JP2001046088A - N−アセチルアミノ酸ラセマーゼ、そのコーディング遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及び微生物、該遺伝子のためのプライマー及びゾンデ及び該ラセマーゼの使用 - Google Patents
N−アセチルアミノ酸ラセマーゼ、そのコーディング遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及び微生物、該遺伝子のためのプライマー及びゾンデ及び該ラセマーゼの使用Info
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Abstract
チルアミノ酸ラセマーゼ。 【解決手段】 N−アセチル−アミノ酸ラセマーゼ及び
そのコーディング遺伝子を使用する。 【効果】 TS−1−60からのN−アセチルアミノ酸
ラセマーゼに比して、重金属イオンの活性依存性が少な
い別のN−アセチルアミノ酸ラセマーゼが得られる。
Description
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダ(Amy
colatopsis orientalis sub
specieslurida)からのN−アセチルアミ
ノ酸ラセマーゼ(AAR)並びにこれをコーディングす
る遺伝子及び該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及
び微生物に関するものである。
た場合、アシラーゼとの複合作用において100%まで
の光学的に純粋なアミノ酸を相応する保護されたラセミ
体のN−アセチルアミノ酸から取得することができる。
光沢的に純粋なアミノ酸は、腸管外摂取並びにキラル生
物活性作用物質の製造に使用されている。
eptomyces atratus)Y−53(トク
ヤマ他、Appl. Microbiol. Biot
echnol.1994、40、835〜840)及び
アミコラトプシスsp.TS−1−60(トクヤマ他、
Appl. Microbiol. Biotechn
ol. 1995a、42、853〜859)から、N
−アセチルアミノ酸ラセマーゼ(AAR)は、既に公知
である。
らのAARは、その活性に関して強力なコバルトイオン
依存性及びマンガンイオン依存性を有している。合成液
への前記の重金属イオンの添加は、大工業規模では環境
保護の観点から見て不利である。
は、その上更に、TS−1−60からのAARに比し
て、重金属イオンの少ない活性依存性を有する別のAA
Rを提供することであった。
記載のAARによって解決される。請求項2は、前記酵
素をコーディングする遺伝子を保護するものである。請
求項3から5は、前記遺伝子を有するプラスミド、ベク
ター及び微生物に関するものである。請求項6は、前記
遺伝子のプライマーに関するものである。請求項7は、
AAR−遺伝子を突き止めるための有利な遺伝子ゾンデ
を保護するものである。請求項8及び9は、本発明によ
るAARの有利な用途に関するものである。
スペーシーズ ルリダからのN−アセチルアミノ酸ラセ
マーゼ(配列2)を、N−アセチルアミノ酸のラセミ分
割のために準備することによって、専ら、N−アセチル
アミノ酸をラセミ分割し、N−保護されていないアミノ
酸と反応せず、その上更に、TS−1−60からのAA
Rに比して重金属イオンCo2+についての少ない依存性
を有する酵素が得られる。この事実は、酵素の大工業的
な使用にとって、コスト及び環境の観点から極めて遊離
である。ラセマーゼをコーディングする遺伝子のA.s
p.TS−1−60(トクヤマ他、Appl. Mic
robiol. Biotechnol. 1995
b、42、884から889)及びA.オリエンタリス
サブスペーシーズ ルリダのDNAレベルへの同一性
は、86%である。従って、微生物の1つの属において
この種の異なる性質を有する同じ酵素を見出すことは極
めて驚異的なことであった。
明によるラセマーゼをコーディングする遺伝子(配列
1)が必要とされている。この場合、本発明によれば、
遺伝子コードの変質によって予め定められているバンド
幅の範囲内で現れることができる遺伝子も含まれる。
遺伝子を有するプラスミド又はベクターも保護されてい
る。pAAR1−21I、pAAR2−21I及びpA
AR3−21Iが、有利なプラスミド及びベクターと見
なすべきものである(図1、3及び4)。
明による遺伝子を有する全ての微生物が必要とされてい
る。殊に、該微生物は、例えば前記プラスミドを有する
E.coli菌株(DH5αもしくはBL21)であ
る。なかでも、DE3菌株が、これに関して特に有利で
ある。
者に公知の、遺伝子を相応する切断部位によりクローニ
ングするかもしくはこうして生じた構造を形質転換させ
ることができる各プラスミド(ベクター)/ホスト系が
該当する。当業者には、この種の系がよく知られてお
り、プラスミドを種々のホスト系と組み合わせることが
できる可能性についても承知している。T7−発現系に
ついての概観は、Studier他、Methods
Enzymol.1990、185、61〜69に記載
されている。他の適当な発現系は、Novagen、P
romega、New England Biolab
s、Clontech並びにGibcoBRLの各社の
当該の公知のパンフレット中に見出すことができる。
伝子の既に公知のDNA配列の比較によってか又は相応
する微生物のコドン使用へのアミノ酸配列の「翻訳」に
よって行われる(例えばストレプトミセトについて:W
right他、Gene 1992,113,55〜6
5)。またこの場合、いわゆる上科からの蛋白質の一致
しているAS−配列も有用である(Firestine
他、Chemistry & Biology 199
6,3、779〜783)。
ラーゼ上科に属している(Babbitt他、Bioc
hemistry 1996、35、16589〜16
501)。従って、当業者には、有利に、本発明による
目的にとって有利であると思われる配列を引き寄せるこ
とができるプライマーにつながるストラテジーが公知で
ある。殊に、遺伝子断片の、効果的にPCRを伝える増
幅のために、2つのプライマー(AR1)及び(AR
5)を構成させることができる。
もしくは終了配列が、有利なプライマーと見なされる。
適当な切断部位は、上記のパンフレット中に見出され
る。
有する以下の配列: AR_EX1Nde:5'CAA GGA GCA CAT ATG AAA CTC AGC GGT GTG G3' (配列6) AR_Ex2Bgl:5'GAA TTC GTA AGA TCT TAC GAA CCG ATC CAC G3' (配列7) がなかでも特に有利である。
に、本発明による遺伝子の504bpの大きさのフラグ
メントを、PCR−技術を用いて増幅させた。この技術
は、詳細には、Saiki他、Science(198
8)、239、487〜491中で評価されており、従
って、当業者には公知である。その塩基対の順序(配列
3)は、以下のように示される:
のゾンデの一部として用いた。遺伝子フラグメントから
の遺伝子ゾンデの製造は、就中、Sambrook他、
Alaboratory manual、Cold S
pring HarborLaboratory Pr
ess、ニューヨーク(1989)中に記載されてお
り、当業者には周知のことである。この特殊な場合に
は、上記の遺伝子フラグメントを、Roche Dia
gnostics社のDIG−マーカーと一緒に使用し
た。
たアミノ酸又はその誘導体の製造のためのプロセスにお
ける本発明によるラセマーゼの使用である。このため、
ラセミ体のN−アセチルアミノ酸を、アシラーゼ及びA
ARの存在下に、生理学的条件下に反応させる。この場
合、形成されたアミノ酸が、析出によって、反応の平衡
から取り除かれ、かつAARが、残留している光学的に
強化されたN−アセチルアミノ酸から常にラセミ体化合
物を形成することによって、当該のアミノ酸の光学対掌
体にするためのラセミ体化合物が100%変換すること
になる。
器中で行われる(ドイツ連邦共和国特許第199106
91.6号)。
ド化(Southern−Hybridisierun
g)(Sambrook他、A laboratory
manual、Cold Spring Harbo
r LaboratoryPress、ニューヨーク
(1989)及びHopwood他、A.labora
tory manual、The John Inne
s Foundation,Norwich(198
5))により、A.オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダのゲノムDNAから約2.5kbのEcoRI
を検出した。
たが、その際、ゲノムDNAの2.5kbの大きさのE
coRIフラグメントのDNA集団全体を、制限酵素で
事前にEcoRIを加水分解したプラスミドpUC18
(Vieira他、Gene(1982)、19、25
9〜268)中に結紮させた。
換して、E.coli DH5αにした。この後、AA
Rの遺伝子を有するDNAフラグメントの同定を、コロ
ニー−ハイブリッド化(Sambrook他、A la
boratory manual、Cold Spri
ng Harbor Laboratory Pres
s、ニューヨーク(1989)及びHopwood他、
A laboratory manual、The J
ohn Innes Foundation、Norw
ich(1985))を用いて、前記のDIG−マーカ
ー504bp−ゾンデの使用下に行った。
ドを、pAAR1−21I(図1)と呼称した。図2
は、AAR−遺伝子を有する2.5kbのEcoRIフ
ラグメントの制限図を示している。AAR−遺伝子を有
する1,3kb−EcoRIフラグメントを、二本鎖配
列させ、かつ分析した。
全遺伝子の増幅のために、プライマーAR_Ex1Nd
e及びAR_Ex2Bglを使用した。前記プライマー
を用いて、遺伝子の5′末端において、NdeI−制限
切断部位を挿入し、かつAAR−遺伝子の3′末端にお
いて、BglII−切断部位を挿入した。
したプラスミドpUC18中に結紮させ、こうして生じ
た構造pAAR2−21I(図3)を形質転換してE.
coli DH5αにした。
の挿入により、発現ベクター(Novagen社)中へ
の遺伝子のクローニングを可能になった。pAAR3−
21I(図4)と呼称する、A.オリエンタリス サブ
スペーシ−ズ ルリダからのAAR−遺伝子を有する前
記発現ベクターを、発現菌株E.coli BL21
(DE3)(Novagen社;ゲノム中のlac−オ
ペロンの制御下に組み込んでT7−ポリメラーゼを含有
する)に形質転換させた。
て、E.coli BL21(DE3)中のA.オリエ
ンタリス サブスペーシーズ ルリダからのAARを、
Studier他、Methods Enzymol
(1990)、185、61〜89の変更されたプロト
コルにより非相同過剰表現(ueberexprimi
ert)させることができた。過剰発現を、イソプロピ
ルチオガラクトシド(IPTG)によって誘導した。
E.coli発現菌株は、本来、N−アセチルアミノ酸
ラセマーゼ活性を有していなかった。
チル化したアミノ酸、この場合、メチオニンの形成をH
PLC−システムIを用いて検証することによって、A
AR活性を、接続した酵素評価(第1図)により追跡し
た。助酵素としては、シュバイネニーレン(Schwe
inenieren)又はアスペルギルス・オリーゼか
らのL−特異性アシラーゼを用いた。
程で行った: 1.50℃で30分間の加熱沈澱: 2.Q−セファロースによるアニオン交換クロマトグラ
フィー処理(高速流;Pharmacia社) 3.フェニル−セファロースによる疎水性相互作用クロ
マトグラフィー(流線;Pharmacia社) AARの他の特性決定は、HPLC−システムIIを用
いて行った。このシステムは、AARの活性を直接的に
試験することができた。助酵素、アシラーゼを不要にで
きたので、支障となる副活性を回避することができた。
ルリダからのAARの性質として、引き続き晶出させ
た: i)AARは、専ら、N−アセチルアミノ酸をラセミ分
割し、N−アセチル保護されていないアミノ酸は変換し
ない。
は、変性した状態、分子量約40kDaでSDS−PA
GE−分析において現れる(Laemmli、Natu
re(1970)、227,680〜685)。
有する(図5)。
いて2mMのCoCl2×6H2Oを用いて30.6U/
mgであった。従って、この値は、トクヤマ及びハタノ
がそのラセマーゼについて見出した値(Appl. M
icrobiol. Biotechnol.199
6、44,774〜777)よりも約30.8%高い。
6H2Oを用いる活性は、37.5U/mgであった。
活性に比して1mMのCoCl2×6H2Oを用いるA.
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのAA
Rの活性の増大は、1250%であった。評価における
1mMのCoCl2×6H2Oの添加により、A.sp.
TS−1−60からのAARの場合には、僅か496%
増大したにすぎなかった(トクヤマ及びハタノ、App
l. Microbiol. Biotechnol.
1996、44、774〜777)。このことから、
A.オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからの
AARは、評価における同じCoCl2×6H2O濃度で
は、A.sp.TS−1−60からのラセマーゼよりも
152%だけ活性であることが判明した。
l2×4H2O、ZnSO4×7H2O及びMgCl2×6
H2Oを、種々の濃度で標準酵素評価において試験し
た。この場合、Mn及びMgは、10mM、コバルト置
換に比して、なお約40%の活性を示した(図6)。
ス サブスペーシーズ ルリダからのAARの際に20
0mMを上回るN−アセチル−D−メチオニンの基質濃
度の場合に生じている(図7)。TS−1−60につい
ては、阻害は、50mMのN−アセチル−D−メチオニ
ンの際に早くも観察された。
挙げられた明白な利点に比して、工業的規模での使用の
ための活性、重金属イオン依存性及び阻害傾向に関連し
ては十分であることを確認できる。
サブスペーシーズ ルリダは、ドイツ連邦共和国微生
物寄託局(Deutschen Sammlung f
uer Mikroorganismen)にDSM4
3134号の番号で寄託されている。
素並びに組換えにより製造された酵素のことである。
ス オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダの育成
及びゲノムDNAの調製 アクチノミセス菌株 アミコラトプシス オリエンタリ
ス サブスペーシーズルリダ(DSM43134)を、
TSB培地(オキソイド、ベゼル)上で増殖させた。こ
の培養菌を、収穫後に、2回、滅菌した10.3%のシ
ョ糖溶液で洗浄し、かつ、使用するまで−20℃で保存
した。このゲノムDNAの調製を、MEHLING他、
FEMS Microbiol Lett(199
5)、128、119〜126により行った。
場合には、Sambrook他、A laboator
y manual、Cold SpringHarbo
r Laboratory Press、ニューヨーク
(1989)及びHopwood他、A labora
tory manual、The John Inne
s Foundation、Norwich(198
5)により記載されている。全ての酵素及び相応する緩
衝液は、製造者の指示により用いられる。ALFred
DNA−シーケンサー(Pharmacia、フライ
ブルク)を用いる自動配列のために、Cy5標識された
プライマーを使用した。サザンブロット法及びハイブリ
ッド化並びにDNAゾンデのための3′−DIG−ラベ
リング(非放射性検出用)を、ROche Diagn
ostics社の指示により行った。
ki他、Science(1988)、239、487
〜491に依拠して、生物統計学的熱循環器(Biom
etra Thermocycler)(ゲッチンゲ
ン)を用いて実施した。テンプレートとして、A.オリ
エンタリス サブスペーシーズ ルリダからのゲノムD
NAを用いた。PCR−バッチに、熱安定性ポリメラー
ゼTaq(Gibco BRL社)を使用した。使用し
たプライマー対は、第1表中に記載されている。アニー
ル温度Aを、オリゴヌクレオチドのDNA融点(Tm)
を通して求めた。DNA−ポリメラーゼの連鎖反応の時
間Xは、1kb=1分−規則に従っていた。全てのバッ
チを、約50μlの鉱油で被覆した。
した場合に、工程2〜4を、30回繰り返した。
(第1表参照)のリスト、アニール温度並びに増幅の長
さ。
ニーハイブリッド化 サザンによるハイブリッド化のために、A.オリエンタ
リス サブスペーシーズ ルリダのゲノムDNAの調製
物のアリコートを、制限酵素EcoRIでハイブリッド
化させた。次に、生じたDNAフラグメントを、アガロ
ース−ゲルにより分離した。こうして分離されたフラグ
メントを、引き続き、ナイロン膜(Hybond
N+、Amersham社)の上で吸い取らせた。ゾン
デとして、A.オリエンタリス サブスペーシーズ ル
リダからのDIG−標識された(Roche Diag
nostics社)504bp−フラグメントを使用し
た。ハイブリッド化温度は、61℃であった。
ルリダからのシグナルを発する2.5kbの大きさのD
NAフラグメントを、溶離させ、EcoRIで加水分解
したプラスミドpUC18を結紮させ、引き続き、E.
coli DH5α ショットガンクローニングした。
れたE.coli形質転換株を、それぞれ50個のLB
amp100−プレート上に薄く伸ばした。次に、前記プレー
トを用いて、コロニー−リフト及び引き続きコロニー−
ハイブリッド化を実施した。ゾンデとして、再度、A.
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのDI
G−標識された504bpフラグメントを用いた。この
方法を用いて、AAR−遺伝子を有するE.coli形
質転換株を明確に同定できた。このプラスミドをpAA
R1−21Iと命名した。
他、A laboratory manual、Col
d Spring Harbor Laborator
yPress(1989)及びHopwood他、A
loboratory manual、The Joh
n Innes Foundation、Norwic
h(1985)で評価されており、従って、当業者には
公知である。
のA.オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダから
のAAR−酵素の非相同発現 E.coli BL21中のA.オリエンタリス サブ
スペーシーズ ルリダからの組換えAAR−酵素の標準
化された非相同発現を、Studier他、Metho
ds Enzymol(1990)、185、61〜8
9により行った:過剰発現のためのプラスミド(pAA
R3−21I)を用いて形質転換したE.coli B
L21(DE3)−誘導体を、LB−培地(アンピシリ
ン100μg/mlを含有)中で、37℃で一晩(Ue
N)恒温保持した。次に、主要培養菌500ml(4つ
のじゃま板付きフラスコ(Schikane−Kolb
en)中のアンピシリン100μg/mlを含有するL
B−培地)に、一晩経過した培養菌10ml(1:5
0)を植え付けた。T7−ポリメラーゼを、OD60nm=
0.5〜0.9の細胞密度で、100mMのIPTG溶
液(フラスコ中の濃度1mM;IPTG=イソプロピル
チオガラクトシド)5mlで誘導した。37℃で、更に
4〜6時間の恒温保持後に、細胞を収穫した。
の粗製抽出物中には、全蛋白質0.6〜1.2U/mg
のAAR−活性を求めることができた。
ーゼ活性の検出 過剰発現クローンの粗製抽出物もしくは精製された酵素
画分を、N−アセチル−D−メチオニンからのL−メチ
オニンの形成(図1参照)をHPLCにより検出するこ
とができたことにより、酵素試験において使用した:標
準酵素試験(トクヤマ他、Appl Microbio
l Biotechnol(1994)、40、835
〜840;同書、Appl Microbiol Bi
otechnol(1995a)、42 、853〜8
59により一部変更された)は、以下のようにして構成
された: 溶剤:トリス/HCl、pH7.5 50mM N−アセチル−D−メチオニン 25mM 塩化コバルト 2mM アシラーゼI(ASch又はAAsp) 1U 蛋白質 精製した蛋白質又は全蛋白質 2〜150μg 最終容量 200μl この場合、アシラーゼI及びCo2+を、過剰量で挿入す
るので、AAR−反応は、速度の一定した工程である。
恒温保持を、30℃で10〜40分間行った。次に、こ
の反応を、3分間の煮沸によって停止させた。反応生成
物の分析をHPLC(システムI)を用いて行った。
Sch)からのアシラーゼIを酵素試験において使用
し、イオンとしてCo2+(CoCl2×6H2O)を使用
した。あるいはまた選択的に、アスペルギルス・オリー
ゼ(AAsp)からのアシラーゼIを使用した。
価の場合、このシステムを用いて、N−アセチルアミノ
酸を直接エナンチオ選択的に分離でき、かつ検出できた
ので、アシラーゼを省くことができた。
の二価のイオン、例えばMんCl2×4H2Oを、SO4
×7H2O及びMgCl2×6H2Oに対して種々の濃度
で使用した(0.1〜10mM)。
0mMのN−アセチル−D−メチオニンを添加して、基
質阻害を試験した。
Chromasil(R) 展開剤A:酢酸ナトリウム23mM、10%のアセトニ
トリル、pH6.0 展開剤B:100%のアセトニトリル 流速:1ml/分 試料容量:20μl 検出:UV−VIS 225nm 蛍光:340/440nm 誘導:Brueckner他、Journal of
Chromatography A(1994)、66
6、259〜273によるo−フタルジアルデヒド(O
PA)/N−イソブチル−L−システイン(IBLC)
をベース。
mm、(Dr. K.Guenther、Deguss
a−Huels AG、個人貸し出し品) 展開剤A:メタノール700ml、酢酸アンモニウム3
00ml(0.01M)、氷酢酸0.5ml 流速:1ml/分 試料容量:20μl 検出:UV−VIS 225nm 勾配:一定(isokratisch) 9.A.オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダか
らのAARの精製 非相同性過剰発現したAARの精製を、細胞溶解後に3
工程で行った: 1.細胞溶解:トリス/HClを含有する30%の細胞
懸濁液(pH7.5)及び1.5倍のガラス玉(直径
0.3mm)を混合し、ディスインテグレーター(Di
sintegrator)S中で(2回、15分間)分
解した。
クロマトグラフィー処理(高速流;Pharmacia
社)、約25%の展開剤Bでの溶離。
相互作用クロマトグラフィー(流線;Pharmaci
a社)、約40%の展開剤Bでの溶離。
Cl、pH7.5(展開剤A)を用いて、50mMのト
リス/HCl、pH7.5(展開剤B)中の0.5Mの
(NH4)2SOを用いる線状勾配により行った。配列表
−21Iを示す図。
フラグメントの制限図。
示す線図。
果、Mn及びMgが、コバルトに比して、約40%の活
性を有することを示す図。
基質阻害が、A.オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダからのAARの際に200mMを上回るN−アセ
チル−D−メチオニンの基質濃度の場合に生じているこ
とを示す図。
図。
Claims (9)
- 【請求項1】 アミコラトプシス オリエンタリス サ
ブスペーシーズ ルリダからのN−アセチルアミノ酸ラ
セマーゼ。 - 【請求項2】 請求項1に記載のラセマーゼをコーディ
ングする遺伝子。 - 【請求項3】 請求項2に記載の遺伝子を有するプラス
ミド。 - 【請求項4】 請求項2に記載の遺伝子を有するベクタ
ー。 - 【請求項5】 請求項2に記載の遺伝子を有する微生
物。 - 【請求項6】 請求項2に記載の遺伝子のためのプライ
マー。 - 【請求項7】 請求項2に記載の遺伝子のためのゾン
デ。 - 【請求項8】 エナンチオマー蓄積アミノ酸又はその誘
導体の製造のためのプロセスにおける請求項1によるラ
セマーゼの使用。 - 【請求項9】 酵素−膜−反応器中でプロセスを実施す
る、請求項8に記載の使用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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DE19935268.2 | 1999-07-27 | ||
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