CN106995808B

CN106995808B - 一种重组转氨酶及其应用

Info

Publication number: CN106995808B
Application number: CN201710288834.0A
Authority: CN
Inventors: 石利平; 陈峻青; 龚仕荣; 徐春涛; 常斌; 仲召亮; 刘璇; 庞小召; 彭银城; 何义; 刘思琪
Original assignee: Suqian Alfa Technology Co Ltd
Current assignee: Suqian Alfa Technology Co Ltd
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2037-04-27
Also published as: CN106995808A

Abstract

本发明公开了一种重组转氨酶及其应用。一种高活性的重组转氨酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因如SEQ ID NO.1所示。一种制备所述的重组转氨酶的方法，包括发酵培养含有上述编码基因的基因工程菌，以及收集和制备重组转氨酶。本发明所述的重组转氨酶应用于不对称催化合成手性胺类化合物，特别是用于合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑丁酸甲酯。本发明所涉及的酶具有优良的对映体选择性和催化活力，且其催化的反应条件温和，反应转化率和产物的浓度高，易于大规模操作，具有很好的应用前景。

Description

一种重组转氨酶及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组转氨酶及其应用。

背景技术

生物催化是以酶或整体细胞为生物催化剂所进行的化学反应，具有反应条件温和、催化效率高、立体选择性好、副产物少、能耗低、催化剂无毒且可降解等绿色生物生产的典型特征，受到了广泛的关注和重视，也是各国科技与产业发展的战略重点。

光学纯手性胺是制备多种药物，如抗高血压药、抗抑郁药、抗癌药、抗真菌药物等及其中间体的重要手性砌块，其大规模制备具有较大的经济效益和应用价值。目前手性胺的主要制备方法包括化学合成、化学及酶法拆分以及酶催化合成，其中酶催化不对称合成方法更具优势。

转氨酶(transaminase)是不对称合成光学纯手性胺的关键酶，为辅酶磷酸吡哆醛(PLP)依赖型，在动、植物和微生物中分布广泛。其中ω-转氨酶是从前手性酮出发制备光学纯胺类化合物的高效催化剂，其强大的催化活力使其成为了不对称合成手性胺类化合物的重要选择之一一。

西他列汀是第一个用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂类药物，可抑制胰高血糖素的分泌和胰岛β细胞增殖及提高葡萄糖耐受水平，其降糖作用较为适中，不引起患者水肿及体重增加，导致低血糖的风险较小，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀单独使用或与其他降糖药合用，均可达到降糖的目的。

酶催化合成西他列汀中间体具有反应条件温和、反应专一性强、副反应少、产物的收率和光学纯度高、产物容易分离纯化等优点，具有很好的应用前景。本发明开发了一种催化活性高、对映选择性好、底物和有机溶剂耐受性好的重组转氨酶，可用于催化合成手性胺化合物，特别是催化合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有优良的立体对映体选择性和催化活力的重组转氨酶，该转氨酶的编码基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其制备方法，以及该重组转氨酶突变体在催化制备手性胺化合物中的应用。特别的，将该重组转氨酶用于西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的制备。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种高活性的重组转氨酶突变体，以SEQ ID NO.3所示的基因编码的米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)野生型转氨酶为出发酶；所述的重组转氨酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中SEQ ID NO.3所示的核酸来源于米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)。本发明所述SEQ ID NO.3所示的核酸可以从米曲霉(Aspergillus oryzaeRIB40)的基因组中分离获得，也可以从含有SEQ ID NO.3所示核酸的重组表达载体或者重组转化体中分离获得，也可以人工合成获得。

一种编码本发明所述的重组转氨酶突变体的基因，其核苷酸序列选自SEQ IDNO.1。

一种包含本发明所述的重组转氨酶突变体编码基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组转氨酶基因的核酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒pET21a。

一种包含本发明的重组转氨酶突变体编码基因或其重组表达载体的重组表达转化体，本发明优选大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒转化至大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本发明优选的基因工程菌。

一种制备所述的重组转氨酶的方法，包括发酵培养该基因工程菌，以及收集和制备重组转氨酶。

所述方法包括在一定生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组转氨酶的步骤；所述的生产罐发酵条件优选：DO 35％以上，空气流量1:1.5vvm。

本发明所述的重组转氨酶应用于不对称合成手性胺类化合物，特别是用于合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。

本发明重组转氨酶催化反应如下：

优选：在pH 7.0～9.0的反应液中，在磷酸吡哆醛存在下，在本发明所述的重组转氨酶突变体作用下，以化合物A为底物不对称酶催化还原制备光学手性胺化合物

其中，R为烷基或取代杂芳基，优选C_nH_2n+1和苄基，其中n选自1～8的整数。

有益效果：

本发明开发到一种具有优良的对映体选择性和催化活力的重组转氨酶突变体，用于催化合成手性胺化合物。本发明的重组转氨酶的辅酶为磷酸吡哆醛。

本发明所涉及的酶具有优良的对映体选择性和催化活力，且其催化的反应条件温和，反应转化率和产物的浓度高，易于大规模操作，具有很好的应用前景。

具体实施方式

实施例1基因工程菌的建立

根据Genbank收录的米曲霉(Aspergillus oryzae RIB40)转氨酶的基因序列(NCBI登录号：XM_001818514)，人工合成该基因片段，通过PCR扩增扩展该片段(片段两侧加NdeⅠ和BamHⅠ内切酶基因片段)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入pET21a质粒中，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立转氨酶基因工程菌。其中PCR扩增转氨酶基因的引物为：正向引物F1：GCGCACATATGTGAACAAAGTATTTTCCGGTT(SEQ ID NO.4)，反向引物R1：GCGTGGGATCCTCATGGCCCCTGTAATCGATA(SEQ IDNO.5)。

实施例2转氨酶突变体基因的获得

本研究利用易错PCR方法，对转氨酶进行了蛋白质工程改造。易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。本研究采用保真度较低的聚合酶在特定措施下很容易向扩增产物中掺入随机突变的原理，同时利用Mn²⁺替代天然辅助因子Mg²⁺增加易错概率。

50μl PCR反应体系为：10×扩增缓冲液5μl，4种dNTP混合物(2.5mmol/L)各4μl，引物各50pmol，模板DNA1.5μg，Taq DNA聚合酶0.5μL，Mg²⁺2mmol/L，加双蒸水至50μl。

PCR扩增程序为：96℃预变性4min，96℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸120s，进行30个循环；于72℃下继续延伸10min，冷却至4℃。扩增的基因片段经检测后用1％琼脂糖凝胶电泳回收，并纯化扩增产物，去除多余的引物。

实验流程

按照实施例1的方法PCR扩增转氨酶基因并利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET21a质粒中，作为基因突变模板；

易错PCR扩增转氨酶的基因，扩增后基因片段链接至pET21a载体，将连接后的载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中建立转氨酶基因突变体库；利用大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，pET21a质粒为载体，表达扩展转氨酶，高通量筛选高活性突变株；突变后对高活性转氨酶基因进行鉴定。筛选出的高活性转氨酶突变体基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

转氨酶基因引物为：正向引物F1：GCGCACATATGTGAACAAAGTATTTTCCGGTT(SEQ IDNO.4)，反向引物R1：GCGTGGGATCCTCATGGCCCCTGTAATCGATA(SEQ ID NO.5)。

按实施例1所述方法构建表达该转氨酶突变体的基因工程菌。

在获得突变体序列后，也可以通过化学合成方式合成该基因序列后利用NdeⅠ和BamHⅠ内切酶位点将基因插入至pET21a质粒中，再转化大肠杆菌构建含转氨酶突变体的重组大肠杆菌基因工程菌。

实施例3转氨酶的摇瓶制备

将实施例1、实施例2构建所得的重组大肠杆菌分别接种至50mL含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)中，于37℃，200rpm的摇床中振荡培养16小时以上。转接2mL菌体培养液于50mL含氯霉素(或氨苄青霉素)的LB培养基中，置于同样条件下振荡培养，定时测量菌液在600nm下的吸光值以监测菌体生长密度。当菌液的OD 600值在0.6-0.8时，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.2mmol/L，30℃诱导表达12小时以上。表达后通过离心(6000rpm，20min，4℃)收集菌体，并用磷酸缓冲液(pH7.2，50mM)清洗两次，分散于同样预冷的缓冲液中，于冰水浴中进行超声破碎。离心(8000rpm，30min，4℃)收集上清液，浓缩、冷冻干燥得到重组转氨酶或重组转氨酶突变体的粗品粉末。

实施例4重组转氨酶活力的测定

以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯为底物，HPLC检测实施例3制备的重组转氨酶或重组转氨酶突变体的活性，筛选出能够表达具有最高转氨酶酶活的基因工程菌。使用岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配备C18柱(150mm×4.6mm,5um)，流动相0.1％三氟乙酸水溶液-甲醇(40:60)，检测波长254nm，柱温30℃，流速1.0mL/min。

检测条件为：反应体系总体积2mL，其中包含0.5-50μmol/L底物，200μL 1mol/L异丙胺盐酸盐，100μmol磷酸吡哆醛，5％-25％(v/v)DMSO，0.6mg酶冻干粉，45℃反应30min，测定底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的消耗量或产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯的生成量。

酶活力单位(U)的定义为：在上述反应条件下，毎分钟催化生成1μmol(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯所需的酶量或每分钟消耗1μmol底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯所需的酶量。

测得重组转氨酶突变体的比酶活为991U/g，比野生型的酶活提高了3倍以上。

实施例5重组转氨酶的发酵制备

发酵培养基成分为：硫酸铵0.82g/L，NaCl 9.2g/L，磷酸氢二钾11.9g/L，磷酸二氢钾5.9g/L，酵母提取物10.8g/L，蛋白胨7.4g/L，甘油15.9g/L，钼酸铵四水合物0.01g/L。发酵液通过加入氨水维持pH 7.0，罐温37℃，搅拌转速300-1300rpm，发酵过程中控制DO 35％以上，空气流量1:1.5vvm。接入种子液的OD600为0.72，接入量为发酵液体积的10-12％，发酵液OD600达0.8时加入IPTG至终浓度1mmol/L以诱导转氨酶的表达，此后继续发酵16小时，罐温25℃。发酵过程中通过加入含甘油450g/L、酵母提取物135g/L，氯化铵10.2g/L、钼酸铵四水合物0.03mg/L的溶液维持培养物的生长。发酵结束后将培养物冷却至4℃保存。

将发酵液经离心(8000rpm，15min)、细胞破碎、冷冻干燥等常规处理，制备得到转氨酶多肽冻干粉并于-80℃保存。

实施例6重组转氨酶催化合成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯

向2000L反应釜中加入32.6kg底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，132kg异丙胺盐酸盐，0.55kg 5-磷酸吡哆醛(PLP)，550L DMSO，随后向釜内投加按照实施例5方法制备的重组转氨酶冻干粉1.05kg，在氮气保护下，升温至45℃，并加入4mol/L异丙胺水溶液调节反应液的pH为8.5。反应过程中通过加入4mol/L异丙胺水溶液控制反应液的pH为8.5-9.0，搅拌反应至底物含量降至1％以下时终止反应。

反应终止后经离心、萃取、脱色等操作，得到产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯：¹H NMR(CDCl₃)d7.08(m,1H),6.94(m,1H),3.85(s,2H),3.77(s,3H),3.55(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)d 197.9,167.1,156.9,154.5,150.4,147.9,145.5,119.4,117.0,105.5,52.4,48.3,41.9。经HPLC分析，确定底物转化率97.1％，产物ee 99％。

产物ee值的具体分析条件为：Chiralpak AD-H色谱柱(150mm×4.6mm,5um)，流动相正己烷-异丙醇(80:20，v/v)；检测波长254nm，流速1mL/min，柱温30℃。

<110> 宿迁阿尔法科技有限公司

<120> 一种重组转氨酶及其应用

<160> 5

<210> 1

<211> 930

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组转氨酶突变体的编码基因

<400> 1

atgacatcta tgaacaaagt attttccggt tactacgagc gcaaggctcg tctagataac 60

agtgacaacc gctttgcgaa aggaattgcc tacgtccagg gatctttcgt cacactcgcc 120

gacgcacgag tcccactcct cgacgagggt ttcatgcata gcgacctcac gtacgatgtg 180

ccatcggtct gggatgggcg ctttttccgc cttgatgatc atctcagtcg attggaagat 240

agttgtgaaa agatgcgact gaagatccca ctgtccaggg actttgtcca gcaaacccta 300

agggagatgg ttgctaagag tggaatcgaa gatgcctttg tggagctgat cgtcactcgt 360

ggcctgaaag gggtccgtgg caataagcca gaggatcttt tcgacaatca tctctatctg 420

atcgtcatgc cgtatgtctg ggtgatggag cccgccatcc aacataccgg aggtactgcg 480

atcattgccc gtacatgggg ggacttgaca cggggtctat ttgaagcggc tgaccgtggc 540

gcggattacc catttctctc agatggagat accaatctca cagaaggatc cggtttcaat 600

atagtgttgg ttaaagatgg tattatctac acgcccgacc gtggtgttct ggaaggcatt 660

acacgtaaga gtgtttttga tattgcccag gtcaagaaca tcgaggtccg cgttcaggtg 720

gtgccactcg aacatgccta tcacgccgat gagatattca tgtgtactac tgctggtggc 780

attatgccta tcacgaaact cgatgggaaa ccgatccgga atggagaagt cggtcccctt 840

actacaaaga tatgggatga gtactgggcg atgcactatg acccgaaata tagctctgct 900

atcgattaca ggggccatga gggtaactga 930

<210> 2

<211> 309

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 重组转氨酶突变体

<400> 2

Met Thr Ser Met Asn Lys Val Phe Ser Gly Tyr Tyr Glu Arg Lys Ala

5 10 15

Arg Leu Asp Asn Ser Asp Asn Arg Phe Ala Lys Gly Ile Ala Tyr Val

20 25 30

Gln Gly Ser Phe Val Thr Leu Ala Asp Ala Arg Val Pro Leu Leu Asp

35 40 45

Glu Gly Phe Met His Ser Asp Leu Thr Tyr Asp Val Pro Ser Val Trp

　　50 55 60

Asp Gly Arg Phe Phe Arg Leu Asp Asp His Leu Ser Arg Leu Glu Asp

65 70 75 80

Ser Cys Glu Lys Met Arg Leu Lys Ile Pro Leu Ser Arg Asp Phe Val

85 90 95

Gln Gln Thr Leu Arg Glu Met Val Ala Lys Ser Gly Ile Glu Asp Ala

100 105 110

Phe Val Glu Leu Ile Val Thr Arg Gly Leu Lys Gly Val Arg Gly Asn

115 120 125

Lys Pro Glu Asp Leu Phe Asp Asn His Leu Tyr Leu Ile Val Met Pro

130 135 140

Tyr Val Trp Val Met Glu Pro Ala Ile Gln His Thr Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ile Ile Ala Arg Thr Trp Gly Asp Leu Thr Arg Gly Leu Phe Glu Ala

165 170 175

Ala Asp Arg Gly Ala Asp Tyr Pro Phe Leu Ser Asp Gly Asp Thr Asn

180 185 190

Leu Thr Glu Gly Ser Gly Phe Asn Ile Val Leu Val Lys Asp Gly Ile

195 200 205

Ile Tyr Thr Pro Asp Arg Gly Val Leu Glu Gly Ile Thr Arg Lys Ser

210 215 220

Val Phe Asp Ile Ala Gln Val Lys Asn Ile Glu Val Arg Val Gln Val

225 230 235 240

Val Pro Leu Glu His Ala Tyr His Ala Asp Glu Ile Phe Met Cys Thr

245 250 255

Thr Ala Gly Gly Ile Met Pro Ile Thr Lys Leu Asp Gly Lys Pro Ile

260 265 270

Arg Asn Gly Glu Val Gly Pro Leu Thr Thr Lys Ile Trp Asp Glu Tyr

275 280 285

Trp Ala Met His Tyr Asp Pro Lys Tyr Ser Ser Ala Ile Asp Tyr Arg

290 295 300

Gly His Glu Gly Asn

305

<210> 3

<211> 930

<212> DNA

<213> 米曲霉（Aspergillus oryzaeRIB40）

<220>

<223> 转氨酶基因

<400> 3

atgacatcta tgaacaaagt attttccggt tactacgagc gcaaggctcg tctagataac 60

agtgacaacc gctttgcgaa aggaattgcc tacgtccagg gatctttcgt cccactcgcc 120

gacgcacgag tcccactcct cgacgagggt ttcatgcata gcgacctcac gtacgatgtg 180

ccatcggtct gggatgggcg ctttttccgc cttgatgatc atctcagtcg attggaagat 240

agttgtgaaa agatgcgact gaagatccca ctgtccaggg acgaagtcaa gcaaacccta 300

agggagatgg ttgctaagag tggaatcgaa gatgcctttg tggagctgat cgtcactcgt 360

ggcctgaaag gggtccgtgg caataagcca gaggatcttt tcgacaatca tctctatctg 420

atcgtcatgc cgtatgtctg ggtgatggag cccgccatcc aacataccgg aggtactgcg 480

atcattgccc gtacatgggg ggacttgaca cggggtctat ttgaagcggc tgaccgtggc 540

gcggattacc catttctctc agatggagat accaatctca cagaaggatc cggtttcaat 600

atagtgttgg ttaaagatgg tattatctac acgcccgacc gtggtgttct ggaaggcatt 660

acacgtaaga gtgtttttga tattgcccag gtcaagaaca tcgaggtccg cgttcaggtg 720

gtgccactcg aacatgccta tcacgccgat gagatattca tgtgtactac tgctggtggc 780

attatgccta tcacgaaact cgatgggaaa ccgatccgga atggagaagt cggtcccctt 840

actacaaaga tatgggatga gtactgggcg atgcactatg acccgaaata tagctctgct 900

atcgattaca ggggccatga gggtaactga 930

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物F1

<400> 4

gcgcacatat gtgaacaaag tattttccgg tt 32

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物R1

<400> 5

gcgtgggatc ctcatggccc ctgtaatcga ta 32

Claims

1.一种磷酸吡哆醛依赖的重组转氨酶突变体，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的重组转氨酶突变体的基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.一种含有权利要求2所述的基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于表达载体系统为pET21a。

5.一种用于生产权利要求1所述的重组转氨酶突变体的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌中含有权利要求2所述的基因。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌的宿主细胞为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21(DE3)。

7.一种权利要求1所述的重组转氨酶突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：培养权利要求5~6中任一项所述的基因工程菌，获得重组表达的重组转氨酶突变体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法包括在生产罐发酵条件下，进行工业化制备所述重组转氨酶突变体的步骤；所述的生产罐发酵条件：DO 35%以上，空气流量1:1.5 vvm。

9.权利要求1所述的重组转氨酶突变体作为催化剂在制备(R)-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯中的应用。

10.一种合成(R)-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯的方法，其特征在于在pH7.0~9.0的反应液中，在磷酸吡哆醛存在下，在权利要求1所述的重组转氨酶突变体作用下，以3-羰基- 4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯为底物不对称酶催化还原制备(R)-3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)-丁酸甲酯。