸甲酯的方法

Info

Publication number: CN102206686A
Application number: CN201110098532XA
Authority: CN
Inventors: 许建和; 倪燕; 潘江; 李春秀; 马宏敏
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-04-19
Also published as: WO2012142921A1; CN102206686B

Abstract

本发明公开了一种生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法及所用的重组载体和基因工程菌。本方法包括在pH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表达重组还原酶和重组葡萄糖脱氢酶的基因工程菌湿菌体或其冻干细胞为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸甲酯为底物，进行生物转化反应，其中所述的重组还原酶是重组醛酮还原酶。本基因工程菌整细胞同时表达醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，可以实现细胞内辅酶NADP⁺的高效再生。因此不需要添加辅酶，就可催化高浓度邻氯苯甲酰甲酸甲酯完全转化成单一构型的(R)-邻氯扁桃酸甲酯。因辅酶价格昂贵，本发明极大的降低了生产成本，且反应条件温和，环境友好，操作简便，具有很好的工业应用前景。

Description

生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法及所用的重组载体和基因工程菌。

背景技术

氯吡格雷(Clopidogrel)，化学名(S)-α-(2-氯苯基)-6，7-二氢噻吩并[3，2-c]吡啶-5(4H)-乙酸甲酯，系一种血小板凝集抑制剂，由法国赛诺菲-安万特公司(Sanofi-Aventis)公司于1986年研究开发成功，临床用其硫酸盐，商品名

(波立维)，主要用于治疗动脉粥样硬化等心脑血管疾病。2009年该药品全球销售额达一百亿美元，仅次于降血脂药物阿伐他汀，成为全球药品市场中排名第二位的畅销药物。(R)-邻氯扁桃酸及其甲酯是合成氯吡格雷的重要手性砌块，(R)-邻氯扁桃酸甲酯经磺酸酯化和亲核取代合成氯吡格雷的方法，反应产率高，产物基本无消旋化。因此，研究(R)-邻氯扁桃酸甲酯的手性合成具有广阔的应用前景。

目前为止，(R)-邻氯扁桃酸及其甲酯的合成路线主要包括以下三条：

(1)从消旋邻氯扁桃酸或其酯出发，采用非对映体盐结晶拆分法或酶促水解拆分法得到单一构型的邻氯扁桃酸甲酯。如专利WO2007078176A1中报道了商品酶CAL-A(Novozym 735)可以在水相中水解拆分邻氯扁桃酸甲酯或乙酯，底物浓度1％(v/v)，产物ee值均达99％以上。CAL-B(Novozym 435)拆分邻氯扁桃酸甲酯时的产物ee值为95.9％，拆分邻氯扁桃酸乙酯时产物ee值大于99％。CAL-A亦可以在非水相中拆分邻氯扁桃酸甲酯得到光学纯(R)-邻氯扁桃酸甲酯(＞99％ ee)，产物得率41％，E＝34.7(J.Mol.Catal.B：Enzym.，2007，45：34-38)。但这种合成方法的理论收率仅50％，一定程度上造成了资源的浪费和环境的污染。

(2)利用羟腈化酶催化邻氯苯甲醛与氢氰酸不对称合成(R)-邻氯扁桃腈，再经酸水解生成(R)-邻氯扁桃酸。如van Langen等(Org.Process Res.Dev.，2003，7：828-831)利用商品化的羟腈化酶较低温度下(0-20℃)合成(R)-邻氯扁桃腈，产物得率98％，ee值90％，酸水解后得到(R)-邻氯扁桃酸，进一步重结晶后产物ee值可达99％以上。Glieder等(Angew Chem.Int.Ed.，2003，42：4815-4818)利用扁桃(Prunus amygdalus)羟腈水解酶为催化剂，从邻氯苯甲醛出发得到(R)-邻氯扁桃腈，产物ee值为96.5％。将该酶交联固定化后，催化剂可以重复使用10个批次以上(Org.Lett.，2005，7：327-329)。该方法虽然产物得率高，选择性较好，但由于需用到剧毒的氢氰酸，加大了反应操作难度和危险性。

(3)直接不对称还原邻氯苯甲酰甲酸或其甲酯得到(R)-邻氯扁桃酸或其甲酯，该方法理论上可以实现100％的产率，使原料得到充分利用。Yin等(J.Organometal.Chem.，2009，694：2092-2095)利用金属钌(Ru)催化剂通过不对称氢化法合成(R)-邻氯扁桃酸甲酯，但该反应产物ee值只有92％，且反应条件相对苛刻，产物中容易残留有毒的重金属。相比而言，生物催化的不对称还原法反应条件非常温和，环境污染小，使其成为最具潜力的绿色生产方法之一。如专利EP1316613A2中筛选了几十种微生物，用以不对称还原邻氯苯甲酰甲酸，底物加入量10g/L，产物ee值大多在98％以上，产物的最高得率为88.7％。Guo等(J.Chem.Technol.Biotechnol.，2009，84：1787-1792)筛选得到一株椭圆酵母(Saccharomyces ellipsoideus)GIM2.105，可以不对称还原邻氯苯甲酰甲酸生成光学纯(R)-邻氯扁桃酸，但底物浓度仅为30mM。Jeong等(Biotechnol.Lett.，2010，32：1529-1531)利用面包酵母催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原，底物浓度16.7g/L，转化率100％，ee值96.1％。利用高表达还原酶的重组细胞作为催化剂可以克服野生微生物催化时反应的时空产率和立体选择性较低的障碍，提高产率和立体选择性。由于还原酶催化不对称还原反应通常需要在辅酶存在下才能进行，通过将还原酶和辅酶再生酶类(如葡萄糖脱氢酶)进行共表达有可能可以解决辅酶再生问题。日本的Ema等(Adv.Synth.Catal.，2008，350：2039-2044)通过将羰基还原酶Gre2与葡萄糖脱氢酶共表达，利用重组大肠杆菌作为催化剂不对称还原1M邻氯苯甲酰甲酸甲酯合成(R)-邻氯扁桃酸甲酯，反应的转化率和对映选择性均可达99％以上，但是该方法并没有解决辅酶再生的问题，还是需额外添加1g/L的昂贵辅酶NADP⁺，显著增大了生产的成本，且反应需要在20℃下进行，一定程度上也增加了能耗。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的生物还原法制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯需额外添加辅酶的严重缺陷，提供一种利用重组还原酶和辅酶再生酶双酶的基因工程菌整细胞为催化剂来催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯不对称还原制备光学纯(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法，以及其中所用的重组载体和重组菌。该方法不需要额外添加价格昂贵的辅酶NADP⁺，极大地降低了生产的成本，并且反应的生产效率高，产物的光学纯度高，反应条件温和，环境友好，操作简便，易于放大。

本发明通过下述技术方案解决上述问题：

本发明的第一方面提供一种生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法，包括在pH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表达重组还原酶和重组葡萄糖脱氢酶的基因工程菌湿菌体或其冻干细胞为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸甲酯为底物，进行生物转化反应，其中，所述的重组还原酶是重组醛酮还原酶(aldo-keto reductase，AKR)。

本发明中，所述的重组醛酮还原酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：2所示；或者是在保持由该醛酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

本发明中，所述的重组葡萄糖脱氢酶(GDH)可以是现有的任何来源的葡萄糖脱氢酶，只要能够在所在的基因工程菌中表达且可以实现辅酶的再生即可。较佳的，所述的重组葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，更佳的是氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：3所示的重组葡萄糖脱氢酶；或者是在保持由该葡萄糖脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：3所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

本发明中，所述的基因工程菌可为本领域常规的各种微生物，只要能满足能够有效表达本发明的重组醛酮还原酶和和重组葡萄糖脱氢酶即可。该基因工程菌同时表达醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，能够实现细胞内辅酶的高效再生。较佳的，所述的基因工程菌是重组大肠杆菌，更佳的为重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。本发明的基因工程菌可以按照本领域的常规方法制备而得，一般将含有本发明的重组醛酮还原酶和和重组葡萄糖脱氢酶的重组载体导入宿主细胞即可。

本发明中，所述底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯的浓度较佳的为50～1000g/L缓冲液，较佳的为100-600g/L缓冲液。本发明的基因工程菌的用量为催化有效量，能使底物转化达到99％以上即可，较佳的所述冻干细胞的用量为10～50g/L。所述葡萄糖用量与底物质量之比较佳的为1.0～2.0，更佳的为1.0-1.5。

本发明中，在所述的生物转化反应中不加入辅酶NADP⁺就能够达到发明效果。还可以加入辅酶NADP⁺，则达到极其优良的效果。所述的NADP⁺用量较佳的不超过1.0mmol/L。

本发明中，反应液的pH为6-8，通过使用磷酸盐缓冲液进行控制。所述的磷酸盐缓冲液较佳的如磷酸-磷酸钾或磷酸-磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05-0.1mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。反应过程中也可以滴加碱液，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等的水溶液以维持反应液pH恒定在pH 6-8的范围。

本发明中，所述的生物转化反应的温度较佳的为20～40℃。所述的生物转化反应的时间以反应完全为准，一般为1-24小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取(R)-邻氯扁桃酸甲酯。

本发明的第二方面提供一种重组载体，其含有编码醛酮还原酶和编码葡萄糖脱氢酶的碱基序列；或者含有在保持由该碱基序列编码的醛酮还原酶或者葡萄糖脱氢酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

本发明中，所述的重组葡萄糖脱氢酶可以是现有的任何来源的葡萄糖脱氢酶，只要能够在所在的基因工程菌中表达且可以实现辅酶的再生即可。较佳的，所述的重组葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，更佳的是氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：3所示的重组葡萄糖脱氢酶；或者是在保持由该葡萄糖脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：3所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

本发明中，所述的编码醛酮还原酶的碱基序列可以是常规，也可以是按照密码子的间并性，进行了优化适合在宿主细胞中有效表达重组醛酮还原酶。较佳的是来源于枯草芽孢杆菌的醛酮还原酶基因，更佳的是序列表SEQID NO：1的第1至843位所示的碱基序列；或者含有在保持由该碱基序列编码的醛酮还原酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

本发明中，所述的编码葡萄糖脱氢酶的碱基序列同样的可以是常规，也可以是按照密码子的间并性，进行了优化适合在宿主细胞中有效表达重组葡萄糖脱氢酶。较佳的是来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶基因，更佳的是序列表SEQ ID NO：1的第859至1644位所示的碱基序列，或者含有在保持由该碱基序列编码的葡萄糖脱氢酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

本发明中，所述的重组载体的可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET28a。本发明的重组载体可以按照本领域的常规方法制备得到。本发明的一较佳实施例是通过下述方法制得本发明的重组载体：根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的醛酮还原酶ytbE基因设计引物(该引物较佳的如上游引物：CGCGGATCCATGACAACACATTTACAAGCAAAAG；下游引物：CCGGTCGAGTTAAAAATCAAAGTTGTCCGGATC。)，以枯草芽孢杆菌全基因组为模板进行PCR扩增得到编码醛酮还原酶的基因片段，将PCR扩增出来的目的片段回收。将所得到的编码醛酮还原酶(AKR)的基因片段酶切后连接到pET28a质粒上，构建得到重组质粒pET28a-AKR。将重组质粒pET28a-AKR进行XhoI单酶切并去磷酸化；根据Genbank中已报道的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的葡萄糖脱氢酶基因(GDH)序列设计引物，其中引物5’端引入pET28a-AKR上经过单酶切后切口两端15bp的序列(该引物较佳的如上游引物：TGGTGGTGGTGGTGCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA；下游引物：ACTTTGATTTTTAACAAGGAGATATACATATGTATCC)，以枯草芽孢杆菌全基因组为模板进行PCR扩增GDH基因片段，将PCR扩增出来的目的片段回收后，利用clone EZ试剂盒通过基因同源重组的方法将目的基因重组到单酶切后的pET28a-AKR上，形成同时含有醛酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因序列的重组质粒pET28a-AKR-GDH。

本发明的第三方面提供一种基因工程菌，其包含如上所述的本发明的重组载体。该基因工程菌能够同时表达醛酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，实现细胞内辅酶的高效再生。其可通过将本发明的重组载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的还原酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coli BL21(DE3)。将前述重组载体pET28a-AKR-GDH转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-AKR-GDH。

本发明的第四方面提供一种发酵培养如上所述的基因工程菌的方法，包括将如上所述的基因工程大肠杆菌接种至含卡那霉素(卡那霉素浓度为10～200μg/ml，优选50μg/ml)的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7(优选0.6)时，加入终浓度为0.1-1mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，继续诱导8-16小时。将发酵液离心，即得重组菌的湿菌体，再经冷冻干燥即得重组菌的冻干细胞。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的共表达醛酮还原酶和葡萄糖脱氢的基因工程菌可以高效高选择性地制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯。与现有报道的生物还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法相比，本发明的基因工程菌整细胞可以在不额外添加辅酶的情况下，催化高浓度邻氯苯甲酰甲酸甲酯的完全转化成单一构型的(R)-邻氯扁桃酸甲酯，催化效率高、立体选择性强。在不加入辅酶的情况下，50g/L冻干细胞可以催化400g/L邻氯苯甲酰甲酸甲酯完全转化生成光学纯的(R)-邻氯扁桃酸甲酯。若在加入1mmol/L辅酶的情况下，30g/L冻干细胞可以完全转化600g/L邻氯苯甲酰甲酸甲酯生成光学纯的(R)-邻氯扁桃酸甲酯。本发明的方法是目前为止生物还原法制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯生产效率最高的方法。由于反应体系中不需要额外添加价格昂贵的辅酶，极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成畅销药物氯吡格雷的手性中间体方面具有很好的工业应用前景。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1为醛酮还原酶基因的PCR扩增产物电泳图谱。其中，1、醛酮还原酶基因的PCR扩增产物；2、Marker(Marker II，北京天根生化科技有限公司)。

图2为葡萄糖脱氢酶基因的扩增图谱。其中，1、葡萄糖脱氢酶基因的扩增产物；2、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图3质粒pET28a-AKR的单酶切分析图谱。其中，1、pET28a-AKR单酶切产物；2、DNA Marker(Marker IV，北京天根生化科技有限公司)。

图4为重组质粒pET28a-AKR-GDH的构建示意图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

下列实施例中材料的来源为：

表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。

Clone EZ重组克隆试剂盒购自GenScript公司。

实施例1～4过程如图4所示。

实施例1 醛酮还原酶基因的克隆

根据Genbank中已收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)的还原酶ytbE的基因序列(Gene ID 937984)，设计PCR引物如下：

上游引物：CGCGGATCCATGACAACACATTTACAAGCAAAAG；

下游引物：CCGGTCGAGTTAAAAATCAAAGTTGTCCGGATC。

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为XhoI酶切位点。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168(从美国俄亥俄州州立大学杆状菌遗传库存中心，BGSC购买)的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 12μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性45s；(3)60℃退火1min；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(图1)，即醛酮还原酶基因。

实施例2 重组质粒pET28a-AKR的制备

将实施例1回收所得的醛酮还原酶基因目标条带在37℃用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经BamHI和XhoI酶切后的质粒pET28a，在4℃下连接过夜得到重组质粒pET28a-AKR。

实施例3 葡萄糖脱氢酶基因的克隆

根据Genbank中已收录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的葡萄糖脱氢酶基因序列(Gene ID 938261)，设计特异性引物：

上游引物：TGGTGGTGGTGGTGCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAA；

下游引物：ACTTTGATTTTTAACAAGGAGATATACATATGTATCC。

以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 15μl，上游引物和下游引物各1μl(0.3μmol/L)，DNA模板1μl(0.1μg)和ddH₂O 12μl。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性5min；(2)94℃，变性45s；(3)57℃退火1min；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复35次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～900bp区间的目标条带(图2)，即葡萄糖脱氢酶基因扩增产物。

实施例4 重组质粒pET28a-AKR-GDH的制备

将实施例2中所得质粒pET28a-AKR在37℃用限制性内切酶XhoI单酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段(图3)。将线性化质粒pET28a-AKR与实施例3回收所得葡萄糖脱氢酶基因的扩增产物目标条带进行同源重组。反应体系为：线性化载体6μl，葡萄糖脱氢酶基因的扩增产物8μl，10×CloneEZ缓冲液2μl，CloneEZ酶2μl和ddH₂O 2μl。将混合物在25℃放置30分钟，冰上保持5分钟，然后立即转化E.coli DH5α感受态细胞，涂在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养至长出单菌落后，抽提所得质粒即为重组质粒pET28a-AKR-GDH，经DNA测序，基因全长1644bp，碱基序列如序列表中SEQ ID No：1所示。其中，从第1～第843位是醛酮还原酶基因的编码序列，从第859～第1644位是葡萄糖脱氢酶基因的编码序列。

实施例5 重组菌的制备及培养

将实施例4所得重组质粒重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-AKR-GDH。

将上述所得的重组大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100ml LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)的500ml三角瓶中，置37℃、180rpm摇床培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，将所得的静息细胞冷冻干燥得冻干细胞。

实施例6 重组菌催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原

取0.3g实施例5所得的重组大肠杆菌的冻干细胞悬浮于10ml磷酸-磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.5)中，加入6g底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯，9g葡萄糖和10μmol NADP⁺。在30℃，磁力搅拌下反应22h。反应结束后用乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏除去乙酸乙酯并真空干燥，即得(R)-邻氯扁桃酸甲酯。用气相色谱(手性毛细管柱CP-Chirasil-DEX CB，载气氮气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温180℃)和液相色谱(手性OD-H柱，流动相：正己烷/异丙醇＝97/3，流速1ml/min，检测器波长254nm)分析测定底物转化率和还原产物的ee值。核磁共振分析产物纯度，旋光仪测定比旋光度。结果如下：转化率100％；分离得率92％；ee值＞99.9％；

¹H NMR(CDCl₃，500Hz)：3.76(s，4H)，5.58(s，1H)，7.25-7.29(m，2H)，7.38-7.41(m，2H)。

实施例7 重组菌催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯的不对称还原

取5g实施例5所得的重组大肠杆菌的冻干细胞悬浮于100ml磷酸-磷酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 6.5)中，加入40g底物邻氯苯甲酰甲酸甲酯，60g葡萄糖。在30℃，机械搅拌(400rpm)下反应5h。反应结束后用乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，获得37.2g(R)-邻氯扁桃酸甲酯，ee值＞99.9％。

Claims

1.一种生物催化不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯的方法，包括在pH 6-8中，在葡萄糖的存在下，以共表达重组还原酶和重组葡萄糖脱氢酶的基因工程菌湿菌体或其冻干细胞为催化剂，以邻氯苯甲酰甲酸甲酯为底物，进行生物转化反应，其特征在于，所述的重组还原酶是重组醛酮还原酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组醛酮还原酶来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：2所示；或者是在保持由该醛酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还加入辅酶NADP⁺，所述的NADP⁺用量不超过1.0mmol/L。

4.一种重组载体，其特征在于，含有编码醛酮还原酶和编码葡萄糖脱氢酶的碱基序列；或者含有在保持由该碱基序列编码的醛酮还原酶或者葡萄糖脱氢酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，

所述的编码醛酮还原酶的碱基序列，

(1)是编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：2所示的重组醛酮还原酶的碱基序列；或者是编码在保持由该醛酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的碱基序列；或者

(2)是序列表SEQ ID NO：1的第1至843位所示的碱基序列；或者是在保持由该碱基序列编码的醛酮还原酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列；

所述的编码葡萄糖脱氢酶的碱基序列，

(1)是编码氨基酸序列如序列表中SEQ.ID NO：3所示的重组葡萄糖脱氢酶的碱基序列；或者是编码在保持由该葡萄糖脱氢酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中SEQ.ID NO：3所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列的碱基序列；

(2)是序列表SEQ ID NO：1的第859至1644位所示的碱基序列；或者是在保持由该碱基序列编码的葡萄糖脱氢酶的催化活性的前提下，由插入、缺失或替换该碱基序列中至少一个碱基而得到的变异的碱基序列。

6.如权利要求4或5所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体是质粒pET28a。

7.一种基因工程菌，其特征在于，包含如权利要求4～6任一项所述的重组载体。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌为大肠杆菌。

9.如权利要求7或8所述的基因工程菌在生物催化不对称还原邻氯苯甲酰甲酸甲酯制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯中的应用。

10.一种发酵培养如权利要求8所述的基因工程菌的方法，其特征在于，包括将如权利要求8所述的大肠杆菌接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5-0.7时，加入终浓度为0.1-1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，继续诱导8-16小时。