CN111593039B

CN111593039B - 重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN111593039B
Application number: CN202010556311.1A
Authority: CN
Inventors: 赖敦岳; 周硕; 叶涛; 雷军林; 张壹腾; 汪钱
Original assignee: Zhejiang Haisen Pharmaceutical Ltd By Share Ltd
Current assignee: Zhejiang Haisen pharmaceutical Limited by Share Ltd.
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2040-06-17
Also published as: CN111593039A

Abstract

本发明提供了重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其在合成R‑3‑氨基丁酸中的应用，属于基因工程与生物合成技术领域。本发明的重组天冬氨酸酶突变体可以巴豆酸为底物，在催化R‑3‑氨基丁酸合成反应中的区域选择性以及立体选择性好；催化效率高，成本更低。利用本发明提供的利用重组天冬氨酸突变体合成R‑3‑氨基丁酸反应条件温和，对环境友好。

Description

重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和生物合成技术领域，尤其涉及重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用。

背景技术

R-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyric acid)，CAS：3775-73-3，主要作为医药中间体R-3-氨基丁醇的前体物。R-3-氨基丁醇(R-3-amino-1-butanol)，CAS： 61477-40-5，是一种用于治疗艾滋病药物度鲁特韦(Dolutegravir)的关键中间体。因此，R-3-氨基丁酸是合成度鲁特韦的重要原料之一。

R-3-氨基丁酸的合成路线开发具有重要的应用价值，开发具有高效、低成本的路线合成高纯度的R-3-氨基丁酸是降低度鲁特韦原料药成本，推广其应用范围的关键步骤。但是，现有化学合成方法，反应条件苛刻，产率低，且容易产生废液废水，对环境不友好。亟需开发更加高效环保的R-3-氨基丁酸合成路线。

发明内容

为改善现有技术的上述缺陷，本发明的目的在于提供重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其在合成R-3-氨基丁酸中的应用。

本发明提供了以下技术方案：

本发明提供一种重组天冬氨酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.2 或SEQ IDNo.3所示。

本发明还涉及包含所述编码基因的表达盒、包含所述核酸或者表达盒的重组载体。进一步地，本发明还提供包含所述编码基因、表达盒或者所述载体的宿主细胞，例如用所述核酸序列、表达盒或者载体转化或转染原始宿主细胞。

在一个实施方案中，所述表达盒包含表达所述变体的所有元件，包括在宿主细胞中转录和翻译过程中所必须的元件，例如，所述表达盒包括启动子和终止子，所述启动子和终止子没有特别的限定，可以是本领域已知的能够实现所述变体表达的启动子和终止子。例如，启动子可以是原核的或真核的，可选自例如Lacl、LacZ、pLacT、ptac、T3或T7噬菌体RNA聚合酶启动子、 CMV启动子、HSV胸苷激酶启动子、SV40启动子、小鼠金属硫蛋白–L启动子等。本发明所述的表达盒，还可以任选地包括增强子或其他必须元件。

在一些实施方案中，所述宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或真核生物。真核生物可以是低等真核生物，诸如酵母(例如，巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)或真菌或高等真核生物诸如昆虫细胞、哺乳动物细胞或植物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞，例如CHO(中国仓鼠卵巢细胞系) 等。所述宿主细胞优选大肠杆菌。

在一些实施方案中，所述载体可以是质粒、噬菌体、粘粒、病毒、YAC、 BAC、土壤杆菌属(Agrobacterium)pTi质粒等。载体可以优选地包含选自以下的一个或更多个元件：复制起点、多克隆位点和可选择的基因。优选地，载体是质粒。所述载体的一些具体实例如下：pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、 pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescriptSK、pbsks、pNH8A、pNH16A、 pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pBR322、 pRIT5、pET-28a。优选地，所述载体是表达载体，优选为pET-28a。

本发明提供了所述重组天冬氨酸酶突变体、其编码基因或宿主细胞在合成R-3-氨基丁酸中的应用。

本发明提供了一种合成R-3-氨基丁酸的方法，包括将底物与上述重组天冬氨酸酶突变体接触，进行催化反应，生成R-3-氨基丁酸，其中，所述底物包括巴豆酸和氨水。

在一些实施方案中，所述底物直接与经分离纯化的重组天冬氨酸酶突变体接触，进行催化反应。

在一些实施方案中，所述催化反应的反应体系包括：浓度为50g/L-400g/L 巴豆酸，浓度为10g/L-150g/L氨水，在重组天冬氨酸酶突变体作用下生产 R-3-氨基丁酸。

在一些实施方案中，所述催化反应的反应温度为15～60℃，所述催化反应的反应时间为8～60h。

在一些实施方案中，所述反应的温度为30-45℃，所述反应的时间为 10-24h，反应体系的pH为7.5-8.5。

在一些实施方案中，所述PB缓冲液的浓度为0.01～0.5mol/L，所述PB 缓冲液的pH为7.5-8.5。

在一些实施方案中，所述重组天冬氨酸酶突变体的用量没有特别的限定，可以根据酶活力和催化速率的要求确定。

在一些实施方案中，所述底物与表达重组天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，培养所述宿主细胞，进行催化反应。

本发明的有益效果：

本发明提供的重组天冬氨酸酶突变体在催化R-3-氨基丁酸合成中的区域选择性以及立体选择性好；催化效率高，反应条件温和对环境友好，具有重大的经济和环境价值。

附图说明

图1为实施例5转化体系反应0小时取样液相图谱；

图2为实施例5转化体系反应24小时取样液相图谱；

图1和图2中，保留时间3分钟左右的峰为巴豆酸，6分钟左右的峰为 R-3-氨基丁酸。

具体实施方式

本发明提供的重组天冬氨酸酶突变体，其重组氨基酸序列如SEQ ID No.2和SEQID No.3所示。在本发明实施例中，所述重组载体以pET-28a(+) 表达载体为初始载体，将所述重组天冬氨酸酶突变体的编码基因连接到所述 pET-28a(+)表达载体上获得重组载体；在本发明实施例中，所述重组天冬氨酸酶突变体的编码基因优选的连接至XhoΙ和NdeΙ酶切位点之间。本发明对所述重组载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域已知的重组载体制备方法。

本发明提供了包括所述的重组天冬氨酸酶突变体的编码基因的重组菌株。在本发明中，所述重组菌株优选的通过将所述重组载体转入原始菌株中制备获得重组菌株。在本发明中，所述原始菌株优选为大肠杆菌JM109 (DE3)。本发明对所述重组菌株的制备方法没有特殊要求，可以采用本领域已知的重组菌株制备方法。

如无特殊说明，本发明所用试剂均为市购所得。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1生产野生型天冬氨酸酶LBS

合成的基因LBS连接到表达载体pET-28a(+)上，使其可以在大肠杆菌 JM109(DE3)中表达。

实验操作流程如下：

a)使用相同的限制性内切酶对编码SEQ ID No.1氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IDNo.4和表达载体pET-28a(+)进行双酶切以得到粘性末端片段， 37℃酶切100min后与10X的Loading Buffer，吹打均匀后进行琼脂糖凝胶电泳，20μL的酶切体系见表1。

表1限制性内切酶酶切体系

b)使用DNA胶回收试剂盒纯化回收LBS基因片段和pET-28a(+)载体片段，具体操作步骤见说明书；

c)使用Ligation high(购自东洋纺生物科技有限公司)将回收产物连接成环形质粒，16℃连接3h，连接体系见表2。

表2粘性末端片段的连接体系

d)12μL的连接产物转化至大肠杆菌JM109(DE3)，活化抗性菌后提取 pET-28a-LBS质粒并进行双酶切验证；验证后的质粒pET-28a-LBS转化至 JM109(DE3)，挑斑活化和扩大培养后，添加诱导剂IPTG诱导重组天冬氨酸酶LBS蛋白表达，实验操作流程如下：

A1)保藏于超低温冰箱的JM109(DE3)感受态细胞悬液置于冰上解冻后加入2μL质粒或10μL的连接产物，冰上静置30min让质粒附集在细胞表面；

A2)42℃水浴热击55s增加细胞通透性，促使质粒进入细胞；热激后立即在冰上静置3min；

A3)吸取0.8mL LB培养基(无抗性)加入，37℃条件振荡复苏1h；

A4)吸取200μL复苏液在平板(Kan抗性)上涂布出单菌落，37℃恒温培养箱倒置培养(过夜)。

用灭菌的牙签蘸取单菌落，置于在5mL LB培养液中，35℃条件振荡复苏培养过夜，菌液和80％(w/w)灭菌甘油按8:2的比例保菌，于-20℃条件下保存。

挑取单菌落至5mL LB培养液(含0.1％Kan抗性)，37℃条件下振荡 (180rpm)复苏10h，转接至50mL LB培养液，37℃条件下振荡培养至光密度值达到0.5～0.6后，按0.1％的比例加入IPTG母液至其工作浓度为0.1μM， 25℃低温条件下振荡培养过夜，诱导LBS蛋白表达。发酵液高速(5000×g) 离心8min后收集沉淀，用5mL PB缓冲液(0.1M，pH8.0)重悬，细胞重悬液置于冰水中，185W超声波破碎8.8min后，11000×g离心8.8min收集上清液，上清液即包含了工程菌所表达的野生型天冬氨酸酶LBS的粗酶液，置于 -20℃冰箱保藏。

实施例2生产天冬氨酸酶突变体LBS-2和LBS-3

合成的基因LBS-2连接到表达载体pET-28a(+)上，使其可以在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。

实验操作流程如下：

a)使用相同的限制性内切酶对编码SEQ ID No.2氨基酸序列的核苷酸序列SEQ IDNo.5和表达载体pET-28a(+)进行双酶切以得到粘性末端片段，37℃酶切100min后与10X的Loading Buffer，吹打均匀后跑琼脂糖胶，20μL 的酶切体系见表3。

表3限制性内切酶酶切体系

b)使用DNA胶回收试剂盒纯化回收LBS-2基因片段和pET-28a(+)载体片段，具体操作步骤见说明书；

c)使用Ligation high(购自东洋纺生物科技有限公司)将回收产物连接成环形质粒，16℃连接3h，连接体系见表4。

表4粘性末端片段的连接体系

d)12μL的连接产物转化至大肠杆菌JM109(DE3)，活化抗性菌后提取 pET-28a-LBS-2质粒并进行双酶切验证，验证后的质粒pET-28a-LBS-2转化至JM109(DE3)，挑斑活化和扩大培养后，添加诱导剂IPTG诱导重组天冬氨酸酶LBS-2蛋白表达，实验操作流程如下：

A3)吸取0.8mL LB培养基(无抗性)加入，37℃条件振荡复苏1h；

挑取单菌落至5mL LB培养液(含0.1％Kan抗性)，37℃条件下振荡 (180rpm)复苏10h，转接至50mL LB培养液，37℃条件下振荡培养至光密度值达到0.5～0.6后，按0.1％的比例加入IPTG母液至其工作浓度为0.1μM， 25℃低温条件下振荡培养过夜，诱导LBS蛋白表达。发酵液高速(5000×g) 离心8min后收集沉淀，用5mL PB缓冲液(0.1M，pH8.0)重悬，细胞重悬液置于冰水中，185W超声波破碎8.8min后，11000×g离心8.8min收集上清液，上清液即包含了工程菌所表达的重组天冬氨酸酶突变体LBS-2(粗酶液)，置于-20℃冰箱保藏。

将核苷酸序列替换为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，制备得到SEQ ID No.3所示氨基酸序列的重组天冬氨酸酶突变体LBS-3。

实施例3野生天冬氨酸酶LBS和重组天冬氨酸酶突变体LBS-2和LBS -3蛋白纯化

以缓冲液A平衡蛋白质Ni+柱后，加入实施例1制备的粗酶液，充分摇荡30min，放掉废液，以缓冲液A冲洗三次后，加入缓冲液B充分摇荡均匀 20min，后收集流出液，流出液中加入过量硫酸铵至无法溶解，离心3000rpm， 10min，收集沉淀，沉淀中加入质量浓度15％甘油水溶液溶解，获得蛋白溶液；蛋白溶液过以g25为填料的层析柱脱盐，检测流出液的A280吸收值，收集A280吸收值大于0.1的部分，获得纯化的野生型天冬氨酸LBS酶液；缓冲液A：NaCl 140mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 1.8mmol/L，以5M NaOH调节pH值至8.0，溶剂为水；缓冲液B： Na₂HPO₄·2H₂O 50mM，NaCl 300mM，咪唑(imidazole)500mM，以5M盐酸溶液调节pH值至8.0，溶剂为水。

用实施例2中得到的重组天冬氨酸突变体LBS-2粗酶和LBS-3粗酶，进行上述纯化步骤，获得重组天冬氨酸突变体LBS-2纯酶和LBS-3纯酶。

实施例4野生天冬氨酸酶LBS和天冬氨酸酶突变体LBS-2、LBS-3活力测定

LBS对巴豆酸每个酶活力单位(U)指的是单位时间(1min)催化还原 1μmoL巴豆酸的酶的用量(酶液体积或蛋白质量)。

对野生型及突变体蛋白LBS-2进行酶活力测定。反应体系：10μL实施例3纯化的酶溶液LBS、LBS-2和LBS-3，2890μLPB(0.1M，pH 7.0)加入 10mg底物巴豆酸和10μL氨水，取样进行HPLC分析，测得反应液中未反应的底物的量。所有实验重复三次。野生型天冬氨酸酶LBS和突变体蛋白 LBS-2、LBS-3酶活力如表5。

表5野生型天冬氨酸酶和突变体LBS-2、LBS-3的酶活力

实施例5天冬氨酸酶突变体LBS-2催化巴豆酸合成R-3-氨基丁酸

配制如下反应体系：25g巴豆酸，水20g，25％氨水20g，温度47℃， pH7.8，25g含菌体浓度为10％的天冬氨酸酶突变体LBS-2的大肠杆菌发酵液，转化24小时，转化率大于99％。反应0小时(反应起始)和反应24小时反应液的液相图谱分别如图1和图2所示。图1和图2液相图谱分析结果分析分别参见表6和表7，其中保留时间3分钟左右的峰为巴豆酸，6分钟左右的峰为R-3-氨基丁酸。

表6反应0小时液相图谱分析

实施例6天冬氨酸酶突变体LBS-2催化巴豆酸合成R-3-氨基丁酸

配制如下反应体系：5L反应釜中，投入500g纯化水，1000g巴豆酸， 25％氨水800g，温度47℃，使用25％氨水继续调节pH至8.0，投入1000g 含菌体浓度为10％的天冬氨酸酶突变体LBS-2的发酵液，适量补水至总体积4L，转化24小时，转化率大于99％。反应结束后，加入5公斤活性炭，升温至70℃，减压蒸馏驱氨，至总体积2500mL，过滤除渣，滤液继续减压蒸馏至1500g，降温结晶后离心收集收集固体，放入烘箱60℃烘干24小时后即得R-3-氨基丁酸935kg，纯度为98.8％，单次结晶得率77.9％。

根据实施例5和实施例6可以得出，本发明提供的重组天冬氨酸酶突变体在催化巴豆酸制备R-3-氨基丁酸时，反应条件温和，催化活性高，具有重大的经济和环境价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和变化，这些改进和变化也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 台州酶易生物技术有限公司

<120> 重组天冬氨酸酶突变体、编码基因及其应用

<130> SZ200902-CN

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 1

Met Met Ala Asp Leu Met Arg Ile Glu His Asp Ser Met Gly Thr Ile

1 5 10 15

Glu Val Pro Ala Gly Val Leu Trp Gly Ala Gln Thr Gln Arg Ser Leu

20 25 30

Leu Asn Phe Ala Ile Ser Thr Asp Arg Met Pro Val Glu Leu Ile His

35 40 45

Ala Leu Ala Leu Ile Lys Gln Ala Ala Ala Ser Val Asn Cys Arg Leu

50 55 60

Gly Val Leu Asp Glu Val Gln Arg Asp Gln Ile Ile Lys Ala Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Ala Ser Gly Leu His Asp Asp Gln Phe Pro Leu Arg Val Trp

85 90 95

Gln Thr Gly Ser Gly Thr His Thr Asn Met Asn Val Asn Glu Val Ile

100 105 110

Ser Asn Leu Ala Ser Gln Ala Asn Asp Glu Pro Leu Gly Ser His Arg

115 120 125

Pro Val His Pro Asn Asp His Val Asn Arg Ser Gln Ser Thr Asn Asp

130 135 140

Ala Phe Pro Thr Ala Ile His Ile Ala Ala Val Gln Gly Ile Thr Asn

145 150 155 160

Asn Leu Leu Pro Glu Leu Glu Gln Leu Ile Ala Ala Phe Ala Arg Lys

165 170 175

Ser Asp Ala Trp Ser Asp Ile Ile Lys Ile Gly Arg Thr His Leu Gln

180 185 190

Asp Ala Val Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Ala Ser Ala Trp Arg Asp

195 200 205

Gln Ile Ala Ser Ala His Ser Arg Ile Gln Ser Ser Leu Ile Glu Leu

210 215 220

Tyr Pro Leu Pro Leu Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala

225 230 235 240

Pro Ala Arg Phe Gly Gln Glu Thr Ala Ala Gln Leu Ala Ser Ile Thr

245 250 255

Gly Leu Pro Phe Ser Ser Ala Lys Asn Lys Phe Ala Val Met Ala Ser

260 265 270

His Asp Gly Leu Val Asn Ala Met Ala Gln Leu Arg Met Leu Ala Val

275 280 285

Ala Leu Phe Lys Ile Ser Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro

290 295 300

Arg Ala Gly Leu Ala Glu Leu His Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Ser Gln Cys Glu Ala Met Ala

325 330 335

Met Val Cys Leu Gln Val Ile Gly Leu Asp Ser Ala Val Thr Met Ala

340 345 350

Gly Gly Ser Gly His Leu Gln Met Asn Val Tyr Lys Pro Leu Ile Gly

355 360 365

Phe Asn Leu Leu His Ser Ile Glu Leu Leu His Asp Ala Cys Arg Lys

370 375 380

Tyr Arg Leu Ala Met Val Gln Gly Ile Glu Pro Asn Arg Ile Lys Ile

385 390 395 400

Gln His Asp Leu Glu Gln Ser Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Ala Pro

405 410 415

Glu Ile Gly Tyr Asp Lys Ala Ser Glu Ile Ala His Leu Ala His Glu

420 425 430

Lys Gly Phe Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Val Ser

435 440 445

Lys Glu Asp Phe Asp Arg Ile Val Asn Pro Ala Leu Met Thr Ser Ala

450 455 460

Arg Leu

465

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 2

Met Met Ala Asp Leu Met Arg Ile Glu His Asp Ser Met Gly Thr Ile

1 5 10 15

Glu Val Pro Ala Gly Val Leu Trp Gly Ala Gln Thr Gln Arg Ser Leu

20 25 30

Leu Asn Phe Ala Ile Ser Thr Asp Arg Met Pro Val Glu Leu Ile His

35 40 45

Ala Leu Ala Leu Ile Lys Gln Ala Ala Ala Ser Val Asn Cys Arg Leu

50 55 60

Gly Val Leu Asp Glu Val Gln Arg Asp Gln Ile Ile Lys Ala Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Ala Ser Gly Leu His Asp Asp Gln Phe Pro Leu Arg Val Trp

85 90 95

Gln Thr Gly Ser Gly Thr His Thr Asn Met Asn Val Asn Glu Val Ile

100 105 110

Ser Asn Leu Ala Ser Gln Ala Asn Asp Glu Pro Leu Gly Ser His Arg

115 120 125

Pro Val His Pro Asn Asp His Val Asn Arg Ser Gln Ser Thr Asn Asp

130 135 140

Ala Phe Pro Thr Ala Ile His Ile Ala Ala Val Gln Gly Ile Thr Asn

145 150 155 160

Asn Leu Leu Pro Glu Leu Glu Gln Leu Ile Ala Ala Phe Ala Arg Lys

165 170 175

Ser Asp Ala Trp Ser Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln

180 185 190

Asp Ala Val Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Ala Ser Ala Trp Arg Asp

195 200 205

Gln Ile Ala Ser Ala His Ser Arg Ile Gln Ser Ser Leu Ile Glu Leu

210 215 220

Tyr Pro Leu Pro Leu Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala

225 230 235 240

Pro Ala Arg Phe Gly Gln Glu Thr Ala Ala Gln Leu Ala Ser Ile Thr

245 250 255

Gly Leu Pro Phe Ser Ser Ala Lys Asn Lys Phe Ala Val Met Ala Ser

260 265 270

His Asp Gly Leu Val Asn Ala Met Ala Gln Leu Arg Met Leu Ala Val

275 280 285

Ala Leu Phe Lys Ile Ser Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro

290 295 300

Arg Ala Gly Leu Ala Glu Leu His Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Ser Gln Cys Glu Ala Met Ala

325 330 335

Met Val Cys Leu Gln Val Ile Gly Leu Asp Ser Ala Val Thr Met Ala

340 345 350

Gly Gly Ser Gly His Leu Gln Met Asn Val Tyr Lys Pro Leu Ile Gly

355 360 365

Phe Asn Leu Leu His Ser Ile Glu Leu Leu His Asp Ala Cys Arg Lys

370 375 380

Tyr Arg Leu Ala Met Val Gln Gly Ile Glu Pro Asn Arg Ile Lys Ile

385 390 395 400

Gln His Asp Leu Glu Gln Ser Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Ala Pro

405 410 415

Glu Ile Gly Tyr Asp Lys Ala Ser Glu Ile Ala His Leu Ala His Glu

420 425 430

Lys Gly Phe Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Val Ser

435 440 445

Lys Glu Asp Phe Asp Arg Ile Val Asn Pro Ala Leu Met Thr Ser Ala

450 455 460

Arg Leu

465

<210> 3

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 3

Met Met Ala Asp Leu Met Arg Ile Glu His Asp Ser Met Gly Thr Ile

1 5 10 15

Glu Val Pro Ala Gly Val Leu Trp Gly Ala Gln Thr Gln Arg Ser Leu

20 25 30

Leu Asn Phe Ala Ile Ser Thr Asp Arg Met Pro Val Glu Leu Ile His

35 40 45

Ala Leu Ala Leu Ile Lys Gln Ala Ala Ala Ser Val Asn Cys Arg Leu

50 55 60

Gly Val Leu Asp Glu Val Gln Arg Asp Gln Ile Ile Lys Ala Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Ala Ser Gly Leu His Asp Asp Gln Phe Pro Leu Arg Val Trp

85 90 95

Gln Thr Gly Ser Gly Thr His Thr Asn Met Asn Val Asn Glu Val Ile

100 105 110

Ser Asn Leu Ala Ser Gln Ala Asn Asp Glu Pro Leu Gly Ser His Arg

115 120 125

Pro Val His Pro Asn Asp His Val Asn Arg Ser Gln Ser Thr Asn Asp

130 135 140

Ala Phe Pro Thr Ala Ile His Ile Ala Ala Val Gln Gly Ile Thr Asn

145 150 155 160

Asn Leu Leu Pro Glu Leu Glu Gln Leu Ile Ala Ala Phe Ala Arg Lys

165 170 175

Ser Asp Ala Trp Ser Asp Ile Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln

180 185 190

Asp Ala Val Pro Leu Thr Leu Gly Gln Glu Ala Ser Ala Trp Arg Asp

195 200 205

Gln Ile Ala Ser Ala His Ser Arg Ile Gln Ser Ser Leu Ile Glu Leu

210 215 220

Tyr Pro Leu Pro Leu Gly Gly Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala

225 230 235 240

Pro Ala Arg Phe Gly Gln Glu Thr Ala Ala Gln Leu Ala Ser Ile Thr

245 250 255

Gly Leu Pro Phe Ser Ser Ala Lys Asn Lys Phe Ala Val Met Ala Ser

260 265 270

His Asp Gly Leu Val Asn Ala Met Ala Gln Leu Arg Met Leu Ala Val

275 280 285

Ala Leu Phe Lys Ile Ser Asn Asp Leu Arg Leu Leu Ala Cys Gly Pro

290 295 300

Arg Ala Gly Leu Ala Glu Leu His Leu Pro Glu Asn Glu Pro Gly Ser

305 310 315 320

Ser Ile Met Pro Gly Lys Val Asn Pro Ser Gln Cys Glu Ala Met Ala

325 330 335

Met Val Cys Leu Gln Val Ile Gly Leu Asp Ser Ala Val Thr Met Ala

340 345 350

Gly Gly Ser Gly His Leu Gln Met Asn Val Tyr Lys Pro Leu Ile Gly

355 360 365

Phe Asn Leu Leu His Ser Ile Glu Leu Leu His Asp Ala Ser Arg Lys

370 375 380

Tyr Arg Leu Ala Met Val Gln Gly Ile Glu Pro Asn Arg Ile Lys Ile

385 390 395 400

Gln His Asp Leu Glu Gln Ser Leu Met Leu Val Thr Ala Leu Ala Pro

405 410 415

Glu Ile Gly Tyr Asp Lys Ala Ser Glu Ile Ala His Leu Ala His Glu

420 425 430

Lys Gly Phe Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Lys Leu Gly Tyr Val Ser

435 440 445

Lys Glu Asp Phe Asp Arg Ile Val Asn Pro Ala Leu Met Thr Ser Ala

450 455 460

Arg Leu

465

<210> 4

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 4

atgatggcgg atctgatgcg cattgaacat gatagcatgg gcaccattga agtgccggcg 60

ggcgtgctgt ggggcgcgca gacccagcgc agcctgctga actttgcgat tagcaccgat 120

cgcatgccgg tggaactgat tcatgcgctg gcgctgatta aacaggcggc ggcgagcgtg 180

aactgccgcc tgggcgtgct ggatgaagtg cagcgcgatc agattattaa agcggcgagc 240

gcggtggcga gcggcctgca tgatgatcag tttccgctgc gcgtgtggca gaccggcagc 300

ggcacccata ccaacatgaa cgtgaacgaa gtgattagca acctggcgag ccaggcgaac 360

gatgaaccgc tgggcagcca tcgcccggtg catccgaacg atcatgtgaa ccgcagccag 420

agcaccaacg atgcgtttcc gaccgcgatt catattgcgg cggtgcaggg cattaccaac 480

aacctgctgc cggaactgga acagctgatt gcggcgtttg cgcgcaaaag cgatgcgtgg 540

agcgatatta ttaaaattgg ccgcacccat ctgcaggatg cggtgccgct gaccctgggc 600

caggaagcga gcgcgtggcg cgatcagatt gcgagcgcgc atagccgcat tcagagcagc 660

ctgattgaac tgtatccgct gccgctgggc ggcaccgcgg tgggcaccgg cctgaacgcg 720

ccggcgcgct ttggccagga aaccgcggcg cagctggcga gcattaccgg cctgccgttt 780

agcagcgcga aaaacaaatt tgcggtgatg gcgagccatg atggcctggt gaacgcgatg 840

gcgcagctgc gcatgctggc ggtggcgctg tttaaaatta gcaacgatct gcgcctgctg 900

gcgtgcggcc cgcgcgcggg cctggcggaa ctgcatctgc cggaaaacga accgggcagc 960

agcattatgc cgggcaaagt gaacccgagc cagtgcgaag cgatggcgat ggtgtgcctg 1020

caggtgattg gcctggatag cgcggtgacc atggcgggcg gcagcggcca tctgcagatg 1080

aacgtgtata aaccgctgat tggctttaac ctgctgcata gcattgaact gctgcatgat 1140

gcgtgccgca aatatcgcct ggcgatggtg cagggcattg aaccgaaccg cattaaaatt 1200

cagcatgatc tggaacagag cctgatgctg gtgaccgcgc tggcgccgga aattggctat 1260

gataaagcga gcgaaattgc gcatctggcg catgaaaaag gctttagcct gcgcgaagcg 1320

gcgctgaaac tgggctatgt gagcaaagaa gattttgatc gcattgtgaa cccggcgctg 1380

atgaccagcg cgcgcctg 1398

<210> 5

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 5

atgatggcgg atctgatgcg cattgaacat gatagcatgg gcaccattga agtgccggcg 60

ggcgtgctgt ggggcgcgca gacccagcgc agcctgctga actttgcgat tagcaccgat 120

cgcatgccgg tggaactgat tcatgcgctg gcgctgatta aacaggcggc ggcgagcgtg 180

aactgccgcc tgggcgtgct ggatgaagtg cagcgcgatc agattattaa agcggcgagc 240

gcggtggcga gcggcctgca tgatgatcag tttccgctgc gcgtgtggca gaccggcagc 300

ggcacccata ccaacatgaa cgtgaacgaa gtgattagca acctggcgag ccaggcgaac 360

gatgaaccgc tgggcagcca tcgcccggtg catccgaacg atcatgtgaa ccgcagccag 420

agcaccaacg atgcgtttcc gaccgcgatt catattgcgg cggtgcaggg cattaccaac 480

aacctgctgc cggaactgga acagctgatt gcggcgtttg cgcgcaaaag cgatgcgtgg 540

agcgatatta ttaaaatggg ccgcacccat ctgcaggatg cggtgccgct gaccctgggc 600

caggaagcga gcgcgtggcg cgatcagatt gcgagcgcgc atagccgcat tcagagcagc 660

ctgattgaac tgtatccgct gccgctgggc ggcaccgcgg tgggcaccgg cctgaacgcg 720

ccggcgcgct ttggccagga aaccgcggcg cagctggcga gcattaccgg cctgccgttt 780

agcagcgcga aaaacaaatt tgcggtgatg gcgagccatg atggcctggt gaacgcgatg 840

gcgcagctgc gcatgctggc ggtggcgctg tttaaaatta gcaacgatct gcgcctgctg 900

gcgtgcggcc cgcgcgcggg cctggcggaa ctgcatctgc cggaaaacga accgggcagc 960

agcattatgc cgggcaaagt gaacccgagc cagtgcgaag cgatggcgat ggtgtgcctg 1020

caggtgattg gcctggatag cgcggtgacc atggcgggcg gcagcggcca tctgcagatg 1080

aacgtgtata aaccgctgat tggctttaac ctgctgcata gcattgaact gctgcatgat 1140

gcgtgccgca aatatcgcct ggcgatggtg cagggcattg aaccgaaccg cattaaaatt 1200

cagcatgatc tggaacagag cctgatgctg gtgaccgcgc tggcgccgga aattggctat 1260

gataaagcga gcgaaattgc gcatctggcg catgaaaaag gctttagcct gcgcgaagcg 1320

gcgctgaaac tgggctatgt gagcaaagaa gattttgatc gcattgtgaa cccggcgctg 1380

atgaccagcg cgcgcctg 1398

<210> 6

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223>

<400> 6

atgatggcgg atctgatgcg cattgaacat gatagcatgg gcaccattga agtgccggcg 60

ggcgtgctgt ggggcgcgca gacccagcgc agcctgctga actttgcgat tagcaccgat 120

cgcatgccgg tggaactgat tcatgcgctg gcgctgatta aacaggcggc ggcgagcgtg 180

aactgccgcc tgggcgtgct ggatgaagtg cagcgcgatc agattattaa agcggcgagc 240

gcggtggcga gcggcctgca tgatgatcag tttccgctgc gcgtgtggca gaccggcagc 300

ggcacccata ccaacatgaa cgtgaacgaa gtgattagca acctggcgag ccaggcgaac 360

gatgaaccgc tgggcagcca tcgcccggtg catccgaacg atcatgtgaa ccgcagccag 420

agcaccaacg atgcgtttcc gaccgcgatt catattgcgg cggtgcaggg cattaccaac 480

aacctgctgc cggaactgga acagctgatt gcggcgtttg cgcgcaaaag cgatgcgtgg 540

agcgatatta ttaaaatggg ccgcacccat ctgcaggatg cggtgccgct gaccctgggc 600

caggaagcga gcgcgtggcg cgatcagatt gcgagcgcgc atagccgcat tcagagcagc 660

ctgattgaac tgtatccgct gccgctgggc ggcaccgcgg tgggcaccgg cctgaacgcg 720

ccggcgcgct ttggccagga aaccgcggcg cagctggcga gcattaccgg cctgccgttt 780

agcagcgcga aaaacaaatt tgcggtgatg gcgagccatg atggcctggt gaacgcgatg 840

gcgcagctgc gcatgctggc ggtggcgctg tttaaaatta gcaacgatct gcgcctgctg 900

gcgtgcggcc cgcgcgcggg cctggcggaa ctgcatctgc cggaaaacga accgggcagc 960

agcattatgc cgggcaaagt gaacccgagc cagtgcgaag cgatggcgat ggtgtgcctg 1020

caggtgattg gcctggatag cgcggtgacc atggcgggcg gcagcggcca tctgcagatg 1080

aacgtgtata aaccgctgat tggctttaac ctgctgcata gcattgaact gctgcatgat 1140

gcgagccgca aatatcgcct ggcgatggtg cagggcattg aaccgaaccg cattaaaatt 1200

cagcatgatc tggaacagag cctgatgctg gtgaccgcgc tggcgccgga aattggctat 1260

gataaagcga gcgaaattgc gcatctggcg catgaaaaag gctttagcct gcgcgaagcg 1320

gcgctgaaac tgggctatgt gagcaaagaa gattttgatc gcattgtgaa cccggcgctg 1380

atgaccagcg cgcgcctg 1398

Claims

1.一种重组天冬氨酸酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2或SEQ IDNo.3所示。

2.编码如权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示。

3.包括如权利要求2所述基因的表达盒或重组载体。

4.包括如权利要求3所述基因的表达盒或重组载体的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.如权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体在合成R-3-氨基丁酸中的应用。

7.一种合成R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括将底物与权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体接触，或者与表达权利要求1所述重组天冬氨酸酶突变体的宿主细胞接触，进行催化反应，生成R-3-氨基丁酸，其中，所述底物为巴豆酸和氨水。

8.根据权利要求7所述的合成R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，将底物与所述重组天冬氨酸酶突变体接触，进行催化反应，所述催化反应的反应体系中，所述巴豆酸浓度为50g/L-400g/L，氨水浓度为10g/L-150g/L。

9.根据权利要求7或8所述的合成R-3-氨基丁酸的方法，所述催化反应的反应体系中，反应体系的pH为7.5-8.5。

10.根据权利要求7或8所述的合成R-3-氨基丁酸的方法，所述催化反应的反应温度为15～60℃，所述催化反应的反应时间为8～60h。