JP4618753B2 - Ｎ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、および光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents
Ｎ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、および光学活性アミノ酸の製造方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラセマーゼによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、更にＬ−アミノアシラーゼ、あるいはＤ−アミノアシラーゼを作用させてそれぞれに対応する光学活性アミノ酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ（以下NAARと省略する）は、アミノ酸には作用せず、Ｎ−アシル−アミノ酸を特異的にラセミ化する酵素である。Streptomyces属、Amycolatopsis属、あるいはSebekia属などの放線菌にNAAR活性を持つ酵素が見出されている（特許第２７１２３３１号）。また、アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌としてアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０とそれを用いた製造方法（特開平６−２０５６６８）、その菌株由来であるアシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ断片等（特開平４−３６５４８２）が知られている。しかしながら、単離精製され、その基質特異性が明らかにされたNAARは、ストレプトミセス・スピーシーズＹ-53とアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０に由来する２種類の酵素のみである。
これら基質特異性を明らかにされたNAARは、いずれも実質的に作用するアシルアミノ酸が限定されている。ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３に由来するNAARの活性は、Ｎ−アシルメチオニンに対する活性を１００とした場合にＮ−アシルロイシン、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ−アシルバリンに対しては５０以上だが、Ｎ−アシルトリプトファン、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシルアスパラギン酸に対しては５０未満である。
またアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０に由来するNAARの活性は、Ｎ−アシルメチオニンに対する活性を１００とした場合に、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ−アシルバリンに対しては５０以上だがＮ−アシルトリプトファン、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシルアスパラギン酸、Ｎ−アシルロイシンに対しては５０未満である。更に本発明者らは、既にセベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)に由来するNAARの遺伝子の単離と組み換え体の発現に成功している（生物工学会大会・１９９９年度大会講演要旨集p.166）。しかしS. benihanaがＮ−アシル−Ｌ−メチオニンに対するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を持つことは知られているものの、酵素の基質特異性に関する具体的な知見はない。
【０００３】
アシルアミノ酸のラセミ化は、光学活性アミノ酸の製造における重要な工程である。酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほとんど絶対的といえる。
さて、近年における研究の精密化に伴い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体を扱うことの重要性が増している。光学異性体は生理活性をまったく異にする場合があるため、それらを特異的に得るための技術は重要である。たとえばサリドマイドは、D（R）体は催奇形性を持たないが、L（S）体には強い催奇形性がある。そのラセミ体を実用に供したことが、サリドマイドによる薬害事件を引き起こす原因となった。更に対掌体の一方のみが有効な生理活性を示す場合、両者の共存によって、もう一方の異性体が単に活性を持たないという問題のみならず、有効な対掌体に対して競合阻害をもたらす。その結果、ラセミ体の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減してしまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００４】
この課題に対して、ラセミ体を合成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用いられている。しかし合成後の分割による手法では、常に目的としない対掌体を副生成物として合成することになるので、原料の有効利用という点では問題を残す。たとえ回収された副生成物を原料として再生するとしても、常に一定量の副生成物の合成を繰り返すことには変わりは無い。したがって、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法による光学分割が注目されている。酵素法による光学分割は、酵素の特異性を利用して、必要な対掌体を特異的に生成させる方法である。不要な対掌体の合成を低く抑えることができるので、光学的な純度に優れた生成物を容易に得ることができる。また、原料の有効利用の点でも有利である。光学分割を利用するにしろ、酵素的に特定の対掌体を特異的に合成するにしろ、いずれにせよ、基質となるラセミ体を合成するにはラセマーゼの作用が有用である。すなわち、アシルアミノ酸のラセミ化を触媒するには、NAARが必要となる。
【０００５】
たとえばD-トリプトファンは、医薬品原料などとして重要なD-アミノ酸の一つである。D-トリプトファンは、N-アシル-DL-トリプトファンの脱アシル化によって得ることができる。しかし、N-アシルトリプトファンをラセミ化してN-アシル-DL-トリプトファンを効率良く触媒することができるラセマーゼは知られていない。同様に、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、あるいはＮ−アシル−バリンといったアシルアミノ酸においても、これらを基質として効率的なラセミ化を触媒することができるラセマーゼは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、幅広い基質に対してラセミ化活性を持つラセマーゼを用いたＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、およびこの方法を利用した光学活性アミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題の解決のために、幅広い基質に対して有効なラセマーゼの探索を進めた。そして、本発明者らが先に報告したセベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)に由来するNAARが、Ｎ−アシル−アミノ酸の工業的なラセミ化に利用可能な基質特異性を備えていることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に示す特定の基質特異性を備えたNAARによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、並びにこのラセミ化方法に基づく光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
〔１〕ラセマーゼまたはその処理物を光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼが次の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼであることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
〔２〕ラセマーゼ産生菌またはその処理物を光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼ産生菌が次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能に保持した形質転換体であることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列におけるタンパク質コード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
〔３〕Ｎ−アシル−アミノ酸がＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、およびＮ−アシル−トリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つのＮ−アシル−アミノ酸である〔１〕または〔２〕に記載のＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法。
〔４〕Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸を基質として〔１〕または〔２〕に記載のラセミ化方法を行うことを特徴とするＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質からなるNAARによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法を提供する。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
【０００９】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるNAARは、セベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)から単離することができる。S.benihanaは、たとえばIFO 14309として入手することができる。より具体的には、S.benihanaを公知の方法によって培養し、その培養物よりNAARを精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過などを組み合わせることにより、精製することができる。S.benihana IFO 14309より精製されたNAARは、次の理化学的性質、および酵素学的性質（３）〜（６）を有する。
（３）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量約４４０００、ゲルろ過による分子量約３４００００
（４）阻害剤：ＰＣＭＢに阻害される。
（５）作用適温の範囲：至適温度は４０−６０℃である。
（６）安定ｐＨの範囲：ｐＨ７．５から１０の範囲で安定である。
【００１０】
本発明におけるNAARは、NAARをコードするポリヌクレオチドの発現によって得られる組み換え体を用いることもできる。本発明におけるNAARは、前記（ｂ）あるいは（ｃ）として記載したタンパク質からなるNAARを含む。S.benihana IFO 14309より精製されたNAARのアミノ酸配列（配列番号:２）に対して、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列からなるNAARに近い酵素活性を示す可能性が高い。したがって、このようなアミノ酸配列からなるタンパク質の中から、本発明に利用することができるNAAR変異体を選択することは、当業者が日常的に行っていることである。
【００１１】
更に、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、前記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質は、本発明におけるNAARとして利用することができる。S.benihana IFO 14309より単離されたNAARをコードするDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質には、前記NAARと類似の酵素活性を持つタンパク質が多く含まれる。これらの酵素の中から本発明の方法に用いることができるNAAR変異体を選択することは、当業者が日常的に行っていることである。
【００１２】
本発明のNAAR変異体の選択において、Ｎ−アシル−アミノ酸に対するラセマーゼ活性は、次のようにして測定することができる。Tris-HCL緩衝液（pH 7.5-50 mM）、塩化コバルト−1.0mM、Ｎ−アシル−アミノ酸−20 mM及び酵素を含む反応液を、30℃で5分間反応し、100℃で5分間加熱し、反応を停止した。反応停止後、3UのL-アミノアシラーゼを加え、再び30℃で１時間反応させた。１時間後、100℃で３分間加熱し反応を停止させた。反応停止後、遠心分離（15000rpm、10分間、4℃）し、TNBS法により生成したアミノ酸を測定した。１Uは、１分間に１μmolのＮ−アシル−アミノ酸をラセミ化する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。TNBS法は、以下のようにして行った。まず0.5mlのアミノ酸を含むサンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μlの110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を加え、素早く攪拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ、420nmにおける吸光度を測定した。
【００１３】
なお本発明のNAARの変異体を得るにあたり、ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、プローブＤＮＡが、たとえば ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするＤＮＡを指す。プローブDNAには、配列番号：１に記載された塩基配列中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ、または複数選択したDNAを用いることができる。
【００１４】
配列番号：１に示す塩基配列は、S.benihana IFO 14309より単離されたNAARをコードするDNAの塩基配列である。このようなDNAは、S.benihanaのゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを鋳型とするPCRによって得ることができる。PCRに必要なプライマーは、配列番号：１に示す塩基配列に基づいて当業者が設計することができる。あるいは、この塩基配列から選択された塩基配列を持つDNAプローブで、ゲノムライブラリーやｃDNAライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる。PCRやプローブのハイブリダイゼーションによる遺伝子のクローニング方法は公知である。
【００１５】
すなわち、セベキア属に属し、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物を培養し、細胞壁分解酵素によりスフェロプラストとし、通常の方法（例えば J.Biol.Chem．268，26212-26219(1993)，Meth.Cell.Biol．29，39-44(1975)）によりゲノムＤＮＡを調製する。微生物としては、S.benihana IFO 14309を用いることができる。調製した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（HindIII，EcoRI，BamHI，Sau3AIなど）により完全もしくは部分消化し、2〜8 kb程度のＤＮＡ断片とする。このゲノムDNAに対して、配列番号：１に基づいて設計したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ断片とハイブリットを形成させる。ハイブリッドを形成した複数のＤＮＡ断片を回収し、大腸菌の発現ベクターに導入する。
得られた組換えプラスミドで大腸菌（エシェリヒア・コリ JM109株など）を形質転換してゲノムライブラリーを作成する。発現ベクターとしては、pUC18（宝酒造製）、pKK223-3（ファルマシア製）、pET誘導体（宝酒造など）、あるいはpMAL-p2（NEB製）などを用いることができる。ゲノムライブラリーに対し、同じプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによって陽性コロニーを得る。陽性コロニーからプラスミドを抽出し制限酵素切断してインサートDNAを得る。同じプローブでサザンハイブリダイゼーションを行い、インサートDNAとプローブをハイブリットを形成させることによって目的の遺伝子を確認できる。更にインサートの塩基配列を決定して配列番号：１に示す塩基配列と照合すれば、目的とする遺伝子が単離できたことを確認できる。得られたＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞へ形質転換することによって、該ＤＮＡがコードするNAARの高発現株を得ることができる。このような高発現株を、本発明による光学活性アミノ酸の製造に用いることができる。
【００１６】
NAARの高発現株からは、NAARを精製することができる。すなわち、NAARの発現を誘導する条件下で前記高発現株を培養し、酵素遺伝子を発現させる。培養菌体を集菌、破砕し、得られた上清を粗酵素液とし酵素反応に用いることができる。あるいは前記のような方法によって、精製NAARとすることもできる。
粗酵素液のNAAR活性は次のようにして決定することができる。すなわち、粗酵素液、基質のN-アセチル-D-メチオニンと共にL-アミノアシラーゼを共存させ、30℃で5〜60時間反応させ、L-メチオニンの生成量を測定することでＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を測定する。1分間に1μmoleのL-メチオニンが生成するのに必要な酵素量を1Uとする。メチオニンの生成は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって定性的に確認することもできる。
【００１７】
なお、上記クローニングに際して遺伝子源として使用されるＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物としては、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有するセベキア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種などを含む。それらのうち特に好ましい菌株は、セベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)種などがあげられる。
また、大腸菌における発現ベクター、例えば、pUC18、pKK223-3、pET、pMAL-p2などを用い、プロモーターの下流に順方向にオープンリーディングフレームを連結すれば、セベキア属由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼを直接もしくは融合タンパク質として発現可能である。
【００１８】
本発明は、前記NAARを利用したＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法である。前記NAAR、その高発現株を含む培養物、あるいはそれらの処理物を、Ｎ−アシル−アミノ酸を含む反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。すなわち、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相混合系により行うことができる。本発明によるラセミ化方法は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
本発明におけるNAARを含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。一方NAARの処理物とは、NAARを公知の方法により不溶性の担体に固定化したものが含まれる。なお、本発明におけるNAARは、精製酵素に限定されず、粗精製物等として用いることもできる。
【００１９】
本発明によるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法におけるＮ−アシル−アミノ酸としては、例えば下記一般式（１）に示すような化合物を挙げることができる。
一般式（１）
（式中、Ｘは置換基を有してもよいカルボン酸由来のアシルを、Ｒは置換基を有しても良い炭素数１−２０のアルキルを示す）
【００２０】
Ｎ−アシル−アミノ酸のアシル基（Ｘ）に関し、これらのアシル基は置換基（ハロゲン、アルキル、アルコキシなど）を有していて良く、ホルミル、アセチル、クロロアセチルなどのアルカノイル、ベンゾイル、ｐ−クロロベンゾイルなどのベンゾイル、フェニルアセチル、フェニルプロピオニルなどのアリールアルカノイルなどのカルボン酸アシルが挙げられる。
また、Ｒで表わされるアルキルとして直鎖状または分枝状のアルキル、ヒドロキシルアルキル、Ｃ１−３アルキルチオ、チオール、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはインドリルで置換されたＣ1-4アルキルおよびアミノ、カルボキシル、グアニジルもしくはイミダゾリルなどで置換されたＣ１−４アルキルなどが挙げられる。
更に具体的には、特に反応性が高い、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンが好適に用いられる。
【００２１】
本発明のラセミ化反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応収率は５０−１００％で進行する場合が多い。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００２２】
加えて本発明は、前記NAARとＬ−アミノアシラーゼ若しくはＤ−アミノアシラーゼとの組み合わせによる光学活性アミノ酸の製造方法に関する。すなわち先に述べたNAAR、または該酵素を産生する微生物もしくはその処理物をＮ−アシル−アミノ酸に作用させ、更にＬ−アミノアシラーゼ若しくはＤ−アミノアシラーゼを作用させることにより、反応産物である光学活性アミノ酸を製造することができる。本発明による光学活性アミノ酸の製造方法は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２相混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明に基づくラセミ化方法によれば、例えばアシラーゼを用いた光学活性アミノ酸の製造において廃棄される残存原料を再利用しうることから、工業的な利用において有利である。
【００２３】
本発明による光学活性アミノ酸の製造方法は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応収率は５０−１００％で進行する場合が多い。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
生成する光学活性アミノ酸の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、晶析などを適当に組み合わせることにより行うことができる。たとえば、Ｄ−トリプトファンでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体を除いた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液を脱水濃縮することによって析出し、ろ別分離することで簡単に精製することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼのクローニング
Amycolatopsis sp. TS-1-60由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列を元にオリゴヌクレオチドプローブを作成した。そして、5種類の制限酵素で部分切断したSebekia benihana IFO14309の染色体DNAに対し、作成したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、約5kbpのSma I断片および約4.5kbpのSph I断片とハイブリットを形成することが確認できた。そこで約5kbpのSma I断片を回収し、プラスミドベクターであるpUC18のSma Iサイトに連結後、大腸菌DH5α株に形質転換し、ゲノムライブラリーを作成した。ゲノムライブラリーに対し、同じプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、約1000個のコロニーのうち１個の陽性コロニーが得られた。このコロニーからプラスミドを抽出し制限酵素Sma Iで切断した結果、約5kbpのインサートDNAが確認できた。同じプローブでサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、約５kbpのインサートDNAとプローブがハイブリットを形成することが確認できた。
【００２５】
次に、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の特定化を行った。まず約5kbpのSma I染色体DNA断片についてダイデオキシ法により全塩基配列を決定した。放線菌遺伝子はGC含量が約70％と全生物種の中でも非常に高く、また、コドンの3文字目のGC含量が100％近くになるという特徴を利用すると、決定した塩基配列の中からコドンの3文字目のGC含量が100％近くになる領域を調べることによりORFの位置を推定することができた。GC含量を調べた結果、この断片中に3つのORF/ORF1、ORF2、ORF3が存在することが推定された。その中の1つのORFであるORF2にオリゴヌクレオチドプローブと相同性を示す配列が見つかり、またORF2がAmycolatopsis sp. TS-1-60由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子と相同性を示した。このORF2は1104bpからなり、368個のアミノ酸をコードしていた。開始コドンはATGであり、開始コドン上流にSD配列と思われる配列がみられた。まず開始コドンの位置に制限酵素Nde Iサイト、終止コドン下流に制限酵素Bgl IIサイトを持つプライマーを作製し、ORF2をPCR法により増幅した。得られたPCR増幅断片を制限酵素Nde I、Bgl IIで切断後、発現ベクターであるpET-3cのT7プロモーター下流に連結し、発現ベクターpET-NRを作製した。
【００２６】
作製したpET-NRを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換し、形質転換体でのORF2の発現を試みた。発現タンパクの不溶化をさけるため、形質転換体を28℃、終濃度0.01mMのIPTG誘導下で培養を行った。培養菌体を集菌、破砕し、得られた上清を粗酵素液とし酵素反応に用いた。酵素反応については粗酵素液、基質のN-アセチル-D-メチオニンと共にL-アミノアシラーゼを共存させ、30℃で5〜60時間反応させた。この反応系では、L-メチオニンの生成量を測定することでNAAR活性を測定した。酵素活性の定義は、1分間に1μmoleのL-メチオニンが生成した場合を1Uとした。なお、メチオニンの生成の確認のみの場合は、TLCを用いて行った。生成したアミノ酸の量をTNBS法によっておこなった。TNBS法は、0.5mlのアミノ酸を含むサンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μlの110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を加え、素早く攪拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ。420nmにおける吸光度を測定した。
【００２７】
［実施例２］形質転換体からのＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼの精製
〈方法〉
・粗酵素液の調整：
大腸菌形質転換体を30℃、24h（培養開始後4hで終濃度0.01mM IPTG添加）培養させた。培養液を回収し得られた湿菌体50gを160mlの50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波破砕（190W、40min）を行った（200ml）。菌体破砕液を遠心分離（18,000rpm、4℃、30mim）し、得られた上清190mlを粗酵素液とした。
・硫安分画-1回目:
粗酵素液に80％飽和硫安溶液（in 50mM Tris-HCl(pH7.5)）を加え、終濃度25％飽和（13％W/V）とした後、4℃で16h静置した。16h後、遠心分離（8,500rpm、4℃、30mim）を行い、上清250mlが得られた。
【００２８】
・Butyl-Toyopearl 650M-1回目：
硫安分画で得られた上清250mlを25％飽和（13％W/V）硫安溶液（in 50mM Tris-HCl(pH7.5)）であらかじめ平衡化した180mlのButyl-Toyopearl 650Mカラムに通し、洗浄後、硫安濃度グラジエント（25％飽和→0％）をつけながら5倍量（900ml）の50mM Tris-HCl(pH7.5)により、吸着タンパク質を溶出した。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できたフラクションを回収した（280ml）。
・硫安分画-2回目:
Butyl-Toyopearl 650M-1回目で回収したサンプルを透析し、385mlのサンプルが得られた。この385mlのサンプルに80％飽和硫安溶液（in 50mM Tris-HCl/pH7.5）を加え、終濃度25％飽和（13％W/V）とした後、4℃で16h静置した。16h後、遠心分離（8,500rpm、4℃、30mim）を行い、上清545mlが得られた。
・Butyl-Toyopearl 650M-2回目：
硫安分画で得られた上清545mlを25％飽和（13％W/V）硫安溶液であらかじめ平衡化した180mlのButyl-Toyopearl 650Mカラムに通し、洗浄後、グラジエント（25％飽和→0％）をつけながら5倍量（900ml）の50mM Tris-HCl(pH7.5)により、吸着タンパク質を溶出した。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できたフラクションを回収した（200ml）。
【００２９】
・Superose 12HR
Butyl-Toyopearl 650M-2回目で回収したサンプルを透析し、280mlのサンプルが得られた。あらかじめ0.15M塩化ナトリウムを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡化させたSuperose 12HRに、このサンプルのうち200μlを通した（流速0.5mim/ml）。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できた1.9mlのサンプルが得られた。総活性および総蛋白質量は全体量280mlの値に換算した。
上記のNAARの精製の概要を表１に、また精製の結果を図１と図２（Butyl-Toyopearl 650Mによるクロマトグラム）、および図３（精製前後のSDS-PAGE）に示した。Butyl-Toyopearl 650Mによる２回の精製およびSuperose12HRによる精製を経て、最終的にNAARをほぼ純粋なタンパク質として精製できることが確認できた。
【００３０】
【表１】
【００３１】
［実施例３］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼの分子量測定
1.分子量の測定
（１）ゲルろ過法と（２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によって、NAARの分子量を測定した。
（１）ゲルろ過法
あらかじめ0.2Mの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（50mM、pH7.0）で平衡化させたTSKgel G3000SWXLカラム（東ソー製、7.8mmID x 30cm ）に供し、20mlの同緩衝液を流速0.5 ml/minで溶出させた。分子量マーカーには、MW-Marker proteins（HPLC）（オリエンタル酵母社製）：グルタメートデヒドロゲナーゼ（290,000）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（142,000）、エノラーゼ（67,000）、ミオキナーゼ（32,000）、チトクロームC（12,400）を用いた。この結果、本酵素の分子量は、約340,000であることが示唆された（図４）。
【００３２】
（２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は Laemmli法（Laemmli, U.K.: Nature,227 ,pp680）に従い、ミニゲルスラブ電気泳動装置（日本エイドー社製）を用いて、電気泳動をおこなった。ゲルには、ポリアクリルアミドゲル（１２％）を用いた。試料は、酵素液と同量の試料処理液（4% SDS（sodium dodecyl sulfate）、20% グリセロール、10% 2-ME、0.005% BPB（Bromo phenol Blue）を含む125mM Tris・HCl（pH 6.8）緩衝液）を混合し、ブロックヒーターを用い、100℃で約5分間加熱し、室温まで冷却したもの１０μlを電気泳動に供した。検出はCBB-Rを用いた染色法によった。分子量マーカーには、SDS-PAGE Molecular Weight Standards,Low Range（ホスホリラーゼb：97,400、アルブミン：66,200、オブアルブミン：45,000、カルボニックアンヒドラーゼ：31,000、トリプシンインヒビター：21,500、リゾチーム：14,400、BIO RAD社製）を用いた。この結果、NAARの分子量は、約44,000であることが示唆された（図５）。ゲルろ過による分子量は約340,000であることから、NAARが８量体として存在している可能性が示唆された。
【００３３】
［実施例４］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの酵素活性測定法
N-アシルアミノ酸ラセマーゼの活性は以下に述べる方法で測定した。
まず、以下の反応液を作製した。
N-アセチル-D-アミノ酸（100mM） 100μl（20mM）
塩化コバルト（100mM） 5μl（1mM）
Tris-HCl（0.5M /pH7.5） 50μl（50 mM）
滅菌蒸留水 295μl
合計 450μl
この反応液に50μlの酵素液を加えて500μlとし、30℃で5分間（活性が低い場合は数十分）反応させた後、100℃で3分間加熱し反応を停止させた。反応停止後、3UのL-アミノアシラーゼを加え、再び30℃で1時間反応させた。1時間後、100℃で3分間加熱し反応を停止させた。
反応停止後TNBS法により、生成したL-メチオニンを測定した。酵素活性は、N-アセチル-D-メチオニンからN-アセチル-L-メチオニンが1分間に1μmole生成された場合を1unit（U）と定義した。
【００３４】
［実施例５］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの至適温度及び熱安定性
作用至適温度は酵素活性測定法における反応温度を25℃〜70℃まで変化させ、反応後生成したL-メチオニンを測定して求めた。本酵素の熱安定性は、酵素液を所定の温度で30分間加熱させた後、直ちに氷冷し残存する活性を酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性は至適温度、熱安定性とも30℃の場合を100とし、相対活性で示した。結果は図６（至適温度）、および図７（熱安定性）に示した。NAARの至適温度は４０−６０℃であった。
【００３５】
［実施例６］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの至適pH及びpH安定性
作用至適pHは酵素活性測定法における緩衝溶液として、ビストリス塩酸緩衝溶液（pH5.0〜7.0）、トリス塩酸緩衝溶液（pH7.0〜10.0）を用い、30℃、30分間反応し活性を求めた。pH安定性は所定のpHの緩衝液（作用至適pH と同様）に酵素液を加え（20倍希釈）、一晩放置後、酵素活性を酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性はそれぞれpH7.5の場合を100とし、相対活性で示した。結果は図８（至適pH）、および図９（pH安定性）に示した。NAARは、ｐＨ７．５から１０の範囲で安定であった。
【００３６】
［実施例７］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの基質特異性
基質特異性は、反応液中の基質を変え、酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性はN-アセチル-Ｄ-メチオニンの場合を100とし、相対活性で示した。
NAARが幅広いＮ−アセチル−アミノ酸に作用してラセミ化する活性を持つことが確認された。特にＮ−アセチルアラニン、Ｎ−アセチル−アスパラギン酸、Ｎ−アセチル−ロイシン、Ｎ−アセチル−バリン、Ｎ−アセチル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アセチル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アセチル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性があることが確認された。この基質特異性に基づいて、後に述べるような酵素反応を構築した。
【００３７】
［実施例８］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの金属イオンの影響
酵素活性測定法において、反応液中に添加する塩化コバルト（最終濃度１mM）を除き、各種の金属塩を最終濃度1mMになるように添加し、無添加の場合をコントロールとして30℃、5分間の反応後、生成したL-メチオニンを測定しN-アシルアミノ酸ラセマーゼに対する各種金属イオンの影響を調べた。酵素活性はＣｏ添加の場合を100とし、相対活性で示した。結果は表２に示した。Ｃｏに活性化の効果があった。
【００３８】
【表２】
【００３９】
［実施例９］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの阻害剤の影響
酵素活性測定法において、各種酵素阻害剤を反応液中の最終濃度がそれぞれ1mMになるように加え、無添加の場合をコントロールとして30℃、10分間反応を行い酵素に対する阻害剤の影響を調べた。なお、反応中に用いたL-アミノアシラーゼは阻害剤の影響がないように過剰に加えた。酵素活性は無添加の場合を100として相対活性で示した。なお、EDTAについては、反応液中の最終濃度が5mMのものも同様に調べた。結果を表３に示した。NAARは、Monoiodoacetic acid、ＰＣＭＢ、ＥＤＴＡに阻害された。
【００４０】
【表３】
【００４１】
［実施例１０］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、０．５%Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン若しくはＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンを含む反応液中で、30℃で終夜反応させた。ラセミ化はＨＰＬＣ法によって反応液中のトリプトファンの光学純度を測定することによって確認した。Ｎ−アシル−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。反応液からＮ−アシル−トリプトファンをメチルエチルケトンで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）で定量及び光学純度を測定しその結果、本発明によって生成したＮ−アセチル−トリプトファンは原料がＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンの場合もＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの場合も反応終了後の光学純度がほぼ０％eeでラセミ体であった。
【００４２】
［実施例１１］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼとＤ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸製造
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、Ｄ−アミノアシラーゼ１Ｕ、１５%Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを含む反応液１００ｍｌ中で、30℃で終夜反応させた。反応が進行するにつれ生成Ｄ−トリプトファンは水層を飽和し、過飽和分は水層中に析出してきたが、反応は続行した。水層に析出してきたＤ−トリプトファンはろ別分離し、水洗乾燥した。（収率７０％）生成したＤ−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）その結果、本発明によって生成したＤ−トリプトファンは光学純度がほぼ１００％eeであった。
【００４３】
［実施例１２］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼとＬ−アミノアシラーゼによるＬ−アミノ酸製造
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、Ｌ−アミノアシラーゼ（シグマ社製）１Ｕ、１５%Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを含む反応液１００ｍｌ中で、30℃で終夜反応させた。反応が進行するにつれ生成Ｌ−トリプトファンは水層を飽和し、過飽和分は水層中に析出してきたが、反応は続行した。水層に析出してきたＬ−トリプトファンはろ別分離し、水洗乾燥した。（収率７０％）生成したＬ−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）その結果、本発明によって生成したＬ−トリプトファンは光学純度がほぼ１００％eeであった。
【００４４】
【発明の効果】
工業的生産に有利なＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼが示された。本酵素を利用することにより、Ｎ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法とＤ−アミノアシラーゼ、若しくはＬ−アミノアシラーゼと組み合わせることによって光学純度の高い光学活性アミノ酸の効率的な生産方法が提供された。
光学活性アミノ酸は、医薬品の製造における中間体として有用である。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液のButyl-Toyopearl650Mによる１回目のクロマトグラムである。縦軸（左）は280nmにおける吸光度、および縦軸（右）は(NH4)2SO4濃度(%)を、横軸はフラクションナンバーを示す。
【図２】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液のButyl-Toyopearl650Mによる２回目のクロマトグラムである。縦軸（左）は280nmにおける吸光度、および縦軸（右）は(NH4)2SO4濃度(%)を、横軸はフラクションナンバーを示す。
【図３】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液の精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１：粗酵素液（菌体破砕液上清）、レーン２：Butyl-Toyopearl 650M１回目、レーン３：Butyl-Toyopearl 650M２回目、レーン４：Superrose 12HR、M:分子量マーカー
【図４】ゲルろ過による分子量測定の結果を示すグラフ。縦軸は分子量(kDa)を、横軸は溶出体積(ml)を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示すグラフ。縦軸はいずれも分子量(kDa)を、横軸は相対移動度を示す。
【図６】NAARの至適温度の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸は温度を示す。
【図７】NAARの熱安定性の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸は温度を示す。
【図８】NAARの至適pHの解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸はpHを示す。
【図９】NAARのpH安定性の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸はpHを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラセマーゼによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、更にＬ−アミノアシラーゼ、あるいはＤ−アミノアシラーゼを作用させてそれぞれに対応する光学活性アミノ酸を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ（以下NAARと省略する）は、アミノ酸には作用せず、Ｎ−アシル−アミノ酸を特異的にラセミ化する酵素である。Streptomyces属、Amycolatopsis属、あるいはSebekia属などの放線菌にNAAR活性を持つ酵素が見出されている（特許第２７１２３３１号）。また、アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌としてアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０とそれを用いた製造方法（特開平６−２０５６６８）、その菌株由来であるアシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ断片等（特開平４−３６５４８２）が知られている。しかしながら、単離精製され、その基質特異性が明らかにされたNAARは、ストレプトミセス・スピーシーズＹ-53とアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０に由来する２種類の酵素のみである。
これら基質特異性を明らかにされたNAARは、いずれも実質的に作用するアシルアミノ酸が限定されている。ストレプトミセス・スピーシーズＹ−５３に由来するNAARの活性は、Ｎ−アシルメチオニンに対する活性を１００とした場合にＮ−アシルロイシン、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ−アシルバリンに対しては５０以上だが、Ｎ−アシルトリプトファン、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシルアスパラギン酸に対しては５０未満である。
またアミコラトプシス・スピーシーズＴＳ−１−６０に由来するNAARの活性は、Ｎ−アシルメチオニンに対する活性を１００とした場合に、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ−アシルバリンに対しては５０以上だがＮ−アシルトリプトファン、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシルアスパラギン酸、Ｎ−アシルロイシンに対しては５０未満である。更に本発明者らは、既にセベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)に由来するNAARの遺伝子の単離と組み換え体の発現に成功している（生物工学会大会・１９９９年度大会講演要旨集p.166）。しかしS. benihanaがＮ−アシル−Ｌ−メチオニンに対するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を持つことは知られているものの、酵素の基質特異性に関する具体的な知見はない。
【０００３】
アシルアミノ酸のラセミ化は、光学活性アミノ酸の製造における重要な工程である。酵素は高い触媒機能をもつだけでなく、基質特異性、反応特異性とともに、立体特異性を示す。酵素の立体特異性は、いくつかの例外はあるものの、ほとんど絶対的といえる。
さて、近年における研究の精密化に伴い、医薬品、農薬、飼料、香料などの分野で光学活性体を扱うことの重要性が増している。光学異性体は生理活性をまったく異にする場合があるため、それらを特異的に得るための技術は重要である。たとえばサリドマイドは、D（R）体は催奇形性を持たないが、L（S）体には強い催奇形性がある。そのラセミ体を実用に供したことが、サリドマイドによる薬害事件を引き起こす原因となった。更に対掌体の一方のみが有効な生理活性を示す場合、両者の共存によって、もう一方の異性体が単に活性を持たないという問題のみならず、有効な対掌体に対して競合阻害をもたらす。その結果、ラセミ体の生物活性が有効な対掌体に対して1／2以下に激減してしまうこともある。従って、光学的に純粋な対掌体をいかにして入手（合成または分割）するかは、産業上重要な課題となっている。
【０００４】
この課題に対して、ラセミ体を合成した上で、それを効果的に光学分割する手法が広く用いられている。しかし合成後の分割による手法では、常に目的としない対掌体を副生成物として合成することになるので、原料の有効利用という点では問題を残す。たとえ回収された副生成物を原料として再生するとしても、常に一定量の副生成物の合成を繰り返すことには変わりは無い。したがって、副生成物や多量の廃液を生じない酵素法による光学分割が注目されている。酵素法による光学分割は、酵素の特異性を利用して、必要な対掌体を特異的に生成させる方法である。不要な対掌体の合成を低く抑えることができるので、光学的な純度に優れた生成物を容易に得ることができる。また、原料の有効利用の点でも有利である。光学分割を利用するにしろ、酵素的に特定の対掌体を特異的に合成するにしろ、いずれにせよ、基質となるラセミ体を合成するにはラセマーゼの作用が有用である。すなわち、アシルアミノ酸のラセミ化を触媒するには、NAARが必要となる。
【０００５】
たとえばD-トリプトファンは、医薬品原料などとして重要なD-アミノ酸の一つである。D-トリプトファンは、N-アシル-DL-トリプトファンの脱アシル化によって得ることができる。しかし、N-アシルトリプトファンをラセミ化してN-アシル-DL-トリプトファンを効率良く触媒することができるラセマーゼは知られていない。同様に、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、あるいはＮ−アシル−バリンといったアシルアミノ酸においても、これらを基質として効率的なラセミ化を触媒することができるラセマーゼは知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、幅広い基質に対してラセミ化活性を持つラセマーゼを用いたＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、およびこの方法を利用した光学活性アミノ酸の製造方法の提供を課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記課題の解決のために、幅広い基質に対して有効なラセマーゼの探索を進めた。そして、本発明者らが先に報告したセベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)に由来するNAARが、Ｎ−アシル−アミノ酸の工業的なラセミ化に利用可能な基質特異性を備えていることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に示す特定の基質特異性を備えたNAARによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法、並びにこのラセミ化方法に基づく光学活性アミノ酸の製造方法に関する。
〔１〕ラセマーゼまたはその処理物を光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼが次の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼであることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
〔２〕ラセマーゼ産生菌またはその処理物を光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼ産生菌が次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能に保持した形質転換体であることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列におけるタンパク質コード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
〔３〕Ｎ−アシル−アミノ酸がＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、およびＮ−アシル−トリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つのＮ−アシル−アミノ酸である〔１〕または〔２〕に記載のＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法。
〔４〕Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸を基質として〔１〕または〔２〕に記載のラセミ化方法を行うことを特徴とするＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、次の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質からなるNAARによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法を提供する。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、特にＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。
【０００９】
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるNAARは、セベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)から単離することができる。S.benihanaは、たとえばIFO 14309として入手することができる。より具体的には、S.benihanaを公知の方法によって培養し、その培養物よりNAARを精製することができる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過などを組み合わせることにより、精製することができる。S.benihana IFO 14309より精製されたNAARは、次の理化学的性質、および酵素学的性質（３）〜（６）を有する。
（３）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量約４４０００、ゲルろ過による分子量約３４００００
（４）阻害剤：ＰＣＭＢに阻害される。
（５）作用適温の範囲：至適温度は４０−６０℃である。
（６）安定ｐＨの範囲：ｐＨ７．５から１０の範囲で安定である。
【００１０】
本発明におけるNAARは、NAARをコードするポリヌクレオチドの発現によって得られる組み換え体を用いることもできる。本発明におけるNAARは、前記（ｂ）あるいは（ｃ）として記載したタンパク質からなるNAARを含む。S.benihana IFO 14309より精製されたNAARのアミノ酸配列（配列番号:２）に対して、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列からなるNAARに近い酵素活性を示す可能性が高い。したがって、このようなアミノ酸配列からなるタンパク質の中から、本発明に利用することができるNAAR変異体を選択することは、当業者が日常的に行っていることである。
【００１１】
更に、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、前記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質は、本発明におけるNAARとして利用することができる。S.benihana IFO 14309より単離されたNAARをコードするDNAに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質には、前記NAARと類似の酵素活性を持つタンパク質が多く含まれる。これらの酵素の中から本発明の方法に用いることができるNAAR変異体を選択することは、当業者が日常的に行っていることである。
【００１２】
本発明のNAAR変異体の選択において、Ｎ−アシル−アミノ酸に対するラセマーゼ活性は、次のようにして測定することができる。Tris-HCL緩衝液（pH 7.5-50 mM）、塩化コバルト−1.0mM、Ｎ−アシル−アミノ酸−20 mM及び酵素を含む反応液を、30℃で5分間反応し、100℃で5分間加熱し、反応を停止した。反応停止後、3UのL-アミノアシラーゼを加え、再び30℃で１時間反応させた。１時間後、100℃で３分間加熱し反応を停止させた。反応停止後、遠心分離（15000rpm、10分間、4℃）し、TNBS法により生成したアミノ酸を測定した。１Uは、１分間に１μmolのＮ−アシル−アミノ酸をラセミ化する酵素量とする。また、タンパク質の定量は、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。TNBS法は、以下のようにして行った。まず0.5mlのアミノ酸を含むサンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μlの110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を加え、素早く攪拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ、420nmにおける吸光度を測定した。
【００１３】
なお本発明のNAARの変異体を得るにあたり、ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、プローブＤＮＡが、たとえば ECL direct nucleic acid labeling and detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer)において、ハイブリダイズするＤＮＡを指す。プローブDNAには、配列番号：１に記載された塩基配列中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つ、または複数選択したDNAを用いることができる。
【００１４】
配列番号：１に示す塩基配列は、S.benihana IFO 14309より単離されたNAARをコードするDNAの塩基配列である。このようなDNAは、S.benihanaのゲノムライブラリーやcDNAライブラリーを鋳型とするPCRによって得ることができる。PCRに必要なプライマーは、配列番号：１に示す塩基配列に基づいて当業者が設計することができる。あるいは、この塩基配列から選択された塩基配列を持つDNAプローブで、ゲノムライブラリーやｃDNAライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる。PCRやプローブのハイブリダイゼーションによる遺伝子のクローニング方法は公知である。
【００１５】
すなわち、セベキア属に属し、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物を培養し、細胞壁分解酵素によりスフェロプラストとし、通常の方法（例えば J.Biol.Chem．268，26212-26219(1993)，Meth.Cell.Biol．29，39-44(1975)）によりゲノムＤＮＡを調製する。微生物としては、S.benihana IFO 14309を用いることができる。調製した染色体ＤＮＡを適当な制限酵素（HindIII，EcoRI，BamHI，Sau3AIなど）により完全もしくは部分消化し、2〜8 kb程度のＤＮＡ断片とする。このゲノムDNAに対して、配列番号：１に基づいて設計したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、目的のＤＮＡ断片とハイブリットを形成させる。ハイブリッドを形成した複数のＤＮＡ断片を回収し、大腸菌の発現ベクターに導入する。
得られた組換えプラスミドで大腸菌（エシェリヒア・コリ JM109株など）を形質転換してゲノムライブラリーを作成する。発現ベクターとしては、pUC18（宝酒造製）、pKK223-3（ファルマシア製）、pET誘導体（宝酒造など）、あるいはpMAL-p2（NEB製）などを用いることができる。ゲノムライブラリーに対し、同じプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによって陽性コロニーを得る。陽性コロニーからプラスミドを抽出し制限酵素切断してインサートDNAを得る。同じプローブでサザンハイブリダイゼーションを行い、インサートDNAとプローブをハイブリットを形成させることによって目的の遺伝子を確認できる。更にインサートの塩基配列を決定して配列番号：１に示す塩基配列と照合すれば、目的とする遺伝子が単離できたことを確認できる。得られたＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞へ形質転換することによって、該ＤＮＡがコードするNAARの高発現株を得ることができる。このような高発現株を、本発明による光学活性アミノ酸の製造に用いることができる。
【００１６】
NAARの高発現株からは、NAARを精製することができる。すなわち、NAARの発現を誘導する条件下で前記高発現株を培養し、酵素遺伝子を発現させる。培養菌体を集菌、破砕し、得られた上清を粗酵素液とし酵素反応に用いることができる。あるいは前記のような方法によって、精製NAARとすることもできる。
粗酵素液のNAAR活性は次のようにして決定することができる。すなわち、粗酵素液、基質のN-アセチル-D-メチオニンと共にL-アミノアシラーゼを共存させ、30℃で5〜60時間反応させ、L-メチオニンの生成量を測定することでＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を測定する。1分間に1μmoleのL-メチオニンが生成するのに必要な酵素量を1Uとする。メチオニンの生成は、薄層クロマトグラフィー(TLC)によって定性的に確認することもできる。
【００１７】
なお、上記クローニングに際して遺伝子源として使用されるＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有する微生物としては、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ生産能を有するセベキア属に属するすべての菌株、突然変異株、変種などを含む。それらのうち特に好ましい菌株は、セベキア・ベニハナ(Sebekia benihana)種などがあげられる。
また、大腸菌における発現ベクター、例えば、pUC18、pKK223-3、pET、pMAL-p2などを用い、プロモーターの下流に順方向にオープンリーディングフレームを連結すれば、セベキア属由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼを直接もしくは融合タンパク質として発現可能である。
【００１８】
本発明は、前記NAARを利用したＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法である。前記NAAR、その高発現株を含む培養物、あるいはそれらの処理物を、Ｎ−アシル−アミノ酸を含む反応溶液と接触させることにより、目的とする酵素反応を行わせることができる。すなわち、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相混合系により行うことができる。本発明によるラセミ化方法は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれらの具体例に限定されるものではない。反応溶液とは、基質を酵素活性の発現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したものである。
本発明におけるNAARを含む微生物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。一方NAARの処理物とは、NAARを公知の方法により不溶性の担体に固定化したものが含まれる。なお、本発明におけるNAARは、精製酵素に限定されず、粗精製物等として用いることもできる。
【００１９】
本発明によるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法におけるＮ−アシル−アミノ酸としては、例えば下記一般式（１）に示すような化合物を挙げることができる。
一般式（１）
【００２０】
Ｎ−アシル−アミノ酸のアシル基（Ｘ）に関し、これらのアシル基は置換基（ハロゲン、アルキル、アルコキシなど）を有していて良く、ホルミル、アセチル、クロロアセチルなどのアルカノイル、ベンゾイル、ｐ−クロロベンゾイルなどのベンゾイル、フェニルアセチル、フェニルプロピオニルなどのアリールアルカノイルなどのカルボン酸アシルが挙げられる。
また、Ｒで表わされるアルキルとして直鎖状または分枝状のアルキル、ヒドロキシルアルキル、Ｃ１−３アルキルチオ、チオール、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはインドリルで置換されたＣ1-4アルキルおよびアミノ、カルボキシル、グアニジルもしくはイミダゾリルなどで置換されたＣ１−４アルキルなどが挙げられる。
更に具体的には、特に反応性が高い、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンが好適に用いられる。
【００２１】
本発明のラセミ化反応は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応収率は５０−１００％で進行する場合が多い。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
【００２２】
加えて本発明は、前記NAARとＬ−アミノアシラーゼ若しくはＤ−アミノアシラーゼとの組み合わせによる光学活性アミノ酸の製造方法に関する。すなわち先に述べたNAAR、または該酵素を産生する微生物もしくはその処理物をＮ−アシル−アミノ酸に作用させ、更にＬ−アミノアシラーゼ若しくはＤ−アミノアシラーゼを作用させることにより、反応産物である光学活性アミノ酸を製造することができる。本発明による光学活性アミノ酸の製造方法は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との２相混合系により行うことができる。本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
本発明に基づくラセミ化方法によれば、例えばアシラーゼを用いた光学活性アミノ酸の製造において廃棄される残存原料を再利用しうることから、工業的な利用において有利である。
【００２３】
本発明による光学活性アミノ酸の製造方法は、反応温度４−６０℃、好ましくは１０−４０℃、ｐＨ３−１１、好ましくはｐＨ６−９、基質濃度０．０１−９０%、好ましくは０．１−３０%で行うことができる。反応収率は５０−１００％で進行する場合が多い。また、基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。
生成する光学活性アミノ酸の精製は、菌体、タンパク質の遠心分離、膜処理などによる分離、溶媒抽出、晶析などを適当に組み合わせることにより行うことができる。たとえば、Ｄ−トリプトファンでは、微生物菌体を含む反応液を遠心分離し、微生物菌体を除いた後、限外濾過によりタンパク質を除去し、その濾液を脱水濃縮することによって析出し、ろ別分離することで簡単に精製することができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［実施例１］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼのクローニング
Amycolatopsis sp. TS-1-60由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の塩基配列を元にオリゴヌクレオチドプローブを作成した。そして、5種類の制限酵素で部分切断したSebekia benihana IFO14309の染色体DNAに対し、作成したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、約5kbpのSma I断片および約4.5kbpのSph I断片とハイブリットを形成することが確認できた。そこで約5kbpのSma I断片を回収し、プラスミドベクターであるpUC18のSma Iサイトに連結後、大腸菌DH5α株に形質転換し、ゲノムライブラリーを作成した。ゲノムライブラリーに対し、同じプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った結果、約1000個のコロニーのうち１個の陽性コロニーが得られた。このコロニーからプラスミドを抽出し制限酵素Sma Iで切断した結果、約5kbpのインサートDNAが確認できた。同じプローブでサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、約５kbpのインサートDNAとプローブがハイブリットを形成することが確認できた。
【００２５】
次に、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子の特定化を行った。まず約5kbpのSma I染色体DNA断片についてダイデオキシ法により全塩基配列を決定した。放線菌遺伝子はGC含量が約70％と全生物種の中でも非常に高く、また、コドンの3文字目のGC含量が100％近くになるという特徴を利用すると、決定した塩基配列の中からコドンの3文字目のGC含量が100％近くになる領域を調べることによりORFの位置を推定することができた。GC含量を調べた結果、この断片中に3つのORF/ORF1、ORF2、ORF3が存在することが推定された。その中の1つのORFであるORF2にオリゴヌクレオチドプローブと相同性を示す配列が見つかり、またORF2がAmycolatopsis sp. TS-1-60由来のＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ遺伝子と相同性を示した。このORF2は1104bpからなり、368個のアミノ酸をコードしていた。開始コドンはATGであり、開始コドン上流にSD配列と思われる配列がみられた。まず開始コドンの位置に制限酵素Nde Iサイト、終止コドン下流に制限酵素Bgl IIサイトを持つプライマーを作製し、ORF2をPCR法により増幅した。得られたPCR増幅断片を制限酵素Nde I、Bgl IIで切断後、発現ベクターであるpET-3cのT7プロモーター下流に連結し、発現ベクターpET-NRを作製した。
【００２６】
作製したpET-NRを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換し、形質転換体でのORF2の発現を試みた。発現タンパクの不溶化をさけるため、形質転換体を28℃、終濃度0.01mMのIPTG誘導下で培養を行った。培養菌体を集菌、破砕し、得られた上清を粗酵素液とし酵素反応に用いた。酵素反応については粗酵素液、基質のN-アセチル-D-メチオニンと共にL-アミノアシラーゼを共存させ、30℃で5〜60時間反応させた。この反応系では、L-メチオニンの生成量を測定することでNAAR活性を測定した。酵素活性の定義は、1分間に1μmoleのL-メチオニンが生成した場合を1Uとした。なお、メチオニンの生成の確認のみの場合は、TLCを用いて行った。生成したアミノ酸の量をTNBS法によっておこなった。TNBS法は、0.5mlのアミノ酸を含むサンプルに0.5mlの100mM Na2B4O7を加え、これに、20μlの110mM TNBS（Trinitrobenzenesulfonic acid）溶液を加え、素早く攪拌した。5分後に、1.5mMのNa2SO3を含む100mM NaHPO4を2ml加え、呈色反応を停止させ。420nmにおける吸光度を測定した。
【００２７】
［実施例２］形質転換体からのＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼの精製
〈方法〉
・粗酵素液の調整：
大腸菌形質転換体を30℃、24h（培養開始後4hで終濃度0.01mM IPTG添加）培養させた。培養液を回収し得られた湿菌体50gを160mlの50mM Tris-HCl(pH7.5)に懸濁し、超音波破砕（190W、40min）を行った（200ml）。菌体破砕液を遠心分離（18,000rpm、4℃、30mim）し、得られた上清190mlを粗酵素液とした。
・硫安分画-1回目:
粗酵素液に80％飽和硫安溶液（in 50mM Tris-HCl(pH7.5)）を加え、終濃度25％飽和（13％W/V）とした後、4℃で16h静置した。16h後、遠心分離（8,500rpm、4℃、30mim）を行い、上清250mlが得られた。
【００２８】
・Butyl-Toyopearl 650M-1回目：
硫安分画で得られた上清250mlを25％飽和（13％W/V）硫安溶液（in 50mM Tris-HCl(pH7.5)）であらかじめ平衡化した180mlのButyl-Toyopearl 650Mカラムに通し、洗浄後、硫安濃度グラジエント（25％飽和→0％）をつけながら5倍量（900ml）の50mM Tris-HCl(pH7.5)により、吸着タンパク質を溶出した。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できたフラクションを回収した（280ml）。
・硫安分画-2回目:
Butyl-Toyopearl 650M-1回目で回収したサンプルを透析し、385mlのサンプルが得られた。この385mlのサンプルに80％飽和硫安溶液（in 50mM Tris-HCl/pH7.5）を加え、終濃度25％飽和（13％W/V）とした後、4℃で16h静置した。16h後、遠心分離（8,500rpm、4℃、30mim）を行い、上清545mlが得られた。
・Butyl-Toyopearl 650M-2回目：
硫安分画で得られた上清545mlを25％飽和（13％W/V）硫安溶液であらかじめ平衡化した180mlのButyl-Toyopearl 650Mカラムに通し、洗浄後、グラジエント（25％飽和→0％）をつけながら5倍量（900ml）の50mM Tris-HCl(pH7.5)により、吸着タンパク質を溶出した。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できたフラクションを回収した（200ml）。
【００２９】
・Superose 12HR
Butyl-Toyopearl 650M-2回目で回収したサンプルを透析し、280mlのサンプルが得られた。あらかじめ0.15M塩化ナトリウムを含む50mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡化させたSuperose 12HRに、このサンプルのうち200μlを通した（流速0.5mim/ml）。Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性が確認できた1.9mlのサンプルが得られた。総活性および総蛋白質量は全体量280mlの値に換算した。
上記のNAARの精製の概要を表１に、また精製の結果を図１と図２（Butyl-Toyopearl 650Mによるクロマトグラム）、および図３（精製前後のSDS-PAGE）に示した。Butyl-Toyopearl 650Mによる２回の精製およびSuperose12HRによる精製を経て、最終的にNAARをほぼ純粋なタンパク質として精製できることが確認できた。
【００３０】
【表１】
［実施例３］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼの分子量測定
1.分子量の測定
（１）ゲルろ過法と（２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）によって、NAARの分子量を測定した。
（１）ゲルろ過法
あらかじめ0.2Mの塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液（50mM、pH7.0）で平衡化させたTSKgel G3000SWXLカラム（東ソー製、7.8mmID x 30cm ）に供し、20mlの同緩衝液を流速0.5 ml/minで溶出させた。分子量マーカーには、MW-Marker proteins（HPLC）（オリエンタル酵母社製）：グルタメートデヒドロゲナーゼ（290,000）、ラクテートデヒドロゲナーゼ（142,000）、エノラーゼ（67,000）、ミオキナーゼ（32,000）、チトクロームC（12,400）を用いた。この結果、本酵素の分子量は、約340,000であることが示唆された（図４）。
【００３２】
（２）SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は Laemmli法（Laemmli, U.K.: Nature,227 ,pp680）に従い、ミニゲルスラブ電気泳動装置（日本エイドー社製）を用いて、電気泳動をおこなった。ゲルには、ポリアクリルアミドゲル（１２％）を用いた。試料は、酵素液と同量の試料処理液（4% SDS（sodium dodecyl sulfate）、20% グリセロール、10% 2-ME、0.005% BPB（Bromo phenol Blue）を含む125mM Tris・HCl（pH 6.8）緩衝液）を混合し、ブロックヒーターを用い、100℃で約5分間加熱し、室温まで冷却したもの１０μlを電気泳動に供した。検出はCBB-Rを用いた染色法によった。分子量マーカーには、SDS-PAGE Molecular Weight Standards,Low Range（ホスホリラーゼb：97,400、アルブミン：66,200、オブアルブミン：45,000、カルボニックアンヒドラーゼ：31,000、トリプシンインヒビター：21,500、リゾチーム：14,400、BIO RAD社製）を用いた。この結果、NAARの分子量は、約44,000であることが示唆された（図５）。ゲルろ過による分子量は約340,000であることから、NAARが８量体として存在している可能性が示唆された。
【００３３】
［実施例４］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの酵素活性測定法
N-アシルアミノ酸ラセマーゼの活性は以下に述べる方法で測定した。
まず、以下の反応液を作製した。
N-アセチル-D-アミノ酸（100mM） 100μl（20mM）
塩化コバルト（100mM） 5μl（1mM）
Tris-HCl（0.5M /pH7.5） 50μl（50 mM）
滅菌蒸留水 295μl
合計 450μl
この反応液に50μlの酵素液を加えて500μlとし、30℃で5分間（活性が低い場合は数十分）反応させた後、100℃で3分間加熱し反応を停止させた。反応停止後、3UのL-アミノアシラーゼを加え、再び30℃で1時間反応させた。1時間後、100℃で3分間加熱し反応を停止させた。
反応停止後TNBS法により、生成したL-メチオニンを測定した。酵素活性は、N-アセチル-D-メチオニンからN-アセチル-L-メチオニンが1分間に1μmole生成された場合を1unit（U）と定義した。
【００３４】
［実施例５］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの至適温度及び熱安定性
作用至適温度は酵素活性測定法における反応温度を25℃〜70℃まで変化させ、反応後生成したL-メチオニンを測定して求めた。本酵素の熱安定性は、酵素液を所定の温度で30分間加熱させた後、直ちに氷冷し残存する活性を酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性は至適温度、熱安定性とも30℃の場合を100とし、相対活性で示した。結果は図６（至適温度）、および図７（熱安定性）に示した。NAARの至適温度は４０−６０℃であった。
【００３５】
［実施例６］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの至適pH及びpH安定性
作用至適pHは酵素活性測定法における緩衝溶液として、ビストリス塩酸緩衝溶液（pH5.0〜7.0）、トリス塩酸緩衝溶液（pH7.0〜10.0）を用い、30℃、30分間反応し活性を求めた。pH安定性は所定のpHの緩衝液（作用至適pH と同様）に酵素液を加え（20倍希釈）、一晩放置後、酵素活性を酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性はそれぞれpH7.5の場合を100とし、相対活性で示した。結果は図８（至適pH）、および図９（pH安定性）に示した。NAARは、ｐＨ７．５から１０の範囲で安定であった。
【００３６】
［実施例７］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの基質特異性
基質特異性は、反応液中の基質を変え、酵素活性測定法に従って測定し求めた。酵素活性はN-アセチル-Ｄ-メチオニンの場合を100とし、相対活性で示した。
【００３７】
［実施例８］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの金属イオンの影響
酵素活性測定法において、反応液中に添加する塩化コバルト（最終濃度１mM）を除き、各種の金属塩を最終濃度1mMになるように添加し、無添加の場合をコントロールとして30℃、5分間の反応後、生成したL-メチオニンを測定しN-アシルアミノ酸ラセマーゼに対する各種金属イオンの影響を調べた。酵素活性はＣｏ添加の場合を100とし、相対活性で示した。結果は表２に示した。Ｃｏに活性化の効果があった。
【００３８】
【表２】
［実施例９］N-アシルアミノ酸ラセマーゼの阻害剤の影響
酵素活性測定法において、各種酵素阻害剤を反応液中の最終濃度がそれぞれ1mMになるように加え、無添加の場合をコントロールとして30℃、10分間反応を行い酵素に対する阻害剤の影響を調べた。なお、反応中に用いたL-アミノアシラーゼは阻害剤の影響がないように過剰に加えた。酵素活性は無添加の場合を100として相対活性で示した。なお、EDTAについては、反応液中の最終濃度が5mMのものも同様に調べた。結果を表３に示した。NAARは、Monoiodoacetic acid、ＰＣＭＢ、ＥＤＴＡに阻害された。
【００４０】
【表３】
［実施例１０］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、０．５%Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン若しくはＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンを含む反応液中で、30℃で終夜反応させた。ラセミ化はＨＰＬＣ法によって反応液中のトリプトファンの光学純度を測定することによって確認した。Ｎ−アシル−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。反応液からＮ−アシル−トリプトファンをメチルエチルケトンで抽出し、脱溶媒した後、光学分割カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより分析した。光学分割カラムは、ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）で定量及び光学純度を測定しその結果、本発明によって生成したＮ−アセチル−トリプトファンは原料がＮ−アセチル−Ｌ−トリプトファンの場合もＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンの場合も反応終了後の光学純度がほぼ０％eeでラセミ体であった。
【００４２】
［実施例１１］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼとＤ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸製造
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、Ｄ−アミノアシラーゼ１Ｕ、１５%Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを含む反応液１００ｍｌ中で、30℃で終夜反応させた。反応が進行するにつれ生成Ｄ−トリプトファンは水層を飽和し、過飽和分は水層中に析出してきたが、反応は続行した。水層に析出してきたＤ−トリプトファンはろ別分離し、水洗乾燥した。（収率７０％）生成したＤ−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）その結果、本発明によって生成したＤ−トリプトファンは光学純度がほぼ１００％eeであった。
【００４３】
［実施例１２］Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼとＬ−アミノアシラーゼによるＬ−アミノ酸製造
１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ6.5）、Ｎ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ１Ｕ、Ｌ−アミノアシラーゼ（シグマ社製）１Ｕ、１５%Ｎ−アセチル−ＤＬ−トリプトファンを含む反応液１００ｍｌ中で、30℃で終夜反応させた。反応が進行するにつれ生成Ｌ−トリプトファンは水層を飽和し、過飽和分は水層中に析出してきたが、反応は続行した。水層に析出してきたＬ−トリプトファンはろ別分離し、水洗乾燥した。（収率７０％）生成したＬ−トリプトファンの光学純度を次のようにして求めた。ダイセル化学工業株式会社製CHIRALPAKＷＨを用い、0.25mM硫酸銅水溶液を溶離液として、室温で測定した。（流速：1ml／分、検出：254nm）その結果、本発明によって生成したＬ−トリプトファンは光学純度がほぼ１００％eeであった。
【００４４】
【発明の効果】
工業的生産に有利なＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼが示された。本酵素を利用することにより、Ｎ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法とＤ−アミノアシラーゼ、若しくはＬ−アミノアシラーゼと組み合わせることによって光学純度の高い光学活性アミノ酸の効率的な生産方法が提供された。
光学活性アミノ酸は、医薬品の製造における中間体として有用である。
【００４５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液のButyl-Toyopearl650Mによる１回目のクロマトグラムである。縦軸（左）は280nmにおける吸光度、および縦軸（右）は(NH4)2SO4濃度(%)を、横軸はフラクションナンバーを示す。
【図２】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液のButyl-Toyopearl650Mによる２回目のクロマトグラムである。縦軸（左）は280nmにおける吸光度、および縦軸（右）は(NH4)2SO4濃度(%)を、横軸はフラクションナンバーを示す。
【図３】NAAR発現ベクターで形質転換した大腸菌から得られた粗酵素液の精製過程におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。レーン１：粗酵素液（菌体破砕液上清）、レーン２：Butyl-Toyopearl 650M１回目、レーン３：Butyl-Toyopearl 650M２回目、レーン４：Superrose 12HR、M:分子量マーカー
【図４】ゲルろ過による分子量測定の結果を示すグラフ。縦軸は分子量(kDa)を、横軸は溶出体積(ml)を示す。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量測定の結果を示すグラフ。縦軸はいずれも分子量(kDa)を、横軸は相対移動度を示す。
【図６】NAARの至適温度の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸は温度を示す。
【図７】NAARの熱安定性の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸は温度を示す。
【図８】NAARの至適pHの解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸はpHを示す。
【図９】NAARのpH安定性の解析結果を示すグラフである。縦軸は相対活性（％）を示し、横軸はpHを示す。
Claims (4)
- ラセマーゼまたは不溶性の担体に固定化したラセマーゼを光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼが次の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質からなるＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼであることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質であって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。 - ラセマーゼ産生菌、または、界面活性剤又は有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた前記菌あるいは菌体を破砕した無細胞抽出液やその部分精製物から選ばれるその処理物を光学活性Ｎ−アシル−アミノ酸に作用させ、該Ｎ−アシル−アミノ酸をラセミ化する工程を含むＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法において、前記ラセマーゼ産生菌が次の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドがコードするタンパク質を発現可能に保持した形質転換体であることを特徴とするラセミ化方法。
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列におけるタンパク質コード領域を含むポリヌクレオチド。
（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（ｄ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、下記（１）および（２）に記載の理化学的性質を有するＮ−アシル−アミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（１）作用：Ｎ−アシル−アミノ酸に作用してラセミ化する。
（２）基質特異性：Ｎ−アシル−アミノ酸のうち、Ｎ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、Ｎ−アシル−トリプトファンのそれぞれのＮ−アシル−アミノ酸に対して少なくとも相対活性でＮ−アシル−メチオニンを１００とした場合に５０以上の活性がある。 - Ｎ−アシル−アミノ酸がＮ−アシルアラニン、Ｎ−アシル−アスパラギン酸、Ｎ−アシル−ロイシン、Ｎ−アシル−バリン、およびＮ−アシル−トリプトファンからなる群から選択される少なくとも１つのＮ−アシル−アミノ酸である請求項１または２に記載のＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化方法。
- Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−ＤＬ−アミノ酸を基質として請求項１または２に記載のラセミ化方法を行うことを特徴とするＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法。
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