JPH04365482A - Ｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は発酵法によるアシルアミ
ノ酸ラセマーゼの製造法、その製造に用いられる新規微
生物および該新規微生物を作出するのに有用な新規ＤＮ
Ａ断片に関する。

【０００２】

【従来の技術】アシルアミノ酸ラセマーゼは、放線菌に
広く分布し、光学活性なＮ−アシルアミノ酸を対応する
対掌体に変換するが光学活性のアミノ酸には作用しない
特異な酵素であって、その詳細な性質についてはすでに
明らかにされている（特開平１−１３７９７３，日本農
芸化学会１９９０年度大会講演要旨集，３６８頁，１９
９０年）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】このようにアシルアミ
ノ酸ラセマーゼは、光学活性アミノ酸の製造に利用でき
る有用な酵素である。しかしながら、該酵素を安価に効
率良く製造する方法の開発は十分とは言えず、さらに有
利な方法がのぞまれていた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な現状に鑑み、研究を重ね、アミコラトプシス・スピシ
ーズ　　ＴＳ−１−６０（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ
　ｓｐ．　ＴＳ−１−６０）の生産するアシルアミノ酸
ラセマーゼについて報告した（日本農芸化学会１９９０
年度大会講演要旨集，３６８頁，１９９０年）。そして
新たに、アミコラトプシス・スピシーズＴＳ−１−６０
より、該アシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡ
をクローニングすることに成功し、更に鋭意研究を重ね
た結果本発明を完成した。即ち、本発明はアシルアミノ
酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片、該
ＤＮＡ断片が組み込まれたベクター、該ベクターで形質
転換されたアシルアミノ酸ラセマーゼ生産能を有する新
規微生物および該微生物を用いるアシルアミノ酸ラセマ
ーゼの製造法を提供するものである。本発明におけるア
シルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（以下、アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする
ＤＮＡまたは単にアシルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡと称
することもある。）は、本発明者らが初めて明らかにし
たもので、例えば、アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌、
ストレプトマイセス・スピシーズ　　Ｙ−５３（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　Ｙ−５３，ＩＦＯ　　１
４５９６，ＦＥＲＭ　　Ｐ−９５１８）またはアミコラ
トプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０（Ａｍｙｃｏ
ｌａｔｏｐｓｉｓ　ｓｐ．　ＴＳ−１−６０，ＩＦＯ　
　１５０７９，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０９２）からＤＮ
Ａを分離し、該ＤＮＡをファージまたはプラスミドに組
み込み、得られた組み換えファージまたはプラスミドで
宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養後、形質
転換体から適当な方法、例えば　　アシルアミノ酸ラセ
マーゼ抗体を用いたイムノアッセイ、またはＤＮＡプロ
ーブを用いたプラークまたはコロニーハイブリダイゼー
ションにより目的とするＤＮＡを含有するファージ、ま
たはプラスミドを単離し、そのファージまたはプラスミ
ドから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、該クロ
ーン化ＤＮＡを適当なプラスミドにサブクローニングす
ることにより製造することができる。こうして得られた
ＤＮＡをプラスミドやファージに組み込み、例えば大腸
菌、放線菌または酵母などの宿主を形質転換することが
できる。上記のＩＦＯ番号は、財団法人発酵研究所（Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｆｏｒ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
、Ｏｓａｋａ；ＩＦＯ）における受託番号を、またＦＥ
ＲＭ　　ＢＰ番号は、通商産業省工業技術院微生物工業
技術研究所（ＦＲＩ）における受託番号をそれぞれ示し
、以下同様である。なお、アミコラトプシス・スピシー
ズ　　ＴＳ−１−６０の菌学的性質を示すと、下記の通
りである。

【０００５】（ａ）形態 １）液体培養 本菌の胞子あるいは菌糸をトリプチカーゼ・ソイ・ブロ
スなどの栄養液体培地に接種後、２８℃、１〜２日振盪
培養すると、菌糸は細かく断裂し、その形態は多形態を
示す。 ２）平板寒天培養 基生菌糸は、寒天培地中にジグザク状を呈した生育をす
る。気菌糸は、一般に直線状からやや屈曲状（ＲＦ）を
呈する。また、気菌糸どおしが絡み合った菌糸塊が観察
される（ＩＳＰ−２およびＩＳＰ−７）。胞子は、一般
に円筒状を呈し、その大きさは（０．３〜０．５×０．
６〜２．３μｍ）と長さにおいて多様性を示した。その
表面は平滑である。 （ｂ）菌体組成 細胞壁成分のジアミノピメリン酸は　ｍｅｓｏ　型で糖
はアラビノース，ガラクトースが検出され細胞壁はタイ
プＩＶＡに属する。ミコール酸は検出されず、メナキノ
ンは９（Ｈ２，Ｈ４）で、ホスホリピドはタイプＩＩ（
有：ジホスファチジルグリセロール，ホスファチジルエ
タノールアミン，ホスファチジルイノシトール，ホスフ
ァチジルイノシトールマンノサイド，無：ホスファチジ
ルコリン）であった。 （ｃ）各種培地における生育状態 ＴＳ−１−６０株の各種培地上の生育状態は表１に示す
通りである。括弧内に示す色の記号はコンテナー・コー
ポレーション・オブ・アメリカ社製のカラー・ハーモニ
ー・マニュアル第４版に記載のものを用いた。

【表１】 （ｃ）生理的性質 ■生育温度範囲：イースト・麦芽寒天培地上，１３−３
７℃ （最適生育温度２０−３０℃） ■ゼラチンの液化：陰性 ■スターチの加水分解：陰性 ■脱脂牛乳の凝固：陰性 脱脂牛乳のペプトン化：陰性 ■メラニン様色素の生成：陰性 （ｄ）炭素源の同化性 陽性：グルコース，キシロース，フラクトース，マンニ
トール，イノシトール，アラビノース 陰性：シュークロス，ラフィノース，ラムノース該ＤＮ
Ａを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌のｐ
ＢＲ３２２［ジーン（Ｇｅｎｅ），２，９５（１９７７
）］，ｐＢＲ３２５［ジーン（Ｇｅｎｅ），４，１２１
（１９７８）］，ｐＵＣ１３［ジーン（Ｇｅｎｅ），１
９，２５９（１９８２）］，などが挙げられるが、その
他のものであっても、宿主内で複製保持されるものであ
れば、いずれをも用いることができる。また、ＤＮＡを
組み込むファージベクターとしては、たとえばλｇｔ　
１１［Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．，ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ，　Ｒ．
，　プロシージング　　オブ　　ザ　　ナショナル　　
アカデミー　　オブ　　サイエンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．　８０
，１１９４（１９８３）］などが挙げられるが、その他
のものであっても、宿主内で増殖できるものであればよ
い。

【０００６】プラスミドに該ＤＮＡを組み込む方法とし
ては、たとえばＭａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　らによる
モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ｐ．　２３９（１９８２）
に記載の方法などが挙げられる。また、ファージベクタ
ーにＤＮＡを組み込む方法としては、たとえば　Ｈｙｕ
ｎｈ，　Ｔ．　Ｖ．　らの方法［ディー　　エヌ　　エ
ー　　クローニング、ア　　プラクティカル　　アプロ
ーチ（ＤＮＡｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８５）］など
が挙げられる。この　ようにして得られたプラスミドや
ファージベクターは、適当な宿主たとえば大腸菌などに
導入する。上記大腸菌の例としては、Ｅｓｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ１２，ＤＨ１［プロシージングオブ
　　ナショナル　　アカデミー　　オブ　　サイエンス
（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，Ｕ
．Ｓ．Ａ．　６０、１６０（１９６８）］，ＪＭ１０３
［ヌクレイック　　アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌ．　Ａ
ｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．），９，３０９（１９８１）］，
ＪＡ２２１［ジャーナル　　　オブ　　モレキュラー　
　バイオロジー（Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．），１２
０，５１７（１９７８）］，ＨＢ１０１［ジャーナル　
　オブ　　モレキュラー　　バイオロジー（Ｊ．　Ｍｏ
ｌ．　Ｂｉｏｌ．），４１、４５９（１９６９）］，Ｃ
６００［ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９
，４４０（１９５４）］などが挙げられる。プラスミド
で宿主を形質転換する方法としては、たとえば　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　らによるモレキュラークローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ｃｏｌ
ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，　ｐ．　２３９（１９８２）に記載のカルシュウム
クロライド法あるいはカルシュウムクロライド／ルビジ
ュウムクロライド法などが挙げられる。また、ファージ
ベクターにはたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロ
パッケージング法を用いて導入することができる。アシ
ルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡを含有する放線菌ＤＮＡラ
イブラリーは上記の方法などで得ることが出来る。

【０００７】放線菌ＤＮＡライブラリーからアシルアミ
ノ酸ラセマーゼＤＮＡをクローニングする方法としては
、例えばファージベクターλｇｔ１１とアシルアミノ酸
ラセマーゼ抗体を用いたＨｕｙｎｈらの方法［ディー　
　エヌエー　　クローニング、ア　　プラクティカル　
　アプローチ（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ，　ａ　ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ），１，４９（１９８
５）］あるいはアミコラトプシス・スピシーズＴＳ−１
−６０から得られたアシルアミノ酸ラセマーゼのアミノ
酸配列にもとずいて化学合成したオリゴヌクレオチドを
プローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション
またはプラークハイブリダイゼーション法［Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，　Ｔ．，　ら、モレキュラークローニング（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ），Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１
９８２）］などが挙げられる。このようにしてクローン
化されたアシルアミノ酸ラセマーゼＤＮＡは必要があれ
ばプラスミド、例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１２、ｐＵ
Ｃ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８，ｐＵ
Ｃ１１９、などにサブクローニングすることができる。 このようにして得られたＤＮＡの塩基配列を、たとえば
マキサム・ギルバート（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）
法［Ｍｘａｍ，　Ａ．　Ｍ．　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ
，　Ｗ．，　プロシーディング　　オブナショナル　　
アカデミー　　オブ　　サイエンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａ
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，
５６０（１９７７）］あるいはジデオキシ法［Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ，　Ｊ．　ら、ヌクレイック　　アシッズ　　リ
サーチ（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．），９，
３０９（１９８１）］、あるいはデアザ法［Ｍｉｚｕｓ
ａｗａ，　Ｓ．，　ら、ヌクレイック　　アシッズ　　
リサーチ（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ．　Ｒｅｓ．），１
４、１３１９（１９８６）］によって決定し、既知のア
ミノ酸配列との比較からアシルアミノ酸ラセマーゼＤＮ
Ａの存在を確認する。その結果、アシルアミノ酸ラセマ
ーゼをコードする全領域がカバーされていない場合には
、該ＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブ
リダイゼーションによってアシルアミノ酸ラセマーゼＤ
ＮＡの再クローニングを行い、カバーされていない領域
を得る。以上のようにして、アシルアミノ酸ラセマーゼ
をコードするＤＮＡが得られる。

【０００８】本発明のアシルアミノ酸ラセマーゼをコー
ドするＤＮＡの代表例として、後述の実施例１で得られ
たアシルアミノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡが挙げ
られる。その制限酵素切断地図を〔図４〕に示す。上記
のようにしてクローン化されたアシルアミノ酸ラセマー
ゼをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化、あるいは、部位特異的変異法
［メソッズ　　イン　　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１００，４６８
（１９８３）］などを用いてプラスミドを改良して使用
することができる。上記のクローン化されたアシルアミ
ノ酸ラセマーゼをコードするＤＮＡはｌａｃプロモター
、　ｔａｃプロモター［ｄｅ　Ｂｏｙｅｒ．　Ｈ．　Ａ
．，　Ｃａｍｓｔｏｃｋ．　Ｌ．　Ｊ．，　Ｖａｓｓｅ
ｒ．　Ｍ．，プロシーディング　　オブ　　ナショナル
　　アカデミー　　オブ　　サイエンス（Ｐｒｏｃ．　
Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．　
８０，２１（１９８０）］、Ｔ７プロモター［Ｔａｂｏ
ｒ，Ｓ．，　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．　Ｃ．　Ｃ．，　
プロシーデイング　　オブ　　ナショナル　　アカデミ
ーオブ　　サイエンス（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．　Ｓｃｉ．），Ｕ．Ｓ．Ａ．　８２，１０７４（
１９８５）］などのプロモターを用い、例えば大腸菌で
大量に発現させることができる。上記のクローン化ＤＮ
Ａを用いて形質転換した微生物（例、放線菌，大腸菌，
酵母等）を培養し、培地中に生産されたアシルアミノ酸
ラセマーゼを取得することができる。そして、以上述べ
た方法により、アシルアミノ酸ラセマーゼ自体の性質（
例、酵素活性，安定性等）を改良することも可能である
。なお、発現に利用される宿主としてはストレプトマイ
セス・リビダンスＴＫ６４（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ｌｉｖｉｄａｎｓ　ＴＫ６４）およびエシェリヒア・
コリ　　ＨＢ１０１（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＨＢ１０１）などが挙げられるが、その他の放線菌、
大腸菌、枯草菌さらには酵母も利用することができる。

【０００９】放線菌の形質転換はそれ自体公知であり、
Ｈｏｐｗｏｏｄ，　Ｄ．　Ａ．，　ら［ジェネティック
・マニピュレイション・オブ・ストレプトマイセス・ア
・ラボラトリー・マニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｎ
ｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）］の方法
によって行う。また、大腸菌の形質転換法もまた公知で
あり、Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，　ら［モレキュラー
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）
，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，　ｐ．　２３９（１９８２）に記載］のカ
ルシュウムクロライド法あるいはカルシュウムクロライ
ド／ルビジュウムクロライド法などに従って行うことが
できる。このような本発明の形質転換株の代表的な例と
しては、後記の実施例で得られた、エシェリヒア・コリ
　　ＥＲ−４（ＩＦＯ　　１５０８３，ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−３０９１）が挙げられる。もちろん、受容菌を選ぶ
ことによって、本明細書に記載の方法に従って、同様に
種々の形質転換株を容易に作出することができる。この
ようにして得られた形質転換体をそれ自体公知の方法で
培養する。放線菌を培養する場合は、培地は、種培地と
して３％　　グリセロール、０．５％　　ポリペプトン
、０．３　　％肉エキス、０．０５％　　Ｎ−アセチル
−ＤＬ−メチオニン、ｐＨ７．２を、生産培地としては
１．７％　　パンクレアチン処理カゼイン、０．３％パ
パイン処理脱脂大豆粉、０．５％　　食塩、０．２５％
　　リン酸水素二カリウム、１％　　グルコース、０．
０５％　　Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、ｐＨ７．
０を用いる。培養は、通常１５〜４０℃、好ましくは２
４〜３０℃で１０〜９６時間、好ましくは２４〜７２時
間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる
。大腸菌を培養する場合は、培地は、ＬＢ培地（１％ポ
リペプトン，０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリ
ウム）を用いる。培養は、通常１５〜４０℃、好ましく
は２４〜３７℃で１０〜９６時間、好ましくは２４〜４
８時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもで
きる。

【００１０】培養終了後、それ自体公知の方法で細胞と
上清とを分離する。細胞内に残存するアシルアミノ酸ラ
セマーゼは、当分野における通常の方法、例えば超音波
破砕法、フレンチプレスなどを利用した破砕法、摩砕な
どの機械的破砕法、細胞溶解酵素による破砕法などによ
り細胞を破砕し抽出する。このようにして得られた抽出
液中に含まれるアシルアミノ酸ラセマーゼは通常の蛋白
質精製法、例えば塩析、等電点沈殿、ゲルろ過、イオン
交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィーなどに付して精製され、目的
とするアシルアミノ酸ラセマーゼを得ることができる。 上記で得られるアシルアミノ酸ラセマーゼ活性は公知の
方法（特開平１−１３７９７３号）で測定される。すな
わち、測定しようとする酵素サンプルを２５ｍＭＮ−ア
セチル−Ｄ−メチオニン、２ｍＭ　　塩化コバルト、Ｌ
−アミノアシラーゼ　　２Ｕ，５０ｍＭ　　トリス塩酸
バッファー　（ｐＨ７．５）から成る反応液５００μｌ
に加え，３０℃、５分間反応させた後、３分間煮沸して
反応を停止させた。酵素の単位（Ｕ）はＬ−メチオニン
が１分間に１μｍｏｌ生成される量を１単位（Ｕ）とし
た。

【００１１】なお、本明細書において、塩基やアミノ酸
などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ　　Ｃ
ｏｍｍｉｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野
における慣用略号に基づくものであり、その例を次ぎに
挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場
合は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。 ＤＮＡ　　　　　　デオキシリボ核酸 Ａ　　　　　　　　アデニン Ｃ　　　　　　　　シトシン Ｇ　　　　　　　　グアニン Ｔ　　　　　　　　チミン Ａｌａ　　　　　　　　アラニン Ａｒｇ　　　　　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　　　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　　　　　　アスパラギン酸Ｃｙｓ　　　　
　　　　システイン Ｇｌｎ　　　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　　　　グリシン Ｈｉｓ　　　　　　　　ヒスチジン Ｉｌｅ　　　　　　　　イソロイシン Ｌｅｕ　　　　　　　　ロイシン Ｌｙｓ　　　　　　　　リジン Ｍｅｔ　　　　　　　　メチオニン Ｐｈｅ　　　　　　　　フェニルアラニンＰｒｏ　　　
　　　　　プロリン Ｓｅｒ　　　　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　　　　スレオニン Ｔｒｐ　　　　　　　　トリプトファンＴｙｒ　　　　
　　　　チロシン Ｖａｌ　　　　　　　　バリン

【００１２】

【実施例】以下に、実施例を挙げて、本発明をさらに具
体的に説明するが、本発明はこれらに限定されることは
ない。

【００１３】実施例１ アミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０の染
色体ＤＮＡの単離 アミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０をト
リプトース・ソイ・ブロス（ベクトン・ディキンソン社
）２０ｍｌを含む２００ｍｌ三角フラスコで２８℃、４
２時間振盪培養した。得られた湿菌体（４ｇ）を２０ｍ
ｌのバッファーＡ液［０．３Ｍシュークロス、２５ｍＭ
　　ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス・塩酸バッファー（ｐＨ
８）］に懸濁し、これに卵白リゾチームを２ｍｇ／ｍｌ
の濃度になるように添加し、３７℃で１時間穏やかに振
盪する。これに、８ｍｌの２％　　ＳＤＳを添加し、２
〜３度穏やかに混合する。この溶液にクロロフォルム５
ｍｌ、バッファーＡで飽和したフェノール５ｍｌを添加
し撹拌後、遠心分離機にかけ（３０００ｒｐｍ，２０分
）ＤＮＡを抽出した。このフェノール抽出を３回繰り返
した後に、ＤＮＡ溶液の１／１０量の３Ｍ酢酸カリウム
溶液ならびに２倍量の氷冷エタノールを加えＤＮＡを沈
殿させる。沈殿したＤＮＡを遠心分離で集めた後、７０
％エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥し保存した。

【００１４】実施例２ アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子のクロー
ニング： （Ａ）ジーンライブラリーの調製： ａ）制限酵素Ｈａｅ　ＩＩＩによる部分消化実施例１に
おいて単離されたアミコラトプシス・スピシーズ　　Ｔ
Ｓ−１−６０の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｈａｅ　ＩＩＩ
［宝酒造（株）］で部分消化した。すなわち、１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、７ｍＭ塩化マグネシ
ュウム、６０ｍＭ食塩、７ｍＭ２−メルカプトエタノー
ル、５μｇ供与体ＤＮＡ、１０単位Ｈａｅ　ＩＩＩから
成る反応液５０μｌで、３７℃２分間反応させた。反応
終了後、反応液をフェノール・クロロフォルム処理して
蛋白を除き、２倍量のエタノールを添加してＤＮＡ断片
を回収した。 ｂ）メチラーゼ反応 Ｈａｅ　ＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片のＥｃｏＲＩ
サイトのアデノシン部分をメチル化した。部分消化した
ＤＮＡ断片５μｇに１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）２ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ
、８０μＭ　　Ｓ−アデノシルメチオニン、４０単位メ
チラーゼ［宝酒造（株）］から成る反応液２０μｌで３
７℃、６０分反応させた。ＤＮＡ断片を前述と同様の方
法で回収した。 ｃ）リンカーライゲーション メチル化したＤＮＡ断片の末端にＥｃｏＲＩリンカーを
接続した。ＥｃｏＲＩリンカーはｄ（ｐＧＧＡＡＴＴＣ
Ｃ）［宝酒造（株）］を用いた。また、リンカーとの結
合は、ライゲーションキット［宝酒造（株）］を用いた
。反応は、ＤＮＡ５μｇ、ＥｃｏＲＩリンカー２μｌ（
２μｇ）、Ａ液１６μｌ、Ｂ液２μｌ、合計２０μｌで
、１６℃、１６時間おこなった。反応終了後、フェノー
ル・クロロホルム処理し、エタノール沈殿後、乾燥させ
、ＤＮＡを回収した。 ｄ）制限酵素ＥｃｏＲＩによる消化 ｃ）で得られたＤＮＡ断片を５μｇを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉを用いて３７℃、３時間 の反応条件で消化した。反応終了後、ＤＮＡ断片を電気
泳動にかけ、１−３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片のもの
を回収し、フェノール・クロロホルム処理し、エタノー
ル沈殿後、減圧乾固し、２０μｌのＴＮＥ緩衝液（１０
ｍＭトリス−塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ，３００ｍＭＮａＣ
ｌ、ｐＨ８．０）に溶解した。 ｅ）ベクター（λｇｔ　１１）とのライゲーションおよ
びパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）ＥｃｏＲＩ処
理、フォスファターゼ処理したλｇｔ　１１（ストラタ
ジーン・クローニング・システム社製、米国）とＤＮＡ
断片（１−３　　ｋｂｐ）をライゲーションキットを用
いて連結し、この連結反応液を、ギガパック・ゴールド
（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ｇｏｌｄ）（ストラタジーン・ク
ローニング・システム社製、米国）を用いてパッケージ
ングを行った。 （Ｂ）プローブの調製：アミコラトプシス・スピシーズ
　　ＴＳ−１−６０の生成するアシルアミノ酸ラセマー
ゼの精製蛋白質４ｍｇをリジルエンドペプチダーゼで処
理し蛋白を数種類のペプチドに切断した。これを逆相ク
ロマトグラフィーで精製後、ピーク２と命名したペプチ
ドについてアミノ酸配列を決定した。その配列は、（Ｌ
ｙｓ）　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　
Ｇｌｎ　　Ｉｌｅ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　Ｉｌｅ　　
Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　　ＧｌｙＡｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒでそのうち下線部分のペプチド
に基づいて推定した以下に示すオリゴヌクレオチドを合
成した。すなわち５’−ＧＡＧＡＴＣＣＴＲ４ＡＡＣＡ
ＴＣＡＡＧＣＣ−３’（Ｒ４はＧまたはＣを表す）。こ
のオリゴヌクレオチドの５’末端に常法により３２Ｐを
導入し、これをプローブとした。 （Ｃ）アシルアミノ酸ラセマーゼの抗体の調製：アミコ
ラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０から得たア
シルアミノ酸ラセマーゼ精製蛋白約１ｍｇをウサギに４
回（４００，２００，２００，２００μｇ）に分けてチ
ャレンジさせた。その結果、オクタロニー法で１６の抗
体価を有するポリクローナル抗体の血清が得られた。 （Ｄ）イムノアッセイ法によるスクリーニング大腸菌Ｙ
１０９０にアミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１
−６０由来のλｇｔ　１１ＤＮＡライブラリーに感染さ
せ、約２０万プラークから１３個の陽性プラークを得た
。これらを純化、増殖後、ＤＮＡ抽出し、これをＥｃｏ
ＲＩで切断し、電気泳動に付した。電気泳動で分離でき
たＤＮＡ断片に対して３２Ｐでラベルした上記プローブ
を用いサザンハイブリダイゼイションを行った。１３個
の組み換えファージからプローブにハイブリダイズした
のは、λ−８およびλ−９の２ファージであった。つい
でλ−９のＥｃｏＲＩ断片の一部を用いて約６００ｂｐ
のプローブを調製し、これを用いて再度λｇｔ　１１Ｄ
ＮＡライブラリーから得た約５万個のプラークに対しプ
ラークハイブリダイゼイションを行った。その結果、λ
−４４が得られ、これを精査したところアシルアミノ酸
ラセマーゼをコードする全ＤＮＡを含んでいた。

【００１５】実施例３ 塩基配列の決定：λ−４４から単離したＥｃｏＲＩ断片
（１．４ｋｂｐ）をＭｅｓｓｉｎｇらの方法［ヌクレイ
ック　　アッシズ　　リサーチ（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ
ｓ．　Ｒｅｓ．），９，３０９（１９８１）］に従って
大腸菌ファージＭ１３ｍｐ８およびＭ１３ｍｐ９に挿入
しデアザ法［Ｍｉｚｕｓａｗａ，　Ｓ．，ら、ヌクレイ
ック　　アッシズ　　リサーチ（Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ
ｓ．　Ｒｅｓ．），１４，１３１９（１９８６）］によ
って塩基配列を決定した。その結果を〔図１〕より〔図
３〕に示した。この塩基配列から推定したアミノ酸配列
の一部は、アミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１
−６０から精製、単離したアシルアミノ酸ラセマーゼか
ら決定したアミノ酸配列の一部と一致した。従ってλ−
４４は、アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺伝子
を含むことが分かった。

【００１６】実施例４ 放線菌の形質転換体を用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ
の生産 アミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０の全
ＤＮＡからアシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子を抽出し、
これを放線菌用プラスミド、ｐＩＪ７０２に組み込み、
これをストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４に形質
転換した、ストレプトマイセス・リビダンスＴＫ６４／
ｐＲＡ３２株を使用した。本菌を酵母エキス−麦芽エキ
ス寒天斜面培地（ＩＳＰ２培地）に２８℃、７日培養し
て形成させた胞子の１白金耳を２００ｍｌ容三角フラス
コに２０ｍｌ分注滅菌した種培地（３％グリセロール、
０．５％　　ポリペプトン、０．３％　　肉エキス、０
．０５％　　Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、ｐＨ７
．２）に接種し、回転振盪機上（２００ｒｐｍ）で２８
℃、４８時間培養した。この培養液８ｍｌを滅菌した１
５ｍｌ容バイアル瓶に分注し、−８０℃で凍結保存し、
これを凍結保存菌液とした。第一シードは、上記種培地
に凍結保存菌液１ｍｌを接種し同一条件下で培養し調製
した。第二シードは、第一シード培養菌液２０ｍｌを２
リットル容坂口フラスコに分注滅菌した５００ｍｌ種培
地に接種し、往復振盪機上（７８ｓｐｍ）で２８℃、７
２時間培養し調製した。酵素の生産は、生産培地（１．
７％　　パンクレアチン処理カゼイン、０．３％パ　パ
イン処理脱脂大豆粉、０．５％　　食塩、０．２５％　
　リン酸水素二カリウム、１％　　グルコース、０．０
５％　　Ｎ−アセチル−ＤＬ−メチオニン、ｐＨ７．０
）１００リットルを２００リットル容発酵槽に分注滅菌
し、これに第二シードを培養液４リットルを移植し、通
気（８０ｖｖｍ）撹拌（１６０ｒｐｍ）しながら２８℃
で４２時間培養した。対照菌として、ＤＮＡ供与体であ
る、アミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０
株を同様の方法で培養し、酵素生産性を比較したところ
、形質転換体の方がより高い生産性を示した。

【００１７】実施例５ ｌａｃプロモーターを用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ
遺伝子の大腸菌での発現組換えファージλ−４４からア
シルアミノ酸ラセマーゼの構造遺伝子を含むＳｍａＩ／
ＸｈｏＩ断片を分離し、この断片を大腸菌プラスミドｐ
ＵＣ１１８のマルチクローニングサイト（ＳｍａＩ／Ｓ
ａｌＩサイト）にｌａｃプロモーターの向きに合わせて
連結し、プラスミドｐＲＡ４を作成した〔図５〕。この
プラスミドｐＲＡ４を用い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転
換した。得られた形質転換体ＥＲ−４株（ＩＦＯ１５０
８３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０９１）を竹串で釣り、４
ｍｌのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地
（１％ポリペプトン、０．５％　　酵母エキス、０．５
％　　塩化ナトリウム）に接種し、３７℃，１６時間振
とう培養した。この培養液０．３ｍｌを３０ｍｌのアン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地に接種し、
３７℃，３時間振とう培養後、０．３ｍｌの０．１Ｍ　
　ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド）を添加し（最終濃度１ｍＭ）さらに４時間培養
を続けた。集菌（３，０００ｒｐｍ，１０分間）後５ｍ
Ｍのトリス塩酸バッファー（５０ｍＭ　　ｐＨ７．５）
に細胞を懸濁し超音波処理（４分間）した。得られた細
胞破砕液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，１０分間）
しその上清液のアシルアミノ酸ラセマーゼ活性を公知の
方法により測定した。宿主大腸菌ＪＭ１０５には認めら
れないアシルアミノ酸ラセマーゼ活性を形質転換体ＥＲ
−４に確認することができた。その酵素生産性は６４Ｕ
／リットル（培地）で、ＤＮＡ供与体である、アミコラ
トプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０株の約３倍で
あった。

【００１８】実施例６ ｔａｃプロモーターを用いたアシルアミノ酸ラセマーゼ
遺伝子の大腸菌での発現実施例５のｌａｃ発現プラスミ
ドｐＲＡ４から、アシルアミノ酸ラセマーゼの構造遺伝
子を含むＳｍａＩ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を分離した。 この断片をｔａｃプロモーターを有する発現プラスミド
ベクターｐＫＫ２２３−３［Ｂｒｏｓｉｕｓ，　Ｊ．　
ａｎｄ　Ｈｏｌｌｙ，　Ａ．，プロシーディング　　オ
ブ　ナショナル　　アカデミー　　オブ　　サイエンス
（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．）Ｕ
．Ｓ．Ａ．，　８１，６９２９（１９８４）］のＳｍａ
Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサイトに連結し、プラスミドｐＲ
Ａ７を作成した〔図６〕。このプラスミドｐＲＡ７を用
い、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換した。得られた形質転
換体ＥＲ７を実施例５に示した方法で培養し、アシルア
ミノ酸ラセマーゼ活性を公知の方法で測定したところ、
本酵素活性が認められた。その酵素生産性は３４Ｕ／リ
ットル（培地）で、ＤＮＡ供与体であるアミコラトプシ
ス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０株の約１．５倍であ
った。

【００１９】実施例７ 開始コドンＧＴＧからＡＴＧへの変換 組換えファージλ−４４から開始コドンを含むＥｃｏＲ
Ｉ断片を分離回収し、プラスミドベクターｐＵＣ１１８
のＥｃｏＲＩサイトに連結した。この組換えプラスミド
を大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換し得られた形質転換
体からＶｉｅｉｒａらの方法［メソッズ　　イン　　エ
ンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ），　１００，３（１９８７）］により一本鎖
ＤＮＡを調製した。変異点を有する合成オリゴヌクレオ
チド　　５’−ＧＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＴＣ−
３’を用いた部位特異的変異　法［インビトロミュータ
ジェネシスシステム（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ　　２．０
）アマシャム社製］を用い行った。得られた変異プラス
ミドｐＭＡ１から変異点を含むＳａｃＩ断片を分離回収
し、予めＳａｃＩ処理した発現プラスミドｐ　ＲＡ４に
この断片を連結し開始コドンがＡＴＧに変換したｌａｃ
プロモター発現プ　ラスミドｐＲＡ４Ａを作成した〔図
７〕。同様に変異プラスミドｐＭＡ１から変異点を含む
ＳｍａＩ／ＳａｃＩ断片を分離回収し、予めＳｍａＩ／
ＳａｃＩ処理した発現プラスミドｐＲＡ７にこの断片を
連結し開始コドンがＡＴＧに変換したｔａｃプロモター
発現プラスミドｐＲＡ７Ａを作成した〔図８〕。これら
の変異発現プラスミド　を大腸菌ＪＭ１０５に形質転換
し、それぞれ形質転換体ＥＲ４Ａ株（ＪＭ１０５　／ｐ
ＲＡ４Ａ）、ＥＲ７Ａ株（ＪＭ１０５／ｐＲＡ７Ａ，Ｉ
ＦＯ　　１５１３１，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２７２）を
得た。これらの形質転換体を実施例５に示した方法で　
ＩＰＴＧ添加後９時間培養しアシルアミノ酸ラセマーゼ
活性を公知の方法で測定した。その酵素生産性はＥＲ４
Ａ株で７４０Ｕ／リットル（培地）、ＥＲ７Ａ株で１９
８Ｕ／リットル（培地）で、ＤＮＡ供与体であるアミコ
ラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１−６０株のそれぞ
れ約３７倍、約１０倍であった。

【００２０】実施例８ アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子のＴ７発現システムで
の発現 Ｔ７発現プラスミドｐＥＴ−３ｃ［ジーン（Ｇｅｎｅ）
５８，１２５（１９８７）］のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサ
イトにアシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子をサブクローン
化するために部位特異的変異法を用い開始コドンの部位
にＮｄｅＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ）、終止コドン近傍に
Ｂｇｌ　ＩＩサイト（ＡＧＡＴＣＴ）を作成した。 Ａ）ＮｄｅＩサイトの作成 発現プラスミドｐＲＡ４を大腸菌ＭＶ１１８４株に形質
転換し得られた形質転換体からＶｉｅｉｒａらの方法を
用い一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮＡとＮｄ
ｅＩサイト（ＣＡＴＡＴＧ）を持つ合成オリゴヌクレオ
チド　　５’−ＧＡＧＴＴＴ　ＣＡＴＡＴＧＣＴＣＣＴ
ＣＣ−３’を用い部位特異的変異法［インビトロミュー
タジェネシスシステム（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ，　ｖｅｒｓｉｏｎ　　２
．０）アマシャム社製］により開始コドンの部位にＮｄ
ｅＩサイトを持つプラスミドｐＲＡ４Ｎを作成した〔図
９〕。 Ｂ）Ｂｇｌ　ＩＩサイトの作成 プラスミドｐＲＡ４ＮからＮｄｅＩサイトを持つＳｍａ
Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片を分離し、予めＳｍａＩ及び
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで処理したプラスミドｐＵＣ１１９に
連結した。この組換えプラスミドを大腸菌ＭＶ１１８４
株に形質転換し得られた形質転換体からＶｉｅｉｒａら
の方法により一本鎖ＤＮＡを調製した。この一本鎖ＤＮ
ＡとＢｇｌ　ＩＩサイト（ＡＧＡＴＣＴ）を持つ合成オ
リゴヌクレオチド　　５’−ＧＡＧＧＴＡＧＡＴ　ＣＴ
ＧＧＴＣＧＧＡＴ−３’を用い、Ａ）と同様に部位特異
的変異法により終止コドン近傍にＢｇｌ　ＩＩサイトを
持つプラスミドｐＲＡ４ＮＢを作成した〔図１０〕。 Ｃ）発現 プラスミドｐＵＮＢから本酵素遺伝子を含むＮｄｅＩ／
Ｂｇｌ　ＩＩ断片を分離回収しプラスミドｐＥＴ−３ｃ
のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩサイトに連結しアシルアミノ酸
ラセマーゼ発現プラスミドｐＥＴ−３ｃＮを作成した〔
図１１〕。このプラスミドを大腸菌ＭＭ２９４（ＤＥ３
）に形質転換し形質転換体ＭＲ−１株（ＩＦＯ　　１５
１３２，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３２７３）を得た。この形
質転換体を実施例７で示した方法で培養しアシルアミノ
酸ラセマーゼ活性を公知の方法で測定したところ酵素生
産性は１７９５Ｕ／リットル（培地）であり、ＤＮＡ供
与体であるアミコラトプシス・スピシーズ　　ＴＳ−１
−６０株の約９０倍であった。 Ｄ）形質転換体ＭＲ−１株のタンク培養（２０リットル
）ＭＲ−１株の菌体一白金耳を１リットル容三角フラス
コに分注滅菌した４００ｍｌのアンピシリン（５０μｇ
／ｍｌ）を含むＬＢ培地に接種し３７℃，２０時間振盪
培養（２５０ｒｐｍ）した。この培養液１リットルを２
０リットルのポリペプトン（１．５％）を含むＭ９培地
［Ｍａｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．，らモレキュラークローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ），　Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，（１９８２）］に接種し通気（１００ｖｖｍ）撹
拌（４５０ｒｐｍ）しながら２８℃で３４時間培養した
。培養開始後８時間でＩＰＴＧを最終濃度０．０１ｍＭ
になるように添加し、グルコース（８％）ポリペプトン
（２％）混液を連続的（１５０ｍｌ／時間）に添加しな
がら培養した。培養終了後培養液を遠心分離（１０００
ｒｐｍ，２０分間）し１３２０ｇの湿菌体を得た。アシ
ルアミノ酸ラセマーゼ活性を公知の方法で測定したとこ
ろ酵素生産性は２２３００Ｕ／リットル（培地）であり
ＤＮＡ供与体であるアミコラトプシス・スピシーズ　　
ＴＳ−１−６０株の約１１００倍であった。

【００２１】実施例９ 大腸菌形質転換体からの酵素精製 形質転換体ＥＲ４Ａ株の菌体一白菌耳を２００ｍｌ容三
角フラスコに分注滅菌したアンピシリン（５０μｇ／ｍ
ｌ）を含む４０ｍｌのＬＢ培地に接種し３７℃１６時間
振盪培養（３００ｒｐｍ）した。この培養液４ｍｌを１
リットル容三角フラスコに分注滅菌した４００ｍｌのＬ
Ｂ培地に移植し３０℃，３０時間振盪培養（２５０ｒｐ
ｍ）した。ＩＰＴＧ（０．１Ｍ）は培養開始から約６時
間後に４ｍｌ添加した（終濃度１ｍＭ）。培養液８リッ
トルから遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０分間）によ
り湿菌体１４１ｇを得た。この菌体をトリス塩酸バッフ
ァー（５０ｍＭ　　ｐＨ７．５）に懸濁して５００ｍｌ
とし超音波処理（５分間×３）を行い細胞を破砕した。 細胞破砕液に同バッファーと硫酸マグネシウム（最終濃
度１０ｍＭ）を加え１リットルとし加熱処理（６０℃　
　３０分間）行い、遠心分離（１００００ｒｐｍ，２０
分間）して上清液９４０ｍＭを得た。この上清液に硫酸
アンモニウム１０７．２ｇ（２０％飽和）を加え、０℃
で２時間放置後遠心分離（１００００ｒｐｍ，３０分間
）し得られた上清液を予め２０％飽和硫　酸アンモニウ
ムを含むトリス塩酸バッファーで平衡化したブチルトヨ
パールカラム（ＢＵＴＹＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　６
５０Ｍ，東ソー，４．５×３０ｃｍ）に添加した。２リ
ットルの２０％飽和硫酸アンモニウムを含む同バッファ
ーで洗浄後２リットルの同バッファーで飽和硫酸アンモ
ニウム濃度を２０％から０％まで変化させ溶出し２０ｍ
ｌごとに分画した。アシルアミノ酸ラセマーゼ活性は３
４から５０番目の画分に認められた。活性画分を集め同
バッファーで透析し予め同バッファーで平衡化したＤＥ
ＡＥトヨパールカラム（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
　　６５０Ｍ，東ソー，４．１×１６ｃｍ）に添加し１
リットルの同バッファーで洗浄した。１リットルの同バ
ッファーで塩化ナトリウムの濃度を０から０．５Ｍまで
変化させ溶出し１０ｍｌ　ごとに分画した。アシルアミ
ノ酸ラセマーゼ活性は４８から５３番目の画分に認めら
れた。以上の操作によりＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動でほぼ単一なバンドを示すアシルアミノ酸ラセマ
ーゼ１５７０Ｕを得た。形質転換体（ＥＲ４　Ａ株）か
らの本酵素の精製結果を以下に示す。

【表２】 ─────────────────────────
───────　　　　ステップ　　　　　　　総蛋白
質　　総活性　　　　　比活性　　　　　純度　　　収
率　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ｍｇ
）　　　　（ｕｎｉｔｓ）　　（ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）　
　（ｆｏｌｄ）　　（％）─────────────
───────────────────　　細胞破砕
液　　　　　　　　１８０００　　　　　３１８０　　
　　　　　０．１７　　　　　　　１．０　　　　１０
０　　加熱処理　　　　　　　　　　　７１２３　　　
　　３２５６　　　　　　　０．４６　　　　　　　２
．７　　　　１００　　ＢＵＴＹＬ−Ｔｏｙｏｐｅａｒ
ｌ　　　　　２４９　　　　　１６２０　　　　　　　
６．５０　　　　　　３８．２　　　　　５１　　ＤＥ
ＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　　　　　　１９８　　　　
　１５７３　　　　　　　７．９４　　　　　　４６．
７　　　　　４９─────────────────
───────────────

【００２２】実施例１
０ 大腸菌形質転換体から得られた酵素の性質実施例９で示
した方法で調製した酵素の性質を調べた。 酵素活性の測定は以下に示す方法のいずれかで行った。 測定方Ａ：適当量の酵素を含む反応液（２５ｍＭ　　Ｎ
−アセチル−Ｄ−メチオニン、２ｍＭ　　塩化コバルト
、Ｌ−アミノアシラーゼ　　４Ｕ／ｍｌ，５０ｍＭ　　
トリス塩酸バッファー（ｐＨ７．５））５００μｌを、
３０℃、５分間反応させ、１００μｌの塩酸（１Ｎ）を
加え反応を停止させた。水酸化ナトリウム（１Ｎ）で中
和後、生成したＬ−メチオニンを高速液体クロマトグラ
フィーで定量した。酵素の単位（Ｕ）はＬ−メチオニン
が１分間に１μｍｏｌ生成される量を１単位（Ｕ）とし
た。 測定法Ｂ：Ｌ−アシラーゼを含まない測定法Ａの反応液
を、３０℃、５分間保温し反応させ、０．５ｍｌの塩酸
（２Ｎ）を加え反応を停止させた。加水分解（１２０℃
，６０分間）後、水酸化ナトリウム（１Ｎ）で中和し、
生成したＬ−メチオニンを高速液体クロマトグラフィで
定量した。 Ａ）基質特異性 光学活性Ｎ−アシルアミノ酸には作用するが、対応する
光学活性なアミノ酸には作用しなかった。活性は測定法
Ｂに準じ測定し、各基質に対する活性はＮ−アセチル−
Ｄ−メチオニンに対する活性を１００とした相対値で〔
表３〕に示した。

【表３】 　　　　　　　　　　　　　　基　　　　質　　　　特
　　　　異　　　　性───────────────
───────────────　　　基　　質　　　
　　　相対活性（％）　　　　　基　　質　　　　　　
　相対活性（％）─────────────────
─────────────　　Ａｃ−Ｄ−Ｍｅｔ　　
　　　　　　１００　　　　　　　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｍ
ｅｔ　　　　　　　　　　１３８　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｆｒ−Ｌ
−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　１６　　Ｐｒ−Ｄ−Ｍ
ｅｔ　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　　Ｐｒ
−Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　１０２　　Ｂｕ−Ｄ
−Ｍｅｔ　　　　　　　　　５７　　　　　　　　　　
Ｂｕ−Ｌ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　　　５６　　Ａｃ
−Ｄ−Ｍｅｔ　　　　　　　　　１１　　　　　　　　
　　Ａｃ−Ｌ−Ａｌａ　　　　　　　　　　　　７　　
Ａｃ−Ｄ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　１８　　　　　　
　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　２２
　　Ａｃ−Ｄ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　５０　　　　
　　　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　
１７　　Ａｃ−Ｄ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　１３　　
　　　　　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　
　　１２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｔｙｒ　　　　　　　
　　　　４６　　Ａｃ−Ｄ−Ｖａｌ　　　　　　　　　
３３　　　　　　　　　　Ａｃ−Ｌ−Ｖａｌ　　　　　
　　　　　　２７　　ＣＡ−Ｄ−Ｖａｌ　　　　　　　
　　９３　　　　　　　　　　ＣＡ−Ｌ−Ｖａｌ　　　
　　　　　　　　６９　　Ｄ−Ｍｅｔ　　　　　　　　
　　　　　０　　　　　　　　　　Ｌ−Ｍｅｔ　　　　
　　　　　　　　　　　０　　Ｄ−Ａｌａ　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　　　　　Ｌ−Ａｌａ　　
　　　　　　　　　　　　　０　　Ｄ−Ｌｅｕ　　　　
　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　Ｌ−Ｌｅｕ
　　　　　　　　　　　　　　　０　　Ｄ−Ｐｈｅ　　
　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　Ｌ−Ｐ
ｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　０　Ｄ−Ｔｙｒ　
　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　Ｌ−
Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　０　　Ｄ−Ｔｒ
ｐ　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　
Ｌ−Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　０　　Ｄ−
Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　Ｌ−Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　０──
─────────────────────────
───Ｆｒ：ホルミル　　　　Ａｃ：アセチル　　　　
Ｐｒｏ：プロピオニル　　　　Ｂｕ：ブチリルＣＡ：ク
ロロアセチルＢ）至適ｐＨ 至適ｐＨは８．０付近であった。測定法Ａにおいてトリ
ス塩酸バッファー（ｐＨ７．５）の代わりにビストリス
塩酸バッファー（ｐＨ６．０−７．０）トリス塩酸バッ
ファー（７．５−９．０）を用いた。生成したＬ−メチ
オニンの量比から相対活性を求め、その結果を〔図１２
〕に示した。 Ｃ）ｐＨ安定性 本酵素はｐＨ６．０からｐＨ１０．０の範囲で安定であ
った。ビストリス塩酸バッファー（５０ｍＭ，ｐＨ６．
０−７．０）およびトリス塩酸バッファー（５０ｍＭ，
ｐＨ７．５−１０．０）に２０分の１量の酵素液を加え
３０℃、１時間保温後、測定法Ａに従い酵素の活性を測
定した。生成したＬ−メチオニンの量比から相対活性を
求め、その結果を〔図１３〕に示した。 Ｄ）至適温度 反応至適温度は４５℃から５０℃であった。酵素の活性
は測定法Ａに従い行った。生成したＬ−メチオニンの量
比から相対活性を求め、その結果を〔図１４〕に示した
。 Ｅ）熱安定性 本酵素は６０℃，３０分間処理（１０ｍＭ　　硫酸マグ
ネシウム添加）で９１％の残存活性を示した。熱処理は
各温度で３０分間行い、活性の測定は測定Ａに従い行っ
た。 その結果を〔図１５〕に示す。 Ｆ）金属イオンの影響 本酵素はマンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン、
ニッケルイオン、亜鉛イオン、マグネシウムイオンによ
り活性化された。一方、ナトリウムイオン、アルミニウ
ムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオンなどでは
この条件下では活性化は認められなかった。活性の測定
は測定法Ｂに準じて行い、生成したＬ−メチオニンの量
比から相対活性を求め、その結果を〔表４〕に示した。

【表４】 Ｇ）阻害剤の影響 ｐ−クロロメルクリ安息香酸（１ｍＭ，ＰＣＭＢ）、５
，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（５ｍＭ，
ＤＴＮＢ）は本酵素活性を阻害したが、Ｎ−エチレンマ
レイミド（５ｍＭ，ＮＥＭ）は阻害しなかった。活性の
測定は測定法Ｂに準じて行い、生成したＬ−メチオニン
の量比から相対活性を求め、その結果を〔表５〕に示し
た。

【表５】 　　阻害剤の酵素活性に及ぼす影響 ─────────────────────────
────────　　　　　　　　阻　　　　害　　　
　剤　　　　　　　　　　　　　　　　　　　濃度（ｍ
Ｍ）　　　相対活性（％）─────────────
────────────────────　な　　し
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１００　ｐ−クロロメルクリ安息香酸　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　　　
　　　　　　　　　　２　５，５’−ジチオビス（２−
ニトロ安息香酸）　　　　　　１　　　　　　　　　　
　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
　　　　　　　　　　　　　３　エチレンジアミン四酢
酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　１　１
，５−ジフェニルカルバジド　　　　　　　　　　　　
　　　　　１　　　　　　　　　　　　８７　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　
　　　５７　硫酸ヒドラジン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　
　　　　　　９９　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　５　　　　　　　　　　　　８７　塩酸セミカル
バジド　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１　　　　　　　　　　　　９８　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　
　　９４　塩酸ヒドロキシルアミン　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　
　９７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　
　　　　　　　　　　　８０　Ｎ−エチルマレイミド　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　　９５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　８５　Ｌ
−ペニシラミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　９４
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　
　　　　　　　　７１　フェニルメタンスルホニルフル
オリド　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　
　８６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５　
　　　　　　　　　　　３１　Ｎ−α−ｐ−トシル−Ｌ
−リジンクロロメチル　　　１　　　　　　　　　　　
　９９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ケトン　　　５　　　　
　　　　　　　　７６───────────────
──────────────────Ｈ）Ｎ−アセチ
ルメチオニンのラセミ化Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン
またはＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン１００ｍＭを基質
として本酵素を３０℃で作用させた。測定法Ｂに従い塩
酸加水分解後、メチオニンを分割定量しラセミ化の状態
を調べた。その結果を〔図１６〕，〔図１７〕に示した
。両基質とも約３時間でラセミ化した。

【００２３】実施例１１ 大腸菌形質転換体から得られた酵素のＮ末端アミノ酸配
列 実施例９で示した方法で得られた酵素をさらに、イナー
トシル３００Ｃ８カラム（４．６×１００ｍｍ，ガスク
ロ工業（株））を用いた逆相クロマトグラフィー（移動
相：０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル
／水，溶出条件：アセトニトリル濃度を２０％から８０
％まで直線的に変化させた）により精製した。この精製
酵素タンパク質　　２００ｐｍｏｌｅを気相プロテイン
シークエンサー（モデル４７０Ａ，アプライド　　バイ
オシステム社）を用いて分析した。大腸菌形質転換体か
ら得られた本酵素のＮ末端アミノ酸配列は放線菌から得
られた酵素のそれと同一であった。以下にＮ末端アミノ
酸配列を示す。 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ
−Ａｒｇ

【００２４】

【発明の効果】本発明によると、光学活性アミノ酸の製
造に利用できる有用な酵素であるアシルアミノ酸ラセマ
ーゼを収率よく工業的に有利に製造できる。

【００２５】配列番号：１ 配列の種類：ＤＮＡ 配列の名称：アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子（ａｃｙ
ｌａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒａｃｅｍａｓｅ）配列の長
さ：１４００ 他の情報 遺伝子産物名：アシルアミノ酸ラセマーゼ（ａｃｙｌａ
ｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｒａｃｅｍａｓｅ） 鎖の数：環状 トポロジー：直鎖状 酵素委員会番号：なし 直接の採取源 属名：アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ
）種名：スピシーズ（ｓｐ．） 株名：ＴＳ−１−６０ 寄託番号：ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３０９２配列： ＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧ　ＧＧＴＧＡＣＣＧＧＣ　ＴＴＣ
ＧＡＣＣＧＡＧ　ＣＣＧＧＣＴＴＴＴＡ　ＣＧＴＧＡＴ
ＣＴＣＣ　ＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣ　　　６０Ａ　ＧＴＧ
　ＡＡＡ　ＣＴＣ　ＡＧＣ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ　
ＣＴＧ　ＣＧＣ　ＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＡＴＧ　Ｃ
ＣＧ　ＣＴＣ　ＧＴＣ　　１０９　　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　
Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａ
ｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｌ　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　
５　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１５ＧＣＣ　ＣＣＧ　Ｔ
ＴＣ　ＣＧＧ　ＡＣＴ　ＴＣＧ　ＴＴＣ　ＧＧＣ　ＡＣ
Ｃ　ＣＡＧ　ＴＣＧ　ＧＴＣ　ＣＧＣ　ＧＡＧ　ＣＴＣ
　ＴＴＧ　　　　１５７Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｒ
ｇ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ
　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
　　　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３０ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＧＣ　ＧＣＧ　ＧＴＣ　Ａ
ＣＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣ　ＧＧＣ　ＧＡＧ　ＧＧＣ　ＴＧ
Ｇ　ＧＧＣ　ＧＡＡ　ＴＧＣ　ＧＴＧ　　　　２０５Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　　　　　　　　　３５　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４５ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　
ＧＧＴ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣ　ＴＣＧ　ＴＣＧ　Ｇ
ＡＧ　ＴＡＣ　ＡＡＣ　ＧＡＣ　ＧＧＣ　ＧＣＧ　ＧＡ
Ａ　　　　２５３Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙ
ｒ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　　　
　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６０ＣＡＣ　ＧＴＧ
　ＣＴＧ　ＣＧＧ　ＣＡＣ　ＴＡＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　
ＣＣＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＧＣＧ　Ｇ
ＡＡ　ＧＡＣ　　　　３０１Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　
Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｐ　６５　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０　
　　　　　　　　　　　　　　　　　７５　　　　　　
　　　　　　　　　　　　８０ＡＴＣ　ＡＣＣ　ＧＣＧ
　ＧＣＧ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＡＣＧ　ＣＣＧ　ＣＴＧ　
ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＴＴＣ　ＡＡＧ　ＧＧＣ　Ｃ
ＡＣ　　　　３４９Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａ
ｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　　　
　　　　　　　　　　　　　　８５　　　　　　　　　
　　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　９５ＣＧＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＧＧＣ
　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　ＧＴＧ　
ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＧＣＣ　ＧＡＡ　ＣＴＣ　　　　３９
７Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　
　１００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　
　　　　　　　　　　　　　　　　１１０ＣＧＣ　ＧＣ
Ｇ　ＣＡＣ　ＧＡＧ　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＴＴＣ　ＧＣＣ
　ＧＣＣ　ＧＡＡ　ＣＴＣ　ＧＧＡ　ＴＣＧ　ＧＴＧ　
ＣＧＣ　ＧＡＴ　　　　４４５Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｈｉｓ
　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａ
ｓｐ　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　　　
１２５ＴＣＴ　ＧＴＧ　ＣＣＧ　ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＧＴ
Ｔ　ＴＣＧ　ＧＴＣ　ＧＧＧ　ＡＴＣ　ＡＴＧ　ＧＡＣ
　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　　　　４９３Ｓｅ
ｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ
　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　
Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　　　　１３０　　　　　　　
　　　　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　
　　　　　１４０ＣＴＧ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　Ｇ
ＴＧ　ＧＧＣ　ＧＧＡ　ＴＡＣ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＧＡ
Ｇ　ＧＧＴ　ＴＡＣ　ＧＴＧ　ＣＧＧ　ＡＴＣ　　　　
５４１Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ１４５　　　　　　
　　　　　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　
　　　　　　１５５　　　　　　　　　　　　　　　　
　１６０ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＴＣ　ＧＡＡ　Ｃ
ＣＣ　ＧＧＣ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＡＧ　ＣＣ
Ｇ　ＧＴＧ　ＣＧＣ　ＧＣＧ　ＧＴＣ　　　　５８９Ｌ
ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　
　　　１６５　　　　　　　　　　　　　　　　　１７
０　　　　　　　　　　　　　　　　　１７５ＣＧＣ　
ＧＡＧ　ＣＧＣ　ＴＴＣ　ＧＧＣ　ＧＡＣ　ＧＡＣ　Ｇ
ＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＧＣ
Ｇ　ＡＡＣ　ＡＣＣ　　　　６３７Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａ
ｒｇ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｓｎ
　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　１８０　　　　　　
　　　　　　　　　　　１８５　　　　　　　　　　　
　　　　　　１９０ＧＣＣ　ＴＡＣ　ＡＣＣ　ＣＴＣ　
ＧＧＣ　ＧＡＣ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ
ＣＣ　ＣＧＧ　ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＣＣＧ　ＴＴＣ　　　
　６８５Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒ
ｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　　　　　　　　
１９５　　　　　　　　　　　　　　　　　２００　　
　　　　　　　　　　　　　　　２０５ＧＧＣ　ＣＴＧ
　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＴＣ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧ　
ＣＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＣ　ＧＴＧ　Ｃ
ＴＣ　ＧＧＣ　　　　７３３Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　　　　２１０　　　　　　　　　　　　　　　　　
２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０ＣＡ
Ｃ　ＧＣＣ　ＧＡＡ　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＣＧＣ　ＣＧＧ
　ＡＴＣ　ＣＡＧ　ＡＣＡ　ＣＣＧ　ＡＴＣ　ＴＧＣ　
ＣＴＣ　ＧＡＣ　ＧＡＧ　　　　７８１Ｈｉｓ　Ａｌａ
　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　
Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａ
ｓｐ　Ｇｌｕ２２５　　　　　　　　　　　　　　　　
　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５　
　　　　　　　　　　　　　　　　２４０ＴＣＧ　ＡＴ
Ｃ　ＧＴＧ　ＴＣＧ　ＧＣＧ　ＣＧＣ　ＧＣＧ　ＧＣＧ
　ＧＣＧ　ＧＡＣ　ＧＣＣ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　
ＧＧＣ　ＧＣＧ　　　　８２９Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ
　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａ
ｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　２４５　　　　
　　　　　　　　　　　　　２５０　　　　　　　　　
　　　　　　　　２５５ＧＴＣ　ＣＡＡ　ＡＴＣ　ＧＴ
Ｇ　ＡＡＣ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣ　ＣＧＣ
　ＧＴＣ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＧＡＡ　
　　　８７７Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ
　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　　　　　
　　　　　　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　
　２６５　　　　　　　　　　　　　　　　　２７０Ｇ
ＣＧ　ＣＧＧ　ＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＧＡＣ　ＧＴ
Ｇ　ＴＧＣ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＣＡＣ　ＧＧＧ　ＡＴＣ
　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　　　　９２５Ａｌａ　Ａｒ
ｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ
　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　
Ｖａｌ　Ｔｒｐ　　　　　　　　２７５　　　　　　　
　　　　　　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　
　　　　　２８５ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　Ａ
ＴＣ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　ＧＧＣ　ＣＴＣ　ＧＧＣ　ＣＧ
Ｇ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＡＡＣ　ＧＴＣ　ＧＣＧ　　　　
９７３Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ
　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　　　　２９０　　
　　　　　　　　　　　　　　　２９５　　　　　　　
　　　　　　　　　　３００　ＣＴＧ　ＧＣＣ　ＴＣＧ
　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＡＣＣ　ＣＴＧ　
ＣＣＣ　ＧＧＣ　ＧＡＣ　ＡＣＣ　ＴＣＧ　ＧＣＧ　Ｔ
ＣＧ　　　１０２１Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　
Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇ
ｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ３０５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０　　　　　
　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　　　　　　
　　　　　　　３２０ＧＡＣ　ＣＧＧ　ＴＴＣ　ＴＡＣ
　ＡＡＡ　ＡＣＣ　ＧＡＣ　ＡＴＣ　ＡＣＣ　ＧＡＧ　
ＣＣＧ　ＴＴＣ　ＧＴＧ　ＣＴＣ　ＴＣＣ　ＧＧＣ　　
　１０６９Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　
Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐ
ｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　　　　　　　
　　　　　　　　　３２５　　　　　　　　　　　　　
　　　　３３０　　　　　　　　　　　　　　　　　３
３５ＧＧＣ　ＣＡＣ　ＣＴＣ　ＣＣＧ　ＧＴＧ　ＣＣＧ
　ＡＣＣ　ＧＧＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣ　ＣＴＣ　ＧＧＣ　
ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＡＴＴ　　　１１１７Ｇｌｙ
　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　
Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　　　　　　　　　　　　３４０
　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　
　　　　　　　　　　　　３５０ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴ
Ｇ　ＣＴＧ　ＧＡＣ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣ　ＡＣＧ
　ＧＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＴＧＧ　ＡＴＣ　ＧＧＴ　
ＴＣＧ　　　１１６５Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　
Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　　
　　　　　　３５５　　　　　　　　　　　　　　　　
　３６０　　　　　　　　　　　　　　　　　３６５Ｔ
ＡＧＣＣＣＧＣＴＡ　ＣＧＡＡＴＴＣＣＧＧ　ＡＧＧＴ
ＡＧＡＴＴＴ　ＧＧＴＣＧＧＡＴＣＧ　ＧＡＣＣＡＧＣ
ＣＧＧ　ＴＣＣＧＣＡＣＧＡＧ　１２２５ＧＣＣＧＧＡ
ＴＣＴＡ　ＣＣＴＴＣＧＧＧＧＧ　ＧＴＧＣＴＧＡＣＡ
Ｃ　ＣＧＧＴＧＣＣＧＡＧ　ＣＡＡＡＣＣＧＣＡＣ　Ａ
ＣＧＡＧＴＣＴＧＧ　１２８５ＧＡＣＧＣＧＴＣＣＴ　
ＣＧＡＡＧＣＴＣＴＣ　ＧＧＧＧＡＣＧＴＧＣ　ＴＣＣ
ＴＣＧＡＧＣＣ　ＧＧＴＣＧＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＧ
ＡＣＡＣ　１３４５ＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧ　ＣＴＣＧＧ
ＣＧＧＧＧ　ＴＧＧＴＧＡＴＴＣＡ　ＣＧＡＣＣＣＧＣ
ＡＣ　ＧＡＣＧＡＣＧＣＧＧ　ＡＡＴＴＣ　　　　　　
１４００

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列（その
１）

【図２】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列（その
２）

【図３】実施例３で決定されたＤＮＡの塩基配列（その
３）

【図４】実施例１で得られたＤＮＡの制限酵素切断地図

【図５】プラスミドｐＲＡ４の調製法

【図６】プラスミドｐＲＡ７の調製法

【図７】プラスミドｐＲＡ４Ａの調製法

【図８】プラス
ミドｐＲＡ７Ａの調製法

【図９】プラスミドｐＲＡ４Ｎ
の調製法

【図１０】プラスミドｐＲＡ４ＮＢの調製法

【
図１１】プラスミドｐＥＴ−３ｃＮの調製法

【図１２】
実施例１０Ｂで得られた酵素活性とｐＨの関係

【図１３】実施例１０Ｃで得られた酵素安定性とｐＨの
関係

【図１４】実施例１０Ｄで得られた酵素活性と反応温度
との関係

【図１５】実施例１０Ｅで得られた酵素安定性と温度の
関係

【図１６】実施例１０Ｈで得られたアセチル−Ｄ−メチ
オニンのラセミ化

【図１７】実施例１０Ｈで得られたアセチル−Ｌ−メチ
オニンのラセミ化

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺
   伝子を含むＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】遺伝子が微生物由来である請求項（１）の
   ＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】微生物がアクチノミセス（ａｃｔｉｎｏｍ
   ｙｃｅｓ）である請求項（２）のＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】アシルアミノ酸ラセマーゼをコードする遺
   伝子の塩基配列が配列表の配列番号１で示すものである
   請求項（１）のＤＮＡ断片。
5. 【請求項５】請求項（１）ないし（４）のＤＮＡ断片を
   組み込んだベクター。
6. 【請求項６】請求項（５）のベクターで形質転換した微
   生物。
7. 【請求項７】請求項（６）の微生物を培養し、培養液中
   にアシルアミノ酸ラセマーゼを培養物中に蓄積させ、そ
   れを採取することを特徴とするアシルアミノ酸ラセマー
   ゼの製造法。