CN108866021B - 一种转氨酶突变体及在制备西他列汀中间体中的应用 - Google Patents

一种转氨酶突变体及在制备西他列汀中间体中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨基转移酶突变体及其制备西他列汀中间体的应用，所述的应用以含有氨基转移酶编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8‑9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30‑45℃、搅拌速度100‑250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀；本发明方法的总收率约81％，产物e.e.值达到99％。

Description

一种转氨酶突变体及在制备西他列汀中间体中的应用
(一)技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体地说，是ω-转氨酶及其突变体酶在制备光学纯西他列汀中间体中的方法，包括转氨酶、突变体、编码基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌和重组酶、以及应用。
(二)背景技术
西他列汀(sitagliptin)是由美国Merck公司和Codexis公司研制和开发，是首个获得FDA批准用于治疗Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂(2016年10月)。DPP-IV是一个以同型二聚体形式存在于细胞膜上的多功能酶，它可以裂解包括胰高血糖素样肽-1和抑胃肽在内的多种肽类激素，而这两者与II型糖尿病有着密切联系。DPP-IV抑制剂通过抑制DPP-IV减少GLP-1的降解，增加GLP-1的血浆浓度，从而改善餐后血糖。此外，DPP-IV抑制剂还可抑制GIP、垂体腺苷酸环化酶激活多肽和胃泌素释放肽等参与调节血糖的其他肽类的降解。西他列汀能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。西他列汀的商品名为捷诺维(Januvia)，目前已在全世界70多个国家批准使用，近年来销售额都在40亿美元左右(2016年与二甲双胍联合销售合计61亿美元)，是国际上药物销售额前20强的药物。
西他列汀及其中间体的合成既有完全化学法合成，也有化学法与酶法相结合的。对于化学-酶法而言关键就是要获得一种ω-转氨酶，其能够催化不对称转氨反应得到光学纯的西他列汀中间体。
美国专利US6699871公开了一种西他列汀中间体的化学合成方法，采用手性源来诱导出手性的alpha-氨基酸，而后通过重氮化反应产生beta-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。
国际专利W02005003135公开了以S-苯甘氨酰胺来诱导催化氢化而合成手性胺的合成方法(默克公司)。该路线需要两次催化氢化，第一次所用的铂催化剂价格昂贵，第二次脱保护时需要用大量的Pd(OH)2-C催化剂，成本较高，e.e.值为96％，需要进一步重结晶。
国际专利W02004087650公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成路线，利用手性钌催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52％，工艺中用到高压氢气，立体选择性也不高。
国际专利W02007050485公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成方法，采用了手性锗催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84％，e.e.值94％，但该方法需要用昂贵的锗手性催化剂，去除与回收也较为困难。
美国专利US8293507公开了Codexis公司对节杆菌来源的转氨酶(ATA117)进行改造得到的生物催化剂代替上述工艺中的锗催化剂，转氨得到的产物ee值达到99％。
以下专利对于合成西他列汀中间体的生产方法，公开了工艺路线。
中国专利CN102838511公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采用格式试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成beta-羟基酸，该方法总收率仅40％，而且采用剧毒氰化物，应用受限。
中国专利CN102485718公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体合成的路线，通过采用甲硫氨酸作为手性源进行合成，但是产率仅14％。
中国专利CN103014081公开了苏州汉酶公司利用转氨酶将3-碳基-4-(2，4，5-三氟苯基)-丁酸甲酯转氨化为(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，但是并没有公开具体转氨酶的序列以及克隆方法。
中国专利CN105018440公开了南京博优康远生物医药科技有限公司利用分支杆菌转氨酶的突变体将3-碳基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯转化为(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，Boc保护，脱保护后得到西他列汀，收率为87％。
近年来，由于化学-酶法具有高选择性及环境优化的优势，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。ω-转氨酶是生产西他列汀的关键酶。许多ω-转氨酶基因已被克隆，其中部分转氨酶的基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得了酶活和选择性都较高的基因工程菌。尽管如此，对于R-型选择性转氨的天然ω-转氨酶报道很少，且这些ω-转氨酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应用范围。随着定向进化技术的发展，蛋白质工程越来越多地被用于改造酶的底物特异性，筛选具有较宽底物谱的新型转氨酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物及其中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。
(三)发明内容
本发明针对现有生产西他列汀中间体工艺中存在的缺陷(立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题)，提供了一种转氨酶突变体、编码基因、重组载体、重组基因工程菌，以及一种酶法不对称转氨得到西他列汀(或西他列汀酯类)中间体，该方法原料转化率高、生产成本低、收率高。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种源于节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99(在专利中公开，申请号CN201110224295.7)的ω-转氨酶，所述转氨酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种所述转氨酶在生物催化合成西他列汀中间体中的应用(反应式见反应式1)，所述的应用以含有转氨酶编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀中间体的前体酮([1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮])为底物，以二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀中间体(得(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮)；所述反应体系中，湿菌体用量为10～50g/L(优选50g/L)，底物终浓度为2-50g/L，二甲基亚砜体积终浓度为10-20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。
反应式1：
Figure BDA0001678504200000031
第二方面，本发明提供一种转氨酶突变体，所述突变体的氨基酸序列为SEQ IDNO：4。所述SEQ ID NO：4所示突变体(核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示)是将SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第45位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第68位的甘氨酸取代为酪氨酸、第103位的异亮氨酸取代为亮氨酸、第128位的丝氨酸取代为丙氨酸、第157位的酪氨酸取代为丝氨酸、第327位的天冬氨酸取代为谷氨酸获得的。
本发明还涉及所述转氨酶突变体的编码基因构建的重组载体及所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
本发明还提供一种所述转氨酶突变体在生物催化合成西他列汀中间体中的应用，所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮([1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮])为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃(优选35℃)、搅拌速度100-250r/min(优选150r/min)的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀中间体((R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮)；所述反应体系中，湿菌体用量为10～50g/L(优选50g/L)，底物终浓度为2～50g/L(优选20g/L)，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％(v/v)(优选20％)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。
进一步，所述西他列汀中间体为西他列汀酯类中间体，所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以潜手性羰基化合物为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度25-35℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀酯类中间体；所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/L(优选50g/L)，底物终浓度为2～60g/L(优选50g/L)，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％(优选20％)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L；所述底物为下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。
本发明所述反应液分离纯化西他列汀中间体的方法为：反应结束后，用浓盐酸将反应液pH调至1.0，加入硅藻土吸附细胞，搅拌30min，过滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入1M盐酸(用量以能浸没滤渣a即可，优选与反应液体积比1.5:1)，搅拌30min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；合并滤液a和滤液b，用二氯甲烷萃取一次，获得有机相a和水相a，有机相a用1M盐酸萃取，获得有机相b和水相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节pH至12，再用二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c中再加入二氯甲烷萃取，获得有机相d和水相d，合并有机相c和有机相d并用饱和氯化钠水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，得到西他列汀中间体；所述硅藻土用量以反应液体积计为0.18g/mL。(以400mL反应体系为例)，I.用浓盐酸(质量分数为36％-38％)将反应液pH调至1.5，加入72g硅藻土吸附细胞，搅拌20min，抽滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入600ml的1M盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；II.合并滤液a和滤液b总计共约1.0L，以500mL二氯甲烷萃取一次，获得水相a和有机相a，有机相a用100ml的1M盐酸萃取，获得水相b和有机相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节pH至12再加入1.2L二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c中再加入800mL二氯甲烷萃取，获得有机相d和水相d，合并有机相c和有机相d；III.有机相c和有机相d用饱和氯化钠(36g/L)水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，最后得到高纯度西他列汀白色粉末23.1g，(白色粉末状)纯化收率95％，西他列汀中间体纯度大于99％。本发明所述滤液a-滤液c，滤渣a-滤渣c，有机相a-有机相d，水相a-水相d中的字母均无含义，为了便于表述而命名。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶编码基因或转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体。
本发明所述氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且具有转氨酶活性的衍生的氨基酸序列具有至少95％同一性的蛋白质，均属于本发明的保护范围。SEQID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从节杆菌(Arthrobacternitroguajacolicus)中分离获得，也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。两条氨基酸序列或两条核苷酸序列之间的同一性均可通过本领域常用的算法得到，优选采用NCBI Blastp和Blastn软件根据默认参数计算得到。
本领域技术人员所知，由于密码子的兼并性，编码SEQ ID No:2、4的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQ ID No:1、3。本发明的转氨酶基因还可以是通过在SEQ ID No:1、3适当引入替换、缺失、或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。
本发明还涉及含所述转氨酶、突变体基因的重组载体，利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
本发明将转氨酶基因(或者突变体基因)同表达载体pET28b连接，构建了含有转氨酶基因的异源表达重组质粒pET28b-MgTA(或pET28b-MgTAmut1)。将表达重组质粒pET28b-MgTA(或pET28b-MgTAmut1)转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，获得含有重组质粒pET28b-MgTA的重组大肠杆菌/pET28b-MgTA(或pET28b-MgTAmut1)。
本发明还涉及转氨酶基因在制备重组转氨酶中的应用，具体为：构建含有所述转氨酶基因(或转氨酶突变体基因)的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组转氨酶的菌体细胞，破碎后的转氨酶粗酶液以及纯化后转氨酶纯酶(或转氨酶突变体)。
本发明所述催化剂包括转氨酶及其突变体纯酶、相应的重组基因工程菌湿菌体、粗酶液、粗酶粉、纯酶液、纯酶粉等其他形态。
本发明SEQ ID No:2所示的ω-转氨酶和节杆菌来源的转氨酶ATA117-Rd11(美国专利US8293507)的氨基酸序列一致性仅为48％，具有显著差异性。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：针对己报道的不对称合成西他列汀及其中间体的总收率不高(一般低于50％)，立体选择性偏低(产物e.e.值普遍低于90％)、金属催化剂昂贵、生物催化剂不能直接以西他列汀前体酮为底物的问题，本发明提供了来源于一种节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99的转氨酶突变体(生物催化剂)，以西他列汀中间体前体酮(如：1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮)或西他列汀酯类中间体羰基底物(3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯)为底物，同时异丙胺为氨基供体，磷酸吡多醛为辅酶，进行生物催化反应、分离纯化制备高光学纯度的西他列汀中间体或西他列汀酯类中间体，该方法的总收率达到87％(包括转化得率及分离纯化收率)，产物e.e.值达到99％(立体选择性高)。
(四)附图说明
图1美国专利US6699871中西他列汀的化学合成路线。
图2国际专利W02005003135中西他列汀的化学合成路线。
图3国际专利W02004087650中默克公司关于西他列汀的合成路线。
图4国际专利W02007050485中西他列汀的合成方法。
图5中国专利CN102838511中西他列汀的合成方法。
图6中国专利CN105018440中西他列汀的合成路线。
图7为PMD18-T-MgTA重组质粒物理图谱；
图8为pET28b-MgTA重组质粒物理图谱；
图9为转氨酶基因PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000DNA Marker；泳道2和3为利用引物1和引物2扩增得到的转氨酶基因片段；泳道4和5为利用引物3和引物4扩增得到的转氨酶基因片段；
图10为转氨酶纯化后的SDS-PAGE图：泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为纯化后的转氨酶MgTA。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：转氨酶基因MgTA的扩增
根据Genbank收录的来自节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)的转氨酶基因测序信息为依据，用核酸快速提取仪提取节杆菌(Arthrobacter nitroguajacolicus)ZJUTB06-99(在专利中公开，申请号CN201110224295.7)的ω-转氨酶总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(ATGGGTATCGACACCGGTACCTC)、引物2(GTACTGGATAGCTTCGATCAGCG)的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度均为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNAPolymerase 1μL，无核酸水40μL。
采用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收纯化该片段，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4DNA连接酶作用下将该片段同pMD18-T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-MgTA见图7。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为1011bp(MgTA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。
实施例2：重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA的构建
根据实施例1中MgTA基因序列设计引物3(CCGCATATGGGTATCGACACCGGTACCTC)、引物4(TTGCTCGAGGTACTGGATAGCTTCGATCAGC)，并分别在引物3和引物4中引入了Nde I和Xho I限制性酶切位点(下划线标记)。在引物3和引物4的引发下，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，以重组质粒pMD18-T-MgTA为模板(实施例1中获得)，获MgTA基因序列，测序后利用NdeI和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28b-MgTA(图8)。将构建的表达载体pET28b-MgTA转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-MgTA的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-MgTA。
实施例3：转氨酶(ω-MgTA)的诱导表达
将实施例2获得的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-MgTA接种至含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以1％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心25min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于蛋白纯化。
实施例4：转氨酶(ω-MgTA)的分离纯化
将实施例3中获得的湿菌体以结合缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mMNaCl，10mM咪唑)重悬后，经超声破碎(冰浴条件下，240W破碎10min，工作2s暂停2s)，12000rpm离心40min，上清与经上述结合液平衡过的Ni亲和层析树脂孵育后，再用冲洗缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，20mM咪唑)冲洗至基本无杂蛋白，随后以洗脱缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液，含300mM NaCl，250mM咪唑)洗脱并收集目的蛋白，电泳鉴定纯度后合并目的蛋白并以透析缓冲液(50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液)透析48h(透析袋分子截留量14KD)。采用考马斯亮蓝法测定蛋白含量为1.8mg/mL，将酶液(酶活约150U/mg)用50mM，pH 8.0磷酸钠缓冲液稀释至终浓度为0.5mg/mL分装，冻存于-80℃(转氨酶MgTA蛋白电泳图见附图10，每小时催化底物生成1μmol产物所需要的酶量即为1个酶活力单位，用U表示)
实施例5：MgTA基因突变文库的建立
以实施例2中构建质粒pET28b-MgTA为模板，进行易错PCR。在在引物1(ATGGGTATCGACACCGGTACCTC)、引物2(GTACTGGATAGCTTCGATCAGCG)的作用下进行易错PCR。PCR反应体系(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度均为50μM的克隆引物1、引物2各0.5μM，质粒模板0.8ng/μL，Taq DNA Polymerase 2.5U，MnCl2 0.2mM，去离子水补足50μL。采用BioRad的PCR仪，PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。纯化易错PCR产物后，以该产物作为引物、实施例2中构建质粒pET28b-MgTA为模板进行大引物PCR，获得大引物PCR产物(即突变体文库1)。PCR体系：大引物10ng/μL，质粒模板1ng/μL，Pfu DNA Polymerase 2.5U。PCR反应条件：去A尾72℃5min，预变性96℃2min，96℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸4min，共25个循环，最后72℃延伸10min。大引物PCR产物的凝胶电泳图。
实施例6：MgTA基因突变文库1的筛选获得突变体1
将实施例5基因文库1转入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，在含有50μg/ml卡那霉素的LB抗性平板上挑取单克隆8327个，分别接种于含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中进行诱导表达，诱导条件如实施例3，获得8327个含有突变体基因的重组大肠杆菌湿菌体，即突变体湿菌体。
得到含有突变蛋白的大肠杆菌后，对20g/L低浓度西他列汀中间体前体酮进行生物转化筛选，催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：突变体1湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮，DMSO终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以含空载体的大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述突变体湿菌体作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)(50:50乙腈：水，10mM乙酸铵，0.8ml/min流速，205nm检测波长)，从6681个蛋白中挑选出底物的转化率最高的一个突变体pET28b-MgTAmut1，转化率为95％，e.e.>99％。突变体pET28b-MgTAmut1的核苷酸序列与氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。突变体1是将SEQ ID NO：2所示第45位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第68位的甘氨酸取代为酪氨酸、第103位的异亮氨酸取代为亮氨酸、第128位的丝氨酸取代为丙氨酸、第157位的酪氨酸取代为丝氨酸、第327位的天冬氨酸取代为谷氨酸。
采用实施例3方法获得突变体1湿菌体，采用实施例4方法获得突变体1纯酶(酶活约150U/mg)。
实施例7：重组转氨酶MgTA在制备西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的应用
以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA湿菌体或通过实施例4的方法得到MgTA纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]为底物，进行生物催化反应合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。
Figure BDA0001678504200000101
低底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或MgTA酶蛋白1mg，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮2g/L，DMSO终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，反应体系的底物的转化率为2.1％，e.e.>99％。
高底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或MgTA酶蛋白1mg，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，底物西他列汀前体酮50g/L，DMSO终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物不能被转化。
实施例8：重组转氨酶MgTA突变体1在制备西他列汀中间体中(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体或通过实施例4的方法得到MgTA突变体1纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]为底物，进行生物催化反应合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。
低底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或MgTA突变体1酶蛋白1mg，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，2g/L底物西他列汀前体酮，DMSO终浓度为10％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)。反应体系的底物浓度为2g/L时，底物的转化率为95％，ee>99％。
高底物浓度催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g或MgTA突变体1酶蛋白1mg，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，50g/L底物西他列汀中间体前体酮，DMSO终浓度为40％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)。底物的转化率为59％，e.e.>99％。
表1.重组MgTA及其突变体催化西他列挺前体酮不对称转氨的结果
Figure BDA0001678504200000111
进一步，实施例9-14介绍了重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备西他列汀酯类中间体中的应用
实施例9：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。
Figure BDA0001678504200000121
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，0.12mo1底物(3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯)约得到0.12mol 产物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯(28.3g)，底物的转化率为91％，e.e.>99％。
实施例10：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯。
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物的转化率为89％，e.e.>99％。
实施例11：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯。
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物的转化率为86％，e.e.>99％。
实施例12：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯。
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTA mut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物的转化率为85％，e.e.>99％。
实施例13：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯。
Figure BDA0001678504200000131
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。经验证该酶能够高选择性(e.e.>99％)转氨生成(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物的转化率为85％，ee>99％。
实施例14：重组转氨酶ω-MgTA突变体1在制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯中的应用
将实施例6中以实施例3方法获得的含有表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1湿菌体作为生物催化剂，以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯为底物，进行生物催化反应制备(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。
Figure BDA0001678504200000141
催化体系(15ml)终浓度组成及催化条件如下：湿菌体0.75g，pH 8-8.5三乙醇胺缓冲液，20g/L底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯，DMSO终浓度为20％(v/v)，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。反应条件：温度35℃、搅拌速度150r/min，反应时间36h。同样条件下，以无菌体加入的反应液作为空白对照，以大肠杆菌BL21/pET28b湿菌体代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28b-MgTAmut1作为阴性对照。反应结束后，取样进行HPLC检测(条件同实施例15)，底物的转化率为83％，e.e.>99％。
表2.转氨酶突变体1催化羰基化合物不对称转氨反应的结果
Figure BDA0001678504200000142
Figure BDA0001678504200000151
实施例15：西他列汀中间体前体酮、西他列汀(R)型中间体以及西他列汀的(S)型对映体的液相检测方法。
高效液相色谱仪器：Shimadzu LC-16系统-SPD-16紫外检测器和Hitachi 8DD-0801系统-1410紫外检测器。
检测转化率是色谱柱为ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：水：乙腈＝50:50，水相加乙酸铵10mM，流速0.8mL/min，柱温40℃，检测波长：205nm。西他列汀中间体前体酮的保留时间为4.0min。西他列汀中间体的保留时间分别为2.8min。
检测ee手性色谱柱为Chiralpak AD-H(150×4.6mm,5μm)，流动相为乙醇/正庚烷/二乙胺＝60:40:0.1，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长：205nm。西他列汀中间体前体酮和西他列汀中间体(R)型对映体的保留时间为10和5min左右。西他列汀中间体的(S)型对映体的保留时间为9.5min。(液相是Shimadzu LC-20AD系统-SPD20A检测器)
产物eep计算公式：
eep＝(CR-CS)/(CR+CS)×100％
CR为西他列汀的峰面积，Cs为S-对映体的峰面积。
实施例16：从反应体系中分离纯化得到高纯度西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮
取实施例11中的400mL反应液，用浓盐酸(质量分数为36％-38％)将pH调至1.5，加入72g硅藻土(中位粒径19.6μm)吸附细胞，搅拌20min。抽滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入600ml的1M盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；合并滤液a和滤液b总计共约1.0L，以500mL二氯甲烷(纯度>99.5％)萃取一次，获得水相a和有机相a，有机相a用100ml的1M盐酸萃取，获得水相b和有机相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节pH至12再加入1.2L二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c再加入800mL二氯甲烷萃取，获得水相d和有机相d，合并有机相c和有机相d用饱和氯化钠(36g/L)水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，最后得到白色粉末20.5g，经实施例15中的液相检测，收率为94％，西他列汀纯度为99.7％。西他列汀的总收率为81％。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 浙江工业大学、浙江永太科技股份有限公司、浙江永太药业有限公司
<120> 一种转氨酶突变体及在制备西他列汀中间体中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1011
<212> DNA
<213> 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)
<400> 1
atgggtatcg acaccggtac ctctaacctg gttgctgttg aaccgggtgc tatccgtgaa 60
gacaccccgg ctggttctgt tatccagtac tctgactacg aaatcgacta ctcttctccg 120
ttcgctggtg gtattgcttg gatcgaaggt gaatacctgc cggctgaaga cgctaaaatc 180
tctatcttcg acaccggttt cggtcactct gacctgacct acaccgttgc tcacgtttgg 240
cacggtaaca tcttccgtct gggtgaccac ctggaccgtc tgctggacgg tgctcgtaaa 300
ctgcgtatcg actctggtta caccaaagac gaactggctg acatcaccaa aaaatgcgtt 360
tctctgtctc agctgcgtga atctttcgtt aacctgacca tcacccgtgg ttacggtaaa 420
cgtaaaggtg aaaaagacct gtctaaactg acccaccagg tttacatctc cgctatcccg 480
tacctgtggg ctttcccgcc ggctgaacag atcttcggta ccaccgctgt tgttccgcgt 540
cacgttcgtc gtgctggtcg taacaccgtt gacccgacca tcaaaaacta ccagtggggt 600
gacctgaccg ctgcttcttt cgaagctaaa gaccgtggtg ctcgtaccgc tatcctgatg 660
gacgctgaca actgcgttgc tgaaggtccg ggtttcaacg tttgcatcgt taaagacggt 720
aaactggctt ctccgtctcg taacgctctg ccgggtatca cccgtaaaac cgttttcgaa 780
atcgctggtg ctatgggtat cgaagctgct ctgcgtgacg ttacctctca cgaactgtac 840
gacgctgacg aaatcatggc tgttaccacc gctggtggtg ttaccccgat caacaccctg 900
gacggtgttc cgatcggtga cggtgaaccg ggtccggtta ccgttgctat ccgtgacagg 960
ttctgggctc tgatggacga tccgggtccg ctgatcgaag ctatccagta c 1011
<210> 2
<211> 337
<212> PRT
<213> 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)
<400> 2
Met Gly Ile Asp Thr Gly Thr Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ile Arg Glu Asp Thr Pro Ala Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser Asp
20 25 30
Tyr Glu Ile Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Ala Gly Gly Ile Ala Trp Ile
35 40 45
Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Ala Glu Asp Ala Lys Ile Ser Ile Phe Asp
50 55 60
Thr Gly Phe Gly His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val Trp
65 70 75 80
His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Gly Asp His Leu Asp Arg Leu Leu Asp
85 90 95
Gly Ala Arg Lys Leu Arg Ile Asp Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Glu Leu
100 105 110
Ala Asp Ile Thr Lys Lys Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu Ser
115 120 125
Phe Val Asn Leu Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Arg Lys Gly Glu
130 135 140
Lys Asp Leu Ser Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Ile Ser Ala Ile Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Ala Glu Gln Ile Phe Gly Thr Thr Ala
165 170 175
Val Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Val Asp Pro
180 185 190
Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe Glu
195 200 205
Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Thr Ala Ile Leu Met Asp Ala Asp Asn
210 215 220
Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Cys Ile Val Lys Asp Gly
225 230 235 240
Lys Leu Ala Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys
245 250 255
Thr Val Phe Glu Ile Ala Gly Ala Met Gly Ile Glu Ala Ala Leu Arg
260 265 270
Asp Val Thr Ser His Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Ile Met Ala Val
275 280 285
Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Asn Thr Leu Asp Gly Val Pro
290 295 300
Ile Gly Asp Gly Glu Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Ile Arg Asp Arg
305 310 315 320
Phe Trp Ala Leu Met Asp Asp Pro Gly Pro Leu Ile Glu Ala Ile Gln
325 330 335
Tyr
<210> 3
<211> 1011
<212> DNA
<213> 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)
<400> 3
atgggtatcg acaccggtac ctctaacctg gttgctgttg aaccgggtgc tatccgtgaa 60
gacaccccgg ctggttctgt tatccagtac tctgactacg aaatcgacta ctcttctccg 120
ttcgctggtg gtgttgcttg gatcgaaggt gaatacctgc cggctgaaga cgctaaaatc 180
tctatcttcg acaccggttt ctatcactct gacctgacct acaccgttgc tcacgtttgg 240
cacggtaaca tcttccgtct gggtgaccac ctggaccgtc tgctggacgg tgctcgtaaa 300
ctgcgtctgg actctggtta caccaaagac gaactggctg acatcaccaa aaaatgcgtt 360
tctctgtctc agctgcgtga agctttcgtt aacctgacca tcacccgtgg ttacggtaaa 420
cgtaaaggtg aaaaagacct gtctaaactg acccaccagg tttacatcta cgctatcccg 480
tacctgtggg ctttcccgcc ggctgaacag atcttcggta ccaccgctgt tgttccgcgt 540
cacgttcgtc gtgctggtcg taacaccgtt gacccgacca tcaaaaacta ccagtggggt 600
gacctgaccg ctgcttcttt cgaagctaaa gaccgtggtg ctcgtaccgc tatcctgatg 660
gacgctgaca actgcgttgc tgaaggtccg ggtttcaacg tttgcatcgt taaagacggt 720
aaactggctt ctccgtctcg taacgctctg ccgggtatca cccgtaaaac cgttttcgaa 780
atcgctggtg ctatgggtat cgaagctgct ctgcgtgacg ttacctctca cgaactgtac 840
gacgctgacg aaatcatggc tgttaccacc gctggtggtg ttaccccgat caacaccctg 900
gacggtgttc cgatcggtga cggtgaaccg ggtccggtta ccgttgctat ccgtgacagg 960
ttctgggctc tgatggacga accgggtccg ctgatcgaag ctatccagta c 1011
<210> 4
<211> 337
<212> PRT
<213> 节杆菌 (Arthrobacter nitroguajacolicus)
<400> 4
Met Gly Ile Asp Thr Gly Thr Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro Gly
1 5 10 15
Ala Ile Arg Glu Asp Thr Pro Ala Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser Asp
20 25 30
Tyr Glu Ile Asp Tyr Ser Ser Pro Phe Ala Gly Gly Val Ala Trp Ile
35 40 45
Glu Gly Glu Tyr Leu Pro Ala Glu Asp Ala Lys Ile Ser Ile Phe Asp
50 55 60
Thr Gly Phe Tyr His Ser Asp Leu Thr Tyr Thr Val Ala His Val Trp
65 70 75 80
His Gly Asn Ile Phe Arg Leu Gly Asp His Leu Asp Arg Leu Leu Asp
85 90 95
Gly Ala Arg Lys Leu Arg Leu Asp Ser Gly Tyr Thr Lys Asp Glu Leu
100 105 110
Ala Asp Ile Thr Lys Lys Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu Ala
115 120 125
Phe Val Asn Leu Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Lys Arg Lys Gly Glu
130 135 140
Lys Asp Leu Ser Lys Leu Thr His Gln Val Tyr Ile Tyr Ala Ile Pro
145 150 155 160
Tyr Leu Trp Ala Phe Pro Pro Ala Glu Gln Ile Phe Gly Thr Thr Ala
165 170 175
Val Val Pro Arg His Val Arg Arg Ala Gly Arg Asn Thr Val Asp Pro
180 185 190
Thr Ile Lys Asn Tyr Gln Trp Gly Asp Leu Thr Ala Ala Ser Phe Glu
195 200 205
Ala Lys Asp Arg Gly Ala Arg Thr Ala Ile Leu Met Asp Ala Asp Asn
210 215 220
Cys Val Ala Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Cys Ile Val Lys Asp Gly
225 230 235 240
Lys Leu Ala Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys
245 250 255
Thr Val Phe Glu Ile Ala Gly Ala Met Gly Ile Glu Ala Ala Leu Arg
260 265 270
Asp Val Thr Ser His Glu Leu Tyr Asp Ala Asp Glu Ile Met Ala Val
275 280 285
Thr Thr Ala Gly Gly Val Thr Pro Ile Asn Thr Leu Asp Gly Val Pro
290 295 300
Ile Gly Asp Gly Glu Pro Gly Pro Val Thr Val Ala Ile Arg Asp Arg
305 310 315 320
Phe Trp Ala Leu Met Asp Glu Pro Gly Pro Leu Ile Glu Ala Ile Gln
325 330 335
Tyr

Claims (10)

1.一种转氨酶突变体，其特征在于所述突变体是SEQ ID NO：2所示第45位的异亮氨酸取代为缬氨酸、第68位的甘氨酸取代为酪氨酸、第103位的异亮氨酸取代为亮氨酸、第128位的丝氨酸取代为丙氨酸、第157位的酪氨酸取代为丝氨酸、第327位的天冬氨酸取代为谷氨酸。
2.一种权利要求1所述转氨酶突变体的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。
3.一种权利要求2所述转氨酶突变体的编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
5.一种权利要求1所述转氨酶突变体在生物催化合成西他列汀中间体中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30-45℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮；所述反应体系中，湿菌体用量为10-100g/L，底物终浓度为2～50g/L，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述西他列汀中间体为西他列汀酯类中间体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以潜手性羰基化合物为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8-9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度25-35℃、搅拌速度100-250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀酯类中间体；所述反应体系中，湿菌体用量为10～100g/L，底物终浓度为2～60g/L，二甲基亚砜体积终浓度为10-40％，磷酸吡哆醛0.5g/L，异丙胺10g/L；所述底物为下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。
9.如权利要求6或8所述的应用，其特征在于所述分离纯化方法为：反应结束后，用浓盐酸将反应液pH调至1.5，加入硅藻土吸附细胞，搅拌20min，过滤，获得滤液a和滤渣a，向滤渣a中加入1M盐酸，搅拌20min，抽滤，获得滤液b和滤渣b；合并滤液a和滤液b，用二氯甲烷萃取一次，获得有机相a和水相a，有机相a用1M盐酸萃取，获得有机相b和水相b，合并水相a和水相b并用氢氧化钠调节pH至12，再用二氯甲烷萃取，获得有机相c和水相c，水相c中再加入二氯甲烷萃取，获得有机相d和水相d，合并有机相c和有机相d并用饱和氯化钠水洗二次，加入无水硫酸钠干燥，抽滤去除硫酸钠，45℃下旋转蒸发，得到西他列汀中间体或西他列汀酯类中间体；所述硅藻土用量以反应液体积计为0.18g/mL。
10.如权利要求6或8所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有转氨酶突变体编码基因的重组大肠杆菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体。
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