JP3943540B2

JP3943540B2 - 環状ｌ−アミノ酸の立体選択的製造

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Inventors: ティボードニ; ドーリンヴォルカー; マルリエルフィリップ
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Description

本発明は、環状Ｌ−アミノ酸又はそれらの塩及び誘導体の立体選択的製造に関係する。

環状アミノ酸特にＬ−プロリン、Ｌ−ピペコリン酸又はＬ−ピペラジン−２−カルボン酸及びそれらの塩については、それらの新規な医薬の合成のための利用の故に、増大する需要がある。

生合成の見地からは、Ｌ−プロリンの環の形成のみが、説明されて記載されている。それは、２つの方法で行なうことができる：
− グルタミン酸セミアルデヒド酸の環化によって、Δ１−ピロリン−５−カルボン酸を形成し、その後不飽和環を還元する；
− か、又はＬ−オルニチンから環状アミド分解によって直接形成する。

しかしながら、これらのプロセスは、工業的規模でのキラル環状アミノ酸の合成のための満足な解決を与えない。

その上、Ｌ−オルニチンのＬ−プロリンへの直接的変換の酵素活性は、クロストリジウムにおいて最初に記載されており(R.N. Costilow等、J.Biol.Chem., 246(21),(1971),6655-60；W.L. Muth等、J.Biol.Chem.,249(23),(1974),7457-62、２０ｍＭのＬ−オルニチンのＬ−プロリンへの全変換は、部分精製された酵素の存在下でイン・ビトロで得られた。このクロストリジウムのオルニチンシクロデアミナーゼ(ｏｃｄ)は、通常酸化反応に関係する補因子であるＮＡＤにより活性化されるという特殊な特徴を有し、精製形態では非常に不安定のようである。それは、Ｄ−オルニチンと反応しないが、４０ｍＭのＤ−オルニチンの存在下で阻害される(４０ｍＭのＬ−リジンの存在下では、その活性は、減少しない)。それ故、このシクロデアミナーゼがＬ−リジンと反応できる可能性は、代謝の酵素は非常に特殊であるということが非常に頻繁に認められているので、これらの著者によっては認識されてさえいなかった。

数年後に、ノパリンの分解に関与するアグロバクテリウムの遺伝子の発現とｏｃｄ活性の間の関係が確立され(N.Sans等、Eur.J.Biochem.,173(1988),123-130)、その後、ｏｃｄをコードする遺伝子は配列決定された。

その後、アグロバクテリウムの別の株において、非常に相同な遺伝子が、同じ著者によって見出された(U.Schindler等、J.Bacteriol.,171,(1989),847-854)。これら２つのシクロデアミナーゼの特性は、研究され、Ｌ−オルニチンに対する活性のみが示された。こうして、再び、Ｌ−リジンが、シクロデアミナーゼの基質でありうる可能性は認識されず、その阻害効果のみが調べられた(Schindler等、前出)。

その後、多くの生物の全配列又は部分配列決定が、このアグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子との強い相同性を有する幾つかの新しい遺伝子の同定を可能にした。しかしながら、これらの遺伝子の各々によりコードされるポリペプチドの酵素活性も、その活性スペクトルも研究されておらず、この酵素は、オルニチンに特異的であると考えられている。特に、これらの酵素の特異性及び触媒活性のレベルは、それらが酵素過程の生産性に決定的な要素であっても未知のままである。

Ｌ−ピペコリン酸から誘導される代謝産物の生産者であるストレプトミセスにおいて見出されたこれらの遺伝子の３つに関して、コードされたポリペプチドについてのリジンシクロデアミナーゼ活性が仮定された(ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１；L.E. Khaw等、J.Bacteriol.,180,(1998),809-814；I.Molnar等、Gene,169,(1996),1-7；H.Motamedi等、Eur.J.Biochem.249、(1998),528-534)。

こうして、遺伝子ｒａｐＬ(Khaw等、前出)又はｐｉｐＡ(ＷＯ−Ａ−９６／０１９０１)によりコードされたシクロデアミナーゼが、リジンのピペコリン酸への変換によるラパマイシンの合成経路に関与しうることが示唆されている。しかしながら、今日まで、たとえ、付随的意見がしばしば示唆されていても、Ｌ−リジンのＬ−ピペコリン酸への環状アミド分解の活性は、示されても、例示されても又は定量されてもいない。これらの遺伝子により真に触媒される反応の知識の欠如は、リジンのピペコリン酸への変換がＤ−リジンによっても達成されうるという公表に関係した著者の何人かによりピペコリン酸へと導く生物学的経路に関する仮説の変化によって示される(Khaw等、前出)。

他の生化学的研究は、不飽和環の還元によるα−アミノアジピン酸からのＬ−ピペコリン酸の形成をアスペルギルスにおいて、アイソトープ標識実験に基づいて記載しており(A.J.Aspen等、Biochemistry,1,(4),(1962),606-612)、かかる生化学的経路はストレプトミセスにおいても当業者(J.W.Reed等、J.Org.Chem.,54(5),(1989),1161-65)により報告されていた。

Ｌ−プロリンの生合成の酵素、特にオルニチンシクロデアミナーゼが新規な環状アミノ酸の生成のために提案されていないという事実は、当業者の一般的意見において、ピペコリン酸の生合成をこの方法で達成することが可能でなかったという更なる証拠を構成する。従って、鏡像的に純粋な形態(特に、ピペコリン酸又はピペラジン−２−カルボン酸のＬ型)へと導く生物変換の幾つかのバイオテクノロジー工程は、数年間にわたって特許により保護されてきた。これらの刊行物中に現れた例は、１５ｇ／Ｌの環状アミノ酸の最大生産を報告しているが；シクロデアミナーゼの利用には言及していない。

これらの文献のすべては、一つの例外を除いて、ラセミ体基質の分離を記載している。それらは、適当な基質に作用するＮ−アシラーゼ型(ＷＯ９５／１０６０４、ＷＯ９９／０７８７３)、アミダーゼ型(ＥＰ−Ａ−０６８６６９８)、アミノ酸オキシダーゼ型(ＪＰ０６０３０７８９)、ニトリラーゼ型(ＪＰ０６０３８７８１、ＪＰ１１１２７８８５)又はエステラーゼ型(ＷＯ００／１２７４５)の活性を利用する。

これらの方法のすべては、幾つかの欠点を有するが、その内でラセミ体混合物における５０％までの最大収率の限界、そうして形成された生成物の及び酵素により変換可能でない基質の、求める鏡像型の回収のための分離の必要性、及び他の鏡像型の再利用の可能な開発の必要性を挙げることができる。ＪＰ０６０３０７８１だけが、Ｌ−リジン(市販の非常に高価ではないキラル基質)のＬ−ピペコリン酸への、様々な非組換え細菌分離株による変換(生物変換を達成するために借りる化学反応を含まない)を記載している。この文献で言及された収率及び生産性に関するその性能(即ち、７日で、１０ｇ／ＬのＬ−リジンからの約４．２ｇ／ＬのＬ−ピペコリン酸の生産)は、利便性及び経済性で競争できる方法であるためには全く不十分なままである。この発明の一つの目的は、当分野で公知のものより一層優れた性能、特に、従来技術で開示されたものの５、１０又は２０倍を超えるオーダーの環状アミノ酸の生産を得ることである。

本願出願人は、今や、ジアミノ酸の濃縮溶液を、アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼ(ＥＣ４.３.１.１２)の遺伝子又はそれと相同な遺伝子にコードされた酵素、又はかかる酵素を過剰生成する組換え微生物を使用することにより、高い収率でα−イミノ−環状酸の溶液に、特に、α−イミノ−環状酸のアンモニウム塩の水溶液に変換することが可能であることを示した。

この発明は、式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸の又は式(Ｉ)のアミノ酸の塩若しくは誘導体の製造方法であって、下記のａ）及びｂ）を特徴とする当該製造方法に関係する：

[式中:
^*Ｒ₁は、水素原子、１〜６炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基及び１〜６炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アシル基の内から選択し；
^*Ｘは、飽和の又は部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖又は分枝鎖のＣ₁−Ｃ₉好ましくはＣ₂−Ｃ₄炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、適宜、該鎖の内部及び／又は末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、ＮＲ₂(Ｒ₂は、Ｈ又はＣ₁−Ｃ₄アルキル基又はアシル基を表す)の内から選択する一個又は数個のヘテロ原子又はヘテロ原子団を含み、該鎖は又、適宜、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ’Ｒ”、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ’Ｒ”、−ＣＮ、−ＮＯ₂、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ’Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ(Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、同じか又は異なって、水素又は２〜２０炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和の又は全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す)の内から選択する一個又は数個の同じ又は異なる基によって置換されており、Ｒ’とＲ”は、それらを有する原子と共に環を形成することができる]
ａ）下記式(II)のＬ−ジアミノ酸

(式中、Ｘ及びＲ₁は、上で規定した通りである)
又はその塩若しくは誘導体、
又は式(II)のＬ−ジアミノ酸及び対応するＤ−アミノ酸、それらの塩若しくは誘導体を様々な割合で好ましくは水性媒質中に含む鏡像体混合物、
を生成して、オルニチンシクロデアミナーゼ又はオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの存在下で反応させ(この酵素又は相同なポリペプチドは、該酵素又は該相同なポリペプチドを発現する組換え発現ベクターから得られる)、
ｂ）式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸又はその塩若しくは誘導体を、少なくとも８０％の鏡像体過剰率にて回収する。

「式(Ｉ)又は(II)のアミノ酸誘導体」は、それらのアミド又はエステルを意味すると理解される。

一層詳細には、本発明は又、式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸又は式(Ｉ)のアミノ酸の塩若しくは誘導体の製造方法であって、下記のａ）及びｂ）を特徴とする当該製造方法に関係する：

[式中、Ｒ₁は、Ｈ又はＣ₁−Ｃ₆アルキル基又はＣ₁−Ｃ₆アシル基を表し、且つＸは、飽和の直鎖又は分枝鎖Ｃ₂−Ｃ₉好ましくはＣ₂−Ｃ₄炭化水素鎖を表し、適宜、Ｏ、Ｓ、ＮＲ₂(Ｒ₂は、Ｈ又はＣ₁−Ｃ₄アルキル又はアシル基を表す)の内から選択する一つ又は幾つかのヘテロ原子又はヘテロ原子団により中断されており、且つ／又は、適宜、一つ又は幾つかのヒドロキシ基、アミノ基若しくはハロゲン化原子団により置換されている]
ａ）下記式(II)のＬ−アミノ酸

[式中、Ｘ及びＲ₁は、上で規定した通りである]
又はその塩若しくは誘導体、
又は式(II)のＬ−アミノ酸及び対応するＤ−アミノ酸、これらの塩若しくは誘導体を様々な割合で好ましくは水性媒質中に含む鏡像体混合物
を生成して、オルニチンシクロデアミナーゼ又はオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの存在下で反応させ(この酵素又は相同なポリペプチドは、該酵素又は該相同なポリペプチドを発現する組換え発現ベクターから得られる)、そして
ｂ）式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸又はその塩若しくは誘導体を、少なくとも８０％鏡像体過剰率にて回収する。

炭化水素鎖が一個又は数個のエチレン性及び／又はアセチレン性不飽和を有する場合には、これらは、好ましくは、式(II)のジアミノ酸のアミン官能基を形成する窒素原子のα位に位置する炭素原子により担われない。

炭化水素鎖が一個又は数個のヘテロ原子を有する場合に、該ヘテロ原子が、少なくとも２つの炭素原子により分離されていることも又、好ましいことである。

本発明の方法を利用して得られた式(Ｉ)の化合物は、最も頻繁に、３、４、５、６又は７結合の環を含み、これらは、有機化学の分野で最も頻繁に遭遇する環である。環が５、６又は７結合である式(Ｉ)の化合物は、好適であり、当業者が最も容易に入手できると思われるものである。しかしながら、本発明の方法は、５、６又は７結合の環を有する化合物の合成に限られるべきではない。

式(Ｉ)の化合物が、６結合環を含み、Ｘが４結合を有する炭化水素鎖を表す場合もこの方法は、好適である。更に一層詳細には、この方法は、Ｘが直鎖又は分枝鎖のアルキレン鎖である式(Ｉ)の化合物を得るために実行される。本発明において、炭化水素鎖は、炭素原子と水素原子を有する鎖を意味すると理解すべきである。

本発明の方法に関して、上で規定した式(II)のＬ−ジアミノ酸は、少なくとも一の酵素及び／又は少なくとも一のオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの存在下に置かれ、この又はこれらの酵素又は相同なポリペプチドは、それらを発現する組換え発現ベクターから得られるということは理解されるべきである。

オルニチンシクロデアミナーゼは、ジアミノ酸を、一層正確には、アミノ−α−アミノ酸を、特にオルニチンとリジンを環化することのできる酵素を意味すると理解される。本稿の残りにおいて言及されるオルニチンシクロデアミナーゼは、好ましくは、アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼ(ＥＣ４.３.１.１２)である。

プラスミドＴｉＣ５８に担われた遺伝子によりコードされるアグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼは、N.Sans等、Eur.J.Biochem.,173,(1988),123-130に記載されており、そのポリペプチド配列は、同様に、Genbank上でアクセス可能である(gi:68365)。

「オルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチド」は、オルニチンシクロデアミナーゼ特にアグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼと相同なアミノ酸の配列を有するポリペプチドを意味すると理解される。

これらの相同な配列は、アグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子のアミノ酸配列の少なくとも２５％に類似し、R.N. Costilow等、J.Biol.Chem.,246,21,(1971),6655-60に記載されたようにオルニチンシクロデアミナーゼ活性を有する配列として規定することができる。

用語「類似する」は、比較するアミノ酸間での完全な類似度又は同一性をいうが、類似性と呼ばれる不完全な類似度をも指す。ポリペプチド配列中のこの類似性の検索は、同じクラスのアミノ酸の置換である保存的置換例えば帯電してない側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン)、塩基性側鎖を有するアミノ酸(リジン、アルギニン及びヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸)、無極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン及びシステイン)の置換を考慮する。

それ故、より一層一般的には、「アミノ酸の相同配列」は、アグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子にコードされたオルニチンシクロデアミナーゼのアミノ酸配列と、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入により又は特に非天然アミノ酸又は擬似アミノ酸による天然アミノ酸の置換によって減少したアミノ酸数によって異なる任意のアミノ酸配列を意味すると理解される(改変は、コードされるポリペプチドの生物学的活性を有意に害しないものである)。

有利には、かかる相同なアミノ酸配列は、アグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子によりコードされるポリペプチドの配列の少なくとも３５％に好ましくは少なくとも４５％に類似である。

相同性は、通常、配列分析ソフトウェアパッケージ(例えば、米国、WI53705, Madison, University Avenue 1710, ウィスコンシン大学、バイオテクノロジーセンター、Genetics Computer GroupのSequence Analysis Software Package)を利用して測定する。アミノ酸の類似配列を、最高度の相同性(即ち、上で規定した同一性及び類似性)を得るために配列させる。この目的のためには、配列に、人為的な仕方でギャップを導入することが必要でありうる。一度最適なアラインメントが達成されたならば、２つの比較される配列のアミノ酸が同一であるすべての位置を記録することによって、全位置に対する相同性の程度が確立される。

これらのポリペプチドは、α−δ又はα−εジアミノデアミナーゼ酸活性を有するという共通の特徴を有する(これは、今まで必ずしも確立されていない)。

かかる相同配列に含まれるのは、アグロバクテリウム、アエロピルム、アルカエグロブス、ブルセラ、コリネバクテリウム、ハロバクテリウム、メソリゾビウム、メタノバクテリウム、シュードモナス、リゾビウム、ロドバクター、シノリゾビウム、シゾサッカロミセス、スルフォロブス、サーモプラスマ、スタフィロコッカス及びストレプトミセス属に属する微生物中で見出されるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの配列である。

下記の表１に列記した種又は株において見出されるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの配列を特に挙げることができる：

ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス(ＡＴＣＣ−２５４８６)のｐｉｐＡ遺伝子によりコードされるポリペプチド(その配列は、ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に記載されている)及び、ラパマイシン、アスコマイシン及びＦＫ−５０６を生成する種又は株並びにストレプトミセス又は他のストレプトグラミンを生成する微生物、特にストレプトミセス・イオイデンシス(ＡＴＣＣ−１１４１５)、ストレプトミセス・ミタカエンシス(ＡＴＣＣ−１５２９７)、ストレプトミセス・オリバセウス(ＡＴＣＣ−１２０１９)、ストレプトミセス・オストレオグリセウス(ＡＴＣＣ−２７４５５)、ストレプトミセス・バージニア(ＡＴＣＣ−１３１６１)において見出されうるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドの配列を挙げることができる。

シロイスナズナ、キイロショウジョウバエ、ヒト、クロカンガルー、ハツカネズミ、及びドブネズミなどの真核生物で見出されるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドも挙げることができ、下記の表２に列記しておく：

この発明の特定の具体例において、これらのポリペプチドは、アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼの遺伝子と相同な遺伝子によりコードされる。

「アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼの遺伝子と相同な遺伝子」は、下記を有する任意の遺伝子を意味すると理解される：
ａ）アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼの遺伝子のコード配列と類似のヌクレオチド配列；又は
ｂ）アグロバクテリウムＣ５８株のオルニチンシクロデアミナーゼの遺伝子のコード配列またはその相補配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；
ｃ）上で規定したアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同であるか又はオルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。

好ましくは、この発明によるかかる相同なヌクレオチド配列は、アグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子の、又は遺伝子ｐｉｐＡ、ｒａｐＬ、SEQ ID NO:１のｐｉｐＡ ^*、SEQ ID NO:２のｒａｐＬ ^*及びSEQ ID NO:５のｒａｐＬ ^* Ｌ ^*(以下で規定)の配列の少なくとも７５％に類似であり、一層好ましくは少なくとも８５％又は少なくとも９０％に類似である。

好適な仕方において、かかる相同なヌクレオチド配列は、アグロバクテリウムのｏｃｄ遺伝子配列の、又は遺伝子ｐｉｐＡ、ｒａｐＬ、SEQ ID NO:１のｐｉｐＡ ^*、SEQ ID NO:２のｒａｐＬ ^*及びSEQ ID NO:５のｒａｐＬ ^* Ｌ ^*(以下で規定)の配列の相補配列にストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする。緊縮条件を規定するパラメーターは、マッチしている鎖の５０％が分離する温度(Ｔｍ)に依存する。

３０塩基より多くの塩基を含む配列については、Ｔｍは、次の関係で規定される：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１(％Ｇ＋Ｃ)＋１６．６Ｌｏｇ(カチオンの濃度)−０．６３(％ホルムアミド)−(６００／塩基数)(Sambrook等、1989)。

非特異的な配列がハイブリダイズしない中位にストリンジェントな条件下では、ハイブリダイゼーション温度は、好ましくは、５〜１０℃(Ｔｍより低温)であってよく、ハイブリダイゼーション緩衝液は、好ましくは、高イオン強度の溶液例えば６×ＳＳＣの溶液である。

上で用いた用語「類似の配列」は、比較されるヌクレオチド間での完全な類似度又は同一性をいうが、類似性と呼ばれる不完全な類似度をも指す。ヌクレオチド配列間の類似性の検索は、例えば、プリンとピリミジンを区別する。

それ故、相同なヌクレオチド配列は、同一の配列の一つから、一個又は数個の塩基の変異、挿入、欠失又は置換により又は遺伝コードの縮重によって異なる任意のヌクレオチド配列を含む。

かかる相同配列は、アグロバクテリウム、アエロピルム、アルカエグロブス、ブルセラ、コリネバクテリウム、ハロバクテリウム、メソリゾビウム、メタノバクテリウム、シュードモナス、リゾビウム、ロドバクター、シノリゾビウム、シゾサッカロミセス、スルフォロブス、サーモプラスマ、スタフィロコッカス及びストレプトミセス属に属する微生物から得ることができる。

上記の表１に列記されている種又は株において見出されるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドをコードする遺伝子配列を特に挙げることができる。

ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に記載されたストレプトミセスプリスチナエスピラリス(ＡＴＣＣ−２５４８６)の遺伝子ｐｉｐＡの配列及びラパマイシン、アスコマイシン及びＦＫ−５０６を生成する種又は株並びにストレプトグラミンを生成するストレプトミセスその他の微生物、特にストレプトミセス・イオイデンシス(ＡＴＣＣ−１１４１５)、ストレプトミセス・ミタカエンシス(ＡＴＣＣ−１５２９７)、ストレプトミセス・オリバセウス(ＡＴＣＣ−１２０１９)、ストレプトミセス・オストレオグリセウス(ＡＴＣＣ−２７４５５)、ストレプトミセス・バージニア(ＡＴＣＣ−１３１６１)において見出されうるアグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドをコードする遺伝子配列も又、挙げることができる。

シロイスナズナ、キイロショウジョウバエ、ヒト、クロカンガルー、ハツカネズミ及びドブネズミ(これらは、アグロバクテリウムのオルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドをコードすることが記載されており、先の表２に列記されている)の真核生物遺伝子の配列をも挙げることができる。

この発明の方法に非常に適している属の内で、ストレプトミセス・ヒグロスコピクスの遺伝子ｒａｐＬ及びストレプトミセス・プリスチナエスピラレスのｐｉｐＡを特に挙げることができ、これらの配列は、Schwecke等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92(17),(1995),7839-43及びＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に記載されている。この発明の具体例によれば、一般式(II)の化合物又は式(II)のＬ−アミノ酸及び対応するＤ−アミノ酸、それらの塩又は誘導体を様々な割合で含む鏡像体混合物を、オルニチンシクロデアミナーゼに相同なポリペプチドを生成する微生物懸の濁液の存在下に置く。

好適な上記の相同な遺伝子は、下記する直接的突然変異導入法により得られる合成遺伝子である。

この発明の具体例によれば、式(II)の化合物又は式(II)のＬ−アミノ酸及び対応するＤ−アミノ酸、それらの塩又は誘導体を様々な割合で含む鏡像体混合物を、産生性微生物から単離された酵素の存在下に置く。

この発明の他の具体例によれば、式(II)の化合物又は式(II)のＬ−ジアミノ酸及び対応するＤ−ジアミノ酸を様々な割合で含む鏡像体混合物を精製状態の酵素の存在下に置く。

この発明の他の具体例によれば、式(II)の化合物又は式(II)のＬ−ジアミノ酸及び対応するＤ−ジアミノ酸を様々な割合で含む鏡像体混合物を、組換え酵素の存在下に置く(この後者の具体例が、好ましい)。

驚くべきことに、この発明の条件下で、上記のポリペプチドが、この発明の式(Ｉ)の化合物の立体特異的合成を、反応媒質へのＮＡＤの外因的添加を要せずに与えるということが見出された。

この発明の具体例において、酵素調製物又は適宜易透化した細胞の懸濁液を、式(II)の化合物又は式(II)の化合物及び対応するＤ−アミノ酸の鏡像体混合物に、約０．０５Ｍより大きい、好ましくは約０．１Ｍより大きい濃度で加えたが、同濃度は、約３Ｍ未満、好ましくは２．５Ｍ未満であり、これは、数時間〜数日にわたって、攪拌しながら、１０〜１００℃の、有利には２０〜７０℃の、好ましくは２５〜４５℃の温度でインキュベートするために残される。

この方法において、式(Ｉ)の化合物の少なくとも２０％の、有利には少なくとも８０％の、好ましくは少なくとも９０％のモル収率及び８０％より大きい、有利には９０％より大きい、好ましくは９５％より大きい鏡像体過剰率を得ることが可能である。

有利には、式(Ｉ)の化合物は、アンモニウム塩の形態である。

変形として、培養培地から抽出し又は式(II)の化合物若しくは式(II)の化合物若しくは対応するＤ−ジアミノ酸の鏡像体混合物を用いて精製した酵素も又、培地においてインキュベートすることができる(該培地は、ｐＨを６〜１１に好ましくは７〜１０に緩衝してもよいし、しなくてもよい)。

得られた生成物を、沈殿法、結晶化又はイオン交換クロマトグラフィーによって集めることができる。

式(Ｉ)の化合物の製造に好適な基質の内で、Ｌ−リジン又はＬ−及びＤ−リジン、Ｌ−チアリジン(Ｓ−２−アミノエチル−Ｌ−システイン)、Ｌ−オルニチン、Ｌ−及びＤ−５−(Ｒ，Ｓ)−ヒドロキシリジンの混合物、Ｌ−及びＤ−アザリジン(γ−Ｎ−２−アミノエチルジアミノプロピオン酸)の混合物を特に挙げることができる。

特に効率的な方法を提供するために、オルニチンシクロデアミナーゼ活性を有するポリペプチドの過剰生産は、特に有利である。

これに関して、上記のポリペプチドをコードする関心ある遺伝子を、宿主微生物好ましくは該ポリペプチドを過剰生成する宿主微生物に導入する。

この目的のために、上で規定したヌクレオチド配列の一つ又は相同な配列を含む核酸を、宿主細胞にトランスフェクトし、それを、対応するポリペプチドの発現(好ましくは、過剰発現)を与える条件下で培養する。

関心あるヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、該発現ベクターにおいては、該配列を、その発現の調節を可能にするエレメント例えば転写のプロモーター、アクチベーター及び／又はターミネーターに機能的様式で結合することができる。

ヌクレオチド配列の発現を制御するシグナル(それらの内で、プロモーター、アクチベーター及び停止配列を挙げることができる)を、使用する宿主細胞の関数として選択する。この目的のために、この発明によるヌクレオチド配列を、選択した宿主中で自律的に複製するベクター又は選択した宿主に組み込まれるベクターに挿入することができる。かかるベクターは、現在当業者に利用されている方法に従って製造することができ、その結果生成したクローンを標準的方法によって適当な宿主に挿入することができる。

好適なベクターの内で、プラスミドｐＴＺ１８(Sigma, St-Louis)、ｐＱＥ７０(Qiagen, Munich)及びＰＱＥ６０(Qiagen, Munich)を挙げることができる。

QIAGENプラスミドは、使用に際して、得られた酵素におけるポリヒスチジンの形成を含むという主な欠点を示した。それ故、これらのプラスミドは、この欠点を克服するように改変されなければならない。従って、それらのコード配列は、改変され又は中断されなければならない。これらの改変は、シクロデアミナーゼをコードする遺伝子の発現レベルに関して如何なる差違ももたらさなかった。

これらの発現ベクターを宿主細胞に導入して、それらを、トランスフェクトされたヌクレオチド配列の複製及び／又は発現を与える条件下で培養する。

宿主細胞の例には、特に、大腸菌、好ましくは大腸菌ＤＨ５α株、β２０３３株及びＫ１２(ＭＧ１６５５)株が含まれる。しかしながら、種々の属に属する他の宿主微生物も同じく適している。

特に興味深い結果は、大腸菌を、対応するネイティブな遺伝子に対して改変した遺伝子を用いて、大腸菌における関心ある遺伝子の最適な発現を与えるような方法でトランスフェクトした場合に得られる。

異種遺伝子は、ネイティブな遺伝子と同じポリペプチド又は前に規定された相同なペプチドをコードしつつ、６５％未満の、有利には５５％未満のＧ＋Ｃ塩基の割合を占めるような仕方で改変される。

従って、ネイティブなＤＮＡのコドンによりコードされる所定のアミノ酸について、もし必要であれば、コドンの第三の塩基(又は、第二の塩基)がＧ又はＣである場合にはそれをＡ又はＴで置換しても得られるコドンがネイティブなコドンによりコードされるものと同じアミノ酸に対応するならば、Ａ又はＴで置換する。

α−イミノ環状酸の最良の発現率及び同じく最高の収率を得ることを可能にした改変遺伝子は、ネイティブなコドンが、アミノ酸シクロデアミナーゼ活性を有するポリペプチドの所定のアミノ酸につき下記の表３に示した各コドンにより置換されたものである。

改変遺伝子を、対応するネイティブな遺伝子からのＰＣＲにより得たセクションを結合すること及び直接的突然変異導入法によって得た。

最良の結果を与えた改変遺伝子の内で、本願の添付書類に示した配列SEQ ID NO:１及びSEQ ID NO:５をそれぞれ有する改変遺伝子ｐｉｐＡ ^*及びｒａｐＬ ^**を挙げることができる。

これらの改変遺伝子に対応するポリヌクレオチドは、この発明の更なる主題を構成する。

添付書類に配列SEQ ID NO:３として示したストレプトミセス・プリスチナエスピラリスの遺伝子ｐｉｐＡにコードされたポリペプチドの配列から遺伝子ｐｉｐＡ ^*を得た。

添付書類に配列SEQ ID NO:４として示したストレプトミセス・ヒグロスコピクスの遺伝子ｒａｐＬにコードされたポリペプチドの配列から遺伝子ｒａｐＬ ^**を得た。

改変遺伝子を、クローニングベクターに、組換え宿主にトランスフェクトしたネイティブな遺伝子について上記したように挿入する。

場合によって組換えであって、ネイティブ状態で存在するか又は上記のように改変された遺伝子を含む宿主微生物を、適宜、発現誘導物質例えばＩＰＴＧの存在下で培養する。

これらの細胞が、標準的培養につき６００ｎｍでの吸光度において少なくとも１単位のオーダーの密度に達したとき及び高密度培養についてかかる単位の数十倍以上のオーダーの密度に達したときに、それらを培養培地から分離して、易透化処理にかける。該処理は、物理的(例えば、交互の凍結融解処理、超音波処理又はフレンチプレスによる処理、機械的破砕)であっても、化学的(例えば、溶剤又は錯化剤例えばＥＤＴＡの添加)であっても、又は酵素的(例えば、リゾチームの添加)であってもよい。

この細胞懸濁液を、次いで、上記のような式(II)の生成物の製造を達成するために利用することができ、該製造においては、生成される関心あるタンパク質を次いで回収して精製することができる。例えば、「Fed-batch」型の方法又は同等な方法を利用して、細胞懸濁液１リットル当たりの乾燥細胞グラム数で表して約１０ｇ／Ｌを超える、有利には３０ｇ／Ｌを超える濃縮物が得られる。同濃縮物は、原則として、超えられない限界を指示するこれがなければ、６０ｇ／Ｌ未満であり、又は５０ｇ／Ｌ未満でさえある。

用いる精製方法は、当業者に公知である。得られた組換えポリペプチドを、溶解物及び細胞抽出物、培養培地上清に基づいて、分画、クロマトグラフィー法、特異的モノ若しくはポリクローナル抗体を利用するイムノアフィニティー技術などの方法を個別に又は組合せて用いることによって精製することができる。

しかしながら、このタンパク質を回収することは必要でない。

有利な具体例によって、必要な酵素活性を有するポリペプチドを生成する宿主細胞を破壊して、それらの細胞質内容物を、ジアミノ酸基質を含む培地中に放出させる。該基質の２つのアミン基は、Ｌ型において又は鏡像体混合物の形態において、及び酵素と基質が出会うことを可能にする仕方で、４又は５結合だけ離れている(幾つかの経路が可能な場合は最短の経路での距離)。

下記の実施例は、この発明を説明する。

実施例１：
ストレプトミセス・プリスチナエスピラリスの遺伝子ｐｉｐＡの、当該株の全ＤＮＡからのＰＣＲによる増幅
１．１全ＤＮＡの抽出
ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス株ＡＴＣＣ２５４８６を２８℃でＴＳＢ培地(DIFCO)中で２４時間培養してから、こうして得られた培養物の１０ｍＬを５分間１１０００ｇで遠心分離した。その遠心分離ペレットを、２ｍＭＥＤＴＡ及び５ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む１０ｍＭトリス(ｐＨ８．０)の溶液１ｍＬに採った。こうして得られた懸濁液を３７℃で３０分間攪拌してから、１００μＬの２０％ＳＤＳ溶液を加えた。３０℃で数分間のインキュベーションの後に、２ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ溶液１２５μｌを再び加えた。その後、ＤＮＡの抽出を、ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅキット(QIAGEN, Munich)の試薬を用いて供給者の指示に従って行なった。こうして抽出したＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出により精製し、エタノール沈殿させて１００μｌの水中に採った。

１．２遺伝子ｐｉｐＡの増幅
遺伝子ｐｉｐＡを、こうして調製した全ＤＮＡから、特許ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に記載された配列を合成のためのプライマーとして用いるＰＣＲにより増幅した。この反応を、５０μＬの容積の緩衝液{１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００、２μＬの全ＤＮＡ溶液、各２５０μＭの４種のｄＮＴＰ、１単位のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(BioLabs)及び各５００ｎMの下記の２つのオリゴヌクレオチドを含む２０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．８)}中で行なった：

用いたＰＣＲ手順は、９７℃で４分間の変性のステップと、その後の８０℃で１分間のインキュベーションで開始し、９７℃で１分間の変性と、その後の５５℃で１分間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする５サイクルを続けた。その後、９７℃で１分間の変性と、その後の５０℃で１分間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする４０サイクルを行なった。この手順を、７２℃で１０分間の伸長ステップにより完了させた。

こうして増幅した断片をＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(QIAGEN)のカラム上で精製してから、ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩにより消化して、予め切断しておいたベクターｐＴＺ１８(SIGMA, ミズーリ、St-Louis在)中にクローン化した。独立したＰＣＲ増幅から得られた２種のプラスミド構築物(ｐＫＴ３５、ｐＫＴ３６)を配列決定した。こうしてクローン化したこれら２つの断片の配列は、同じであった。しかしながら、SEQ ID NO:３の特定されたタンパク質は、８７位の一つのアミノ酸(アラニン)だけが、ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に公開された配列(グリシン)と異なっている。

実施例２：
ストレプトミセス・ヒグロスコピクスの遺伝子ｒａｐＬの、当該株の細胞上清からのＰＣＲによる増幅
ストレプトミセス・ヒグロスコピクスＡＴＣＣ２９２５３株を、２８℃で、ＴＳＢ培地(DIFCO)中で、２４時間培養した。こうして得られた５０μＬの細胞懸濁液を、次の加熱及び冷却のステップにかけた：６５℃で３０秒、８℃で３０秒、６５℃で９０秒、９７℃で１８０秒、８℃で６０秒、６５℃で１８０秒、９７℃で６０秒、６５℃で６０秒、８０℃で２０秒。

遺伝子ｒａｐＬの増幅を、その記載された配列(Schwecke等、1995)をプライマーの合成に利用して、細胞の上清からのＰＣＲにより行なった。この反応を、容積５０μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．８)緩衝液{１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００、１０μＬの予め処理した細胞の懸濁液、各２５０μＭの４種のｄＮＴＰ、１単位のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(BioLabs)及び各５００ｎＭの下記の２つのオリゴヌクレオチドを含む}中で行なった：

ＰＣＲ手順を、９７℃で４分間の変性ステップとその後の８０℃で１分間のインキュベーションによって開始し、９７℃で１分間の変性と、その後の６０℃で１分間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする最初の全５サイクルを続け、その後、９７℃で１分間の変性と、その後の５２℃で１分間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする新たな５サイクルを続けた。その後、９７℃で１分間の変性と、その後の５０℃で１分間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分ｓ３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする３０サイクルを行なった。この手順を、７２℃で１０分間の伸長のステップにより完了した。

こうして増幅した断片をＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(QIAGEN)のカラム上で精製してから、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化して、予め切断しておいたベクターｐＴＺ１８中にクローン化した。独立したＰＣＲ増幅から得られた３種のプラスミド構築物(ｐＫＴ３０、ｐＫＴ３１、ｐＫＴ３４)を配列決定した。こうしてクローン化したこれら３つの断片の配列は、同じであった。しかしながら、SEQ ID NO:４の特定されたタンパク質は、５つのアミノ酸だけが、Schwecke等に公開された配列と異なっている(即ち、この発明のタンパク質は、５０位、８４位、１０２位、１２７位及び１２９位に、それぞれ、スレオニン、グルタミン、アスパラギン酸、アラニン及びアラニンの残基を含んでいる)。

実施例３：遺伝子ｐｉｐＡ ^*のＰＣＲによる全合成
ストレプトミセス・プリスチナエスピラリスに由来する１０６６ｂｐの大きさの遺伝子ｐｉｐＡ(その配列は、特許ＷＯ−Ａ１−９６／０１９０１に記載されている)は、６９．６％のＧ＋Ｃの割合よりなる。この遺伝子は、表３に記載した大腸菌での発現に最適の遺伝コードに従って書き直されている。配列SEQ ID NO:１の書き直された遺伝子ｐｉｐＡ ^*は、今後、３８％のＧ＋Ｃの割合よりなる。単一の制限部位ＫｐｎＩを導入するために、スレオニン残基９７を、表３により与えられるＡＣＴの代りにＡＣＣによりコードさせた。２つの翻訳終止コドンＴＡＡも、配列SEQ ID NO:１の１５位と１０８０位(コドンの第一ヌクレオチド)に加え、一方で、単一制限部位ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩを遺伝子の５’側に、他方で、ＨｉｎｄＩＩＩを遺伝子の３’側にそれぞれ導入し、こうして、クローニングベクターへの挿入を可能にした。

遺伝子ｐｉｐＡ ^*の合成を、２つのセクションＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ(３０５ｂｐのセクション１−ヌクレオチド１〜３０４)とＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ(セクション２−ヌクレオチド３０５〜１０９２)を結合することによって行なった。

各セクションを、５０〜６０ヌクレオチド長の重複する一本鎖オリゴヌクレオチド(「センス」及び「アンチセンス」鎖)の伸長と、その後の５’及び３’末端オリゴヌクレオチドによる増幅によって合成した。

セクション１の合成：ＰＣＲ反応を、容積１００μＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．８){１０ｍＭ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００、０．０１μＭの下記のオリゴヌクレオチド、各０．３ｍＭの４種のｄＮＴＰ及び２単位のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(BioLabs)を含む}中で行なった。使用したＰＣＲ手順は、９６℃で３０秒間の変性と、その後の５５℃で３０秒間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする３０サイクルよりなった。サイクル数１０で、５’(ＰＩＰＡＵＰ)及び３’(ＰＩＰＡＤ１)末端のオリゴヌクレオチドを終濃度０．５μＭで加えた。３０サイクルの終わりに、７２℃で２分間の伸長期間を加えた。

次のオリゴヌクレオチドをこの反応に用いた：ＰｉｐａＶ０、ＰｉｐａＶ２、ＰｉｐａＶ４、ＰｉｐａＶ６、ＰｉｐａＶ８、ＰｉｐａＤ４、ＰｉｐａＤ５、ＰｉｐａＤ６及びＰｉｐａＤ７。これらのオリゴヌクレオチドの配列を表４に記載する。

こうして得られたＰＣＲ生成物を、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(QIAGEN)のカラム上で精製してから、制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩによって連続的に消化し、再びアガロースゲル上で精製した。見かけの大きさ３００ｂｐのバンドを、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット(QIAGEN)を用いてゲルから抽出した。この精製ＰＣＲ生成物を、次いで、予め酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したベクターｐＴＺ１８にＴ４ＤＮＡリガーゼ(BioLabs)より連結して、アガロース上で精製した。この連結反応は、該酵素を供給した連結用緩衝液中で、一晩１６℃で行なった。この連結生成物を、次いで、大腸菌ＤＨ５α ＣＩＰ１０４７３８株(D.Hanahan, J.Mol.Biol.,166,(1983),557-580)中に、熱ショックによりトランスフォームして、組換えクローンを、アンピシリン(１００ｍｇ／Ｌ)を補った寒天ＬＢ培地(DIFCO)上で選択した。

アンピシリンに耐性のトランスフォーマントに含まれるプラスミドを、プラスミド調製システムＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐキット(QIAGEN)を用いて単離した。これらのプラスミドの４つについて、それらの適当な制限酵素による分析は、予想される大きさの挿入を示し、ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を配列決定した。これらの４つの構築物の各配列は、予想された配列に対して１〜３の違いを含んだ。プラスミドｐＳＰ２３(その断片の配列は、６ｂｐの欠失以外は正しかった)を、公開された方法(Ansaldi等、Anal.Biochem.,234,(1996),110-111)に従って、位置指定突然変異導入法にかけて、この欠失を正した。プラスミドｐＳＰ３９が、この方法で得られた。プラスミドｐＳＰ３９のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片の配列決定を行なって、得られた配列は、予想された配列を確認することが見出された。

セクション２の合成：ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩセクションの合成のためのＰＣＲ反応を、伸長期間(持続時間を、３０サイクルについて１分まで、手順の終わりに４分まで延長した)を除いて、セクション１について記載したように行なった。サイクル数１０において、５’(ＰＩＰＡＶ２９)及び３’(ＰＩＰＡＤ３)末端のオリゴヌクレオチドを、０．５μＭの終濃度で加えた。

次のオリゴヌクレオチドを、この反応のために用いた：ＰｉｐａＶ８、ＰｉｐａＶ１０、ＰｉｐａＶ１２、ＰｉｐａＶ１４、ＰｉｐａＶ１６、ＰｉｐａＶ１８、ＰｉｐａＶ２０、ＰｉｐａＶ２２、ＰｉｐａＶ２４、ＰｉｐａＶ２６、ＰｉｐａＶ２８、ＰｉｐａＤ８、ＰｉｐａＤ９、ＰｉｐａＤ１０、ＰｉｐａＤ１１、ＰｉｐａＤ１２、ＰｉｐａＤ１３、ＰｉｐａＤ１４、ＰｉｐａＤ１５、ＰｉｐａＤ１６及びＰｉｐａＤ１７。これらのオリゴヌクレオチドの配列を、表４に記載した。

ＰＣＲ生成物を、ＱｉａｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット(QIAGEN)のカラム上で精製してから、ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより消化して、予め同酵素で消化しておいたベクターｐＴＺ１８中に連結した。大腸菌ＤＨ５α株のトランスフォーメーション及びそれらのトランスフォーマントの選択及びプラスミドの分析を、セクション１について上記したように行なった。プラスミドｐＳＰ２５{そのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列は、予想された配列に対して５つの違いを有した}を、数ステップの位置指定突然変異導入法(Ansaldi等、1996, 同書)にかけて、これらのエラーを正した。プラスミドｐＳＰ４２が、この方法によって得られた。

２セクションの組立て：完全な遺伝子ｐｉｐＡ ^*を、プラスミドｐＳＰ４２から抽出したＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、予め酵素ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断しておいたプラスミドｐＳＰ３９中にクローン化することによって組み立てた。その結果生成したプラスミドの一つであるプラスミドｐＳＰ４３(予想された大きさのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを含む)を配列決定し、こうして、遺伝子の配列を確認した。

実施例４：
遺伝子ｒａｐＬ ^*の連結と変異型ｒａｐＬ ^**の獲得による全合成
ストレプトミセス・ヒグロスコピクスに由来する１０２９ｂｐの大きさの遺伝子ｒａｐＬ(その配列は、Schwecke等、1995, 同書に公開されている)は、６８％のＧ＋Ｃの割合よりなる。この遺伝子は、実施例３における遺伝子ｐｉｐＡ ^*の合成のために採用した遺伝コードに従って、書き直されている。SEQ ID NO:２の書き直した遺伝子ｒａｐＬ ^*は、今後、３８％のＧ＋Ｃの割合よりなる。単一の制限部位ＫｐｎＩを導入するために、スレオニン残基９７を、表３に示したコードにより与えられるＡＣＴの代わりにＡＣＣによってコードさせた。翻訳終止のための２つのコドンＴＡＡも加え、一方で、単一制限部位ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩを遺伝子の５’側に、他方で、ＨｉｎｄＩＩＩを３’側に、それぞれ導入し、そうして、該遺伝子の種々のクローニングベクターへの挿入を可能にした。

遺伝子ｒａｐＬ ^*の全合成を、３つのセクションＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ(３０５ｂｐのセクション１)、ＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ(３１６ｂｐのセクション２)及びＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ(４４０ｂｐのセクション３)を結合することにより行なった。

各セクションを、平均５０ヌクレオチド長の５’リン酸化一本鎖オリゴヌクレオチドの連結により合成した。該セクションは、クローン化すべき配列(「センス」及び「アンチセンス」鎖)の全体をカバーし、重複している。これらのオリゴヌクレオチドの配列及び位置は、表５に記載してある。これらのオリゴヌクレオチドを、重複緩衝液(２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８；０．０８ＭＮａＣｌ)中で等モル様式(１μＭ)で混合して(最終容積２０μＬ)、１０分間、７０℃まで加熱して、それらが周囲温度に戻るまで加熱ブロック中に維持した。こうして得られた生成物を、次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより、一晩、１６℃で、予め適当な制限酵素により消化してあるベクターｐＴＺ１８(ベクター／オリゴヌクレオチドモル濃度比１／１００)の存在下で連結した。

連結生成物を用いて、β２０３３株(大腸菌Ｋ１２、ｐｒｏ、ｔｈｉ、ｒｐｓＬ、ｈｓｄＳ、ΔｌａｃＺ、Ｆ’(ΔｌａｃＺＭ１５、ｌａｃＩ ^q、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋、ｐｒｏＢ＋))を、エレクトロポレーションによってトランスフォームして、組換え体クローンを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、０．５ｍＭＩＰＴＧ及び３０μｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌを含む寒天ＬＢ培地上で選択した。

アンピシリンに耐性の幾つかの白色のトランスフォーマントに含まれるプラスミドを、プラスミド調製システムＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐキット(QIAGEN)を利用して単離した。各セクションにつき、２〜４のプラスミド挿入物(これらのプラスミドの適当な制限酵素による分析は、予想される大きさの断片を示した)を配列決定した。

セクション１の合成：
ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩにより切断したプラスミドｐＴＺ１８を、次のオリゴヌクレオチド(これらの配列は、表５に示してある)と連結させた：ＩｃｄＶ−１、ＩｃｄＶ−２、ＩｃｄＶ−３、ＩｃｄＶ−４、ＩｃｄＶ−５、ＩｃｄＶ−６、ＩｃｄＶｒｅｖ−１６、ＩｃｄＶｒｅｖ−１７、ＩｃｄＶｒｅｖ−１８、ＩｃｄＶｒｅｖ−１９、ＩｃｄＶｒｅｖ−２０、ＩｃｄＶｒｅｖ−２１、ＩｃｄＶｒｅｖ−２２。プラスミドｐＳＰ３(その挿入物の配列は、予想された配列に対して２つしか違いがなかった)が保持された。これら２つのエラーを、公開された方法(Ansaldi等、1996, 同書)に従って位置指定突然変異導入法によって正して、これらの修正を、その結果生成したプラスミドｐＳＰ１４の挿入物の配列決定により確認した。

セクション２の合成：
ＫｐｎＩ及びＰｓｔＩにより切断されたプラスミドｐＴＺ１８を、次のオリゴヌクレオチド(これらの配列は、表５に示してある)と連結した：ＩｃｄＶ−７、ＩｃｄＶ−８、ＩｃｄＶ−９、ＩｃｄＶ−１０、ＩｃｄＶ−１１、ＩｃｄＶ−１２、ＩｃｄＶｒｅｖ−９、ＩｃｄＶｒｅｖ−１０、ＩｃｄＶｒｅｖ−１１、ＩｃｄＶｒｅｖ−１２、ＩｃｄＶｒｅｖ−１３、ＩｃｄＶｒｅｖ−１４、ＩｃｄＶｒｅｖ−１５。プラスミドｐＳＰ８(その挿入物の配列は、予想された配列に対して２つしか違いがなかった)が保持された。このエラーを、位置指定突然変異導入法(Ansaldi等、1996, 同書)により正して、この修正を、その結果生成したプラスミドｐＳＰ１５の挿入物の配列決定により確認した。

セクション３の合成：
ＰｓｔＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断したプラスミドｐＴＺ１８を、次のオリゴヌクレオチド(これらの配列は、表５に示してある)と連結させた：ＩｃｄＶ−１３、ＩｃｄＶ−１４、ＩｃｄＶ−１５、ＩｃｄＶ−１６、ＩｃｄＶ−１７、ＩｃｄＶ−１８、ＩｃｄＶ−１９、ＩｃｄＶ−２０、ＩｃｄＶ−２１、ＩｃｄＶｒｅｖ−１、ＩｃｄＶｒｅｖ−２、ＩｃｄＶｒｅｖ−３、ＩｃｄＶｒｅｖ−４、ＩｃｄＶｒｅｖ−５、ＩｃｄＶｒｅｖ−６、ＩｃｄＶｒｅｖ−７、ＩｃｄＶｒｅｖ−８。プラスミドｐＳＰ１２(その挿入物の配列は、２５ｂｐの欠失と１点の違いのみを有した)が保持された。これら２つのエラーを、位置指定突然変異導入法(Ansaldi等、1996, 同書)によって修正して、これらの修正を、その結果生成したプラスミドｐＳＰ２６の挿入物の配列決定により確認した。

３つのセクションの結合：修正したＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片とＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、既にＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を含んでいるプラスミドｐＳＰ１４中に続けてサブクローン化し、こうして、遺伝子ｒａｐＬ ^*を再構成した。生成したプラスミドｐＳＰ３３の遺伝子ｒａｐＬ ^*の配列を、配列決定により確認した。

変異型ｒａｐＬ ^** の獲得(SEQ ID NO:５)：変異型ｒａｐＬ ^**を、プラスミドｐＳＰ３３の遺伝子ｒａｐＬ ^*から、位置指定突然変異導入法(Ansaldi等、1996, 同書)によって、遺伝子ｒａｐＬ ^**にコードされるタンパク質が、実施例２で増幅され配列決定された遺伝子にコードされるもの(配列SEQ ID NO:４に対応)と同じであるのに必要な５つの変化を、表３に記載の遺伝コードを守りつつ導入することにより得た。こうして、プラスミドｐＴＺ１８に由来するプラスミドｐＳＰ３６(遺伝子ｒａｐＬ ^**を含む)を得た。

実施例５：大腸菌における遺伝子ｐｉｐＡ ^*の過剰発現
遺伝子ｐｉｐＡ ^*をベクターｐＱＥ６０(QIAGEN)(コード配列を予め上記のように改変したプラスミド)中に、実施例３で構築したプラスミドｐＳＰ４３に基づく制限部位ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にクローン化した。その結果生成したプラスミドｐＳＰ４７を、補助プラスミドｐＲＥＰ４(QIAGEN)に基づく遺伝子ＩａｃＩを発現する大腸菌Ｋ１２株ＭＧ１６５５(Vidal等、1998)中に導入した。こうして得られた＋７５株を、ＬＢ培地中で培養して、遺伝子ｐｉｐＡ ^*の発現を供給者の指示に従ってＩＰＴＧの添加により誘導した。これらの細胞の全タンパク質をポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル電気泳動により分離して、クーマシーブルーで染色した。３６ｋＤの分子量のタンパク質が検出され、その発現率は全タンパク質の約５％と見積もられた。

実施例６：遺伝子ｐｉｐＡ、ｒａｐＬ、ｒａｐＬ ^*及びｒａｐＬ ^**の大腸菌における過剰発現
実施例５に上記したように実施して、遺伝子ｐｉｐＡを過剰発現する大腸菌株(＋３５３株)を、プラスミドｐＫＴ３７の導入により得た。このプラスミドを、実施例１に記載のプラスミドｐＫＴ３６から、関心ある遺伝子をベクターｐＱＥ６０の制限部位ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングすることにより得た。

同様に、遺伝子ｒａｐＬ(＋３８株)、ｒａｐＬ ^*(＋６０株)又はｒａｐＬ ^**(＋７３株)を過剰発現する大腸菌株を、それぞれ、プラスミドｐＳＰ３２、ｐＳＰ３７又はｐＳＰ４５を導入することにより得た。これらのプラスミドｐＳＰ３２、ｐＳＰ３７又はｐＳＰ４５は、それぞれ、プラスミドｐＫＴ３０、ｐＳＰ３３又はｐＳＰ３６(実施例２及び４に記載)から、関心ある遺伝子をベクターｐＱＥ７０の制限部位ＳｐｈＩとＨｉｎｄＩＩＩの間にクローニングすることにより得た。

これらの種々のタンパク質の発現率を、実施例５に記載したようにして測定した。各株について、予想された分子量を有するタンパク質が、全タンパク質の約５％の発現率で検出された。

実施例７：アグロバクテリウム・ツメファシエンスのｏｃｄ遺伝子のＰＣＲによる増幅及び大腸菌における過剰発現
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣＩＰ１０４３３３のプラスミドＴｉ−Ｃ５８の調製物を、別書(Hayman等、Mol.Gen.Genet.,223,(1990), 465-473)に記載されたように生成した。ｏｃｄ遺伝子(Sans等、(1988), 同書)を、このプラスミドＴｉ−Ｃ５８の調製物からＰＣＲにより増幅した。

この反応を、５０μｌの容積の２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．８) {１０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄、２ｍＭＭｇＳＯ₄、０．１％トリトンＸ−１００、２ｎｇのプラスミドＴｉ−Ｃ５８、各２００μＭの４種のｄＮＴＰ、１単位のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ(BioLabs)及び各５００ｎＭの次の２つのオリゴヌクレオチドを含有する}中で行なった：

使用するＰＣＲ手順を、９４℃で２分間の変性のステップにより開始し、その後、９４℃で３０秒間の変性と、その後の５２℃で３０秒間のハイブリダイゼーションと、その後の７２℃で１分３０秒間の伸長のシーケンスを特徴とする３０サイクルを続けた。この手順を、７２℃で１０分間の伸長のステップにより完了させた。

こうして増幅した断片をＮｃｏＩとＢｇｌＩＩにより消化して、予め切断してあるベクターｐＱＥ７０(QIAGEN)(コード配列が上記のように改変されたプラスミド)中にクローン化した。こうして得られたプラスミドｐＫＲ７のＮｃｏＩ及びＢｇｌＩＩ断片を配列決定した。特定されたタンパク質は、公表されている配列(Sans等、(1988), 同書)と２つのアミノ酸だけ異なっている(即ち、リジンにより置換されたＧｌｎ２１２残基とロイシンにより置換されたＩｌｅ２９７残基)。これら２つの違いを、独立に得られたＰＣＲによる増幅生成物の配列決定により確認した。

実施例５に記載のように実施することにより、ｏｃｄ遺伝子を過剰発現する大腸菌株(＋７８株)を、プラスミドｐＫＲ７の導入により得た。ｏｃｄ遺伝子によりコードされたタンパク質の発現率を、実施例５に記載のようにして測定した。予想されたものと同じ分子量を有するタンパク質が、全タンパク質の約５％の発現率で検出された。

実施例８：組換え大腸菌株の細胞懸濁液によるＬ−リジンからのＬ−ピペコリン酸の製造
実施例５で構築した＋７５株を、２ｇ／Ｌグルコース、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン及び３０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含む無機培地ＭＳ(Richaud等、J.Biol.Chem.,268,(1993),26827-35)中で培養する。１４時間の培養の最後に、２ｇ／Ｌグルコースを含む４００ｍＬの無機培地ＭＳに、＋７５株予備培養物を１／１０で接種する。この培養物を、ＯＤ_600nmが０．７に達するまで、攪拌しながら、３７℃に置く。次いで、遺伝子ｐｉｐＡ ^*を、２００ｍＬの培養物に対して１ｍＭのＩＰＴＧの添加により、４時間、３７℃で誘導する。ＩＰＴＧを添加しない２００ｍＬの参照用培養物も生成する。このステップの最後に、これらの２種の培養物を、１３０００ｇで遠心分離して、細胞ペレットを、無機培地に、細胞が１００倍濃縮されるようにとる。次いで、これらの細胞を、−２０℃での２ステップの凍結／融解により易透化して、基質の酵素への接近を援助する。次いで、Ｌ−リジン一塩酸塩(ｐＨ＝７)を、細胞懸濁液中の終濃度１Ｍで加える(最終容積＝２ｍＬ)。酵素反応を、３７℃で攪拌しながら達成する。２０時間の終りに、各培養物３００μＬの試料を採り、それを１３０００ｇで遠心分離して、それで上清を回収する。次いで、上清の希釈溶液をシリカの薄層上につけ、同時に、ＨＰＬＣにより分析する。

Ｌ−ピペコリン酸のものと区別できないクロマトグラフィー上の移動度(Ｒｆ＝０．２２；溶離液：ＣＭＣ中のブタノール／酢酸／水４／１／１)を有し且つニンヒドリンにより染色される化合物が、ＩＰＴＧで誘導した培地の場合には検出されるが、誘導しない参照用培養物の場合には、該化合物は存在しない。

ＨＰＬＣによる分析(条件は、以下に記載)は、４０ｇ／Ｌの濃度のＬ−ピペコリン酸塩を、２０時間の終りに示す。鏡像体過剰率は、９５％より大きい。

Ｌ−ピペコリン酸のＬ−リジンからの生成試験を、実施例６及び７で構築した＋３８、＋６０、＋７３、＋７８及び＋３５３株を用いて、＋７５株について上で適用したものと同じ条件下で行なった。ニンヒドリンによる染色後のシリカ薄層上のそれぞれの上清のクロマトグラフィーによる分析は、Ｌ−ピペコリン酸の生成を、＋７３、＋７８及び＋３５３株についてのみ示した。

用いたＨＰＬＣ法の説明：
− Phenomenex Synergi Polar-RP-80 ４μ(２５０×４．６ｍｍ)カラム(サーモスタットで３０℃に制御)、
− ２１０ｎｍでのＵＶ検出
− 注入した試料の容積：１０μＬ
− ０．０５％のＴＦＡの水溶液による５分間にわたる定組成溶離と、その後のカラムの８０％アセトニトリル及び０．０５％ＴＦＡ水溶液での洗浄、
− 滞留時間：リジン２．９８分、ピペコリン酸４．６２分。

実施例９：Ｌ−チオモルフィン−２−カルボン酸の、Ｌ−チアリジンからの製造
Ｌ−チオモルフィン−２−カルボン酸の製造を、実施例８に記載したようにして調製した＋７５株の細胞懸濁液に基づいて行なった。Ｌ−チアリジン(Ｓ−(２−アミノエチル)−Ｌ−システイン)(SIGMA)を、終濃度１Ｍで加えた。インキュベートした懸濁液の上清の薄層クロマトグラフィーを行ない、それは、Ｌ−チアリジン及びＬ−ピペコリン酸のものとは区別される移動度(Ｒｆ＝０．２８；溶離液：ブタノール／酢酸／水４／１／１)を有し且つニンヒドリンで染色される化合物を示す。

同じ条件下で、実施例７に記載の＋７８株は、＋７５株により生成されるのと同じ化合物を生々する。

実施例１０：５−Ｒ−及び５−Ｓ−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の混合物の、Ｌ−及びＤ−５−(Ｒ，Ｓ)ヒドロキシリジンの混合物からの生成
５−Ｒ−及び５−Ｓ−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の混合物の生成を、実施例８に記載したように調製した＋７５株の細胞懸濁液に基づいて行なった。５−Ｒ，Ｓ−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−リジン(SIGMA)を、終濃度１Ｍで加える。インキュベートした懸濁液の上清のシリカ薄層クロマトグラフィーを行ない、それは、等しい割合で存在して、５−Ｒ，Ｓ−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−リジン及びＬ−ピペコリン酸のものとは区別される移動度(Ｒｆ１＝０．１４、Ｒｆ２＝０．２０；溶離液：ブタノール／酢酸／水４／１／１)を有し且つニンヒドリンで染色される２種の化合物を示す。

同じ条件下で、実施例７に記載の＋７８株は、＋７５株により生成されるものと同じ２つの化合物を生成する。

実施例１１：他の環状アミノ酸の製造
本発明の方法の大きな多様性は、出発ジアミノ酸の性質の改変により実施例８に記載の操作方法を用いて得られる次の環状アミノ酸により例示されうる。

配列表

Claims

式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸の又はその塩若しくは誘導体の一つの製造方法であって、下記のａ）及びｂ）を特徴とする当該製造方法：

[式中:
・Ｒ₁は、水素原子、１〜６炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基及び１〜６炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖アシル基の内から選択し；
・Ｘは、飽和の又は部分的に若しくは全体的に不飽和の、直鎖又は分枝鎖のＣ₁−Ｃ ₉ 炭化水素鎖を表し、該炭化水素鎖は、適宜、該鎖の内部及び／又は末端に、Ｏ、Ｓ、Ｐ、ＮＲ₂(Ｒ₂は、Ｈ又はＣ₁−Ｃ₄アルキル基又はアシル基を表す)の内から選択する一個又は数個のヘテロ原子又はヘテロ原子団を含み、該鎖は、適宜、−Ｒ、−ＯＲ、−ＳＲ、＝Ｏ、−Ｃ(Ｏ)ＯＲ、−Ｃ(Ｓ)ＯＲ、−Ｃ(Ｏ)ＮＲ’Ｒ”、−Ｃ(Ｓ)ＮＲ’ＲＲ”、−ＣＮ、−ＮＯ₂、−Ｘ、−ＭｇＸ、−ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ’Ｃ(Ｏ)Ｒ、−ＳｉＲ及び−ＳｉＯＲ(Ｒ、Ｒ’及びＲ”は、同じか又は異なって、水素又は２〜２０炭素原子を有する直鎖若しくは分枝鎖の飽和の又は全体的に若しくは部分的に不飽和の炭化水素基を表す)の内から選択する一個又は数個の同じ又は異なる基によって置換されており、Ｒ’とＲ”は、それらを有する原子と共に環を形成することができる]
ａ）下記式(II)のＬ−ジアミノ酸

(式中、Ｘ及びＲ₁は、上で規定した通りである)
又はその塩若しくは誘導体、
又は式(II)のＬ−ジアミノ酸及び対応するＤ−ジアミノ酸、それらの塩若しくは誘導体を様々な割合で含む鏡像体混合物、
を生成して、
SEQ ID NO: １のｐｉｐＡ ^* 遺伝子、 SEQ ID NO: ２のｒａｐＬ ^* 遺伝子及び SEQ ID NO: ５のｒａｐＬ ^* Ｌ ^* 遺伝子の群から選ばれた少なくとも一種にコードされた酵素の存在下で反応させ、
ｂ）式(Ｉ)の環状Ｌ−アミノ酸又はその塩若しくは誘導体を、少なくとも８０％の鏡像体過剰率にて回収する。
式(Ｉ)の化合物が、６結合の環を含み、Ｘが４結合を有する炭化水素鎖を表す、請求項１に記載の方法。
炭化水素鎖Ｘが、直鎖の又は分枝したアルキレン鎖である、請求項１又は２に記載の方法。
式(II)の化合物又は式(II)のＬ−ジアミノ酸及び対応するＤ−ジアミノ酸を様々な割合で含む鏡像体混合物を、純粋状態の酵素の存在下に置く、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
一般式(Ｉ)の化合物が、水溶液中のアンモニウム塩の形態である、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
Ｌ−ピペリジン−２−カルボン酸又はその塩の一つが、Ｌ−リジンから調製される、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
Ｌ−ピペラジン−２−カルボン酸又はその塩の一つが、Ｌ−アザリジンから調製される、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
Ｌ−チオモルホリン−２−カルボン酸又はその塩の一つが、Ｌ−チアリジンから調製される、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
酵素が、大腸菌において発現される、請求項１〜８いずれか１項に記載の方法。
反応媒質に外因性ＮＡＤを加えない、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
反応が水性媒質中で行われる請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
配列SEQ ID NO:１を含むポリヌクレオチド。
配列SEQ ID NO:２を含むポリヌクレオチド。
配列SEQ ID NO:５を含むポリヌクレオチド。