KR100731597B1 - 환형 ｌ-아미노산의 입체-선택적 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식(I)의 환형 L-아미노산의 제조 방법으로서:

오르니틴 사이클로데아미나아제 또는 상기 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드의 존재 하에 식(II)의 L-디아미노산, 또는 그러한 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산을 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물를 반응시키는 단계를 포함하는 제조 방법:

아미노산, 오르니틴 사이클로데아미나아제, 폴리펩타이드, 거울상 이성체, 뉴클레오타이드

Description

환형 Ｌ-아미노산의 입체-선택적 제조 {STEREOSELECTIVE PREPARATION OF CYCLIC L-AMINO ACIDS}

본 발명은 환형 L-아미노산 또는 그의 염 및 유도체의 입체-선택적 제조에 관한 것이다.

환형 아미노산, 특히 L-프롤린, L-피페콜산 또는 L-피페라진-2-카르복시산 및 그의 염은 신약의 합성에 사용되기 때문에, 그에 대한 요구가 증가되고 있다. 이들이 키랄 분자 경우에는 그 합성이 곤란하다.

생합성 측면에서, L-프롤린의 고리 형성만이 설명되고 밝혀져 있다. 이는 하기의 2가지 방식으로 실시될 수 있다:

- 글루탐산 반무수물(semianhydride)의 고리화를 통한 Δ1-피롤린-5-카르복시산의 형성 및 이어서 불포화 고리의 환원; 또는

- L-오르니틴의 직접 사이클로데아민화(cyclodeamination).

그러나, 이들 방법은 산업적 규모의 키랄 환형 아미노산의 합성을 위한 만족스러운 해법을 제공하지는 못한다.

나아가, L-오르니틴을 L-프롤린으로 직접 전환시키는 효소 활성은 Clostridium에서 처음으로 밝혀졌으며(R.N. Costilow et al., J. Biol. Chem., 246 (21), (1971), 6655-60; W.L. Muth et al., J. Biol. Chem., 249 (23), (1974), 7457-62), 시험관내에서 부분적으로 정제된 효소의 존재 하에 총 20mM의 L-오르니틴이 L-프롤린으로 전환되었다. 이 Clostridium의 오르니틴 사이클로데아미나아제(ocd)는 NAD에 의해 활성화되는 특성을 가지며, 통상은 보조인자(cofactor)가 산화 반응에 관여하고, 정제된 형태의 경우에는 매우 불안정한 것으로 여겨진다. 이는 D-오르니틴에 대해서는 반응하지 않으나, 40mM의 D-오르니틴의 존재 하에서는 저해되는 반면, 40mM의 L-리신의 존재 하에서는 그 활성이 감소하지 않는다. 따라서, 흔히 대사 효소는 매우 특이적인 것으로 인식되고 있기 때문에, 이상의 저자들은 사이클로데아미나아제가 L-리신에 대하여 반응할 가능성에 대해서조차 생각한 바가 없다.

몇 년 후, 노팔린의 분해에 관여하는 Agrobacterium의 유전자 발현과 ocd 활성 사이의 상관성이 밝혀졌으며(N. Sans et al., Eur. J. Biochem., 173, (1988), 123-130), 이후 ocd를 코딩하는 유전자가 시퀀싱되었다.

상기 저자에 의하여 Agrobacterium의 다른 균주에서 매우 상동한 제2의 유전자가 발견되었다(U. Schindler et al., J. Bacteriol., 171, (1989), 847-854). 이들 두 사이클로데아미나아제의 특성이 연구되었으며, L-오르니틴에 대한 활성만이 입증되었다. 따라서, 다시 L-리신이 사이클로데아미나아제의 기질일 가능성은 고려되지 않았고, 그의 저해 작용만이 조사되었다(Schindler et al., ibid).

뒤이어, 많은 유기체의 전체 또는 부분 서열이 결정됨으로써, Agrobacterium의 ocd 유전자와 강한 상동성을 가지는 여러 새로운 유전자가 동정되었다. 그러 나, 이들 각각의 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 효소 활성 및 그 활성의 범위는 전혀 연구된 바 없으며, 이 효소는 오르니틴에 대하여 특이적인 것으로 간주되었다. 특히, 이들 효소에 대한 특이성 및 그들의 촉매 활성의 수준은 효소적 과정의 생산성에 있어 결정적인 요소임에도 불구하고, 아직까지 밝혀지지 않은 상태로 남아 있다.

L-피페콜산으로부터 유래되는 대사물의 생산자인 Streptomyces 내에서 발견된 이들 세 유전자에 대하여, 코딩된 폴리펩타이드에 대한 리신 사이클로데아미나아제의 활성이 가정되었다(WO-A1-96/01901; L.E. Khaw et al., J. Bacteriol., 180, (1998), 809-814; I. Molnar et al., Gene, 169, (1996), 1-7; H. Motamedi et al., Eur. J. Biochem., 249, (1998), 528-534).

따라서, rapL 유전자(Khaw et al., ibid.) 또는 pipA(WO-A-96/01901)에 의하여 코딩되는 사이클로데아미나아제가 리신의 피페콜산으로의 전환(transformation)을 통한 라파마이신(Rapamycin)의 합성 경로에 관여할 수 있는 것으로 제안되어 왔다. 그러나, 현재까지 이러한 견해가 지배적이었다 해도, L-리신의 L-피페콜산으로의 사이클로데아민화 활성은 전혀 입증되거나 예증된 바 없으며, 정량화된 바도 없다. 이들 유전자에 의하여 실제로 촉매되는 반응에 대한 이러한 지식의 부족은,피페콜산을 유도하는 생물학적 경로와 관련하여 존재하는 통일되지 못하는 다양한 가설에 의해 입증되며, 이러한 문헌에서 리신이 피페콜산으로 전환되는 것은 D-리신을 통해서도 이루어질 수 있다고 언급히고 있다 (Khaw et al., ibid.).

기타 생화학적 연구를 통해, 동위원소 표지 실험을 기초로 하여 Aspergillus 내에서 불포화 고리의 환원에 의한 α-아미노아디프산으로부터의 L-피페콜산의 형성이 밝혀졌으며(A.J. Aspen et al., Biochemistry, 1, (4), (1962), 606-612), 그러한 생합성 경로는 당업자에 의하여 Streptomyces에서도 밝혀졌다(J.W. Reed et al., J. Org. Chem., 54 (5), (1989), 1161-65).

L-프롤린의 생합성 효소, 특히 오르니틴 사이클로데아미나아제가 새로운 환형 아미노산의 생산에 대하여 제안된 바 없다는 사실은 당업자의 일반적인 견해에서, 피페콜산의 생합성이 이러한 방식으로는 달성될 수 없음을 추가로 증명해준다. 따라서, 거울상 이성체 면에서 순수한 형태, 보다 구체적으로 L형 피페콜산 또는 피페라진-2-카르복시산을 유도하는 생전환에 대한 여러 가지 생명공학적 방법들이 수년 동안 특허로서 보호받아 왔다. 이들 문헌에 나타난 예들은 환형 아미노산의 최대 생산량이 15 g/ℓ인 것으로 보고하고 있으며, 사이클로데아미나아제의 사용에 대해서는 전혀 언급하는 바가 없다.

단지 한 문헌을 제외한 이들 모든 문헌에서 라세미체 기질을 해법으로서 제시하고 있다. 그들은 안정된 기질에 작용하는 N-아실라아제 유형(WO 95/10604, WO 99/07873), 아미다아제 유형(EP-A-0 686 698), 아미노산 옥시다아제 유형(JP 06030789), 니트릴라아제 유형(JP 06038781, JP 11127885), 또는 에스테라아제 유형(WO 00/12745)의 활성을 이용한다.

이들 방법 모두는 많은 단점을 갖고 있는데, 그중 라세미 혼합물에 대한 최대 수율이 50%로 제한된다는 점과, 거울상 이성체를 회수하기 위하여 효소에 의해 전환되지 않는 기질과 형성된 산물을 분리해야한다는 것, 그리고 다른 거울상 이성 체의 재순환 가능성에 대해 대비해야 한다는 것이다. 단지 JP 06030781호만이 다양한 비재조합 박테리아 분리주에 의한, 상업적으로 입수 가능한 고가의 키랄 기질인 L-리신의 L-피페콜산으로의 전환을 제시하고 있으나, 이 생전환 과정을 실시하기 위한 화학 반응 순서의 도입되지 않았다. 이 특허에서는 7일에 10 g/ℓ의 L-리신으로부터 대략 4.2 g/ℓ의 L-피페콜산이 생산된다고 하는 수율 및 생산성 측면에서의 성능에 대하여 언급하고 있다. 따라서, 유리하고 경제적인 방법은 매우 불충분한 상태이다. 본 발명의 목적은 종래보다 우수한 성능, 특히 환형 아미노산의 생산성에 있어 종래보다 대략 5배, 10배, 심지어 20배, 또는 그 이상을 달성하는 것이다.

본 출원인은 Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제(EC 4.3.1.12)의 유전자 또는 이들과 상동한 유전자에 의하여 코딩되는 효소, 또는 그러한 효소를 과다생산하는 재조합 미생물을 이용하여, 특히 환형 α-이미노산의 암모늄염 수용액 중에서 디아미노산(diamino acid)의 농축 용액을 환형 α-이미노산 용액으로 고수율로 전환시킬 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 하기의 단계를 포함하는 식(I)의 L-아미노산, 또는 식(I)의 아미노산의 염 또는 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:

상기 식에서,

R₁은 수소 원자, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 알킬라디칼, 및 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 아실 라디칼로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

X는 O, S, P, 및 NR₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종원자 또는 이종원자기를 사슬 내에 및/또는 사슬의 말단에 선택적으로 포함하는 포화되거나, 혹은 부분적으로 또는 전체적으로 불포화된 선형 또는 분지형 C₁-C₉, 바람직하게는 C₂-C₄ 탄화수소 사슬을 나타내고, 여기서 R₂는 H 또는 C₁-C₄ 알킬 또는 아실기를 나타내고, 상기 사슬은 -R, -OR, -SR, =O, -C(O)OR, -C(S)OR, -C(O)NR'R", -C(S)NR'RR", -CN, -NO₂, -X, -MgX, -NR'R", -NR'C(O)R, -SiR, 및 -SiOR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동일하거나 상이한 라디칼에 의하여 선택적으로 치환되고, R, R' 및 R"는 동일하거나 상이한 것으로서, 수소, 또는 선형 또는 분지형의 포화된, 혹은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 2개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 탄화수소 라디칼을 나타내고, R' 및 R"은 그들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있는 것으로 이해됨,

a) 식(II)의 L-디아미노산(diamino acid) 또는 그의 염 또는 유도체, 혹은 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산, 그의 염 또는 유도체를 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물을 바람직하게는 수계 매질 내에서 재조합 발현 벡터로부터 발현된 오르니틴 사이클로데아미나아제(ornithine cyclodeaminase), 또는 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드의 존재 하에 반응시키는 단계; 및

(상기 식에서, X 및 R₁은 상기에 정의된 바와 같음),

b) 식(I)의 환형 L-아미노산, 또는 그의 염 또는 유도체를 적어도 80% 이상의 거울상 이성체로서 회수하는 단계.

"식(I) 또는 (II)의 아미노산 유도체"는 그들의 아미드 또는 에스테르를 의미하는 것으로 이해된다.

보다 구체적으로, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 식(I)의 환형 L-아미노산, 또는 그의 염 또는 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:

상기 식에서,

R₁은 수소 원자 또는 C₁-C₆ 알킬기 또는 C₁-C₆ 아실기를 나타내고, X는 O, S, 및 NR₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종원자 또는 이종원자기에 의하여 선택적으로 중단된 포화된 선형 또는 분지형 C₂-C₉, 바람직하게는 C₂ -C₄ 탄화수소 사슬을 나타내고, 여기서 R₂는 H 또는 C₁-C₄ 알킬 또는 아실기를 나타내고, 상기 사슬은 하나 이상의 하이드록시기, 아미노기 또는 할로겐화기에 의하여 선택적으로 치환됨,

a) 식(II)의 L-디아미노산 또는 그의 염 또는 유도체, 혹은 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산, 그의 염 또는 유도체를 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물을 바람직하게는 수계 매질 내에서 재조합 발현 벡터로부터 발현된 오르니틴 사이클로데아미나아제, 또는 상기 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드의 존재 하에 반응시키는 단계; 및

(상기 식에서, X 및 R₁은 상기에 정의된 바와 같음),

b) 식(I)의 환형 L-아미노산, 또는 그의 염 또는 유도체를 적어도 80% 이상의 거울상 이성체로서 회수하는 단계.

상기 탄화수소 사슬은 에틸렌계 및/또는 아세틸렌계 불포화 상태를 하나 이상 함유하며, 이러한 불포화 상태는 식(II)의 디아미노산의 아민 작용기를 형성하는 질소 원자의 α-위치에 존재하는 탄소 원자가 소유하지 않는 것이 바람직하다.

또한, 상기 탄화수소 사슬은 하나 이상의 이종원자를 함유하고, 상기 이종원자는 적어도 2개의 탄소 원자에 의하여 분리되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법을 이용해 얻어지는 식(I)의 화합물은 대부분 3, 4, 5, 6 또는 7개 결합의 고리를 포함하며, 이들은 유기화학 분야에서 가장 자주 대하는 고리들이다. 5, 6, 또는 7개 결합의 고리를 가지는 식(I)의 화합물이 바람직하고, 이는 당업자들이 가장 많이 접하는 것 중 하나이다. 그러나, 본 발명에 따르는 방법은 5, 6 또는 7개 결합의 고리를 가지는 화합물의 합성으로 제한되지 않는다.

상기 방법은 또한 상기 식(I)의 화합물이 6개의 결합을 가지는 고리를 포함하고, X는 4개의 결합을 가지는 탄화수소 사슬을 나타내는 경우에 바람직하다. 보다 구체적으로, 상기 방법은 X가 선형 또는 분지형 알킬렌 사슬인 식(I)의 화합물을 얻기 위하여 실시된다. 본 발명에서, 탄화수소 사슬은 탄소 및 수소 원자를 가지는 사슬을 의미하는 것으로 이해된다.

본 발명에 따르는 방법에 대하여, 상기 식(II)의 L-디아미노산은 적어도 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 1종의 효소 및/또는 적어도 1종의 폴리펩타이드의 존재 하에서 반응되며, 상기 효소 또는 상동 펩타이드는 상기 효소 또는 상동 펩타이드를 발현하는 재조합 발현 벡터로부터 얻어진다.

오르니틴 사이클로데아미나아제는 디아미노산, 보다 구체적으로는 아미노-α-아미노산 및 특히 오르니틴 및 리신을 고리화할 수 있는 임의의 효소를 의미하는 것으로 이해된다. 이하에서 제조되는 오르니틴 사이클로데아미나아제는 Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제(EC 4.3.1.12)인 것이 바람직하다.

플라스미드 TiC58이 함유하는 유전자에 의하여 코딩되는 Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제는 N. Sans 등의 Eur. J. Biochem., 173, (1988), 123-130에 제시되어 있으며, 그 폴리펩타이드 서열은 Genbank(gi:68365)로부터 누구나 입수 가능하다.

"오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드"는 특히 Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 아미노산 서열과 상동한 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 상동 서열은 R.N. Costilow 등에 의하여 J. Biol. Chem., 246, 21, (1971), 6655-60에 개시된 바와 같이, Agrobacterium의 ocd 유전자의 아미노산 서열과 적어도 25% 유사한 것으로 오르니틴 사이클로데아미나아제 활성을 가지는 서열로서 정의될 수 있다.

"유사"란 용어는 비교되는 아미노산들 사이의 완전한 닮음 또는 동일을 의미하며, 불완전한 닮음도 유사성이란 말로 표현된다. 폴리펩타이드 서열 내에서의 유사성에 대한 이러한 연구는 다음과 같은 동일한 부류의 아미노산간의 치환인 보존적 치환을 고려한다: 비하전 측쇄를 가지는 아미노산의 치환(예를 들면, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 및 티로신), 염기성 잔기를 가지는 아미노산의 치환(예를 들면, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘), 산성 측쇄를 가지는 아미노산의 치환(예를 들면, 아스파르트산 및 글루탐산), 비극성 측쇄를 가지는 아미노산의 치환(예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 및 시스테인).

따라서 보다 일반적으로, "아미노산의 상동 서열"은, 그러한 변형이 코딩된 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유의하게 결정짓지 않는 그러한 위치에서의 아미노산 또는 감소된 수의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 치환, 특히 비천연 아미노산 또는 유사 아미노산에 의한 천연 아미노산의 치환에 의하여 Agrobacterium의 ocd 유전자에 의하여 코딩되는 오르니틴 사이클로데아미나아제의 아미노산 서열과 상이한 임의의 아미노산 서열을 의미하는 것으로 이해된다.

이러한 아미노산의 상동 서열은 Agrobacterium의 ocd 유전자에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드의 서열과 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 45% 유사하다.

상동성은 통상 서열 분석 소프트웨어 패키지(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705, USA)를 이용하여 결정된다. 아미노산의 유사 서열은 최대의 상동 수준(즉, 상기에 정의된 바와 같은 동일성 또는 유사성)을 얻기 위하여 정렬된다. 이러한 목적을 위하여, 인위적인 방식으로 서열에 갭을 도입할 필요가 있을 수 있다. 최적의 정렬이 획득되면, 위치의 총수를 기준으로, 비교되는 두 서열의 아미노산이 동일한 모든 위치를 기록함으로써 상동 수준이 정해진다.

이들 폴리펩타이드는 통상 α-δ 또는 α-ε 디아미노산 데아미나아제 활성을 갖는 것을 특징으로 하며, 이는 부득이하게 지금까지 입증되지 못하여 왔다.

그러한 상동 서열 중에는 Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus, 및 Streptomyces종에 속하는 미생물 내에서 발견되는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드의 서열이 포함된다.

상기 종 또는 균주 내에서 발견되는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드 서열로 특히 언급할 수 있는 것들을 하기 표 1에 수록하였다.

표 1: Agrobacterium 의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 폴리펩타이드 서열과 상동한 폴리펩타이드 서열을 가지는 미생물

또한, 그 서열이 WO-A1-96/01901에 개시된 Streptomyces pristinaespiralis의 유전자 pipA(ATCC-25486)에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드, 및 라파마이신, 아스코마이신, 및 FK-506을 생산하는 종 또는 균주, 그리고 스트렙토그라민을 생산하는 Streptomyces 또는 기타 미생물, 특히 Streptomyces ioidensis(ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis(ATCC-15297), Streptomyces olivaceus(ATCC-12019), Streptomyces ostreogriseus(ATCC-27455), Streptomyces virginiae(ATCC-13161)에서 발견될 수 있는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드 서열도 언급할 수 있다.

또한, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus fuliginosus, Mus musculus, 및 Rattus norvegicus와 같은 진핵생물 유기체 내에서 발견되는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드도 언급할 수 있으며, 이들은 하기 표 2에 수록하였다.

표 2: Agrobacterium 의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 폴리펩타이드 서열과 상동한 폴리펩타이드 서열을 가지는 고등 유기체

본 발명의 특정 구현형태에서, 이들 폴리펩타이드는 Agrobacterium C58 균주 의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 유전자와 상동한 유전자에 의하여 코딩된다.

"Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 유전자와 상동한 유전자"란 하기 서열을 가지는 임의의 유전자를 의미하는 것으로 이해된다:

a) Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제의 유전자의 코딩 서열과 유사한 뉴클레오타이드 서열;

b) 엄격한 혼성화 조건 하에서 Agrobacterium C58 균주의 오르니틴 사이클로데아미나아제 유전자의 코딩 서열과 혼성화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보 서열; 또는

c) 상기 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동하거나, 또는 오르니틴 사이클로데아미나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열.

바람직하게는, 본 발명에 따르는 이러한 상동 뉴클레오타이드 서열은 Agrobacterium의 ocd 유전자, 또는 SEQ ID No. 1 서열의 유전자 pipA, rapL , pipA ^*, SEQ ID No. 2 서열의 유전자 rapL ^*, 및 SEQ ID No. 5 서열의 유전자 rapL ^* L ^*의 서열과 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 또는 적어도 90% 유사하다.

바람직한 방식에서, 이러한 상동 뉴클레오타이드 서열은 특히 엄격한 조건 하에서 이하에 정의된 Agrobacterium의 ocd 유전자, 또는 SEQ ID No. 1 서열의 유전자 pipA, rapL, pipA ^*, SEQ ID No. 2 서열의 유전자 rapL ^* , 및 SEQ ID No. 5 서열 의 유전자 rapL ^* L ^*의 서열의 상보 서열과 혼성화한다. 엄격 조건을 규정하는 매개 변수는 매치되는 가닥의 50%가 분리되는 온도(Tm)에 따라 좌우된다.

30개 이상의 염기를 포함하는 서열의 경우, Tm은 하기 관계식으로 규정된다:

Tm = 81.5+0.41(G+C 함유율(%)) + 16.6Log(양이온 농도) - 0.63(포름아미드 함유율(%)) - (600/염기의 개수) (Sambrook et al., 1989).

비특이적 서열은 혼성화되지 못하는 적합한 엄격 조건 하에서, 혼성화 온도는 바람직하게는 Tm 5 내지 10℃ 이하일 수 있고, 사용되는 혼성화 완충액은 예를 들면 6×SSC 용액과 같은 고도의 이온화 세기를 가지는 용액이 바람직하다.

상기에서 사용된 "유사 서열"이란 용어는 비교하는 뉴클레오타이드들 사이의 완전한 닮음 또는 동일뿐 아니라, 유사성으로 불리는 불완전 닮음도 일컫는다. 핵산 서열 내에서의 유사성에 대한 이러한 연구를 통해 예를 들면 퓨린 및 피리미딘이 구별되었다.

따라서, 상동 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 염기의 임의의 돌연변이, 삽입, 결실 또는 치환, 또는 유전자 코드의 축퇴에 의하여 동정된 서열 중 하나와 상이한 임의의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

이러한 상동 서열은 Agrobacterium, Aeropyrum, Archaeoglobus, Brucella, Corynebacterium, Halobacterium, Mesorhizobium, Methanobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodobacter, Sinorhizobium, Schizosaccharomyces, Sulfolobus, Thermoplasma, Staphylococcus, 및 Streptomyces종에 속하는 미생물로부터 얻어질 수 있다.

특히, 상기 표 1에 수록한 종 또는 균주 내에서 발견되는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 서열을 언급할 수 있다.

또한, 그 서열이 WO-A1-96/01901에 개시된 Streptomyces pristinaespiralis의 유전자 pipA의 서열(ATCC-25486), 및 라파마이신, 아스코마이신 및 FK-506을 생산하는 종 또는 균주뿐만 아니라, 스트렙토그라민을 생산하는 Streptomyces 또는 기타 미생물, 특히 Streptomyces ioidensis(ATCC-11415), Streptomyces mitakaensis(ATCC-15297), Streptomyces olivaceus(ATCC-12019), Streptomyces ostreogriseus(ATCC-27455), Streptomyces virginiae(ATCC-13161) 내에서 발견될 수 있는 Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드를 코딩하는 서열도 언급할 수 있다.

또한, Agrobacterium의 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드를 코딩하는 것으로 알려진, 상기 표 2에 수록한 Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Macropus fuliginosus, Mus musculus, 및 Rattus norvegicus와 같은 진핵생물의 유전자 서열도 언급할 수 있다.

본 발명에 따르는 방법에 매우 적합한 유전자 중에는, 구체적으로 Streptomyces hygroscopicus의 유전자 rapL 및 Streptomyces pristinaespirales의 유전자 pipA을 들 수 있으며, 이들 서열은 각각 Schwecke 등에 의하여 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92 (17), (1995), 7839-43 및 WO-A1-96/01901에 개시되어 있다. 본 발명의 한 구현형태에 따르면, 일반식(II)의 화합물 또는 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산, 그의 염 또는 유도체를 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물은 오르니틴 사이클로데아미나아제와 상동한 폴리펩타이드를 생산하는 미생물 현탁액의 존재 하에서 반응된다.

상술한 바와 같은 바람직한 상동 유전자는 이하에서 설명하는 직접 돌연변이 유발에 의하여 얻어지는 합성 유전자들이다.

본 발명의 한 구현형태에 따르면, 상기 식(II)의 화합물 또는 식(II)의 L-아미노산 및 해당 D-아미노산, 그의 염 또는 유도체를 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물은 생산성 미생물로부터 분리되는 효소의 존재 하에서 반응된다.

본 발명의 다른 구현형태에 따르면, 상기 식(II)의 화합물 또는 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산을 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물은 정제 상태의 효소의 존재 하에서 반응된다.

본 발명의 또 다른 구현형태에 따르면, 상기 식(II)의 화합물 또는 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산을 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물은 재조합 효소의 존재 하에서 반응되며, 이 구현형태가 바람직하다.

본 발명의 조건 하에서, 상기 폴리펩타이드는 반응 매질 내에 외인성 NAD를 첨가할 필요 없이, 본 발명의 식(I)의 화합물의 입체 특이적 합성이 허용된다.

본 발명의 한 구현형태에서는, 선택적 투과가 가능한 효소 제제 또는 세포 현탁액이 대략 0.05M 이상, 바람직하게는 대략 0.1M 이상의 농도로 상기 식(II)의 화합물 또는 식(II)의 화합물 및 해당 D-디아미노산의 거울상 이성체 혼합물에 첨 가되며, 이때 이들 화합물의 염 또는 유도체의 농도는 대략 3M 미만, 바람직하게는 2.5M 미만이고, 이를 10℃ 내지 100℃, 유리하게는 20℃ 내지 70℃, 바람직하게는 25℃ 내지 45℃의 배양 온도에서 수시간 내지 수일 동안 교반 하에 방치한다.

이러한 방식으로는, 80몰% 이상, 유리하게는 90몰% 이상, 바람직하게는 95몰% 이상의 거울상 이성체와 함께, 식(I)의 화합물이 적어도 20몰%, 유리하게는 적어도 80몰%, 바람직하게는 적어도 90몰%의 수율로 얻어질 수 있다.

상기 식(I)의 화합물은 암모늄염 형태인 것이 유리하다.

변이체로서, 배지로부터 추출되거나, 상기 식(II)의 화합물 또는 식(II)의 화합물 및 해당 D-디아미노산의 거울상 이성체 혼합물과 함께 정제되는 효소도 pH 6 내지 11, 바람직하게는 7 내지 10으로 완충될 수도 있고 완충되지 않을 수도 있는 배지 내에서 배양될 수 있다.

얻어진 산물은 침전, 결정화 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 수집될 수 있다.

식(I)의 화합물의 제조에 바람직한 기질 중에는, 특히 L-리신 또는 L-리신 및 D-리신의 혼합물, L-티아리신(S-2-아미노에틸-L-시스테인), L-오르니틴, L-5-(R,S)-하이드록시리신 및 D-5-(R,S)-하이드록시리신의 혼합물, L-아자리신(γ-N-2-아미노에틸디아미노프로피온산) 및 D-아자리신(γ-N-2-아미노에틸디아미노프로피온산)의 혼합물이 있다.

상기 방법을 보다 효율적으로 실시하기 위하여, 오르니틴 사이클로데아미나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드를 과다생산하는 것도 특히 유리하다.

이런 측면에서, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 관심 유전자는 바람직하게는 상기 폴리펩타이드를 과다발현하는 숙주 미생물 내로 도입된다.

이를 위하여, 상기 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 포함하거나 상동 서열을 포함하는 핵산을 함유하는 벡터가 해당 폴리펩타이드의 발현, 바람직하게는 과다발현이 허용되는 조건 하에서 배양되는 숙주 세포 내로 형질전환된다.

관심 핵산 서열은 이들의 발현을 조절하는 요소, 예를 들면 구체적으로 프로모터, 활성자 및/또는 종결자에 유효한 방식으로 연결된 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다.

뉴클레오타이드 서열의 발현을 조절하는 신호(예를 들면, 프로모터, 활성자, 및 종결 서열)는 사용된 숙주 세포의 기능에 따라 선택된다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명에 따르는 뉴클레오타이드 서열이 선택된 숙주 내에 자발적인 복제 체제를 가지는 벡터, 또는 선택된 숙주 내로 혼입되는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 벡터는 당 기술분야에 공지된 종래의 방법에 따라 제조될 것이고, 이를 통해 얻어지는 클론은 표준 방법에 의하여 적합한 숙주 내로 도입될 수 있다.

바람직한 벡터 중에는, 플라스미드 pTZ18(Sigma, St-Louis), pQE70(Qiagen, Munich), 및 PQE60(Qiagen, Munich)을 언급할 수 있다.

이들이 사용된 경우, QIAGEN 플라스미드는 얻어지는 효소에서 폴리히스티딘의 형성과 관련하여 많은 단점을 나타내었다. 따라서, 이들 플라스미드는 이러한 단점을 극복하기 위하여 변형되어 왔다. 그러므로, 코딩 서열은 변형 또는 붕괴되어야 한다. 이러한 변형은 사이클로데아미나아제를 코딩하는 유전자의 발현 수준 면에서는 어떠한 차이도 초래하지 않았다.

상기 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되고, 트랜스펙션된 뉴클레오타이드 서열의 복제 및/또는 발현을 허용하는 조건 하에서 배양된다.

숙주 세포의 예로는 구체적으로 E. coli, 바람직하게는 균주 Escherichia coli DH5α, Escherichia coli β2033, 및 Escherichia coli K12(MG1655)가 포함된다. 그러나, 상이한 유전자를 소지하는 기타 숙주 유기체도 역시 적합하다.

특히 흥미로운 결과는 E. coli 내에서 관심 유전자의 최적의 발현을 가능하게 하는 방식으로 E. coli가 해당 천연 유전자에 비하여 변형된 유전자로 트렌스펙션되는 경우에 얻어진다.

이종(heterologous) 유전자는 G+C 염기를 65% 미만, 유리하게는 55% 미만의 비율로 포함하나, 상술한 바와 같이 천연 유전자와 동일한 폴리펩타이드 또는 상동 폴리펩타이드를 코딩하도록 하는 변형된다.

따라서, 천연 DNA 코돈에 의하여 코딩되는 주어진 아미노산에 대하여, 코돈의 세 번째 염기가 교체되거나, 또는 코돈의 두 번째 염기가 G 또는 C인 경우는 이 두 번재 염기가 A 또는 T로 교체될 필요가 있으나, 이 경우에도 얻어지는 코돈은 천연 코돈에 의하여 코딩되는 아미노산과 동일한 아미노산에 해당한다.

환형 α-이미노산의 최대 발현율 및 최고의 수율을 달성할 수 있도록 변형된 유전자는 천연 코돈이 아미노산 사이클로데아미나아제 활성을 가지는 폴리펩타이드의 주어진 아미노산이 하기 표 3에 나타내어진 각각의 코돈으로 교체된 것들이다.

표 3: 사용된 보존 코드

상기 변형 유전자는 해당 천연 유전자로부터 PCR 및 직접 돌연변이 유발에 의하여 얻었다.

최상의 결과를 제공하는 변형 유전자로는 각각 본 명세서에 첨부한 서열목록의 SEQ ID No. 1 및 SEQ ID No. 5의 서열을 가지는 변형 유전자 pipA ^* 및 rapL ^**를 들 수 있다.

이들 변형 유전자에 해당하는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 또 다른 대상을 구성한다.

유전자 pipA ^*는 이하에 첨부한 서열목록에 SEQ ID No. 3의 서열로 나타내어진 Streptomyces pristinaespiralis의 유전자 pipA에 의하여 코딩되는 폴리펩타이 드의 서열로부터 얻었다.

유전자 rapL ^**는 이하에 첨부한 서열목록에 SEQ ID No. 4의 서열로 나타내어진 유전자 Streptomyces hygroscopicus의 유전자 rapL에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드의 서열로부터 얻었다.

상기 변형 유전자는 재조합 숙주 내로 트랜스펙션된 천연 유전자에 대하여 상기한 바와 같은 클로닝 벡터 내로 삽입된다.

경우에 따라, 재조합되어, 천연 상태로 존재하거나 상술한 바와 같이 변형된 유전자를 포함하는 숙주 미생물은 선택적으로 발현 유도자, 예를 들면 IPTG의 존재 하에 배양된다.

세포가 600nm에서 표준 배양주에 대해서는 대략 적어도 하나의 흡광 단위의 밀도에 도달하고, 고밀도 배양주에 대해서는 대략 수십개 이상의 흡광 단위의 밀도에 도달하는 경우, 이들을 배지로부터 분리하여, 물리적 투과화 처리(예를 들면, 교호(alternating) 냉동 및 해동 처리, 초음파 처리 또는 프렌치 프레스 처리, 기계적 압착) 또는 화학적 투과화 처리(예를 들면, 용매 또는 EDTA와 같은 착화제의 첨가), 또는 효소적 투과화 처리(예를 들면, 라이소자임의 첨가)한다.

이어서, 세포 현탁액을 사용해 상기 식(II)의 산물을 제조한 뒤, 생성된 관심 단백질은 회수 및 정제할 수 있다. 예를 들면, "공급-배치(Fed-batch)" 유형의 방법 또는 등가의 방법을 이용하여, 농도를 구하고, 세포 현탁액의 단위 ℓ당 건조 세포의 중량(g) 단위로 나타내어 대략 10 g/ℓ 이상, 유리하게는 30 g/ℓ 이상이 다. 이 농도는 일반적으로 60 g/ℓ 미만, 심지어는 50 g/ℓ 미만이나, 이것이 임계갑을 나타내지는 않는다.

사용되는 정제 방법은 당 기술분야 공지되어 있다. 얻어지는 재조합 폴리펩타이드는 특정 단일 클론성 또는 다중 클론성 항체 등을 이용한 분리, 크로마토그래피 방법, 면역-친화성 기술을 개별적으로 또는 조합하여 사용하는 방법을 통해 배지 상청인 용균물 및 세포 추출물을 기준으로 정제할 수 있다.

그러나, 이 단백질을 반드시 회수할 필요는 없다.

유리한 구현형태에 따르면, 원하는 효소 활성을 가지는 폴리펩타이드를 생산하는 숙주 세포는, 그들의 세포질 함유물이 L-형태 또는 거울상 이성체의 혼합물 형태로 효소 및 그의 기질을 함께 운반할 수 있도록 하는 방식으로, (여러 경로가 가능한 경우에는 최단 경로로) 4개 또는 5개의 결합에 의하여 2개의 아미노기가 이격된 디아미노산 기질을 함유하는 매질 내로 방출되도록 파괴된다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이다.

실시예 1: Streptomyces pristinaespiralis 균주의 전체 DNA로부터 pipA 유전자의 PCR 증폭

1.1 전체 DNA의 추출

균주 Streptomyces pristinaespiralis ATCC 25486을 28℃에서 24시간 동안 TSB 배지(DIFCO)에서 배양한 뒤, 얻어진 배양액 10㎖를 11000g에서 5분간 원심분하였다. 원심분리 펠릿을 2mM의 EDTA 및 5 mg/㎖의 라이소자임을 함유하는 10mM의 Tris 용액(pH 8.0) 1㎖에 넣었다. 이렇게 얻어진 현탁액을 37℃에서 30분간 교반 하에 방치한 뒤, 20% SDS 용액 100㎕를 첨가하였다. 30℃에서 수분 동안 배양한 후, 프로테이나아제 K를 2 mg/㎖ 농도로 함유하는 125㎕의 용액을 첨가하였다. 이어서, 공급자의 지침에 따라 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, Munich)의 시료를 이용하여 DNA를 추출하였다. 이렇게 추출된 DNA를 페놀/클로로포름 추출을 통해 정제하고, 에탄올로 침전시킨 뒤, 100㎕의 물에 넣었다.

1.2 유전자 pipA 의 증폭

프라이머를 합성하기 위하여 특허 WO-A1-96/01901호에 개시된 서열을 이용하여 상기에서 제조한 전체 DNA로부터 PCR을 통해 유전자 pipA를 증폭하였다. 반응은 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 2㎕의 전체 DNA 용액, 4종의 dNTP 각각 250μM, 1유닛의 Vent DNA Poymerase(BioLabs), 및 하기 2종의 올리고데옥시뉴클레오타이드 각각 500nM을 함유하는 20mM의 Tris-HCl(pH 8.8) 완충액 50㎕ 내에서 실시되었다:

5' CCCGAATTCCGACACCACGCACGGACGAGAAG

5' CCCTGCAGGCATCTCTCTCCTCGCGAGGGC.

적용된 PCR 절차는 97℃에서 4분간의 변성 단계 및 80℃에서 1분간의 배양 단계로 시작한 뒤, 순차적인 97℃에서 1분간의 변성 단계, 55℃에서 1분간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 5회 사이클을 지속하였다. 이어서, 순차적인 97℃에서 1분간의 변성 단계, 50℃에서 1분간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 40회 사이클을 수행하였다. 상기 절차는 72℃에서 10분간의 연장 단계로 종결하였다.

이렇게 증폭된 단편을 Qiaquick PCR 정제 키트(QIAGEN)의 칼럼 상에서 정제한 뒤, EcoRI 및 PstI에 의하여 분해시켜, 사전 절단된 벡터 pTZ18(SIGMA, St-Louis, MO) 내에 클로닝하였다. 이후의 독립적인 PCR 증폭을 통해 얻어진 2개의 플라스미드 구조체(pKT 35, pKT 36)를 시퀀싱하였다. 이렇게 클로닝된 이들 2개 단편의 서열을 동정하였다. 그러나, SEQ ID No. 3 서열의 특정 단백질은 87번 위치의 아미노산이 WO-A1-96/01901호에 개시된 서열(글리신)에 비하여 알라닌으로 달라져 있었다.

실시예 2: Streptomyces hygroscopicus 균주의 전체 DNA로부터 유전자 rapL 의 PCR 증폭

균주 Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253을 TSB 배지(DIFCO) 내에서 28℃ 하에 24시간 동안 배양하였다. 이렇게 얻어진 50㎕의 세포 현탁액을 다음과 같은 가열 및 냉각 단계에 적용하였다: 65℃에서 30초, 8℃에서 30초, 65℃에서 90초, 97℃에서 180초, 8℃에서 60초, 65℃에서 180초, 97℃에서 60초, 65℃에서 60초, 80℃에서 20분.

유전자 rapL의 증폭은 프라이머를 합성하기 위하여 개시된 서열(Schwecke et al., 1995)을 이용하여 세포 현탁액으로부터 PCR을 통해 실시하였다. 상기 반응은 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 사전 처리된 10㎕의 세포 현탁액, 4종의 dNTP 각각 250μM, 1유닛의 Vent DNA Poymerase(BioLabs), 및 하기 2종의 올리고데옥시뉴클레오타이드 각각 500nM을 함유하는 20mM의 Tris-HCl(pH 8.8) 완충액 50㎕ 내에서 실시되었다:

5' CCCGAATTCGAGGTTGCATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAG

5' CCCAAGCTTAGATCTTTATTACAGCGAGTACGGATCGAGGACG.

적용된 PCR 절차는 97℃에서 4분간의 변성 단계 및 80℃에서 1분간의 배양 단계로 시작하여, 순차적인 97℃에서 1분간의 변성 단계, 60℃에서 1분간의 혼성화 단계, 및 60℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 5회 사이클, 이어서 순차적인 97℃에서 1분간의 변성 단계, 52℃에서 1분간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 새로운 5회 사이클로 지속되었다. 그런 다음, 순차적인 97℃에서 1분간의 변성 단계, 50℃에서 1분간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 30회 사이클을 수행하였다. 상기 절차는 72℃에서 10분간의 연장 단계로 종결하였다.

이렇게 증폭된 단편을 Qiaquick PCR 정제 키트(QIAGEN)의 칼럼 상에서 정제한 뒤, EcoRI 및 HindIII에 의하여 분해시켜, 사전 절단된 벡터 pTZ18 내로 클로닝하였다. 이후의 독립적인 PCR 증폭을 통해 얻어진 3개의 플라스미드 구조체(pKT 30, pKT 31, pKT 34)를 시퀀싱하였다. 이렇게 클로닝된 이들 3개 단편의 서열을 동정하였다. 그러나, SEQ ID No. 4 서열의 특정 단백질은 Schwecke 등에 의하여 공개된 서열에 비하여 5개의 아미노산이 상이하였다. 즉, 본 발명에 따르는 단백질은 50, 84, 102, 127, 및 1297번 위치에 각각 트레오닌, 글루타민, 아스파르트 산, 알라닌, 및 알라닌을 함유한다.

실시예 3: PCR에 의한 유전자 pipA ^* 의 전체 합성

그 서열이 특허 WO-A1-96/01901호에 개시된, Streptomyces pristinaespiralis 유래의 1066bp의 크기를 가지는 유전자 pipA는 69%의 G+C 함유율을 갖는다. 이 유전자를 표 3에 개시한 Escherichia coli 내에서의 발현을 위하여 최적화된 유전자 코드에 따라 고쳐 썼다. 고쳐 쓰여진 SEQ ID No. 1 서열의 유전자 pipA ^*는 이후 38%의 G+C 함유율을 가졌다. 단일 제한 자리 KpnI를 도입하기 위하여, 트레오닌 잔기 97은 표 3의 코드에 의해 제공된 ACT 대신 ACC에 의하여 코딩되었다. 또한, 번역 종결 코돈 TAA 2개를 각각 SEQ ID No. 1 서열의 15번 및 1080번 위치에 첨가하였다. 한편으로는 단일 제한 자리 EcoRI 및 NcoI를, 다른 한편으로는 HindIII를 상기 유전자의 5' 및 3'에 각각 도입하여, 클로닝 벡터 내로 이들을 삽입시켰다.

유전자 pipA ^*의 합성은 2개의 구획 EcoRI - KpnI(305bp의 구획 1 - 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 304) 및 KpnI - HindIII (798bp의 구획 2 - 뉴클레오타이드 305 내지 뉴클레오타이드 1092)을 조립하여 실시하였다.

각각의 구획은 중첩하는 50 내지 60개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드("센스" 및 "안티센스" 가닥)를 연장시킨 뒤, 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 말단을 증폭시켜 합성하였다.

구획 1의 합성 : PCR 반응은 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 하기 올리고뉴클레오타이드 0.01μM, 4종의 dNTP 각각 0.3mM, 및 2유닛의 Vent DNA Poymerase(BioLabs)를 함유하는 20mM Tris-HCl(pH 8.8) 완충액 100㎕ 내에서 실시하였다. 적용된 PCR 절차는 순차적인 96℃에서 30초간의 변성 단계, 55℃에서 30초간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 30회 사이클로 이루어졌다. 10번째 사이클에서, 말단 5'(pipAUP) 및 3'(pipADI)의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도 0.5μM으로 첨가하였다. 30회 사이클 후, 72℃에서 2분간의 연장 기간을 추가하였다.

반응을 위하여 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다: pipAV0, pipAV2, pipAV4, pipAV6, pipAV8, pipAD4, pipAD5, pipAD6, 및 pipAD7. 이들 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표 4에 나타내었다.

이렇게 얻어진 PCR 산물을 Qiaquick PCR 정제 키트(QIAGEN)의 칼럼 상에서 정제한 뒤, 이어서 제한 효소 KpnI 및 EcoRI에 의하여 분해시키고, 아가로스겔 상에서 다시 정제하였다. Qiaquick 겔 추출 키트(QIAGEN)를 이용하여 상기 겔로부터 300bp의 겉보기 크기를 가지는 밴드를 추출하였다. 이어서, 정제된 PCR 산물을 효소 EcoRI 및 KpnI에 의하여 사전 분해되어, 아가로스겔 상에서 정제된 벡터 pTZ18에 T4 DNA 리가아제(BioLabs)를 이용해 결찰시켰다. 상기 결찰 반응은 16℃ 하에서 상기 효소가 보충된 결찰 완충액 중에서 실시하였다. 이어서, 암피실린(100mg/ℓ)이 보충된 아가 LB 배지(DIFCO) 상에서 열충격 및 선택 재조합 클론에 의하여 상기 결찰 산물을 균주 E. coli DH5α CIP104738(D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166, (1983), 557-580) 내로 형질전환시켰다.

암피실린-내성의 형질전환체 내에 함유된 플라스미드를 플라스미드 제조 시스템 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였다. 적합한 제한 효소를 이용해 분석하여 기대 크기가 삽입된 것으로 확인된 이들 4개의 플라스미드에 대하여 단편 EcoRI-KpnI을 시퀀싱하였다. 단편의 서열이 6bp의 결실을 제외하고는 올바른 플라스미드 pSP23을 공지된 방법(Ansaldi et al., Anal. Biochem., 234, (1996), 110-111)에 따라 직접 돌연변이시켜 결실을 교정하였다. 이런 방식으로 플라스미드 pSP39를 얻었다. 플라스미드 pSP39의 EcoRI-KpnI 단편을 시퀀싱하고, 얻어진 서열이 기대 서열과 일치하는 것을 확인하였다.

구획 2의 합성 : 구획 KpnI-HindIII을 합성하기 위한 PCR 반응은, 연장 기간이 30회 사이클의 경우 1분으로 늘어나고, 절차 종료 후에는 4분으로 연장되었다는 점을 제외하고는 구획 1의 합성에 설명한 절차와 동일한 절차로 수행하였다. 10번째 사이클에서, 말단 5'(pipAUV29) 및 3'(pipAD3)의 올리고뉴클레오타이드를 최종 농도 0.5μM으로 첨가하였다.

반응을 위하여 하기 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다: pipAV8, pipAV10, pipAV12, pipAV14, pipAV16, pipAV18. pipAV20, pipAV22, pipAV24, pipAV26, pipAV28, pipAD8, pipAD9, pipAD10, pipAD11, pipAD12, pipAD13, pipAD14, pipAD15, pipAD16, 및 pipAD17. 이들 올리고뉴클레오타이드의 서열은 표 4에 나타내었다.

PCR 산물을 Qiaquick PCR 정제 키트(QIAGEN)의 칼럼 상에서 정제한 뒤, 이어서 제한 효소 KpnI 및 HindIII에 의하여 분해시키고, 동일한 효소에 의하여 사전 분해된 벡터 pTZ18에 결찰시켰다. 균주 E. coli E. coli DH5α의 형질전환 및 형질전환체의 선별 및 플라스미드의 분석은 구획 1에 대하여 설명한 바와 같이 실시하였다. 단편 KpnI-HindIII의 서열이 기대 서열에 비하여 5개의 변이를 갖는 플라스미드 pSP25를 직접 돌연변이시켜(Ansaldi et al., 1996, ibid), 이들 오류를 교정하였다. 이런 방식으로 플라스미드 pSP42를 얻었다.

상기 2개 구획의 조립: 전체 유전자 pipA ^*는 플라스미드 pSP42로부터 추출한 단편 KpnI-HindIII를 상기 KpnI 및 HindIII 효소로 사전 절단된 플라스미드 pSP39 내로 클로닝하여 조립하였다. 얻어진 플라스미드 중 하나인, 기대 크기의 단편 EcoRI-HindIII을 함유하는 플라스미드 pSP43을 시퀀싱하여, 유전자 서열을 확인하였다.

표 4: 상기 올리고뉴클레오타이드의 pipA ^* 유전자 서열의 합성

Pipa V: 5' TTCCAAGGAATTTGTTTACCCAATCTTCAGTCCGTTCGAATTCGAGGTTCC

PipaV2: 5' TGATGTTGCAGAAGTTGTTGCAGCAGTTGGTCGTGATGAATTAATGCGTC

Pipa V4: 5' CAGAAATTGGTCGTGGTGAACGTCATTTATCTCCATTACGTGGTGGTTTA

Pipa V6: 5' GAATGGATGCCACATCGTGAACCAGGTGATCATATTACTTTAAAAACTGT

PipaV8: 5' TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG

Pipa D4: 5' ATA GTT GGT AAA CCA AAA CGA CCT GGA TTT GCT GGA GAA TAA CCA ACA GTT TTT AAA GTA

Pipa D5: 5' ATG TGG CAT CCA TTC CCA AAT ACC TGG AAC TGG TTC AGA ACG TTC TAA ACC ACC ACG TAA 3'

Pipa D6 :5' CAC GAC CAA TTT CTG CTA AAC CAC CAG TTA AAC GAT CGA TAA TAC GAC GCA TTA ATT CAT 3'

Ppia D7: 5' ACT TCT GCA ACA TCA CGA CGA CCT AAA ACC CAA GTT TCC ATG GAA CCT CGA ATT CG 3'

외부 올리고뉴클레오타이드:

PIPAUP: 5' CCCGAATTCGAGGTTCCATGGAAAC

PIPAD1: 5' CAGTAGTATCATCATAACGTGC

단편 Kpn I- Hind III:

Pipa V8: TGGTTTACCAACTATTTTAGGTACCGTTGCACGTTATGATGATACTACTG

Pipa V10: TATTAACTGCATTACGTACTGGTGCAGCATCTGCTGTTGCATCTCGTTTA

Pipa V12: TTAATTGGTACTGGTGCACAAGCAGTTACTCAATTACATGCATTATCTTT

Pipa V14: GGATACTGATCCAGCACATCGTGAATCTTTTGCACGTCGTGCAGCATTTA

Pipa V16: CACGTATTGCAGCAGAAGCAGATGTTATTTCTACTGCAACTTCTGTTGCA

PipaV18: GGTGTTCGTGAACATTTACATATTAATGCAGTTGGTGCAGATTTAGTTGG

Pipa V20: ACGTGCATTTGTTACTGCAGATCATCCAGAACAAGCATTACGTGAAGGTG

Pipa V22: GTCCACAATTAGCACATTTATGTGCAGATCCAGCAGCAGCAGCAGGTCGT

Pipa V24: GGTTTTGCATTTGAAGATGCATTAGCAATGGAAGTTTTTTTAGAAGCAGC

Pipa V26: TATTGAACATCATCCAGGTGATGCATTAGATCCATATGCATTACAACCAT

Pipa V28: 5' ATA AAG ATC TAA GCT TCC CC

Pipa D8: 5' GGGG AAG CTT AGA TCT TTA TTA ATG TGC TGG TGC TGC TAA TGG TAA TGG TAA TGG TTG TAA TGC AT 3'

Pipa D9: 5' GGA TGA TGT TCA ATA CCA ACA CGA ATA CCT AAA TCA CGT TCT GCT GCT GCT TCT AAA AAA 3'

Pipa D10: 5' TTC AAA TGC AAA ACC AGT AGA ATC AAA AAC AGA TAA AGT ATC TTG ACG ACC TGC TGC TGC 3'

Pipa D11: 5' GTG CTA ATT GTG GAC CTA AAC GAT CAG CAG ATA ATT GTT GAC ATT CAC CTT CAC GTA ATG 3'

Pipa D12: 5' GTA ACA AAT GCA CGT TCT AAT AAA CCT AAT GGT AAT TCA GTT TTA CCA ACT AAA TCT GCA 3'

Pipa D13: 5' ATG TTC ACG AAC ACC AGT ATC TGG TAA AAC TGG ACC TTG ACC AAC TGC AAC AGA AGT TGC 3'

Pipa D14: 5' CTG CTG CAA TAC GTG CTG GTT CTG CAA TTT CAA CAG AAA CAC CAG TAA ATG CTG CAC GAC 3'

Pipa D15: 5' GCT GGA TCA GTA TCC CAA ACT AAT GCA CGT TGT AAT GGT AAA ACT AAA GAT AAT GCA TGC 3'

Pipa D16: 5' ACC AGT ACC AAT TAA ACC TAA AGT ATG AGA ATC TGG ACG TGC TAA TAA ACG AGA TGC AAC 3'

Pipa D17: 5' GTA ATG CAG TTA ATA AAA CAC CAT CCA TTA ATG CAG TTA ATG CAC CAG TAG TAT CAT CAT 3'

외부 올리고뉴클레오타이드:

PIPA V29: 5' CTA TTT TAG GTA CCG TTG CA

PIPA D3: 5' CCCAAGCTTAGATCTTTATTAATGTG

실시예 4: 유전자 rapL ^* 의 결찰 및 변이 rapL ^** 획득을 통한 전체 합성

Streptomyces hygroscopicus 유래의 1029bp의 크기를 가지는 유전자 rapL는 68%의 G+C 함유율을 갖는다. 이 유전자를 실시예 3의 유전자 pipA ^*의 합성에 이용한 유전자 코드에 따라 고쳐 썼다. 고쳐 쓰여진 SEQ ID No. 2 서열의 유전자 rapL ^*는 이후 38%의 G+C 함유율을 갖는다. 단일 제한 자리 KpnI를 도입하기 위하여, 트레오닌 잔기 97은 표 3에 제시한 코드에 의하여 제공된 ACT 대신 ACC에 의하여 코딩되었다. 또한, 번역 종결 코돈 TAA 2개를 첨가하였으며, 한편으로는 단일 제한 자리 EcoRI 및 SphI, 다른 한편으로는 HindIII를 상기 유전자의 5' 및 3' 말단에 각각 도입하여, 상이한 클로닝 벡터 내로 이들이 삽입시켰다.

유전자 rapL ^*의 전체 합성은 3개의 구획 EcoRI - KpnI(구획 1 - 305bp1), KpnI-PstI(구획 2 - 316bp), 및 PstI-HindIII(구획 3 - 440bp)을 조립하여 실시하 였다.

각각의 구획은 클로닝될 서열 전체("센스" 및 "안티센스" 가닥)를 커버하고 중첩하는 50개 뉴클레오타이드 길이의 포스포릴화된 단일 가닥의 5' 올리고뉴클레오타이드의 결찰을 통하여 합성하였다. 이들 올리고뉴클레오타이드의 서열 및 위치는 표 5에 나타내었다.

최종 부피 20㎕의 중첩 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8; 0.08M NaCl) 중에서 등몰(1μM)로 혼합된 올리고뉴클레오타이드를 70℃에서 10분 동안 가열하고, 상온으로 복귀될 때까지 가열 블록 내에 보관하였다. 이어서, 이렇게 얻어진 산물을 적합한 제한 효소에 의하여 사전 분해된 벡터 pTZ18(벡터/올리고뉴클레오타이드의 몰농도 비율 = 1/100)의 존재 하에 16℃에서 T4 DNA 리가아제를 이용해 하룻밤 동안 결찰시켰다.

상기 결찰 산물을 이용해 균주 β2033(E. coli K12, pro, thi, rpsL, hsdS, ΔlacZ, F'(ΔlacZM15, lacI ^q , traD36, proA+, proB+))를 전기천공을 통해 형질전환시키고, 100㎍/㎖의 암피실린, 0.5mM의 IPTG, 및 30μg/㎖의 X-Gal을 함유하는 아가 LB 배지 상에서 선별하였다.

암피실린-내성의 여러 백색 형질전환체 내에 함유된 플라스미드를 플라스미드 제조 시스템 QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)를 이용하여 분리하였다. 각각의 구획에 대하여, 적합한 제한 효소를 이용해 분석하여 기대 크기의 단편을 나타내는 2개 내지 4개의 플라스미드 삽입체를 시퀀싱하였다.

구획 1의 합성:

EcoRI 및 KpnI에 의하여 절단된 플라스미드 pTZ18을 하기 올리고뉴클레오타이드(그 서열은 표 5에 예시됨)와 결찰시켰다: IcdV-1, IcdV-2, IcdV-3, IcdV-4, IcdV-5, IcdV-6, IcdVrev-16, IcdVrev-17, IcdVrev-18, IcdVrev-19, IcdVrev-20, IcdVrev-21, IcdVrev-22. 삽입 서열이 기대 서열에 비하여 단지 2개의 변이를 가지는 플라스미드 pSP3이 존재하였다. 2개의 오류는 공지된 방법(Ansaldi et al., 1996, ibid)에 따라 직접 돌연변이 유발을 통해 교정하고, 얻어진 플라스미드 pSP14의 삽입체를 시퀀싱하여 교정을 확인하였다.

구획 2의 합성:

KpnI 및 PstI에 의하여 절단된 플라스미드 pTZ18을 하기 올리고뉴클레오타이드(그 서열은 표 5에 예시됨)와 결찰시켰다: IcdV-7, IcdV-8, IcdV-9, IcdV-10, IcdV-11, IcdV-12, IcdVrev-9, IcdVrev-10, IcdVrev-11, IcdVrev-12 IcdVrev-13, IcdVrev-14, IcdVrev-15. 삽입 서열이 기대 서열에 비하여 단지 2개의 변이를 가지는 플라스미드 pSP8가 존재하였다. 2개의 오류는 공지된 방법(Ansaldi et al., 1996, ibid)에 따라 직접 돌연변이 유발을 통해 교정하고, 얻어진 플라스미드 pSP15의 삽입체를 시퀀싱하여 교정을 확인하였다.

구획 3의 합성:

PstI 및 HindIII에 의하여 절단된 플라스미드 pTZ18을 하기 올리고뉴클레오타이드(그 서열은 표 5에 예시됨)와 결찰시켰다: IcdV-13, IcdV-14, IcdV-15, IcdV-16, IcdV-17, IcdV-18, IcdV-19, IcdV-20, IcdV-21, IcdVrev-1, IcdVrev-2, IcdVrev-3, IcdVrev-4, IcdVrev-5, IcdVrev-6, IcdVrev-7, IcdVrev-8. 삽입 서열이 기대 서열에 비하여 단지 2개의 변이를 가지는 플라스미드 pSP12가 존재하였다. 2개의 오류는 공지된 방법(Ansaldi et al., 1996, ibid)에 따라 직접 돌연변이 유발을 통해 교정하고, 얻어진 플라스미드 pSP15의 삽입체를 시퀀싱하여 교정을 확인하였다.

상기 3개 구획의 조립:

교정된 단편 KpnI-PstI, 및 이어서 PstI-HindIII를 연속적으로 단편 Eco RI-KpnI을 이미 함유하는 플라스미드 pSP14 내로 서브-클로닝하여, 합성 유전자 rapL ^*를 재조작하였다. 얻어진 플라스미드 pSP33의 유전자 rapL ^*를 시퀀싱하여 확인하였다.

변이 rapL ^** (SEQ ID No. 5의 서열)의 획득:

변이 rapL ^**는 플라스미드 pSP33의 유전자 rapL ^*로부터, 유전자 rapL ^**에 의하여 코딩되는 단백질이 실시예 2에 제시된 증폭 및 시퀀싱된 유전자에 의하여 코딩된 것과 동일하고, SEQ ID No. 4의 서열에 해당하되, 표 3에 나타낸 유전자 코드에 고수하도록 5개가 변화되도록 직접 돌연변이시켜(Ansaldi et al., 1996, ibid) 얻었다. 이렇게 하여 플라스미드 pTZ18로부터 유래된 유전자 rapL ^**를 함유하는 플라스미드 pSP36을 얻었다.

표 5: 상기 올리고뉴클레오타이드의 유전자 rapL ^* 서열의 합성

단편 Eco RI- Kpn I:

"센스" 가닥:

lcdV-1: 5'-AATTCGAGGTTGCATGCAAACTAAAGTTTTATGTCAACGTGATATTAA-3'

lcdV-2: 5'p-ACGTATTTTATCTGTTGTT GGTCGTGATGTT ATG ATG GAT CGT TTA ATT T-3'

lcdV-3: 5'p-CTGAAGTTCAT GCA GGT TTT GCA CGT TTA GGT CGT GGT GAAACT GATGAA-3'

lcdV-4: 5'p-CCACCA CCA CGT CCA GGT TTT GCA CGT GGT GGT GAT GTT CCAGGT GTTAT -3'

lcdV-5: 5'p-T GAA TTT ATG CCA CAT CGT GCA TCT GGT ATT GGT GTTACT ATGAAA ACTG -3'

lcdV-6: 5'p-TT TCT TAT TCT CCA GAA AAT TTT GAA CGT TTTAAT TTACCA ACT ATT GTT GGT AC-3'

Brin "안티센스":

lcdVrev-16: 5'p-CAACAATAG TTGGTAAATTAAAA-3'

lcdVrev-17: 5'p-CGTTCAAAATTTTCTGGAGAATAAGAAACAGTTTTCATAGTAACACCAAT-3'

lcdVrev-18: 5'p-ACCAGATGCACGATGTGGCATAAATTCAATAACACCTGGAACATCACCA-3'

lcdVrev-19: 5'p-CCACGTGCAAAACCTGGACGTGGTGGTGGTTCATCAGTTTCACCACGACCT-3'

lcdVrev-20: 5'p-AAACGTGCAAAACCTGCATGAACTTCAGAAATTAAACGATCCATCATAAC-3'

lcdVrev-21: 5'p-ATCACGACCAACAACAGATAAAATACGTTTAATATCACGTTGA-3'

lcdVrev-22: 5'p-CATAAAACTTTAGTTTGCATGCAACCTCG-3'

단편 Kpn I- Pst I:

"센스" 가닥:

lcdV-7: 5'p-CGTTTCT CGT TTA GGT GAT GATTCT GGTTCT ATG GTT GCA TTA GC -3'

lcdV-8: 5'p-A GAT GCA GCAACTATT ACT GCAATGCGTACT GGT GCA GTT GCA TCT GTT A-3'

lcdV-9: 5'p-CT ACT CGT TTATTAGCACGTCCAGGT TCT ACT ACT TTA GCA TTA ATT GGT-3'

lcdV-10: 5'p-GCA GGT GCACAA GCAGTTACT CAA GCA CAT GCA TTA TCT CGT GTT TTA CC-3'

lcdV-11: 5'p-A TTA GAACGT ATTTTA ATTTCTGAT ATT AAA GCA GAA CAT GCA GAA TCT T-3'

lcdV-12: 5'p-TTGCAGGTCGT GTT GCA TTTTTAGAA TTA CCA GTT GAA GTT ACT GATGCAGCAACT GCA ATG GCA ACT GCA-3'

"안티센스" 가닥:

lcdVrev-9: 5'p-GTTGCCATTGCAGTTGCTGCATCAGTAACTTCAA-3'

lcdVrev-10:5'p-CTGGTAATTCTAAAAATGCAACACGACCTGCAAAAGATTCTGCATGTTCTGCTTT-3'

lcdVrev-11: 5'p-AATATCAGAAATTAAAATACGTTCTAATGGTAAAACACGAGATAATGCA-3'

lcdVrev-12: 5'p-TGTGCTTGAGTAACTGCTTGTGCACCTGCACCAATTAATGCTAAAGTAGTA-3'

lcdVrev-13: 5'p-GAACCTGGACGTGCTAATAAACGAGTAGTAACAGATGCAACTGCACCAGT-3'

lcdVrev-14: 5'p-ACGCATTGCAGTAATAGTTGCTGCATCTGCTAATGCAACC-3'

lcdVrev-15: 5'p-ATAGAACCAGAATCATCACCTAAACGAGAAACGGTAC-3'

단편 Pst I- Hind III:

"센스" 가닥:

lcdV-13: 5'p-GATGTTTTA TGT ACT GTT ACTTCTGTTCC-3'

lcdV-14: 5'p-A GTT GGT GGT GGT CCAGTTGTTCCA GCA GAA CCA CGTCAAGCACAT TTA C-3'

lcdV-15: 5'p-AT GTT AAT GGT ATT GGT GCA GATGAACAAGGT AAAACTGAA TTA CCA AAA-3'

lcdV-16: 5'p-GCA TTA TTA GAT GAT GCA TTT ATT TGT GTTGATCAT CCA GGT CAA GCA CG-3'

lcdV-17: 5'p-T GCA GAA GGT GAA TTT CAACAA TTACCAGATCGTGAA TTA GGT CCA TCT T-3'

lcdV-18: 5'p-TA GCA GAT TTA TGT GCAGCACCAGAA ATT GCA GCACCACAT CCA GAA CGT-3'

lcdV-19: 5'p-TTA TCT GTT TTTGATTCTACT GGT TCT GCA TTT GCA GAT C ATATTGCA TTA GAT GTTTTATTA-3'

lcdV-20: 5'p-GGT TTT GCA GAT GAA TTA GGT TTA GGT CAT AAAATGTCTATT GAAT-3'

lcdV-21: 5'p-CTACT CCA GAA GAT GTT TTA GAT CCA TAT TCT TTATAATAAAGATCTA-3'

"안티센스" 가닥:

lcdVrev-1: 5'p-AGCTTAGATCTTTATTATAAAGAATATGGATCTAAAACATCTTCTGGAGTAGATT CAATA GACATTTTATGAC-3'

lcdVrev-2: 5'p-CTAAACCTAATTCATCTGCAAAACCTAATAAAACATCTAATGCAATATGA-3'

lcdVrev-3: 5'p-TCTGCAAATGCAGAACCAGTAGAATCAAAAACAGATAAACGTTCTGGATG-3'

lcdVrev-4: 5'p-TGGTGCTGCAATTTCTGGTGCTGCACATAAATCTGCTAAAGATGGACCT-3'

lcdVrev-5: 5'p-AATTCACGATCTGGTAATTGTTGAAATTCACCTTCTGCACGTGCTTGACCT-3'

lcdVrev-6: 5'p-GGATGATCAACACAAATAAATGCATCATCTAATAATGCTTTTGGTAATT-3'

lcdVrev-7: 5'p-CAGTTTTACCTTGTTCATCTGCACCAATACCATTAACATGTAAATGTGCTT-3'

lcdVrev-8: 5'p-GACGTGGTTCTGCTGGAACAACTGGACCACCACCAACTGGAACAGAAGTAACAGT ACATAAAACATCTGCA-3'

실시예 5: Escherichia coli 내에서의 유전자 pipA ^* 의 과다발현

유전자 pipA ^*를 실시예 3에서 제작된 플라스미드 pSP43을 기본으로 하여 벡터 pQE60(QIAGEN)(상기한 바와 같이 사전에 변형된 코딩 서열의 플라스미드) 내의 제한 자리 NcoI 및 HindIII 사이에 클로닝하였다. 얻어진 플라스미드 pSP47을 보조 플라스미드 pREP4 (QIAGEN)를 기준으로 하여 유전자 IacI를 발현하는 균주 E. coli K12 MG1655(Vidal et al., 1998) 내로 도입하였다. 이렇게 얻어진 균주 +75를 LB 배지 내에서 배양하고, 공급자의 지침에 따라 IPTG를 첨가하여 유전자 pipA ^*의 발현을 유도하였다. 세포의 전체 단백질을 폴리아크릴아미드/SDS 겔 전기 영동에 의하여 분리하고, 쿠마시 블루로 염색하였다. 36kD의 분자량을 갖는 단백질이 검출되었으며, 그의 발현율은 전체 단백질의 대략 5%로 계산되었다.

실시예 6: Escherichia coli 내에서의 유전자 pipA , rapL , rapL ^* 및 rapL ^** 의 과다발현

실시예 5에 제시된 절차에 따라, 플라스미드 pKT37을 도입하여 유전자 pipA를 과다발현하는 E. coli 균주(균주 +353)를 얻었다. 이 플라스미드는 벡터 pQE60의 제한 자리 NcoI 및 HindIII 사이에 관심 유전자를 클로닝하여 실시예 1에 제시된 플라스미드 pKT36으로부터 얻었다.

마찬가지로, 플라스미드 pSP32, pSP37 또는 pSP45를 도입하여 유전자 rapL(균주 +38), rapL ^*(균주 +60), 또는 rapL ^**(균주 +73)를 과다발현하는 E. coli 균주 를 얻었다. 이들 플라스미드 pSP32, pSP37 또는 pSP45는 실시예 2 및 4에 제시된 플라스미드 pKT30, pSP33 또는 pSP36으로부터 벡터 pQE70의 제한 자리 SphI 및 HindIII 사이에 관심 유전자를 클로닝하여 얻었다.

상이한 단백질의 발현율은 실시예 5에 제시한 바와 같이 측정하였다. 각각의 균주에 대하여, 기대 분자량을 가지는 단백질이 전체 단백질의 대략 5% 발현율로 측정되었다.

실시예 7: Escherichia coli 내에서의 Agrobacterium 의 ocd 유전자의 PCR 증폭 및 과다발현

Agrobacterium tumefaciens CIP 104333의 플라스미드 Ti-C58 제조체는 공지된 바(Hayman et al., Mol. Gen. Genet., 223, (1990), 465-473)와 같이 제조하였다. ocd 유전자(Sans et al., (1988), ibid)를 이 플라스미드 Ti-C58 제조체로부터 증폭하였다.

반응은 10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 2mM MgSO₄, 0.1% 트리톤 X-100, 2ng의 플라스미드 Ti-C58, 4종의 dNTP 각각 200μM, 1유닛의 Vent DNA Poymerase(BioLabs), 및 하기 2종의 올리고데옥시뉴클레오타이드 각각 500nM을 함유하는 20mM의 Tris-HCl(pH 8.8) 완충액 50㎕ 중에서 실시하였다:

5' CCCGCATGCCTGCACTTGCCAACC

5' CCCAGATCTTAACCACCCAAACGTCGGAAA.

적용된 PCR 절차는 94℃에서 2분간의 변성 단계로 시작하여, 순차적인 94℃ 에서 30초간의 변성 단계, 54℃에서 30초간의 혼성화 단계, 및 72℃에서 1분 30초간의 연장 단계를 특징으로 하는 30회 사이클이 이어진다. 상기 절차는 72℃에서 10분간의 연장 단계로 종결하였다.

이렇게 증폭된 단편을 NcoI 및 BglII에 의하여 분해시켜, 사전 절단된 pQE70 벡터(QIAGEN)(상기한 바와 같이 사전에 변형시킨 코딩 서열의 플라스미드) 내에 클로닝하였다.

특정 단백질은 공개된 서열(Sans et al., (1988))에 비하여 2개의 아미노산, 즉 잔기 Gln212가 리신으로 교체되어 있고, 잔기 Ile297가 류신으로 교체되어 있다. 독립적으로 얻어진 PCR에 의한 증폭 산물을 시퀀싱하여 2개의 일탈을 확인하였다.

실시예 5에 제시된 절차에 따라, ocd 유전자를 과다발현하는 E. coli 균주(균주 +78)는 플라스미드 pKR7을 도입하여 얻었다. ocd 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 발현율을 실시예 5에 제시된 바와 같이 측정하였다. 기대한 것과 일치하는 분자량을 가지는 단백질의 발현율은 전체 단백질의 대략 5%에 해당하는 것으로 검출되었다.

실시예 8: E. coli 의 재조합 균주의 세포 현탁에 의한 L-리신으로부터 L-피페콜산의 제조

실시예 1에서 제작된 균주 +75를 2g/ℓ의 글루코스, 50mg/ℓ의 암피실리, 및 30mg/ℓ 카나마이신을 함유하는 미네랄 배지(Richaud et al., J. Biol. Chem., 268, (1993), 26827-35) 내에서 배양하였다. 14시간 동안 배양한 후, 2g/ℓ의 글 루코스를 함유하는 400㎖의 미네랄 배지 MS 내에서 균주 +75의 사전 배양주의 1/10 농도로 배양하였다. 이 배양주를 0.7의 OD_600nm에 도달할 때까지 37℃에서 교반 하에 보관하였다. 이어서, 유전자 pipA ^*를 200㎖의 배양주에 1mM의 IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 유도하였다. IPTG를 첨가하지 않은 200㎖의 참조 배양주도 제조하였다. 상기 단계 후, 두 배양주를 13000g로 원심분리하고, 세포 펠릿을 세포 농도의 100배에 해당하는 미네랄 배지 MS에 넣었다. 이어서, 상기 세포를 -20℃에서 냉동/해동 단계를 통해 투과성으로 만들어, 효소에 대한 기질의 접근을 용이하게 하였다. 그런 다음, L-리신 모노하이드로클로라이드(pH=7)를 최종 농도 1M이 되도록 상기 세포 현탁물에 첨가하였다(최종 부피=2㎖). 효소 반응은 교반 하에 37℃에서 실시되었다. 20시간 후, 각 배양주 300㎕의 샘플을 취하여, 13000g에서 원심분리하여 상청을 회수하였다. 이어서, 상청의 희석 용액을 실리카 박막 상에 얹고, HPLC로 분석하였다.

크로마토그래피 이동도(Rf=0.22; CMC 중의 용리액:부탄올/아세트산/물 4/1/1)를 가지며, L-피페콜산의 것과 식별 가능한 닌하이드린으로 염색된 화합물이, IPTG에 의해 유도된 경우에 검출되었고, 비유도된 참조 배양주의 경우에는 검출되지 않았다.

(하기 조건 하에서의) HPLC 분석을 통해, 20시간 후 40g/ℓ 농도의 L-피페콜레이트가 확인되었다. 거울상 이성체가 95% 이상이었다.

균주 +75에 대하여 적용한 조건과 동일한 조건 하에서 실시예 6 및 7에서 제 작된 균주 +38, +60, +73, +78, 및 +353을 이용하여 L-리신으로부터의 L-피페콜산의 생산을 테스트하였다. 닌하이드린으로 염색한 후 실리카 박막 상에서 각각의 상청을 크로마토그래피를 통해 분석 결과, 균주 +73, +78 및 +353에서만이 L-피페콜산의 생산이 확인되었다.

사용된 HPLC 방법의 설명:

- 30℃로 서머스탯-조절된 Phenomenex Synergi Polar-RP-80 4μ (250 x 4.6 mm) 칼럼,

- 210nm에서 UV 검출

- 주입된 샘플의 부피: 10㎕

- 0.05%의 TFA 수용액을 이용해 5분간 등용매 용리 및 이이서 80%의 아세토니트릴 및 0.05%의 TFA 수용액을 이용해 칼럼 세척,

- 보류 식간: 리신 2.98분 및 피페콜산 4.62분.

실시예 9: L-티아리신으로부터 L-티오모르폴린-2-카르복시산의 제조

실시예 8에 제시한 바와 같이 균주 +75의 세포 현탁액을 기본으로 하여 L-티오모르폴린-2-카르복시산을 제조하였다. L-티아리신 (S-(2-아미노에틸)-L-시스테인)(SIGMA)을 최종 농도 1M이 되도록 첨가하였다. 배양된 현탁액의 상청을 박막 실리카 크로마토그래피로 분석한 결과, 이동도(Rf=0.28; 용리액: 부탄올/아세트산/물 4/1/1)를 가지며, L-티아리신 및 L-피페콜산의 것과 구별되는 닌하이드린으로 염색된 화합물이 확인되었다.

동일한 조건 하에서, 실시예 7에 제시된 균주 +78은 균주 +75에 의하여 생산 된 화합물과 동일한 화합물을 생산하였다.

실시예 10: L-5-(R,S)하이드록시리신 및 D-5-(R,S)하이드록시리신 혼합물로부터 5-R-하이드록시-L-피페콜산 및 5-S-하이드록시-L-피페콜산 혼합물의 제조

실시예 8에 제시한 바와 같이 균주 +75의 세포 현탁액을 기본으로 하여 5-R-하이드록시-L-피페콜산 및 5-S-하이드록시-L-피페콜산의 혼합물을 제조하였다. 5-(R,S)하이드록시리신(SIGMA)을 최종 농도 1M이 되도록 첨가하였다. 배양된 현탁액의 상청을 박막 실리카 크로마토그래피로 분석한 결과, 이동도(Rf₁=0.14, Rf₂=0.20; 용리액: 부탄올/아세트산/물 4/1/1)를 가지며, 5-R,S-하이드록시-D,L-리신 및 L-피페콜산의 것과 구별되는 닌하이드린으로 염색된 2종의 화합물이 확인되었다.

동일한 조건 하에서, 실시예 7에 제시된 균주 +78은 균주 +75에 의하여 생산된 화합물과 동일한 2종의 화합물을 생산하였다.

실시예 11: 기타 환형 아미노산의 제조

본 발명에 따르는 방법의 다양한 적용성은 실시예 8에 설명된 조작 방법을 이용하여 출발 디아미노산의 성질을 변형시켜 얻어진 하기의 환형 아미노산에 의하여 예시될 수 있다:

L-디아미노산	환형 L-아미노산
2,6-디아미노헵탄디오산	피페리딘-2,6-헵탄디오산
2,6-디아미노-5-하이드록시헥산산	5-하이드록시피페리딘-2-카르복시산
2-아미노-3-(2-아미노에틸설파닐)프로판산	티오모르폴린-3-카르복시산
아자리신 (βN-2-아미노에틸-α,β -디아미노프로피온산	피페라진-2-카르복시산

<110> Rhodia <120> Stereoselective preparation of cyclic L-amino acids <130> BFF 00/0696 <140> <141> <160> 5 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1097 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: nucleic sequence of the synthetic gene pipA* <400> 1 gaattcgagg ttccatggaa acttgggttt taggtcgtcg tgatgttgca gaagttgttg 60 cagcagttgg tcgtgatgaa ttaatgcgtc gtattatcga tcgtttaact ggtggtttag 120 cagaaattgg tcgtggtgaa cgtcatttat ctccattacg tggtggttta gaacgttctg 180 aaccagttcc aggtatttgg gaatggatgc cacatcgtga accaggtgat catattactt 240 taaaaactgt tggttattct ccagcaaatc caggtcgttt tggtttacca actattttag 300 gtaccgttgc acgttatgat gatactactg gtgcattaac tgcattaatg gatggtgttt 360 tattaactgc attacgtact ggtgcagcat ctgctgttgc atctcgttta ttagcacgtc 420 cagattctca tactttaggt ttaattggta ctggtgcaca agcagttact caattgcatg 480 cattatcttt agttttacca ttacaacgtg cattagtttg ggatactgat ccagcacatc 540 gtgaatcttt tgcacgtcgt gcagcattta ctggtgtttc tgttgaaatt gcagaaccag 600 cacgtattgc agcagaagca gatgttattt ctactgcaac ttctgttgca gttggtcaag 660 gtccagtttt accagatact ggtgttcgtg aacatttaca tattaatgca gttggtgcag 720 atttagttgg taaaactgaa ttaccattag gtttattaga acgtgcattt gttactgcag 780 atcatccaga acaagcatta cgtgaaggtg aatgtcaaca attatctgct gatcgtttag 840 gtccacaatt agcacattta tgtgcagatc cagcagcagc agcaggtcgt caagatactt 900 tatctgtttt tgattctact ggttttgcat ttgaagatgc attagcaatg gaagtttttt 960 tagaagcagc agcagaacgt gatttaggta ttcgtgttgg tattgaacat catccaggtg 1020 atgcattaga tccatatgca ttacaaccat taccattacc attagcagca ccagcacatt 1080 aataaagatc taagctt 1097 <210> 2 <211> 1061 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: nucleic sequence of the synthetic gene rapL* <400> 2 gaattcgagg ttgcatgcaa actaaagttt tatgtcaacg tgatattaaa cgtattttat 60 ctgttgttgg tcgtgatgtt atgatggatc gtttaatttc tgaagttcat gcaggttttg 120 cacgtttagg tcgtggtgaa actgatgaac caccaccacg tccaggtttt gcacgtggtg 180 gtgatgttcc aggtgttatt gaatttatgc cacatcgtgc atctggtatt ggtgttacta 240 tgaaaactgt ttcttattct ccagaaaatt ttgaacgttt taatttacca actattgttg 300 gtaccgtttc tcgtttaggt gatgattctg gttctatggt tgcattagca gatgcagcaa 360 ctattactgc aatgcgtact ggtgcagttg catctgttac tactcgttta ttagcacgtc 420 caggttctac tactttagca ttaattggtg caggtgcaca agcagttact caagcacatg 480 cattatctcg tgttttacca ttagaacgta ttttaatttc tgatattaaa gcagaacatg 540 cagaatcttt tgcaggtcgt gttgcatttt tagaattacc agttgaagtt actgatgcag 600 caactgcaat ggcaactgca gatgttttat gtactgttac ttctgttcca gttggtggtg 660 gtccagttgt tccagcagaa ccacgtcaag cacatttaca tgttaatggt attggtgcag 720 atgaacaagg taaaactgaa ttaccaaaag cattattaga tgatgcattt atttgtgttg 780 atcatccagg tcaagcacgt gcagaaggtg aatttcaaca attaccagat cgtgaattag 840 gtccatcttt agcagattta tgtgcagcac cagaaattgc agcaccacat ccagaacgtt 900 tatctgtttt tgattctact ggttctgcat ttgcagatca tattgcatta gatgttttat 960 taggttttgc agatgaatta ggtttaggtc ataaaatgtc tattgaatct actccagaag 1020 atgttttaga tccatattct ttataataaa gatctaagct t 1061 <210> 3 <211> 355 <212> PRT <213> Streptomyces pristinaespiralis <220> <223> Protein sequence of the gene pipA <400> 3 Met Glu Thr Trp Val Leu Gly Arg Arg Asp Val Ala Glu Val Val Ala 1 5 10 15 Ala Val Gly Arg Asp Glu Leu Met Arg Arg Ile Ile Asp Arg Leu Thr 20 25 30 Gly Gly Leu Ala Glu Ile Gly Arg Gly Glu Arg His Leu Ser Pro Leu 35 40 45 Arg Gly Gly Leu Glu Arg Ser Glu Pro Val Pro Gly Ile Trp Glu Trp 50 55 60 Met Pro His Arg Glu Pro Gly Asp His Ile Thr Leu Lys Thr Val Gly 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Ala Asn Pro Ala Arg Phe Gly Leu Pro Thr Ile Leu Gly 85 90 95 Thr Val Ala Arg Tyr Asp Asp Thr Thr Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met 100 105 110 Asp Gly Val Leu Leu Thr Ala Leu Arg Thr Gly Ala Ala Ser Ala Val 115 120 125 Ala Ser Arg Leu Leu Ala Arg Pro Asp Ser His Thr Leu Gly Leu Ile 130 135 140 Gly Thr Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Leu His Ala Leu Ser Leu Val 145 150 155 160 Leu Pro Leu Gln Arg Ala Leu Val Trp Asp Thr Asp Pro Ala His Arg 165 170 175 Glu Ser Phe Ala Arg Arg Ala Ala Phe Thr Gly Val Ser Val Glu Ile 180 185 190 Ala Glu Pro Ala Arg Ile Ala Ala Glu Ala Asp Val Ile Ser Thr Ala 195 200 205 Thr Ser Val Ala Val Gly Gln Gly Pro Val Leu Pro Asp Thr Gly Val 210 215 220 Arg Glu His Leu His Ile Asn Ala Val Gly Ala Asp Leu Val Gly Lys 225 230 235 240 Thr Glu Leu Pro Leu Gly Leu Leu Glu Arg Ala Phe Val Thr Ala Asp 245 250 255 His Pro Glu Gln Ala Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Gln Leu Ser Ala 260 265 270 Asp Arg Leu Gly Pro Gln Leu Ala His Leu Cys Ala Asp Pro Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Gly Arg Gln Asp Thr Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Phe 290 295 300 Ala Phe Glu Asp Ala Leu Ala Met Glu Val Phe Leu Glu Ala Ala Ala 305 310 315 320 Glu Arg Asp Leu Gly Ile Arg Val Gly Ile Glu His His Pro Gly Asp 325 330 335 Ala Leu Asp Pro Tyr Ala Leu Gln Pro Leu Pro Leu Pro Leu Ala Ala 340 345 350 Pro Ala His 355 <210> 4 <211> 343 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <220> <223> Protein sequence of the gene rapL <400> 4 Met Gln Thr Lys Val Leu Cys Gln Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser 1 5 10 15 Val Val Gly Arg Asp Val Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Val His 20 25 30 Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro 35 40 45 Arg Thr Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Val Pro Gly Val Ile Glu Phe 50 55 60 Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Val Thr Met Lys Thr Val Ser 65 70 75 80 Tyr Ser Pro Gln Asn Phe Glu Arg Phe Asn Leu Pro Thr Ile Val Gly 85 90 95 Thr Val Ser Arg Leu Asp Asp Asp Ser Gly Ser Met Val Ala Leu Ala 100 105 110 Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Val Ala Ala Val 115 120 125 Ala Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile 130 135 140 Gly Ala Gly Ala Gln Ala Val Thr Gln Ala His Ala Leu Ser Arg Val 145 150 155 160 Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Glu His Ala 165 170 175 Glu Ser Phe Ala Gly Arg Val Ala Phe Leu Glu Leu Pro Val Glu Val 180 185 190 Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Val Leu Cys Thr Val 195 200 205 Thr Ser Val Pro Val Gly Gly Gly Pro Val Val Pro Ala Glu Pro Arg 210 215 220 Gln Ala His Leu His Val Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gln Gly Lys 225 230 235 240 Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Val Asp 245 250 255 His Pro Gly Gln Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gln Gln Leu Pro Asp 260 265 270 Arg Glu Leu Gly Pro Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu Ile 275 280 285 Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Val Phe Asp Ser Thr Gly Ser 290 295 300 Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Val Leu Leu Gly Phe Ala Asp 305 310 315 320 Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp 325 330 335 Val Leu Asp Pro Tyr Ser Leu 340 <210> 5 <211> 1061 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Description of the artificial sequence: nucleic sequence of the synthetic gene rapL** <400> 5 gaattcgagg ttgcatgcaa actaaagttt tatgtcaacg tgatattaaa cgtattttat 60 ctgttgttgg tcgtgatgtt atgatggatc gtttaatttc tgaagttcat gcaggttttg 120 cacgtttagg tcgtggtgaa actgatgaac caccaccacg tactggtttt gcacgtggtg 180 gtgatgttcc aggtgttatt gaatttatgc cacatcgtgc atctggtatt ggtgttacta 240 tgaaaactgt ttcttattct ccacaaaatt ttgaacgttt taatttacca actattgttg 300 gtaccgtttc tcgtttagat gatgattctg gttctatggt tgcattagca gatgcagcaa 360 ctattactgc aatgcgtact ggtgcagttg cagcagttgc aactcgttta ttagcacgtc 420 caggttctac tactttagca ttaattggtg caggtgcaca agcagttact caagcacatg 480 cattatctcg tgttttacca ttagaacgta ttttaatttc tgatattaaa gcagaacatg 540 cagaatcttt tgcaggtcgt gttgcatttt tagaattacc agttgaagtt actgatgcag 600 caactgcaat ggcaactgca gatgttttat gtactgttac ttctgttcca gttggtggtg 660 gtccagttgt tccagcagaa ccacgtcaag cacatttaca tgttaatggt attggtgcag 720 atgaacaagg taaaactgaa ttaccaaaag cattattaga tgatgcattt atttgtgttg 780 atcatccagg tcaagcacgt gcagaaggtg aatttcaaca attaccagat cgtgaattag 840 gtccatcttt agcagattta tgtgcagcac cagaaattgc agcaccacat ccagaacgtt 900 tatctgtttt tgattctact ggttctgcat ttgcagatca tattgcatta gatgttttat 960 taggttttgc agatgaatta ggtttaggtc ataaaatgtc tattgaatct actccagaag 1020 atgttttaga tccatattct ttataataaa gatctaagct t 1061

Claims (21)

1. 식(I)의 환형 L-아미노산, 또는 그의 염 또는 유도체의 제조 방법으로서:

   

   상기 식에서,

   R₁은 수소 원자, 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 알킬라디칼, 및 1개 내지 6개의 탄소 원자를 가지는 선형 또는 분지형 아실 라디칼로 이루어지는 군으로부터 선택되고;

   X는 O, S, P, 및 NR₂로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 이종원자 또는 이종원자기를 사슬 내 및 사슬의 말단, 또는 사슬 내 또는 사슬의 말단에 포함할 수 있는, 포화되거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 불포화된 선형 또는 분지형 C₁-C₉ 탄화수소 사슬을 나타내고, 여기서 R₂는 H 또는 C₁-C₄ 알킬 또는 아실기를 나타내고, 상기 사슬은 -R, -OR, -SR, =O, -C(O)OR, -C(S)OR, -C(O)NR'R", -C(S)NR'RR", -CN, -NO₂, -X, -MgX, -NR'R", -NR'C(O)R, -SiR, 및 -SiOR로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동일하거나 상이한 라디칼에 의하여 치환될 수 있고, R, R' 및 R"는 동일하거나 상이한 것으로서, 수소, 또는 선형 또는 분지형의 포화된, 혹은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 2개 내지 20개의 탄소 원자를 가지는 탄화수소 라디칼을 나타내고, R' 및 R"은 그들이 결합된 원자와 함께 고리를 형성할 수 있으며,

   a) 하기 식(II)의 L-디아미노산(diamino acid) 또는 그의 염 또는 유도체, 혹은 식(II)의 L-디아미노산 및 해당 D-디아미노산, 그의 염 또는 유도체를 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물을 SEQ ID No. 1 서열의 유전자 pipA ^* 또는 SEQ ID No. 2 서열의 유전자 rapL ^*, 또는 SEQ ID No. 5 서열의 유전자 rapL ^** 로부터 발현되는 재조합 효소의 존재하에 반응시키는 단계; 및

   

   (상기 식에서, X 및 R₁은 상기에 정의된 바와 같음),

   b) 식(I)의 환형 L-아미노산, 또는 그의 염 또는 유도체를 80% 내지 100%의 거울상 이성체로서 회수하는 단계를 포함하는, 제조 방법
2. 제1항에 있어서,

   상기 식(I)의 화합물이 6개의 결합을 가지는 고리를 포함하고, X는 4개의 결합을 가지는 탄화수소 사슬을 나타내는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 탄화수소 사슬 X가 선형 또는 분지형 알킬렌 사슬인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 식(II)의 화합물, 또는 식(II)의 L-디아미노산 및 대응 D-아미노산을 다양한 비율로 포함하는 거울상 이성체 혼합물은 정제 상태의 효소의 존재 하에 반응시키는 것임을 특징으로 하는 제조 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   상기 일반식(I)의 화합물이 수용액 중에 암모늄염의 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   L-피페리딘-2-카르복시산 또는 그의 염 중 하나가 L-리신으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   L-피페라진-2-카르복시산 또는 그의 염 중 하나가 L-아자리신으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서,

   L-티오모르폴린-2-카르복시산 또는 그의 염 중 하나가 L-티아리신으로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 제1항 또는 제2항에 있어서,

    상기 반응 매질 내에 외인성 NAD가 전혀 첨가되지 않는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
17. SEQ ID No. 1의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
18. SEQ ID No. 2의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
19. SEQ ID No. 5의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
20. 삭제
21. 제1항에 있어서,

    상기 단계 a)의 반응은 수계 매질 중에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.