JP3066473B2 - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるアシルアミ
ノ酸ラセマーゼの製造法、その製造に用いられる新規微
生物および該新規微生物を作出するのに有用な新規ＤＮ
Ａ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】アシルアミノ酸ラセマーゼは、放線菌に
広く分布し、光学活性なＮ−アシルアミノ酸を対応する
対掌体に変換するが光学活性のアミノ酸には作用しない
特異な酵素であって、その詳細な性質についてはすでに
明らかにされている(特開平１−１３７９７３，日本農
芸化学会１９９０年度大会講演要旨集，３６８頁，１９
９０年)。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このようにアシルアミ
ノ酸ラセマーゼは、光学活性アミノ酸の製造に利用でき
る有用な酵素である。しかしながら、該酵素を安価に効
率良く製造する方法の開発は十分とは言えず、さらに有
利な方法がのぞまれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、研究を重ね、アミコラトプシス・スピシ
ーズ ＴＳ−１−６０(Amycolatopsis sp. ＴＳ−１−
６０)の生産するアシルアミノ酸ラセマーゼについて報
告した(日本農芸化学会１９９０年度大会講演要旨集,３
６８頁，１９９０年)。そして新たに、アミコラトプシ
ス・スピシーズＴＳ−１−６０より、該アシルアミノ酸
ラセマーゼをコードするＤＮＡをクローニングすること
に成功し、更に鋭意研究を重ねた結果本発明を完成し
た。即ち、本発明はアシルアミノ酸ラセマーゼをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片が組み込ま
れたベクター、該ベクターで形質転換されたアシルアミ
ノ酸ラセマーゼ生産能を有する新規微生物および該微生
物を用いるアシルアミノ酸ラセマーゼの製造法を提供す
るものである。本発明におけるアシルアミノ酸ラセマー
ゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片(以下、アシル
アミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡまたは単にアシ
ルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡと称することもある。)
は、本発明者らが初めて明らかにしたもので、例えば、
アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌、ストレプトマイセス
・スピシーズ Ｙ−５３(Str eptomyces sp. Ｙ−５３，
ＩＦＯ １４５９６，ＦＥＲＭ Ｐ−９５１８)または
アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０(Amyco
latopsis sp. ＴＳ−１−６０，ＩＦＯ １５０７９，
ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９２)からＤＮＡを分離し、該Ｄ
ＮＡをファージまたはプラスミドに組み込み、得られた
組み換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換
し、得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適当
な方法、例えば アシルアミノ酸ラセマーゼ抗体を用い
たイムノアッセイ、またはＤＮＡプローブを用いたプラ
ークまたはコロニーハイブリダイゼーションにより目的
とするＤＮＡを含有するファージ、またはプラスミドを
単離し、そのファージまたはプラスミドから目的とする
クローン化ＤＮＡを切り出し、該クローン化ＤＮＡを適
当なプラスミドにサブクローニングすることにより製造
することができる。こうして得られたＤＮＡをプラスミ
ドやファージに組み込み、例えば大腸菌、放線菌または
酵母などの宿主を形質転換することができる。上記のＩ
ＦＯ番号は、財団法人発酵研究所(Institute For Ferme
ntation、Osaka；ＩＦＯ)における受託番号を、またＦ
ＥＲＭ ＢＰ番号は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所(ＦＲＩ)における受託番号をそれぞれ示し、
以下同様である。なお、アミコラトプシス・スピシーズ
ＴＳ−１−６０の菌学的性質を示すと、下記の通りで
ある。

【０００５】（a）形態 １）液体培養 本菌の胞子あるいは菌糸をトリプチカーゼ・ソイ・ブロ
スなどの栄養液体培地に接種後、２８℃、１〜２日振盪
培養すると、菌糸は細かく断裂し、その形態は多形態を
示す。 ２）平板寒天培養 基生菌糸は、寒天培地中にジグザク状を呈した生育をす
る。気菌糸は、一般に直線状からやや屈曲状（ＲＦ）を
呈する。また、気菌糸どおしが絡み合った菌糸塊が観察
される（ＩＳＰ−２およびＩＳＰ−７）。胞子は、一般
に円筒状を呈し、その大きさは（０.３〜０.５×０.６
〜２.３μm）と長さにおいて多様性を示した。その表面
は平滑である。 （b）菌体組成 細胞壁成分のジアミノピメリン酸は meso 型で糖はアラ
ビノース，ガラクトースが検出され細胞壁はタイプIVＡ
に属する。ミコール酸は検出されず、メナキノンは９
（Ｈ₂，Ｈ₄）で、ホスホリピドはタイプII（有：ジホス
ファチジルグリセロール，ホスファチジルエタノールア
ミン，ホスファチジルイノシトール，ホスファチジルイ
ノシトールマンノサイド，無：ホスファチジルコリン）
であった。 （c）各種培地における生育状態 ＴＳ−１−６０株の各種培地上の生育状態は表１に示す
通りである。括弧内に示す色の記号はコンテナー・コー
ポレーション・オブ・アメリカ社製のカラー・ハーモニ
ー・マニュアル第４版に記載のものを用いた。

【表１】 （c）生理的性質 生育温度範囲：イースト・麦芽寒天培地上，１３−３
７℃ （最適生育温度２０−３０℃） ゼラチンの液化：陰性 スターチの加水分解：陰性 脱脂牛乳の凝固：陰性 脱脂牛乳のペプトン化：陰性 メラニン様色素の生成：陰性 （d）炭素源の同化性 陽性：グルコース，キシロース，フラクトース，マンニ
トール，イノシトール，アラビノース 陰性：シュークロス，ラフィノース，ラムノース 該ＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌のpＢＲ３２２[ジーン(Gene)，２，９５(１９７
７)]，pＢＲ３２５[ジーン(Gene)，４，１２１(１９７
８)]，pＵＣ１３[ジーン(Gene)，１９，２５９(１９８
２)]，などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。また、ＤＮＡを組み込むファージベク
ターとしては、たとえばλgt １１[Young，R.,and Davi
s, R., プロシージング オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)，
Ｕ.Ｓ.Ａ. ８０，１１９４(１９８３)]などが挙げられ
るが、その他のものであっても、宿主内で増殖できるも
のであればよい。

【０００６】プラスミドに該ＤＮＡを組み込む方法とし
ては、たとえばManiatis, T., らによるモレキュラーク
ローニング(Molecular Cloning)，Cold Spring Harbor
Laboratory, p. ２３９(１９８２)に記載の方法などが
挙げられる。また、ファージベクターにＤＮＡを組み込
む方法としては、たとえば Hyunh, T. V. らの方法[デ
ィー エヌ エー クローニング、ア プラクティカル
アプローチ(ＤＮＡcloning, a practical approac
h)，１，４９(１９８５)]などが挙げられる。この よう
にして得られたプラスミドやファージベクターは、適当
な宿主たとえば大腸菌などに導入する。上記大腸菌の例
としては、Esherichia coli Ｋ１２，ＤＨ１[プロシー
ジングオブ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci.，Ｕ.Ｓ.Ａ. ６０、１６０
(１９６８)]，ＪＭ１０３[ヌクレイック アシッズリサ
ーチ(Nucl. Acids. Res.)，９，３０９(１９８１)]，Ｊ
Ａ２２１[ジャーナル オブ モレキュラー バイオロ
ジー(J. Mol. Biol.)，１２０，５１７(１９７８)]，Ｈ
Ｂ１０１[ジャーナル オブ モレキュラー バイオロ
ジー(J. Mol. Biol.)，４１、４５９(１９６９)]，Ｃ６
００[ジェネティックス(Genetics)，３９，４４０(１９
５４)]などが挙げられる。プラスミドで宿主を形質転換
する方法としては、たとえば Maniatis, T., らによる
モレキュラークローニング(Molecular Cloning)，Cold
Spring Harbor Laboratory, p. ２３９(１９８２)に記
載のカルシュウムクロライド法あるいはカルシュウムク
ロライド／ルビジュウムクロライド法などが挙げられ
る。また、ファージベクターにはたとえば、増殖させた
大腸菌にインビトロパッケージング法を用いて導入する
ことができる。アシルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡを含有
する放線菌ＤＮＡライブラリーは上記の方法などで得る
ことが出来る。

【０００７】放線菌ＤＮＡライブラリーからアシルアミ
ノ酸ラセマーゼＤＮＡをクローニングする方法として
は、例えばファージベクターλgt１１とアシルアミノ酸
ラセマーゼ抗体を用いたHuynhらの方法[ディー エヌエ
ー クローニング、ア プラクティカル アプローチ
(ＤＮＡ cloning, a practical approach)，１，４９
(１９８５)]あるいはアミコラトプシス・スピシーズＴ
Ｓ−１−６０から得られたアシルアミノ酸ラセマーゼの
アミノ酸配列にもとずいて化学合成したオリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼー
ションまたはプラークハイブリダイゼーション法[Mania
tis, T., ら、モレキュラークローニング(Molecular Cl
oning)，Cold Spring Harbor Laboratory，(１９８２)]
などが挙げられる。このようにしてクローン化されたア
シルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡは必要があればプラスミ
ド、例えばpＢＲ３２２，pＵＣ１２、pＵＣ１３、pＵＣ
１８、pＵＣ１９、pＵＣ１１８，pＵＣ１１９、などに
サブクローニングすることができる。このようにして得
られたＤＮＡの塩基配列を、たとえばマキサム・ギルバ
ート(Maxam-Gilbert)法[Mxam, A. M. and Gilbert, W.,
プロシーディング オブナショナル アカデミー オ
ブ サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.)，Ｕ.Ｓ.Ａ.
７４，５６０(１９７７)]あるいはジデオキシ法[Messin
g, J. ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucl. A
cids. Res.)，９，３０９(１９８１)]、あるいはデアザ
法[Mizusawa, S., ら、ヌクレイック アシッズ リサ
ーチ(Nucl. Acids. Res.)，１４、１３１９(１９８６)]
によって決定し、既知のアミノ酸配列との比較からアシ
ルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡの存在を確認する。その結
果、アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする全領域がカ
バーされていない場合には、該ＤＮＡ断片をプローブと
して用いたコロニーハイブリダイゼーションによってア
シルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡの再クローニングを行
い、カバーされていない領域を得る。以上のようにし
て、アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡが得
られる。

【０００８】本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼをコー
ドするＤＮＡの代表例として、後述の実施例１で得られ
たアシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡが挙げ
られる。その制限酵素切断地図を〔図４〕に示す。上記
のようにしてクローン化されたアシルアミノ酸ラセマー
ゼをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化、あるいは、部位特異的変異法
[メソッズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzym
ology),１００，４６８(１９８３)]などを用いてプラス
ミドを改良して使用することができる。上記のクローン
化されたアシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ
はlacプロモター、 tacプロモター[de Boyer. H. A., C
amstock. L. J., Vasser. M.,プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス(Proc. Na
tl. Acad. Sci.)，Ｕ.Ｓ.Ａ. ８０，２１(１９８０)]、
Ｔ７プロモター[Tabor,S., Richardson. Ｃ. Ｃ., プロ
シーデイング オブ ナショナル アカデミーオブ サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci.),Ｕ.Ｓ.Ａ. ８２，
１０７４(１９８５)]などのプロモターを用い、例えば
大腸菌で大量に発現させることができる。上記のクロー
ン化ＤＮＡを用いて形質転換した微生物(例、放線菌，
大腸菌，酵母等)を培養し、培地中に生産されたアシル
アミノ酸ラセマーゼを取得することができる。そして、
以上述べた方法により、アシルアミノ酸ラセマーゼ自体
の性質(例、酵素活性，安定性等)を改良することも可能
である。なお、発現に利用される宿主としてはストレプ
トマイセス・リビダンスＴＫ６４(Strepto myces livida
ns ＴＫ６４)およびエシェリヒア・コリ ＨＢ１０１(E
sherichia coli ＨＢ１０１)などが挙げられるが、その
他の放線菌、大腸菌、枯草菌さらには酵母も利用するこ
とができる。

【０００９】放線菌の形質転換はそれ自体公知であり、
Hopwood, Ｄ. Ａ., ら[ジェネティック・マニピュレイ
ション・オブ・ストレプトマイセス・ア・ラボラトリー
・マニュアル(Genetic Manipulation of Streptomyces
a Laboratory Manual)]の方法によって行う。また、大
腸菌の形質転換法もまた公知であり、Maniatis, T., ら
[モレキュラークローニング(Molecular Cloning)，Cold
Spring Harbor Laboratory, p. ２３９(１９８２)に記
載]のカルシュウムクロライド法あるいはカルシュウム
クロライド／ルビジュウムクロライド法などに従って行
うことができる。このような本発明の形質転換株の代表
的な例としては、後記の実施例で得られた、エシェリヒ
ア・コリ ＥＲ−４(ＩＦＯ １５０８３，ＦＥＲＭ
ＢＰ−３０９１)が挙げられる。もちろん、受容菌を選
ぶことによって、本明細書に記載の方法に従って、同様
に種々の形質転換株を容易に作出することができる。こ
のようにして得られた形質転換体をそれ自体公知の方法
で培養する。放線菌を培養する場合は、培地は、種培地
として３％ グリセロール、０.５％ ポリペプトン、
０.３ ％肉エキス、０.０５％ Ｎ−アセチル−ＤＬ−
メチオニン、pＨ７.２を、生産培地としては１.７％
パンクレアチン処理カゼイン、０.３％パパイン処理脱
脂大豆粉、０.５％ 食塩、０.２５％ リン酸水素二カ
リウム、１％ グルコース、０.０５％ Ｎ−アセチル
−ＤＬ−メチオニン、pＨ７.０を用いる。培養は、通常
１５〜４０℃、好ましくは２４〜３０℃で１０〜９６時
間、好ましくは２４〜７２時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加えることもできる。大腸菌を培養する場合
は、培地は、ＬＢ培地(１％ポリペプトン，０.５％酵母
エキス，０.５％塩化ナトリウム)を用いる。培養は、通
常１５〜４０℃、好ましくは２４〜３７℃で１０〜９６
時間、好ましくは２４〜４８時間行い、必要に応じて通
気や撹拌を加えることもできる。

【００１０】培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と
上清とを分離する。細胞内に残存するアシルアミノ酸ラ
セマーゼは、当分野における通常の方法、例えば超音波
破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法、摩砕な
どの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕法などによ
り細胞を破砕し抽出する。このようにして得られた抽出
液中に含まれるアシルアミノ酸ラセマーゼは通常の蛋白
質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ過、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなどに付して精製され、目的
とするアシルアミノ酸ラセマーゼを得ることができる。
上記で得られるアシルアミノ酸ラセマーゼ活性は公知の
方法(特開平１−１３７９７３号)で測定される。すなわ
ち、測定しようとする酵素サンプルを２５mＭＮ−アセ
チル−Ｄ−メチオニン、２mＭ 塩化コバルト、Ｌ−ア
ミノアシラーゼ ２Ｕ，５０mＭ トリス塩酸バッファ
ー (pＨ７.５)から成る反応液５００μlに加え，３０
℃、５分間反応させた後、３分間煮沸して反応を停止さ
せた。酵素の単位(Ｕ)はＬ−メチオニンが１分間に１μ
mol生成される量を１単位(Ｕ)とした。

【００１１】なお、本明細書において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Comm
ission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるい
は当該分野における慣用略号に基づくものであり、その
例を次ぎに挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示すもの
とする。 ＤＮＡ デオキシリボ核酸 Ａ アデニン Ｃ シトシン Ｇ グアニン Ｔ チミン Ａla アラニン Ａrg アルギニン Ａsn アスパラギン Ａsp アスパラギン酸 Ｃys システイン Ｇln グルタミン Ｇlu グルタミン酸 Ｇly グリシン Ｈis ヒスチジン Ｉle イソロイシン Ｌeu ロイシン Ｌys リジン Ｍet メチオニン Ｐhe フェニルアラニン Ｐro プロリン Ｓer セリン Ｔhr スレオニン Ｔrp トリプトファン Ｔyr チロシン Ｖal バリン

【００１２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることは
ない。

【００１３】実施例１ アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０の染色
体ＤＮＡの単離 アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０をトリ
プトース・ソイ・ブロス(ベクトン・ディキンソン社)２
０mlを含む２００ml三角フラスコで２８℃、４２時間振
盪培養した。得られた湿菌体(４g)を２０mlのバッファ
ーＡ液[０.３Ｍシュークロス、２５mＭ ＥＤＴＡ、２
５mＭトリス・塩酸バッファー(pＨ８)]に懸濁し、これ
に卵白リゾチームを２mg／mlの濃度になるように添加
し、３７℃で１時間穏やかに振盪する。これに、８mlの
２％ ＳＤＳを添加し、２〜３度穏やかに混合する。こ
の溶液にクロロフォルム５ml、バッファーＡで飽和した
フェノール５mlを添加し撹拌後、遠心分離機にかけ(３
０００rpm，２０分)ＤＮＡを抽出した。このフェノール
抽出を３回繰り返した後に、ＤＮＡ溶液の１／１０量の
３Ｍ酢酸カリウム溶液ならびに２倍量の氷冷エタノール
を加えＤＮＡを沈殿させる。沈殿したＤＮＡを遠心分離
で集めた後、７０％エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥
し保存した。

【００１４】実施例２ アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子のクロー
ニング： (Ａ)ジーンライブラリーの調製： a)制限酵素Hae IIIによる部分消化 実施例１において単離されたアミコラトプシス・スピシ
ーズ ＴＳ−１−６０の染色体ＤＮＡを制限酵素Hae II
I[宝酒造(株)]で部分消化した。すなわち、１０mＭトリ
ス塩酸緩衝液(pＨ７.５)、７mＭ塩化マグネシュウム、
６０mＭ食塩、７mＭ２−メルカプトエタノール、５μg
供与体ＤＮＡ、１０単位Hae IIIから成る反応液５０μl
で、３７℃２分間反応させた。反応終了後、反応液をフ
ェノール・クロロフォルム処理して蛋白を除き、２倍量
のエタノールを添加してＤＮＡ断片を回収した。 b)メチラーゼ反応 Hae IIIで部分消化したＤＮＡ断片のＥcoＲＩサイトの
アデノシン部分をメチル化した。部分消化したＤＮＡ断
片５μgに１００mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ８)２mＭジチ
オスレイトール、１０mＭ ＥＤＴＡ、８０μＭ Ｓ−
アデノシルメチオニン、４０単位メチラーゼ[宝酒造
(株)]から成る反応液２０μlで３７℃、６０分反応させ
た。ＤＮＡ断片を前述と同様の方法で回収した。 c)リンカーライゲーション メチル化したＤＮＡ断片の末端にＥcoＲＩリンカーを接
続した。ＥcoＲＩリンカーはd(pＧＧＡＡＴＴＣＣ)[宝
酒造(株)]を用いた。また、リンカーとの結合は、ライ
ゲーションキット[宝酒造(株)]を用いた。反応は、ＤＮ
Ａ５μg、ＥcoＲＩリンカー２μl(２μg)、Ａ液１６μ
l、Ｂ液２μl、合計２０μlで、１６℃、１６時間おこ
なった。反応終了後、フェノール・クロロホルム処理
し、エタノール沈殿後、乾燥させ、ＤＮＡを回収した。 d)制限酵素ＥcoＲＩによる消化 c)で得られたＤＮＡ断片を５μgを制限酵素ＥcoＲＩを
用いて３７℃、３時間 の反応条件で消化した。反応終了後、ＤＮＡ断片を電気
泳動にかけ、１−３kbpの大きさのＤＮＡ断片のものを
回収し、フェノール・クロロホルム処理し、エタノール
沈殿後、減圧乾固し、２０μlのＴＮＥ緩衝液(１０mＭ
トリス−塩酸、１mＭＥＤＴＡ，３００mＭＮaＣl、pＨ
８.０)に溶解した。 e)ベクター(λgt １１)とのライゲーションおよびパッ
ケージング(packaging)ＥcoＲＩ処理、フォスファター
ゼ処理したλgt １１(ストラタジーン・クローニング・
システム社製、米国)とＤＮＡ断片(１−３ kbp)をライ
ゲーションキットを用いて連結し、この連結反応液を、
ギガパック・ゴールド(Gigapack gold)(ストラタジーン
・クローニング・システム社製、米国)を用いてパッケ
ージングを行った。 (Ｂ)プローブの調製：アミコラトプシス・スピシーズ
ＴＳ−１−６０の生成するアシルアミノ酸ラセマーゼの
精製蛋白質４mgをリジルエンドペプチダーゼで処理し蛋
白を数種類のペプチドに切断した。これを逆相クロマト
グラフィーで精製後、ピーク２と命名したペプチドにつ
いてアミノ酸配列を決定した。その配列は、(Ｌys) Ｌ
eu Ｇly Ａla Ｖal Ｇln Ｉle Ｖal Ａsn Ｉle
Ｌys Ｐro ＧlyＡrg Ｖal Ｇly Ｇly Ｔyrでそ
のうち下線部分のペプチドに基づいて推定した以下に示
すオリゴヌクレオチドを合成した。すなわち５'−ＧＡ
ＧＡＴＣＣＴＲ⁴ＡＡＣＡＴＣＡＡＧＣＣ−３'(Ｒ⁴はＧ
またはＣを表す)。このオリゴヌクレオチドの５'末端に
常法により³²Ｐを導入し、これをプローブとした。 (Ｃ)アシルアミノ酸ラセマーゼの抗体の調製：アミコラ
トプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０から得たアシル
アミノ酸ラセマーゼ精製蛋白約１mgをウサギに４回(４
００，２００，２００，２００μg)に分けてチャレンジ
させた。その結果、オクタロニー法で１６の抗体価を有
するポリクローナル抗体の血清が得られた。 (Ｄ)イムノアッセイ法によるスクリーニング 大腸菌Ｙ１０９０にアミコラトプシス・スピシーズ Ｔ
Ｓ−１−６０由来のλgt １１ＤＮＡライブラリーに感
染させ、約２０万プラークから１３個の陽性プラークを
得た。これらを純化、増殖後、ＤＮＡ抽出し、これをＥ
coＲＩで切断し、電気泳動に付した。電気泳動で分離で
きたＤＮＡ断片に対して³²Ｐでラベルした上記プローブ
を用いサザンハイブリダイゼイションを行った。１３個
の組み換えファージからプローブにハイブリダイズした
のは、λ−８およびλ−９の２ファージであった。つい
でλ−９のＥcoＲＩ断片の一部を用いて約６００bpのプ
ローブを調製し、これを用いて再度λgt １１ＤＮＡラ
イブラリーから得た約５万個のプラークに対しプラーク
ハイブリダイゼイションを行った。その結果、λ−４４
が得られ、これを精査したところアシルアミノ酸ラセマ
ーゼをコードする全ＤＮＡを含んでいた。

【００１５】実施例３ 塩基配列の決定：λ−４４から単離したＥcoＲＩ断片
(１.４kbp)をMessingらの方法[ヌクレイック アッシズ
リサーチ(Nucl. Acids. Res.)，９，３０９(１９８
１)]に従って大腸菌ファージＭ１３mp８およびＭ１３mp
９に挿入しデアザ法[Mizusawa, S.,ら、ヌクレイック
アッシズ リサーチ(Nucl. Acids. Res.)，１４，１３
１９(１９８６)]によって塩基配列を決定した。その結
果を〔図１〕より〔図３〕に示した。この塩基配列から
推定したアミノ酸配列の一部は、アミコラトプシス・ス
ピシーズ ＴＳ−１−６０から精製、単離したアシルア
ミノ酸ラセマーゼから決定したアミノ酸配列の一部と一
致した。従ってλ−４４は、アシルアミノ酸ラセマーゼ
をコードする遺伝子を含むことが分かった。

【００１６】実施例４ 放線菌の形質転換体を用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ
の生産 アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０の全Ｄ
ＮＡからアシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を抽出し、こ
れを放線菌用プラスミド、pＩＪ７０２に組み込み、こ
れをストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４に形質転
換した、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４／p
ＲＡ３２株を使用した。本菌を酵母エキス−麦芽エキス
寒天斜面培地(ＩＳＰ２培地)に２８℃、７日培養して形
成させた胞子の１白金耳を２００ml容三角フラスコに２
０ml分注滅菌した種培地(３％グリセロール、０.５％
ポリペプトン、０.３％ 肉エキス、０.０５％ Ｎ−ア
セチル−ＤＬ−メチオニン、pＨ７.２)に接種し、回転
振盪機上(２００rpm)で２８℃、４８時間培養した。こ
の培養液８mlを滅菌した１５ml容バイアル瓶に分注し、
−８０℃で凍結保存し、これを凍結保存菌液とした。第
一シードは、上記種培地に凍結保存菌液１mlを接種し同
一条件下で培養し調製した。第二シードは、第一シード
培養菌液２０mlを２リットル容坂口フラスコに分注滅菌
した５００ml種培地に接種し、往復振盪機上(７８spm)
で２８℃、７２時間培養し調製した。酵素の生産は、生
産培地(１.７％ パンクレアチン処理カゼイン、０.３
％パ パイン処理脱脂大豆粉、０.５％ 食塩、０.２５
％ リン酸水素二カリウム、１％ グルコース、０.０
５％ Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、pＨ７.０)１
００リットルを２００リットル容発酵槽に分注滅菌し、
これに第二シードを培養液４リットルを移植し、通気
(８０vvm)撹拌(１６０rpm)しながら２８℃で４２時間培
養した。対照菌として、ＤＮＡ供与体である、アミコラ
トプシス・スピシーズ ＴＳ−１−６０株を同様の方法
で培養し、酵素生産性を比較したところ、形質転換体の
方がより高い生産性を示した。

【００１７】実施例５ lacプロモーターを用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ遺
伝子の大腸菌での発現組換えファージλ−４４からアシ
ルアミノ酸ラセマーゼの構造遺伝子を含むＳmaＩ／Ｘho
Ｉ断片を分離し、この断片を大腸菌プラスミドpＵＣ１
１８のマルチクローニングサイト(ＳmaＩ／ＳalＩサイ
ト)にlacプロモーターの向きに合わせて連結し、プラス
ミドpＲＡ４を作成した〔図５〕。このプラスミドpＲＡ
４を用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換した。得られた
形質転換体ＥＲ−４株(ＩＦＯ１５０８３，ＦＥＲＭ
ＢＰ−３０９１)を竹串で釣り、４mlのアンピシリン(５
０μg／ml)を含むＬＢ培地(１％ポリペプトン、０.５％
酵母エキス、０.５％ 塩化ナトリウム)に接種し、３
７℃，１６時間振とう培養した。この培養液０．３mlを
３０mlのアンピシリン(５０μg／ml)を含むＬＢ培地に
接種し、３７℃，３時間振とう培養後、０.３mlの０.１
Ｍ ＩＰＴＧ(イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド)を添加し(最終濃度１mＭ)さらに４時間培養を
続けた。集菌(３,０００rpm,１０分間)後５mＭのトリス
塩酸バッファー(５０mＭ pＨ７.５)に細胞を懸濁し超
音波処理(４分間)した。得られた細胞破砕液を遠心分離
(１５,０００rpm，１０分間)しその上清液のアシルアミ
ノ酸ラセマーゼ活性を公知の方法により測定した。宿主
大腸菌ＪＭ１０５には認められないアシルアミノ酸ラセ
マーゼ活性を形質転換体ＥＲ−４に確認することができ
た。その酵素生産性は６４Ｕ／リットル(培地)で、ＤＮ
Ａ供与体である、アミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ
−１−６０株の約３倍であった。

【００１８】実施例６ tacプロモーターを用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ遺
伝子の大腸菌での発現実施例５のlac発現プラスミドpＲ
Ａ４から、アシルアミノ酸ラセマーゼの構造遺伝子を含
むＳmaＩ／Ｈind III断片を分離した。この断片をtacプ
ロモーターを有する発現プラスミドベクターpＫＫ２２
３−３[Brosius, J. and Holly, A.,プロシーディング
オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス(Pro
c. Natl. Acad. Sci.)Ｕ.Ｓ.Ａ., ８１，６９２９(１９
８４)]のＳmaＩ／Ｈind IIIサイトに連結し、プラスミ
ドpＲＡ７を作成した〔図６〕。このプラスミドpＲＡ７
を用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換した。得られた形
質転換体ＥＲ７を実施例５に示した方法で培養し、アシ
ルアミノ酸ラセマーゼ活性を公知の方法で測定したとこ
ろ、本酵素活性が認められた。その酵素生産性は３４Ｕ
／リットル(培地)で、ＤＮＡ供与体であるアミコラトプ
シス・スピシーズ ＴＳ−１−６０株の約１.５倍であ
った。

【００１９】実施例７ 開始コドンＧＴＧからＡＴＧへの変換 組換えファージλ−４４から開始コドンを含むＥcoＲＩ
断片を分離回収し、プラスミドベクターpＵＣ１１８の
ＥcoＲＩサイトに連結した。この組換えプラスミドを大
腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換し得られた形質転換体か
らVieiraらの方法[メソッズ イン エンザイモロジー
(Methods in Enzymology), １００，３(１９８７)]によ
り一本鎖ＤＮＡを調製した。変異点を有する合成オリゴ
ヌクレオチド ５'−ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣ
ＴＣ−３’を用いた部位特異的変異 法[インビトロミュ
ータジェネシスシステム(in vitro Mutagenesis Syste
m,version ２.０)アマシャム社製]を用い行った。得ら
れた変異プラスミドpＭＡ１から変異点を含むＳacＩ断
片を分離回収し、予めＳacＩ処理した発現プラスミドp
ＲＡ４にこの断片を連結し開始コドンがＡＴＧに変換し
たlacプロモター発現プ ラスミドpＲＡ４Ａを作成した
〔図７〕。同様に変異プラスミドpＭＡ１から変異点を
含むＳmaＩ／ＳacＩ断片を分離回収し、予めＳmaＩ／Ｓ
acＩ処理した発現プラスミドpＲＡ７にこの断片を連結
し開始コドンがＡＴＧに変換したtacプロモター発現プ
ラスミドpＲＡ７Ａを作成した〔図８〕。これらの変異
発現プラスミド を大腸菌ＪＭ１０５に形質転換し、そ
れぞれ形質転換体ＥＲ４Ａ株(ＪＭ１０５ ／pＲＡ４
Ａ)、ＥＲ７Ａ株(ＪＭ１０５／pＲＡ７Ａ，ＩＦＯ １
５１３１，ＦＥＲＭ ＢＰ−３２７２)を得た。これら
の形質転換体を実施例５に示した方法で ＩＰＴＧ添加
後９時間培養しアシルアミノ酸ラセマーゼ活性を公知の
方法で測定した。その酵素生産性はＥＲ４Ａ株で７４０
Ｕ／リットル（培地）、ＥＲ７Ａ株で１９８Ｕ／リット
ル（培地）で、ＤＮＡ供与体であるアミコラトプシス・
スピシーズ ＴＳ−１−６０株のそれぞれ約３７倍、約
１０倍であった。

【００２０】実施例８ アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子のＴ７発現システムで
の発現 Ｔ７発現プラスミドpＥＴ−３ｃ[ジーン(Gene)５８，１
２５(１９８７)]のＮdeＩ／ＢamＨＩサイトにアシルア
ミノ酸ラセマーゼ遺伝子をサブクローン化するために部
位特異的変異法を用い開始コドンの部位にＮdeＩサイト
(ＣＡＴＡＴＧ)、終止コドン近傍にＢgl IIサイト(ＡＧ
ＡＴＣＴ)を作成した。 Ａ）ＮdeＩサイトの作成 発現プラスミドpＲＡ４を大腸菌ＭＶ１１８４株に形質
転換し得られた形質転換体からＶｉｅｉｒａらの方法を
用い一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮＡとＮde
Ｉサイト(ＣＡＴＡＴＧ)を持つ合成オリゴヌクレオチド
５'−ＧＡＧＴＴＴ ＣＡＴＡＴＧＣＴＣＣＴＣＣ−
３’を用い部位特異的変異法[インビトロミュータジェ
ネシスシステム(in vitro Mutagenesis System, versio
n ２.０)アマシャム社製]により開始コドンの部位にＮ
deＩサイトを持つプラスミドpＲＡ４Ｎを作成した〔図
９〕。 Ｂ）Ｂgl IIサイトの作成 プラスミドpＲＡ４ＮからＮdeＩサイトを持つＳmaＩ／
Ｈind III断片を分離し、予めＳmaＩ及びＨind IIIで処
理したプラスミドpＵＣ１１９に連結した。この組換え
プラスミドを大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換し得られ
た形質転換体からVieiraらの方法により一本鎖ＤＮＡを
調製した。この一本鎖ＤＮＡとＢgl IIサイト(ＡＧＡＴ
ＣＴ)を持つ合成オリゴヌクレオチド ５'−ＧＡＧＧＴ
ＡＧＡＴ ＣＴＧＧＴＣＧＧＡＴ−３’を用い、Ａ）と
同様に部位特異的変異法により終止コドン近傍にＢgl I
Iサイトを持つプラスミドpＲＡ４ＮＢを作成した〔図１
０〕。 Ｃ）発現 プラスミドpＵＮＢから本酵素遺伝子を含むＮdeＩ／Ｂg
l II断片を分離回収しプラスミドpＥＴ−３ｃのＮdeＩ
／ＢamＨＩサイトに連結しアシルアミノ酸ラセマーゼ発
現プラスミドpＥＴ−３cＮを作成した〔図１１〕。この
プラスミドを大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３）に形質転換し
形質転換体ＭＲ−１株(ＩＦＯ １５１３２，ＦＥＲＭ
ＢＰ−３２７３)を得た。この形質転換体を実施例７で
示した方法で培養しアシルアミノ酸ラセマーゼ活性を公
知の方法で測定したところ酵素生産性は１７９５Ｕ／リ
ットル(培地)であり、ＤＮＡ供与体であるアミコラトプ
シス・スピシーズ ＴＳ−１−６０株の約９０倍であっ
た。 Ｄ）形質転換体ＭＲ−１株のタンク培養(２０リットル) ＭＲ−１株の菌体一白金耳を１リットル容三角フラスコ
に分注滅菌した４００mlのアンピシリン(５０μg／ml)
を含むＬＢ培地に接種し３７℃，２０時間振盪培養(２
５０rpm)した。この培養液１リットルを２０リットルの
ポリペプトン(１.５％)を含むＭ９培地[Maniatis, T.,
らモレキュラークローニング(Molecular Cloning), Col
d Spring Harbor Laboratory,(１９８２)]に接種し通気
(１００vvm)撹拌(４５０rpm)しながら２８℃で３４時間
培養した。培養開始後８時間でＩＰＴＧを最終濃度０.
０１mＭになるように添加し、グルコース(８％)ポリペ
プトン(２％)混液を連続的(１５０ml／時間)に添加しな
がら培養した。培養終了後培養液を遠心分離(１０００r
pm，２０分間)し１３２０gの湿菌体を得た。アシルアミ
ノ酸ラセマーゼ活性を公知の方法で測定したところ酵素
生産性は２２３００Ｕ／リットル(培地)でありＤＮＡ供
与体であるアミコラトプシス・スピシーズ ＴＳ−１−
６０株の約１１００倍であった。

【００２１】実施例９ 大腸菌形質転換体からの酵素精製 形質転換体ＥＲ４Ａ株の菌体一白菌耳を２００ml容三角
フラスコに分注滅菌したアンピシリン(５０μg／ml)を
含む４０mlのＬＢ培地に接種し３７℃１６時間振盪培養
(３００rpm)した。この培養液４mlを１リットル容三角
フラスコに分注滅菌した４００mlのＬＢ培地に移植し３
０℃，３０時間振盪培養(２５０rpm)した。ＩＰＴＧ
(０.１Ｍ)は培養開始から約６時間後に４ml添加した(終
濃度１mＭ)。培養液８リットルから遠心分離(１０００
０rpm，２０分間)により湿菌体１４１gを得た。この菌
体をトリス塩酸バッファー(５０mＭ pＨ７.５)に懸濁
して５００mlとし超音波処理(５分間×３)を行い細胞を
破砕した。細胞破砕液に同バッファーと硫酸マグネシウ
ム(最終濃度１０mＭ)を加え１リットルとし加熱処理(６
０℃ ３０分間)行い、遠心分離(１００００rpm，２０
分間)して上清液９４０mＭを得た。この上清液に硫酸ア
ンモニウム１０７.２g(２０％飽和)を加え、０℃で２時
間放置後遠心分離(１００００rpm，３０分間)し得られ
た上清液を予め２０％飽和硫 酸アンモニウムを含むト
リス塩酸バッファーで平衡化したブチルトヨパールカラ
ム(ＢＵＴＹＬ−Toyopearl ６５０Ｍ，東ソー，４.５
×３０cm)に添加した。２リットルの２０％飽和硫酸ア
ンモニウムを含む同バッファーで洗浄後２リットルの同
バッファーで飽和硫酸アンモニウム濃度を２０％から０
％まで変化させ溶出し２０mlごとに分画した。アシルア
ミノ酸ラセマーゼ活性は３４から５０番目の画分に認め
られた。活性画分を集め同バッファーで透析し予め同バ
ッファーで平衡化したＤＥＡＥトヨパールカラム(ＤＥ
ＡＥ−Toyopearl ６５０Ｍ，東ソー，４.１×１６cm)
に添加し１リットルの同バッファーで洗浄した。１リッ
トルの同バッファーで塩化ナトリウムの濃度を０から
０.５Ｍまで変化させ溶出し１０ml ごとに分画した。ア
シルアミノ酸ラセマーゼ活性は４８から５３番目の画分
に認められた。以上の操作によりＳＤＳ−ポリアクリル
アミド電気泳動でほぼ単一なバンドを示すアシルアミノ
酸ラセマーゼ１５７０Ｕを得た。形質転換体(ＥＲ４ Ａ
株)からの本酵素の精製結果を以下に示す。

【表２】 ──────────────────────────────── ステップ 総蛋白質 総活性 比活性 純度 収率 (mg) (units) (units/mg) (fold) (％) ──────────────────────────────── 細胞破砕液 18000 3180 0.17 1.0 100 加熱処理 7123 3256 0.46 2.7 100 BUTYL-Toyopearl 249 1620 6.50 38.2 51 DEAE-Toyopearl 198 1573 7.94 46.7 49 ────────────────────────────────

【００２２】実施例１０ 大腸菌形質転換体から得られた酵素の性質 実施例９で示した方法で調製した酵素の性質を調べた。
酵素活性の測定は以下に示す方法のいずれかで行った。 測定方Ａ：適当量の酵素を含む反応液(２５mＭ Ｎ−ア
セチル−Ｄ−メチオニン、２mＭ 塩化コバルト、Ｌ−
アミノアシラーゼ ４Ｕ／ml，５０mＭ トリス塩酸バ
ッファー(pＨ７.５))５００μlを、３０℃、５分間反応
させ、１００μlの塩酸(１Ｎ)を加え反応を停止させ
た。水酸化ナトリウム(１Ｎ)で中和後、生成したＬ−メ
チオニンを高速液体クロマトグラフィーで定量した。酵
素の単位(Ｕ)はＬ−メチオニンが１分間に１μmol生成
される量を１単位(Ｕ)とした。 測定法Ｂ：Ｌ−アシラーゼを含まない測定法Ａの反応液
を、３０℃、５分間保温し反応させ、０.５mlの塩酸(２
Ｎ)を加え反応を停止させた。加水分解(１２０℃，６０
分間)後、水酸化ナトリウム(１Ｎ)で中和し、生成した
Ｌ−メチオニンを高速液体クロマトグラフィで定量し
た。 Ａ）基質特異性 光学活性Ｎ−アシルアミノ酸には作用するが、対応する
光学活性なアミノ酸には作用しなかった。活性は測定法
Ｂに準じ測定し、各基質に対する活性はＮ−アセチル−
Ｄ−メチオニンに対する活性を１００とした相対値で
〔表３〕に示した。

【表３】 基 質 特 異 性 ────────────────────────────── 基 質 相対活性(％) 基 質 相対活性(％) ────────────────────────────── Ac-D-Met 100 Ac-L-Met 138 Fr-L-Met 16 Pr-D-Met 115 Pr-L-Met 102 Bu-D-Met 57 Bu-L-Met 56 Ac-D-Met 11 Ac-L-Ala 7 Ac-D-Leu 18 Ac-L-Leu 22 Ac-D-Phe 50 Ac-L-Phe 17 Ac-D-Trp 13 Ac-L-Trp 12 Ac-L-Tyr 46 Ac-D-Val 33 Ac-L-Val 27 CA-D-Val 93 CA-L-Val 69 D-Met 0 L-Met 0 D-Ala 0 L-Ala 0 D-Leu 0 L-Leu 0 D-Phe 0 L-Phe 0 D-Tyr 0 L-Tyr 0 D-Trp 0 L-Trp 0 D-Val 0 L-Val 0 ────────────────────────────── Fr：ホルミル Ac：アセチル Pro：プロピオニル
Bu：ブチリルCA：クロロアセチル Ｂ）至適pＨ 至適pＨは８.０付近であった。測定法Ａにおいてトリス
塩酸バッファー(pＨ７.５)の代わりにビストリス塩酸バ
ッファー(pＨ６.０−７.０)トリス塩酸バッファー(７.
５−９.０)を用いた。生成したＬ−メチオニンの量比か
ら相対活性を求め、その結果を〔図１２〕に示した。 Ｃ）pＨ安定性 本酵素はpＨ６.０からpＨ１０.０の範囲で安定であっ
た。ビストリス塩酸バッファー(５０mＭ，pＨ６.０−
７.０)およびトリス塩酸バッファー(５０mＭ，pＨ７.５
−１０.０)に２０分の１量の酵素液を加え３０℃、１時
間保温後、測定法Ａに従い酵素の活性を測定した。生成
したＬ−メチオニンの量比から相対活性を求め、その結
果を〔図１３〕に示した。 Ｄ）至適温度 反応至適温度は４５℃から５０℃であった。酵素の活性
は測定法Ａに従い行った。生成したＬ−メチオニンの量
比から相対活性を求め、その結果を〔図１４〕に示し
た。 Ｅ）熱安定性 本酵素は６０℃，３０分間処理(１０mＭ 硫酸マグネシ
ウム添加)で９１％の残存活性を示した。熱処理は各温
度で３０分間行い、活性の測定は測定Ａに従い行った。
その結果を〔図１５〕に示す。 Ｆ）金属イオンの影響 本酵素はマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、
ニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオンによ
り活性化された。一方、ナトリウムイオン、アルミニウ
ムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどでは
この条件下では活性化は認められなかった。活性の測定
は測定法Ｂに準じて行い、生成したＬ−メチオニンの量
比から相対活性を求め、その結果を〔表４〕に示した。

【表４】 Ｇ）阻害剤の影響 ｐ−クロロメルクリ安息香酸(１mＭ，ＰＣＭＢ)、５,
５'−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸)(５mＭ，ＤＴＮ
Ｂ)は本酵素活性を阻害したが、Ｎ−エチレンマレイミ
ド(５mＭ，ＮＥＭ)は阻害しなかった。活性の測定は測
定法Ｂに準じて行い、生成したＬ−メチオニンの量比か
ら相対活性を求め、その結果を〔表５〕に示した。

【表５】 阻害剤の酵素活性に及ぼす影響 ───────────────────────────────── 阻 害 剤 濃度(mＭ) 相対活性(％) ───────────────────────────────── な し 100 p−クロロメルクリ安息香酸 1 4 5 2 ５,５'−ジチオビス(２−ニトロ安息香酸) 1 50 5 3 エチレンジアミン四酢酸 1 100 5 1 １,５−ジフェニルカルバジド 1 87 5 57 硫酸ヒドラジン 1 99 5 87 塩酸セミカルバジド 1 98 5 94 塩酸ヒドロキシルアミン 1 97 5 80 Ｎ−エチルマレイミド 1 95 5 85 Ｌ−ペニシラミン 1 94 5 71 フェニルメタンスルホニルフルオリド 1 86 5 31 Ｎ−α−p−トシル−Ｌ−リジンクロロメチル 1 99 ケトン 5 76 ───────────────────────────────── Ｈ）Ｎ−アセチルメチオニンのラセミ化 Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンまたはＮ−アセチル−Ｌ
−メチオニン１００mＭを基質として本酵素を３０℃で
作用させた。測定法Ｂに従い塩酸加水分解後、メチオニ
ンを分割定量しラセミ化の状態を調べた。その結果を
〔図１６〕，〔図１７〕に示した。両基質とも約３時間
でラセミ化した。

【００２３】実施例１１ 大腸菌形質転換体から得られた酵素のＮ末端アミノ酸配
列 実施例９で示した方法で得られた酵素をさらに、イナー
トシル３００Ｃ８カラム(４.６×１００mm，ガスクロ工
業(株))を用いた逆相クロマトグラフィー(移動相：０.
１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／水，溶
出条件：アセトニトリル濃度を２０％から８０％まで直
線的に変化させた)により精製した。この精製酵素タン
パク質 ２００pmoleを気相プロテインシークエンサー
(モデル４７０Ａ，アプライド バイオシステム社)を用
いて分析した。大腸菌形質転換体から得られた本酵素の
Ｎ末端アミノ酸配列は放線菌から得られた酵素のそれと
同一であった。以下にＮ末端アミノ酸配列を示す。 Ｍet−Ｌys−Ｌeu−Ｓer−Ｇly−Ｖal−Ｇlu−Ｌeu−Ａrg−Ａrg−Ｖal−Ｇln− Ｍet−Ｐro−Ｌeu−Ｖal−Ａla−Ｐro−Ｐhe−Ａrg

【００２４】

【発明の効果】本発明によると、光学活性アミノ酸の製
造に利用できる有用な酵素であるアシルアミノ酸ラセマ
ーゼを収率よく工業的に有利に製造できる。

【００２５】配列番号：１ 配列の種類：ＤＮＡ 配列の名称：アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（acylam
ino acid racemase） 配列の長さ：１４００ 他の情報 遺伝子産物名：アシルアミノ酸ラセマーゼ（acylamino
acid racemase） 鎖の数：環状 トポロジー：直鎖状 酵素委員会番号：なし 直接の採取源 属名：アミコラトプシス（Amycolatopsis） 種名：スピシーズ（ｓｐ．） 株名：ＴＳ−１−６０ 寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−３０９２ 配列: GAATTCCCCG GGTGACCGGC TTCGACCGAG CCGGCTTTTA CGTGATCTCC AAGGAGGAGC 60 A GTG AAA CTC AGC GGT GTG GAA CTG CGC CGG GTG CAG ATG CCG CTC GTC 109 Met Lys Leu Ser Gly Val Glu Leu Arg Arg Val Gln Met Pro Leu Val 1 5 10 15 GCC CCG TTC CGG ACT TCG TTC GGC ACC CAG TCG GTC CGC GAG CTC TTG 157 Ala Pro Phe Arg Thr Ser Phe Gly Thr Gln Ser Val Arg Glu Leu Leu 20 25 30 CTG CTG CGC GCG GTC ACG CCG GCC GGC GAG GGC TGG GGC GAA TGC GTG 205 Leu Leu Arg Ala Val Thr Pro Ala Gly Glu Gly Trp Gly Glu Cys Val 35 40 45 ACG ATG GCC GGT CCG CTG TAC TCG TCG GAG TAC AAC GAC GGC GCG GAA 253 Thr Met Ala Gly Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Tyr Asn Asp Gly Ala Glu 50 55 60 CAC GTG CTG CGG CAC TAC TTG ATC CCG GCG CTG CTG GCC GCG GAA GAC 301 His Val Leu Arg His Tyr Leu Ile Pro Ala Leu Leu Ala Ala Glu Asp 65 70 75 80 ATC ACC GCG GCG AAG GTG ACG CCG CTG CTG GCC AAG TTC AAG GGC CAC 349 Ile Thr Ala Ala Lys Val Thr Pro Leu Leu Ala Lys Phe Lys Gly His 85 90 95 CGG ATG GCC AAG GGC GCG CTG GAG ATG GCC GTG CTC GAC GCC GAA CTC 397 Arg Met Ala Lys Gly Ala Leu Glu Met Ala Val Leu Asp Ala Glu Leu 100 105 110 CGC GCG CAC GAG AGG TCG TTC GCC GCC GAA CTC GGA TCG GTG CGC GAT 445 Arg Ala His Glu Arg Ser Phe Ala Ala Glu Leu Gly Ser Val Arg Asp 115 120 125 TCT GTG CCG TGC GGC GTT TCG GTC GGG ATC ATG GAC ACC ATC CCG CAA 493 Ser Val Pro Cys Gly Val Ser Val Gly Ile Met Asp Thr Ile Pro Gln 130 135 140 CTG CTC GAC GTC GTG GGC GGA TAC CTC GAC GAG GGT TAC GTG CGG ATC 541 Leu Leu Asp Val Val Gly Gly Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Val Arg Ile 145 150 155 160 AAG CTG AAG ATC GAA CCC GGC TGG GAC GTC GAG CCG GTG CGC GCG GTC 589 Lys Leu Lys Ile Glu Pro Gly Trp Asp Val Glu Pro Val Arg Ala Val 165 170 175 CGC GAG CGC TTC GGC GAC GAC GTG CTG CTG CAG GTC GAC GCG AAC ACC 637 Arg Glu Arg Phe Gly Asp Asp Val Leu Leu Gln Val Asp Ala Asn Thr 180 185 190 GCC TAC ACC CTC GGC GAC GCG CCG CAG CTG GCC CGG CTC GAC CCG TTC 685 Ala Tyr Thr Leu Gly Asp Ala Pro Gln Leu Ala Arg Leu Asp Pro Phe 195 200 205 GGC CTG CTG CTG ATC GAG CAG CCG CTG GAA GAG GAG GAC GTG CTC GGC 733 Gly Leu Leu Leu Ile Glu Gln Pro Leu Glu Glu Glu Asp Val Leu Gly 210 215 220 CAC GCC GAA CTG GCC CGC CGG ATC CAG ACA CCG ATC TGC CTC GAC GAG 781 His Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ile Gln Thr Pro Ile Cys Leu Asp Glu 225 230 235 240 TCG ATC GTG TCG GCG CGC GCG GCG GCG GAC GCC ATC AAG CTG GGC GCG 829 Ser Ile Val Ser Ala Arg Ala Ala Ala Asp Ala Ile Lys Leu Gly Ala 245 250 255 GTC CAA ATC GTG AAC ATC AAA CCG GGC CGC GTC GGC GGG TAC CTG GAA 877 Val Gln Ile Val Asn Ile Lys Pro Gly Arg Val Gly Gly Tyr Leu Glu 260 265 270 GCG CGG CGG GTG CAC GAC GTG TGC GCG GCG CAC GGG ATC CCG GTG TGG 925 Ala Arg Arg Val His Asp Val Cys Ala Ala His Gly Ile Pro Val Trp 275 280 285 TGC GGC GGG ATG ATC GAG ACC GGC CTC GGC CGG GCG GCG AAC GTC GCG 973 Cys Gly Gly Met Ile Glu Thr Gly Leu Gly Arg Ala Ala Asn Val Ala 290 295 300 CTG GCC TCG CTG CCG AAC TTC ACC CTG CCC GGC GAC ACC TCG GCG TCG 1021 Leu Ala Ser Leu Pro Asn Phe Thr Leu Pro Gly Asp Thr Ser Ala Ser 305 310 315 320 GAC CGG TTC TAC AAA ACC GAC ATC ACC GAG CCG TTC GTG CTC TCC GGC 1069 Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Asp Ile Thr Glu Pro Phe Val Leu Ser Gly 325 330 335 GGC CAC CTC CCG GTG CCG ACC GGA CCG GGC CTC GGC GTG GCG CCG ATT 1117 Gly His Leu Pro Val Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Val Ala Pro Ile 340 345 350 CCG GAG CTG CTG GAC GAG GTG ACC ACG GCA AAG GTG TGG ATC GGT TCG 1165 Pro Glu Leu Leu Asp Glu Val Thr Thr Ala Lys Val Trp Ile Gly Ser 355 360 365 TAGCCCGCTA CGAATTCCGG AGGTAGATTT GGTCGGATCG GACCAGCCGG TCCGCACGAG 1225 GCCGGATCTA CCTTCGGGGG GTGCTGACAC CGGTGCCGAG CAAACCGCAC ACGAGTCTGG 1285 GACGCGTCCT CGAAGCTCTC GGGGACGTGC TCCTCGAGCC GGTCGCCGTC GGCGCGACAC 1345 GCGGCGGCAG CTCGGCGGGG TGGTGATTCA CGACCCGCAC GACGACGCGG AATTC 1400

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列(その
１)

【図２】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列(その
２)

【図３】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列(その
３)

【図４】実施例１で得られたＤＮＡの制限酵素切断地図

【図５】プラスミドpＲＡ４の調製法

【図６】プラスミドpＲＡ７の調製法

【図７】プラスミドpＲＡ４Ａの調製法

【図８】プラスミドpＲＡ７Ａの調製法

【図９】プラスミドpＲＡ４Ｎの調製法

【図１０】プラスミドpＲＡ４ＮＢの調製法

【図１１】プラスミドpＥＴ−３cＮの調製法

【図１２】実施例１０Ｂで得られた酵素活性とpＨの関
係

【図１３】実施例１０Ｃで得られた酵素安定性とpＨの
関係

【図１４】実施例１０Ｄで得られた酵素活性と反応温度
との関係

【図１５】実施例１０Ｅで得られた酵素安定性と温度の
関係

【図１６】実施例１０Ｈで得られたアセチル−Ｄ−メチ
オニンのラセミ化

【図１７】実施例１０Ｈで得られたアセチル−Ｌ−メチ
オニンのラセミ化

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:03） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列表の配列番号：１で示されるアミノ酸
   配列を有するアシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺
   伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】遺伝子が微生物由来である請求項１記載の
   ＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】微生物がアクチノミセス（actinomyces）
   である請求項２記載のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺
   伝子の塩基配列が配列表の配列番号：１で示される塩基
   配列の第６２番目〜第１１６５番目の塩基配列である請
   求項１記載のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺
   伝子の塩基配列が配列表の配列番号：１で示すものであ
   る請求項１記載のＤＮＡ断片。
6. 【請求項６】請求項１ないし５のいずれかに記載のＤＮ
   Ａ断片を組み込んだベクター。
7. 【請求項７】請求項６記載のベクターで形質転換した微
   生物。
8. 【請求項８】請求項７記載の微生物を培養し、培養液中
   にアシルアミノ酸ラセマーゼを培養物中に蓄積させ、そ
   れを採取することを特徴とするアシルアミノ酸ラセマー
   ゼの製造法。