JP2001046088A - Ｎ−アセチルアミノ酸ラセマーゼ、そのコーディング遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及び微生物、該遺伝子のためのプライマー及びゾンデ及び該ラセマーゼの使用 - Google Patents
Ｎ−アセチルアミノ酸ラセマーゼ、そのコーディング遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及び微生物、該遺伝子のためのプライマー及びゾンデ及び該ラセマーゼの使用Info
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 重金属イオンの活性依存性が少ないＮ−アセ
チルアミノ酸ラセマーゼ。 【解決手段】 Ｎ−アセチル−アミノ酸ラセマーゼ及び
そのコーディング遺伝子を使用する。 【効果】 ＴＳ−１−６０からのＮ−アセチルアミノ酸
ラセマーゼに比して、重金属イオンの活性依存性が少な
い別のＮ−アセチルアミノ酸ラセマーゼが得られる。
チルアミノ酸ラセマーゼ。 【解決手段】 Ｎ−アセチル−アミノ酸ラセマーゼ及び
そのコーディング遺伝子を使用する。 【効果】 ＴＳ−１−６０からのＮ−アセチルアミノ酸
ラセマーゼに比して、重金属イオンの活性依存性が少な
い別のＮ−アセチルアミノ酸ラセマーゼが得られる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、アミコラトプシス
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダ（Ａｍｙ
ｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ｓｕｂ
ｓｐｅｃｉｅｓｌｕｒｉｄａ）からのＮ−アセチルアミ
ノ酸ラセマーゼ（ＡＡＲ）並びにこれをコーディングす
る遺伝子及び該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及
び微生物に関するものである。
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダ（Ａｍｙ
ｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ ｓｕｂ
ｓｐｅｃｉｅｓｌｕｒｉｄａ）からのＮ−アセチルアミ
ノ酸ラセマーゼ（ＡＡＲ）並びにこれをコーディングす
る遺伝子及び該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及
び微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルアミノ酸ラセマーゼを用い
た場合、アシラーゼとの複合作用において１００％まで
の光学的に純粋なアミノ酸を相応する保護されたラセミ
体のＮ−アセチルアミノ酸から取得することができる。
光沢的に純粋なアミノ酸は、腸管外摂取並びにキラル生
物活性作用物質の製造に使用されている。
た場合、アシラーゼとの複合作用において１００％まで
の光学的に純粋なアミノ酸を相応する保護されたラセミ
体のＮ−アセチルアミノ酸から取得することができる。
光沢的に純粋なアミノ酸は、腸管外摂取並びにキラル生
物活性作用物質の製造に使用されている。
【０００３】ストレプトマイセス アトラトス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｔｒａｔｕｓ）Ｙ−５３（トク
ヤマ他、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１９９４、４０、８３５〜８４０）及び
アミコラトプシスｓｐ．ＴＳ−１−６０（トクヤマ他、
Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ． １９９５ａ、４２、８５３〜８５９）から、Ｎ
−アセチルアミノ酸ラセマーゼ（ＡＡＲ）は、既に公知
である。
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｔｒａｔｕｓ）Ｙ−５３（トク
ヤマ他、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１９９４、４０、８３５〜８４０）及び
アミコラトプシスｓｐ．ＴＳ−１−６０（トクヤマ他、
Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ． １９９５ａ、４２、８５３〜８５９）から、Ｎ
−アセチルアミノ酸ラセマーゼ（ＡＡＲ）は、既に公知
である。
【０００４】アミコラトプシスｓｐ．ＴＳ−１−６０か
らのＡＡＲは、その活性に関して強力なコバルトイオン
依存性及びマンガンイオン依存性を有している。合成液
への前記の重金属イオンの添加は、大工業規模では環境
保護の観点から見て不利である。
らのＡＡＲは、その活性に関して強力なコバルトイオン
依存性及びマンガンイオン依存性を有している。合成液
への前記の重金属イオンの添加は、大工業規模では環境
保護の観点から見て不利である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、その上更に、ＴＳ−１−６０からのＡＡＲに比し
て、重金属イオンの少ない活性依存性を有する別のＡＡ
Ｒを提供することであった。
は、その上更に、ＴＳ−１−６０からのＡＡＲに比し
て、重金属イオンの少ない活性依存性を有する別のＡＡ
Ｒを提供することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記課題は、請求項１に
記載のＡＡＲによって解決される。請求項２は、前記酵
素をコーディングする遺伝子を保護するものである。請
求項３から５は、前記遺伝子を有するプラスミド、ベク
ター及び微生物に関するものである。請求項６は、前記
遺伝子のプライマーに関するものである。請求項７は、
ＡＡＲ−遺伝子を突き止めるための有利な遺伝子ゾンデ
を保護するものである。請求項８及び９は、本発明によ
るＡＡＲの有利な用途に関するものである。
記載のＡＡＲによって解決される。請求項２は、前記酵
素をコーディングする遺伝子を保護するものである。請
求項３から５は、前記遺伝子を有するプラスミド、ベク
ター及び微生物に関するものである。請求項６は、前記
遺伝子のプライマーに関するものである。請求項７は、
ＡＡＲ−遺伝子を突き止めるための有利な遺伝子ゾンデ
を保護するものである。請求項８及び９は、本発明によ
るＡＡＲの有利な用途に関するものである。
【０００７】アミコラトプシス オリエンタリス サブ
スペーシーズ ルリダからのＮ−アセチルアミノ酸ラセ
マーゼ（配列２）を、Ｎ−アセチルアミノ酸のラセミ分
割のために準備することによって、専ら、Ｎ−アセチル
アミノ酸をラセミ分割し、Ｎ−保護されていないアミノ
酸と反応せず、その上更に、ＴＳ−１−６０からのＡＡ
Ｒに比して重金属イオンＣｏ2+についての少ない依存性
を有する酵素が得られる。この事実は、酵素の大工業的
な使用にとって、コスト及び環境の観点から極めて遊離
である。ラセマーゼをコーディングする遺伝子のＡ．ｓ
ｐ．ＴＳ−１−６０（トクヤマ他、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９５
ｂ、４２、８８４から８８９）及びＡ．オリエンタリス
サブスペーシーズ ルリダのＤＮＡレベルへの同一性
は、８６％である。従って、微生物の１つの属において
この種の異なる性質を有する同じ酵素を見出すことは極
めて驚異的なことであった。
スペーシーズ ルリダからのＮ−アセチルアミノ酸ラセ
マーゼ（配列２）を、Ｎ−アセチルアミノ酸のラセミ分
割のために準備することによって、専ら、Ｎ−アセチル
アミノ酸をラセミ分割し、Ｎ−保護されていないアミノ
酸と反応せず、その上更に、ＴＳ−１−６０からのＡＡ
Ｒに比して重金属イオンＣｏ2+についての少ない依存性
を有する酵素が得られる。この事実は、酵素の大工業的
な使用にとって、コスト及び環境の観点から極めて遊離
である。ラセマーゼをコーディングする遺伝子のＡ．ｓ
ｐ．ＴＳ−１−６０（トクヤマ他、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９５
ｂ、４２、８８４から８８９）及びＡ．オリエンタリス
サブスペーシーズ ルリダのＤＮＡレベルへの同一性
は、８６％である。従って、微生物の１つの属において
この種の異なる性質を有する同じ酵素を見出すことは極
めて驚異的なことであった。
【０００８】本発明のもう１つの態様においては、本発
明によるラセマーゼをコーディングする遺伝子（配列
１）が必要とされている。この場合、本発明によれば、
遺伝子コードの変質によって予め定められているバンド
幅の範囲内で現れることができる遺伝子も含まれる。
明によるラセマーゼをコーディングする遺伝子（配列
１）が必要とされている。この場合、本発明によれば、
遺伝子コードの変質によって予め定められているバンド
幅の範囲内で現れることができる遺伝子も含まれる。
【０００９】更に、本発明の範囲内では、本発明による
遺伝子を有するプラスミド又はベクターも保護されてい
る。ｐＡＡＲ１−２１Ｉ、ｐＡＡＲ２−２１Ｉ及びｐＡ
ＡＲ３−２１Ｉが、有利なプラスミド及びベクターと見
なすべきものである（図１、３及び４）。
遺伝子を有するプラスミド又はベクターも保護されてい
る。ｐＡＡＲ１−２１Ｉ、ｐＡＡＲ２−２１Ｉ及びｐＡ
ＡＲ３−２１Ｉが、有利なプラスミド及びベクターと見
なすべきものである（図１、３及び４）。
【００１０】本発明のもう１つの態様においては、本発
明による遺伝子を有する全ての微生物が必要とされてい
る。殊に、該微生物は、例えば前記プラスミドを有する
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（ＤＨ５αもしくはＢＬ２１）であ
る。なかでも、ＤＥ３菌株が、これに関して特に有利で
ある。
明による遺伝子を有する全ての微生物が必要とされてい
る。殊に、該微生物は、例えば前記プラスミドを有する
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株（ＤＨ５αもしくはＢＬ２１）であ
る。なかでも、ＤＥ３菌株が、これに関して特に有利で
ある。
【００１１】原理的に、本発明の実施のためには、当業
者に公知の、遺伝子を相応する切断部位によりクローニ
ングするかもしくはこうして生じた構造を形質転換させ
ることができる各プラスミド（ベクター）／ホスト系が
該当する。当業者には、この種の系がよく知られてお
り、プラスミドを種々のホスト系と組み合わせることが
できる可能性についても承知している。Ｔ７−発現系に
ついての概観は、Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０、１８５、６１〜６９に記載
されている。他の適当な発現系は、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｐ
ｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ並びにＧｉｂｃｏＢＲＬの各社の
当該の公知のパンフレット中に見出すことができる。
者に公知の、遺伝子を相応する切断部位によりクローニ
ングするかもしくはこうして生じた構造を形質転換させ
ることができる各プラスミド（ベクター）／ホスト系が
該当する。当業者には、この種の系がよく知られてお
り、プラスミドを種々のホスト系と組み合わせることが
できる可能性についても承知している。Ｔ７−発現系に
ついての概観は、Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０、１８５、６１〜６９に記載
されている。他の適当な発現系は、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｐ
ｒｏｍｅｇａ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ並びにＧｉｂｃｏＢＲＬの各社の
当該の公知のパンフレット中に見出すことができる。
【００１２】適当なプライマーの誘導は、求められた遺
伝子の既に公知のＤＮＡ配列の比較によってか又は相応
する微生物のコドン使用へのアミノ酸配列の「翻訳」に
よって行われる（例えばストレプトミセトについて：Ｗ
ｒｉｇｈｔ他、Ｇｅｎｅ １９９２，１１３，５５〜６
５）。またこの場合、いわゆる上科からの蛋白質の一致
しているＡＳ−配列も有用である（Ｆｉｒｅｓｔｉｎｅ
他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９
６，３、７７９〜７８３）。
伝子の既に公知のＤＮＡ配列の比較によってか又は相応
する微生物のコドン使用へのアミノ酸配列の「翻訳」に
よって行われる（例えばストレプトミセトについて：Ｗ
ｒｉｇｈｔ他、Ｇｅｎｅ １９９２，１１３，５５〜６
５）。またこの場合、いわゆる上科からの蛋白質の一致
しているＡＳ−配列も有用である（Ｆｉｒｅｓｔｉｎｅ
他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９９
６，３、７７９〜７８３）。
【００１３】この場合、ここで記載したＡＡＲは、エノ
ラーゼ上科に属している（Ｂａｂｂｉｔｔ他、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６、３５、１６５８９〜１６
５０１）。従って、当業者には、有利に、本発明による
目的にとって有利であると思われる配列を引き寄せるこ
とができるプライマーにつながるストラテジーが公知で
ある。殊に、遺伝子断片の、効果的にＰＣＲを伝える増
幅のために、２つのプライマー（ＡＲ1）及び（ＡＲ
５）を構成させることができる。
ラーゼ上科に属している（Ｂａｂｂｉｔｔ他、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９６、３５、１６５８９〜１６
５０１）。従って、当業者には、有利に、本発明による
目的にとって有利であると思われる配列を引き寄せるこ
とができるプライマーにつながるストラテジーが公知で
ある。殊に、遺伝子断片の、効果的にＰＣＲを伝える増
幅のために、２つのプライマー（ＡＲ1）及び（ＡＲ
５）を構成させることができる。
【００１４】 ＡＲ１：5′ATG AAA CTG AGC GGC GTG GAA CTG CGG CGA 3′ （配列４） ＡＲ５：5′CCA GCC GGG TTC GAT CTT GAG CTT GAT GCG 3′ （配列５） 更に、本発明による遺伝子の切断部位を有する開始配列
もしくは終了配列が、有利なプライマーと見なされる。
適当な切断部位は、上記のパンフレット中に見出され
る。
もしくは終了配列が、有利なプライマーと見なされる。
適当な切断部位は、上記のパンフレット中に見出され
る。
【００１５】ＮｄｅＩもしくはＢｇｌＩＩ−切断部位を
有する以下の配列： AR_EX1Nde:5'CAA GGA GCA CAT ATG AAA CTC AGC GGT GTG G3' （配列６） AR_Ex2Bgl:5'GAA TTC GTA AGA TCT TAC GAA CCG ATC CAC G3' （配列７） がなかでも特に有利である。
有する以下の配列： AR_EX1Nde:5'CAA GGA GCA CAT ATG AAA CTC AGC GGT GTG G3' （配列６） AR_Ex2Bgl:5'GAA TTC GTA AGA TCT TAC GAA CCG ATC CAC G3' （配列７） がなかでも特に有利である。
【００１６】２つのプライマーＡＲ１及びＡＲ５ととも
に、本発明による遺伝子の５０４ｂｐの大きさのフラグ
メントを、ＰＣＲ−技術を用いて増幅させた。この技術
は、詳細には、Ｓａｉｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）、２３９、４８７〜４９１中で評価されており、従
って、当業者には公知である。その塩基対の順序（配列
３）は、以下のように示される：
に、本発明による遺伝子の５０４ｂｐの大きさのフラグ
メントを、ＰＣＲ−技術を用いて増幅させた。この技術
は、詳細には、Ｓａｉｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）、２３９、４８７〜４９１中で評価されており、従
って、当業者には公知である。その塩基対の順序（配列
３）は、以下のように示される：
【００１７】
【化１】
【００１８】これを、必要とされる遺伝子の発見のため
のゾンデの一部として用いた。遺伝子フラグメントから
の遺伝子ゾンデの製造は、就中、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、
Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）中に記載されてお
り、当業者には周知のことである。この特殊な場合に
は、上記の遺伝子フラグメントを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ社のＤＩＧ−マーカーと一緒に使用し
た。
のゾンデの一部として用いた。遺伝子フラグメントから
の遺伝子ゾンデの製造は、就中、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、
Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ、ニューヨーク（１９８９）中に記載されてお
り、当業者には周知のことである。この特殊な場合に
は、上記の遺伝子フラグメントを、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａ
ｇｎｏｓｔｉｃｓ社のＤＩＧ−マーカーと一緒に使用し
た。
【００１９】本願の対象は、同様に、光学的に強化され
たアミノ酸又はその誘導体の製造のためのプロセスにお
ける本発明によるラセマーゼの使用である。このため、
ラセミ体のＮ−アセチルアミノ酸を、アシラーゼ及びＡ
ＡＲの存在下に、生理学的条件下に反応させる。この場
合、形成されたアミノ酸が、析出によって、反応の平衡
から取り除かれ、かつＡＡＲが、残留している光学的に
強化されたＮ−アセチルアミノ酸から常にラセミ体化合
物を形成することによって、当該のアミノ酸の光学対掌
体にするためのラセミ体化合物が１００％変換すること
になる。
たアミノ酸又はその誘導体の製造のためのプロセスにお
ける本発明によるラセマーゼの使用である。このため、
ラセミ体のＮ−アセチルアミノ酸を、アシラーゼ及びＡ
ＡＲの存在下に、生理学的条件下に反応させる。この場
合、形成されたアミノ酸が、析出によって、反応の平衡
から取り除かれ、かつＡＡＲが、残留している光学的に
強化されたＮ−アセチルアミノ酸から常にラセミ体化合
物を形成することによって、当該のアミノ酸の光学対掌
体にするためのラセミ体化合物が１００％変換すること
になる。
【００２０】有利に、前記プロセスは、酵素−膜−反応
器中で行われる（ドイツ連邦共和国特許第１９９１０６
９１．６号）。
器中で行われる（ドイツ連邦共和国特許第１９９１０６
９１．６号）。
【００２１】上記のゾンデを用いて、サザンハイブリッ
ド化（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎ
ｇ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク
（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ．ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅ
ｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ（１９８
５））により、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダのゲノムＤＮＡから約２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ
を検出した。
ド化（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎ
ｇ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ニューヨーク
（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ．ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅ
ｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ（１９８
５））により、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダのゲノムＤＮＡから約２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ
を検出した。
【００２２】この後、ショットガンクローニングを行っ
たが、その際、ゲノムＤＮＡの２．５ｋｂの大きさのＥ
ｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ集団全体を、制限酵素で
事前にＥｃｏＲＩを加水分解したプラスミドｐＵＣ１８
（Ｖｉｅｉｒａ他、Ｇｅｎｅ（１９８２）、１９、２５
９〜２６８）中に結紮させた。
たが、その際、ゲノムＤＮＡの２．５ｋｂの大きさのＥ
ｃｏＲＩフラグメントのＤＮＡ集団全体を、制限酵素で
事前にＥｃｏＲＩを加水分解したプラスミドｐＵＣ１８
（Ｖｉｅｉｒａ他、Ｇｅｎｅ（１９８２）、１９、２５
９〜２６８）中に結紮させた。
【００２３】こうして生じたベクターを、この後形質転
換して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにした。この後、ＡＡ
Ｒの遺伝子を有するＤＮＡフラグメントの同定を、コロ
ニー−ハイブリッド化（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、ニューヨーク（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、
Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊ
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗ
ｉｃｈ（１９８５））を用いて、前記のＤＩＧ−マーカ
ー５０４ｂｐ−ゾンデの使用下に行った。
換して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αにした。この後、ＡＡ
Ｒの遺伝子を有するＤＮＡフラグメントの同定を、コロ
ニー−ハイブリッド化（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ、ニューヨーク（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、
Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊ
ｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗ
ｉｃｈ（１９８５））を用いて、前記のＤＩＧ−マーカ
ー５０４ｂｐ−ゾンデの使用下に行った。
【００２４】ＡＡＲ−遺伝子を有する得られたプラスミ
ドを、ｐＡＡＲ１−２１Ｉ（図１）と呼称した。図２
は、ＡＡＲ−遺伝子を有する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメントの制限図を示している。ＡＡＲ−遺伝子を有
する１，３ｋｂ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、二本鎖配
列させ、かつ分析した。
ドを、ｐＡＡＲ１−２１Ｉ（図１）と呼称した。図２
は、ＡＡＲ−遺伝子を有する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩフ
ラグメントの制限図を示している。ＡＡＲ−遺伝子を有
する１，３ｋｂ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、二本鎖配
列させ、かつ分析した。
【００２５】ｐＡＡＲ１−２１ＩからのＰＣＲを用いる
全遺伝子の増幅のために、プライマーＡＲ＿Ｅｘ１Ｎｄ
ｅ及びＡＲ＿Ｅｘ２Ｂｇｌを使用した。前記プライマー
を用いて、遺伝子の５′末端において、ＮｄｅＩ−制限
切断部位を挿入し、かつＡＡＲ−遺伝子の３′末端にお
いて、ＢｇｌＩＩ−切断部位を挿入した。
全遺伝子の増幅のために、プライマーＡＲ＿Ｅｘ１Ｎｄ
ｅ及びＡＲ＿Ｅｘ２Ｂｇｌを使用した。前記プライマー
を用いて、遺伝子の５′末端において、ＮｄｅＩ−制限
切断部位を挿入し、かつＡＡＲ−遺伝子の３′末端にお
いて、ＢｇｌＩＩ−切断部位を挿入した。
【００２６】増幅を、平滑末端で、ＳｍａＩで加水分解
したプラスミドｐＵＣ１８中に結紮させ、こうして生じ
た構造ｐＡＡＲ２−２１Ｉ（図３）を形質転換してＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５αにした。
したプラスミドｐＵＣ１８中に結紮させ、こうして生じ
た構造ｐＡＡＲ２−２１Ｉ（図３）を形質転換してＥ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５αにした。
【００２７】前記制限切断部位ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩ
の挿入により、発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中へ
の遺伝子のクローニングを可能になった。ｐＡＡＲ３−
２１Ｉ（図４）と呼称する、Ａ．オリエンタリス サブ
スペーシ−ズ ルリダからのＡＡＲ−遺伝子を有する前
記発現ベクターを、発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社；ゲノム中のｌａｃ−オ
ペロンの制御下に組み込んでＴ７−ポリメラーゼを含有
する）に形質転換させた。
の挿入により、発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中へ
の遺伝子のクローニングを可能になった。ｐＡＡＲ３−
２１Ｉ（図４）と呼称する、Ａ．オリエンタリス サブ
スペーシ−ズ ルリダからのＡＡＲ−遺伝子を有する前
記発現ベクターを、発現菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１
（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ社；ゲノム中のｌａｃ−オ
ペロンの制御下に組み込んでＴ７−ポリメラーゼを含有
する）に形質転換させた。
【００２８】発現プラスミドｐＡＡＲ３−２１Ｉを用い
て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＡ．オリエ
ンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡＲを、
Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
（１９９０）、１８５、６１〜８９の変更されたプロト
コルにより非相同過剰表現（ｕｅｂｅｒｅｘｐｒｉｍｉ
ｅｒｔ）させることができた。過剰発現を、イソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。
Ｅ．ｃｏｌｉ発現菌株は、本来、Ｎ−アセチルアミノ酸
ラセマーゼ活性を有していなかった。
て、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＡ．オリエ
ンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡＲを、
Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ
（１９９０）、１８５、６１〜８９の変更されたプロト
コルにより非相同過剰表現（ｕｅｂｅｒｅｘｐｒｉｍｉ
ｅｒｔ）させることができた。過剰発現を、イソプロピ
ルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。
Ｅ．ｃｏｌｉ発現菌株は、本来、Ｎ−アセチルアミノ酸
ラセマーゼ活性を有していなかった。
【００２９】Ｎ−アセチル−Ｄ−アミノ酸からの脱アセ
チル化したアミノ酸、この場合、メチオニンの形成をＨ
ＰＬＣ−システムＩを用いて検証することによって、Ａ
ＡＲ活性を、接続した酵素評価（第１図）により追跡し
た。助酵素としては、シュバイネニーレン（Ｓｃｈｗｅ
ｉｎｅｎｉｅｒｅｎ）又はアスペルギルス・オリーゼか
らのＬ−特異性アシラーゼを用いた。
チル化したアミノ酸、この場合、メチオニンの形成をＨ
ＰＬＣ−システムＩを用いて検証することによって、Ａ
ＡＲ活性を、接続した酵素評価（第１図）により追跡し
た。助酵素としては、シュバイネニーレン（Ｓｃｈｗｅ
ｉｎｅｎｉｅｒｅｎ）又はアスペルギルス・オリーゼか
らのＬ−特異性アシラーゼを用いた。
【００３０】
【外１】
【００３１】第１図：酵素評価の略図 非相同過剰発現したＡＡＲの精製を、細胞溶解後に３工
程で行った： １．５０℃で３０分間の加熱沈澱： ２．Ｑ−セファロースによるアニオン交換クロマトグラ
フィー処理（高速流；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） ３．フェニル−セファロースによる疎水性相互作用クロ
マトグラフィー（流線；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） ＡＡＲの他の特性決定は、ＨＰＬＣ−システムＩＩを用
いて行った。このシステムは、ＡＡＲの活性を直接的に
試験することができた。助酵素、アシラーゼを不要にで
きたので、支障となる副活性を回避することができた。
程で行った： １．５０℃で３０分間の加熱沈澱： ２．Ｑ−セファロースによるアニオン交換クロマトグラ
フィー処理（高速流；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） ３．フェニル−セファロースによる疎水性相互作用クロ
マトグラフィー（流線；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社） ＡＡＲの他の特性決定は、ＨＰＬＣ−システムＩＩを用
いて行った。このシステムは、ＡＡＲの活性を直接的に
試験することができた。助酵素、アシラーゼを不要にで
きたので、支障となる副活性を回避することができた。
【００３２】Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダからのＡＡＲの性質として、引き続き晶出させ
た： ｉ）ＡＡＲは、専ら、Ｎ−アセチルアミノ酸をラセミ分
割し、Ｎ−アセチル保護されていないアミノ酸は変換し
ない。
ルリダからのＡＡＲの性質として、引き続き晶出させ
た： ｉ）ＡＡＲは、専ら、Ｎ−アセチルアミノ酸をラセミ分
割し、Ｎ−アセチル保護されていないアミノ酸は変換し
ない。
【００３３】ｉｉ）ＡＡＲの過剰表現した蛋白質バンド
は、変性した状態、分子量約４０ｋＤａでＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ−分析において現れる（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７０）、２２７，６８０〜６８５）。
は、変性した状態、分子量約４０ｋＤａでＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ−分析において現れる（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７０）、２２７，６８０〜６８５）。
【００３４】ｉｉｉ）ＡＡＲは、ｐＨ８でｐＨ最適値を
有する（図５）。
有する（図５）。
【００３５】ｉｖ）精製後のＡＡＲ比活性は、評価にお
いて２ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏを用いて３０．６Ｕ／
ｍｇであった。従って、この値は、トクヤマ及びハタノ
がそのラセマーゼについて見出した値（Ａｐｐｌ． Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９
６、４４，７７４〜７７７）よりも約３０．８％高い。
いて２ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏを用いて３０．６Ｕ／
ｍｇであった。従って、この値は、トクヤマ及びハタノ
がそのラセマーゼについて見出した値（Ａｐｐｌ． Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９
６、４４，７７４〜７７７）よりも約３０．８％高い。
【００３６】ｖ）評価において１０ｍＭのＣｏＣｌ2×
６Ｈ2Ｏを用いる活性は、３７．５Ｕ／ｍｇであった。
６Ｈ2Ｏを用いる活性は、３７．５Ｕ／ｍｇであった。
【００３７】ｖｉ）評価における金属イオンを用いない
活性に比して１ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏを用いるＡ．
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡ
Ｒの活性の増大は、１２５０％であった。評価における
１ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏの添加により、Ａ．ｓｐ．
ＴＳ−１−６０からのＡＡＲの場合には、僅か４９６％
増大したにすぎなかった（トクヤマ及びハタノ、Ａｐｐ
ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１９９６、４４、７７４〜７７７）。このことから、
Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからの
ＡＡＲは、評価における同じＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ濃度で
は、Ａ．ｓｐ．ＴＳ−１−６０からのラセマーゼよりも
１５２％だけ活性であることが判明した。
活性に比して１ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏを用いるＡ．
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡ
Ｒの活性の増大は、１２５０％であった。評価における
１ｍＭのＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏの添加により、Ａ．ｓｐ．
ＴＳ−１−６０からのＡＡＲの場合には、僅か４９６％
増大したにすぎなかった（トクヤマ及びハタノ、Ａｐｐ
ｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１９９６、４４、７７４〜７７７）。このことから、
Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからの
ＡＡＲは、評価における同じＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ濃度で
は、Ａ．ｓｐ．ＴＳ−１−６０からのラセマーゼよりも
１５２％だけ活性であることが判明した。
【００３８】ｖｉｉ）他の二価のイオン、例えばＭｎＣ
ｌ2×４Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ及びＭｇＣｌ2×６
Ｈ2Ｏを、種々の濃度で標準酵素評価において試験し
た。この場合、Ｍｎ及びＭｇは、１０ｍＭ、コバルト置
換に比して、なお約４０％の活性を示した（図６）。
ｌ2×４Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ及びＭｇＣｌ2×６
Ｈ2Ｏを、種々の濃度で標準酵素評価において試験し
た。この場合、Ｍｎ及びＭｇは、１０ｍＭ、コバルト置
換に比して、なお約４０％の活性を示した（図６）。
【００３９】ｖｉｉｉ）基質阻害は、Ａ．オリエンタリ
ス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡＲの際に２０
０ｍＭを上回るＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの基質濃
度の場合に生じている（図７）。ＴＳ−１−６０につい
ては、阻害は、５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−メチオニ
ンの際に早くも観察された。
ス サブスペーシーズ ルリダからのＡＡＲの際に２０
０ｍＭを上回るＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンの基質濃
度の場合に生じている（図７）。ＴＳ−１−６０につい
ては、阻害は、５０ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−メチオニ
ンの際に早くも観察された。
【００４０】本発明のラセマーゼが、公知技術水準から
挙げられた明白な利点に比して、工業的規模での使用の
ための活性、重金属イオン依存性及び阻害傾向に関連し
ては十分であることを確認できる。
挙げられた明白な利点に比して、工業的規模での使用の
ための活性、重金属イオン依存性及び阻害傾向に関連し
ては十分であることを確認できる。
【００４１】微生物アミコラトプシス オリエンタリス
サブスペーシーズ ルリダは、ドイツ連邦共和国微生
物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆ
ｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）にＤＳＭ４
３１３４号の番号で寄託されている。
サブスペーシーズ ルリダは、ドイツ連邦共和国微生
物寄託局（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆ
ｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）にＤＳＭ４
３１３４号の番号で寄託されている。
【００４２】ＡＡＲは、本発明の範囲内では、天然の酵
素並びに組換えにより製造された酵素のことである。
素並びに組換えにより製造された酵素のことである。
【００４３】
【実施例】１． アクチノミセス菌株 アミコラトプシ
ス オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダの育成
及びゲノムＤＮＡの調製 アクチノミセス菌株 アミコラトプシス オリエンタリ
ス サブスペーシーズルリダ（ＤＳＭ４３１３４）を、
ＴＳＢ培地（オキソイド、ベゼル）上で増殖させた。こ
の培養菌を、収穫後に、２回、滅菌した１０．３％のシ
ョ糖溶液で洗浄し、かつ、使用するまで−２０℃で保存
した。このゲノムＤＮＡの調製を、ＭＥＨＬＩＮＧ他、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９
５）、１２８、１１９〜１２６により行った。
ス オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダの育成
及びゲノムＤＮＡの調製 アクチノミセス菌株 アミコラトプシス オリエンタリ
ス サブスペーシーズルリダ（ＤＳＭ４３１３４）を、
ＴＳＢ培地（オキソイド、ベゼル）上で増殖させた。こ
の培養菌を、収穫後に、２回、滅菌した１０．３％のシ
ョ糖溶液で洗浄し、かつ、使用するまで−２０℃で保存
した。このゲノムＤＮＡの調製を、ＭＥＨＬＩＮＧ他、
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９
５）、１２８、１１９〜１２６により行った。
【００４４】２．オリゴヌクレオチド 第１表：使用したオリゴヌクレオチドのリスト
【００４５】
【表１】
【００４６】３．遺伝子工学的方法 ここで使用した全ての遺伝子工学的方法は、別記しない
場合には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａｂｏａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク
（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅ
ｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ（１９８
５）により記載されている。全ての酵素及び相応する緩
衝液は、製造者の指示により用いられる。ＡＬＦｒｅｄ
ＤＮＡ−シーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、フライ
ブルク）を用いる自動配列のために、Ｃｙ５標識された
プライマーを使用した。サザンブロット法及びハイブリ
ッド化並びにＤＮＡゾンデのための３′−ＤＩＧ−ラベ
リング（非放射性検出用）を、ＲＯｃｈｅ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ社の指示により行った。
場合には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ａ ｌａｂｏａｔｏｒ
ｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク
（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅ
ｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃｈ（１９８
５）により記載されている。全ての酵素及び相応する緩
衝液は、製造者の指示により用いられる。ＡＬＦｒｅｄ
ＤＮＡ−シーケンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、フライ
ブルク）を用いる自動配列のために、Ｃｙ５標識された
プライマーを使用した。サザンブロット法及びハイブリ
ッド化並びにＤＮＡゾンデのための３′−ＤＩＧ−ラベ
リング（非放射性検出用）を、ＲＯｃｈｅ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ社の指示により行った。
【００４７】４．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ポリメラーゼ連鎖反応を用いるＤＮＡ−増幅を、Ｓａｉ
ｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）、２３９、４８７
〜４９１に依拠して、生物統計学的熱循環器（Ｂｉｏｍ
ｅｔｒａ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ゲッチンゲ
ン）を用いて実施した。テンプレートとして、Ａ．オリ
エンタリス サブスペーシーズ ルリダからのゲノムＤ
ＮＡを用いた。ＰＣＲ−バッチに、熱安定性ポリメラー
ゼＴａｑ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を使用した。使用し
たプライマー対は、第１表中に記載されている。アニー
ル温度Ａを、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ融点（Ｔm）
を通して求めた。ＤＮＡ−ポリメラーゼの連鎖反応の時
間Ｘは、１ｋｂ＝１分−規則に従っていた。全てのバッ
チを、約５０μｌの鉱油で被覆した。
ｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）、２３９、４８７
〜４９１に依拠して、生物統計学的熱循環器（Ｂｉｏｍ
ｅｔｒａ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）（ゲッチンゲ
ン）を用いて実施した。テンプレートとして、Ａ．オリ
エンタリス サブスペーシーズ ルリダからのゲノムＤ
ＮＡを用いた。ＰＣＲ−バッチに、熱安定性ポリメラー
ゼＴａｑ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）を使用した。使用し
たプライマー対は、第１表中に記載されている。アニー
ル温度Ａを、オリゴヌクレオチドのＤＮＡ融点（Ｔm）
を通して求めた。ＤＮＡ−ポリメラーゼの連鎖反応の時
間Ｘは、１ｋｂ＝１分−規則に従っていた。全てのバッ
チを、約５０μｌの鉱油で被覆した。
【００４８】ＰＣＲ−バッチの組成：
【００４９】
【表２】
【００５０】増幅プログラム：
【００５１】
【表３】
【００５２】工程２の際にＤＮＡ−ポリメラーゼを添加
した場合に、工程２〜４を、３０回繰り返した。
した場合に、工程２〜４を、３０回繰り返した。
【００５３】表 ２：ＰＣＲに使用したプライマー対
（第１表参照）のリスト、アニール温度並びに増幅の長
さ。
（第１表参照）のリスト、アニール温度並びに増幅の長
さ。
【００５４】
【表４】
【００５５】５．サザンによるハイブリッド化及びコロ
ニーハイブリッド化 サザンによるハイブリッド化のために、Ａ．オリエンタ
リス サブスペーシーズ ルリダのゲノムＤＮＡの調製
物のアリコートを、制限酵素ＥｃｏＲＩでハイブリッド
化させた。次に、生じたＤＮＡフラグメントを、アガロ
ース−ゲルにより分離した。こうして分離されたフラグ
メントを、引き続き、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ+、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の上で吸い取らせた。ゾン
デとして、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ル
リダからのＤＩＧ−標識された（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ社）５０４ｂｐ−フラグメントを使用し
た。ハイブリッド化温度は、６１℃であった。
ニーハイブリッド化 サザンによるハイブリッド化のために、Ａ．オリエンタ
リス サブスペーシーズ ルリダのゲノムＤＮＡの調製
物のアリコートを、制限酵素ＥｃｏＲＩでハイブリッド
化させた。次に、生じたＤＮＡフラグメントを、アガロ
ース−ゲルにより分離した。こうして分離されたフラグ
メントを、引き続き、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ
Ｎ+、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）の上で吸い取らせた。ゾン
デとして、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ル
リダからのＤＩＧ−標識された（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃｓ社）５０４ｂｐ−フラグメントを使用し
た。ハイブリッド化温度は、６１℃であった。
【００５６】Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダからのシグナルを発する２．５ｋｂの大きさのＤ
ＮＡフラグメントを、溶離させ、ＥｃｏＲＩで加水分解
したプラスミドｐＵＣ１８を結紮させ、引き続き、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５α ショットガンクローニングした。
ルリダからのシグナルを発する２．５ｋｂの大きさのＤ
ＮＡフラグメントを、溶離させ、ＥｃｏＲＩで加水分解
したプラスミドｐＵＣ１８を結紮させ、引き続き、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＨ５α ショットガンクローニングした。
【００５７】ショットガンクローニングによって取得さ
れたＥ．ｃｏｌｉ形質転換株を、それぞれ５０個のＬＢ
amp100−プレート上に薄く伸ばした。次に、前記プレー
トを用いて、コロニー−リフト及び引き続きコロニー−
ハイブリッド化を実施した。ゾンデとして、再度、Ａ．
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＤＩ
Ｇ−標識された５０４ｂｐフラグメントを用いた。この
方法を用いて、ＡＡＲ−遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ形
質転換株を明確に同定できた。このプラスミドをｐＡＡ
Ｒ１−２１Ｉと命名した。
れたＥ．ｃｏｌｉ形質転換株を、それぞれ５０個のＬＢ
amp100−プレート上に薄く伸ばした。次に、前記プレー
トを用いて、コロニー−リフト及び引き続きコロニー−
ハイブリッド化を実施した。ゾンデとして、再度、Ａ．
オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダからのＤＩ
Ｇ−標識された５０４ｂｐフラグメントを用いた。この
方法を用いて、ＡＡＲ−遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ形
質転換株を明確に同定できた。このプラスミドをｐＡＡ
Ｒ１−２１Ｉと命名した。
【００５８】前記の技術は、詳細にはＳａｍｂｒｏｏｋ
他、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＰｒｅｓｓ（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ
ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈ
ｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃ
ｈ（１９８５）で評価されており、従って、当業者には
公知である。
他、Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙＰｒｅｓｓ（１９８９）及びＨｏｐｗｏｏｄ他、Ａ
ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｔｈｅ Ｊｏｈ
ｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｗｉｃ
ｈ（１９８５）で評価されており、従って、当業者には
公知である。
【００５９】６．Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）中
のＡ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダから
のＡＡＲ−酵素の非相同発現 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１中のＡ．オリエンタリス サブ
スペーシーズ ルリダからの組換えＡＡＲ−酵素の標準
化された非相同発現を、Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）、１８５、６１〜８
９により行った：過剰発現のためのプラスミド（ｐＡＡ
Ｒ３−２１Ｉ）を用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）−誘導体を、ＬＢ−培地（アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌを含有）中で、３７℃で一晩（Ｕｅ
Ｎ）恒温保持した。次に、主要培養菌５００ｍｌ（４つ
のじゃま板付きフラスコ（Ｓｃｈｉｋａｎｅ−Ｋｏｌｂ
ｅｎ）中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ
Ｂ−培地）に、一晩経過した培養菌１０ｍｌ（１：５
０）を植え付けた。Ｔ７−ポリメラーゼを、ＯＤ60nm＝
０．５〜０．９の細胞密度で、１００ｍＭのＩＰＴＧ溶
液（フラスコ中の濃度１ｍＭ；ＩＰＴＧ＝イソプロピル
チオガラクトシド）５ｍｌで誘導した。３７℃で、更に
４〜６時間の恒温保持後に、細胞を収穫した。
のＡ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダから
のＡＡＲ−酵素の非相同発現 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１中のＡ．オリエンタリス サブ
スペーシーズ ルリダからの組換えＡＡＲ−酵素の標準
化された非相同発現を、Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）、１８５、６１〜８
９により行った：過剰発現のためのプラスミド（ｐＡＡ
Ｒ３−２１Ｉ）を用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｂ
Ｌ２１（ＤＥ３）−誘導体を、ＬＢ−培地（アンピシリ
ン１００μｇ／ｍｌを含有）中で、３７℃で一晩（Ｕｅ
Ｎ）恒温保持した。次に、主要培養菌５００ｍｌ（４つ
のじゃま板付きフラスコ（Ｓｃｈｉｋａｎｅ−Ｋｏｌｂ
ｅｎ）中のアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ
Ｂ−培地）に、一晩経過した培養菌１０ｍｌ（１：５
０）を植え付けた。Ｔ７−ポリメラーゼを、ＯＤ60nm＝
０．５〜０．９の細胞密度で、１００ｍＭのＩＰＴＧ溶
液（フラスコ中の濃度１ｍＭ；ＩＰＴＧ＝イソプロピル
チオガラクトシド）５ｍｌで誘導した。３７℃で、更に
４〜６時間の恒温保持後に、細胞を収穫した。
【００６０】上記の方法で引きつけられた発現クローン
の粗製抽出物中には、全蛋白質０．６〜１．２Ｕ／ｍｇ
のＡＡＲ−活性を求めることができた。
の粗製抽出物中には、全蛋白質０．６〜１．２Ｕ／ｍｇ
のＡＡＲ−活性を求めることができた。
【００６１】７．組み替えられたＡＡＲ−酵素のラセマ
ーゼ活性の検出 過剰発現クローンの粗製抽出物もしくは精製された酵素
画分を、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンからのＬ−メチ
オニンの形成（図１参照）をＨＰＬＣにより検出するこ
とができたことにより、酵素試験において使用した：標
準酵素試験（トクヤマ他、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）、４０、８３５
〜８４０；同書、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５ａ）、４２ 、８５３〜８
５９により一部変更された）は、以下のようにして構成
された： 溶剤：トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ５０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン ２５ｍＭ 塩化コバルト ２ｍＭ アシラーゼＩ（ＡＳｃｈ又はＡＡｓｐ） １Ｕ 蛋白質 精製した蛋白質又は全蛋白質 ２〜１５０μｇ 最終容量 ２００μｌ この場合、アシラーゼＩ及びＣｏ2+を、過剰量で挿入す
るので、ＡＡＲ−反応は、速度の一定した工程である。
恒温保持を、３０℃で１０〜４０分間行った。次に、こ
の反応を、３分間の煮沸によって停止させた。反応生成
物の分析をＨＰＬＣ（システムＩ）を用いて行った。
ーゼ活性の検出 過剰発現クローンの粗製抽出物もしくは精製された酵素
画分を、Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンからのＬ−メチ
オニンの形成（図１参照）をＨＰＬＣにより検出するこ
とができたことにより、酵素試験において使用した：標
準酵素試験（トクヤマ他、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９４）、４０、８３５
〜８４０；同書、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９５ａ）、４２ 、８５３〜８
５９により一部変更された）は、以下のようにして構成
された： 溶剤：トリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５ ５０ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニン ２５ｍＭ 塩化コバルト ２ｍＭ アシラーゼＩ（ＡＳｃｈ又はＡＡｓｐ） １Ｕ 蛋白質 精製した蛋白質又は全蛋白質 ２〜１５０μｇ 最終容量 ２００μｌ この場合、アシラーゼＩ及びＣｏ2+を、過剰量で挿入す
るので、ＡＡＲ−反応は、速度の一定した工程である。
恒温保持を、３０℃で１０〜４０分間行った。次に、こ
の反応を、３分間の煮沸によって停止させた。反応生成
物の分析をＨＰＬＣ（システムＩ）を用いて行った。
【００６２】別記しない場合、シュバイネニーレン（Ａ
Ｓｃｈ）からのアシラーゼＩを酵素試験において使用
し、イオンとしてＣｏ2+（ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ）を使用
した。あるいはまた選択的に、アスペルギルス・オリー
ゼ（ＡＡｓｐ）からのアシラーゼＩを使用した。
Ｓｃｈ）からのアシラーゼＩを酵素試験において使用
し、イオンとしてＣｏ2+（ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ）を使用
した。あるいはまた選択的に、アスペルギルス・オリー
ゼ（ＡＡｓｐ）からのアシラーゼＩを使用した。
【００６３】ＨＰＬＣ−システムＩＩにより分析した評
価の場合、このシステムを用いて、Ｎ−アセチルアミノ
酸を直接エナンチオ選択的に分離でき、かつ検出できた
ので、アシラーゼを省くことができた。
価の場合、このシステムを用いて、Ｎ−アセチルアミノ
酸を直接エナンチオ選択的に分離でき、かつ検出できた
ので、アシラーゼを省くことができた。
【００６４】Ｃｏ2+（ＣｏＣｌ2×６Ｈ2Ｏ）以外に、別
の二価のイオン、例えばＭんＣｌ2×４Ｈ2Ｏを、ＳＯ4
×７Ｈ2Ｏ及びＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏに対して種々の濃度
で使用した（０．１〜１０ｍＭ）。
の二価のイオン、例えばＭんＣｌ2×４Ｈ2Ｏを、ＳＯ4
×７Ｈ2Ｏ及びＭｇＣｌ2×６Ｈ2Ｏに対して種々の濃度
で使用した（０．１〜１０ｍＭ）。
【００６５】ＡＡＲの活量に、基質としての２５〜４０
０ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンを添加して、基
質阻害を試験した。
０ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンを添加して、基
質阻害を試験した。
【００６６】８．ＨＰＬＣ−分析 システム Ｉ： カラム：ＲＰ Ｃ１８、５μｍ、２５０×４．６ｍｍ、
Ｃｈｒｏｍａｓｉｌ(R) 展開剤Ａ：酢酸ナトリウム２３ｍＭ、１０％のアセトニ
トリル、ｐＨ６．０ 展開剤Ｂ：１００％のアセトニトリル 流速：１ｍｌ／分 試料容量：２０μｌ 検出：ＵＶ−ＶＩＳ ２２５ｎｍ 蛍光：３４０／４４０ｎｍ 誘導：Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ（１９９４）、６６
６、２５９〜２７３によるｏ−フタルジアルデヒド（Ｏ
ＰＡ）／Ｎ−イソブチル−Ｌ−システイン（ＩＢＬＣ）
をベース。
Ｃｈｒｏｍａｓｉｌ(R) 展開剤Ａ：酢酸ナトリウム２３ｍＭ、１０％のアセトニ
トリル、ｐＨ６．０ 展開剤Ｂ：１００％のアセトニトリル 流速：１ｍｌ／分 試料容量：２０μｌ 検出：ＵＶ−ＶＩＳ ２２５ｎｍ 蛍光：３４０／４４０ｎｍ 誘導：Ｂｒｕｅｃｋｎｅｒ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ（１９９４）、６６
６、２５９〜２７３によるｏ−フタルジアルデヒド（Ｏ
ＰＡ）／Ｎ−イソブチル−Ｌ−システイン（ＩＢＬＣ）
をベース。
【００６７】勾配：
【００６８】
【表５】
【００６９】システム ＩＩ： カラム：ＥＮＡＮ １，Ｍｅｒｇｅｔ、１４５×４．６
ｍｍ、（Ｄｒ． Ｋ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ、Ｄｅｇｕｓｓ
ａ−Ｈｕｅｌｓ ＡＧ、個人貸し出し品） 展開剤Ａ：メタノール７００ｍｌ、酢酸アンモニウム３
００ｍｌ（０．０１Ｍ）、氷酢酸０．５ｍｌ 流速：１ｍｌ／分 試料容量：２０μｌ 検出：ＵＶ−ＶＩＳ ２２５ｎｍ 勾配：一定（ｉｓｏｋｒａｔｉｓｃｈ） ９．Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダか
らのＡＡＲの精製 非相同性過剰発現したＡＡＲの精製を、細胞溶解後に３
工程で行った： １．細胞溶解：トリス／ＨＣｌを含有する３０％の細胞
懸濁液（ｐＨ７．５）及び１．５倍のガラス玉（直径
０．３ｍｍ）を混合し、ディスインテグレーター（Ｄｉ
ｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）Ｓ中で（２回、１５分間）分
解した。
ｍｍ、（Ｄｒ． Ｋ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ、Ｄｅｇｕｓｓ
ａ−Ｈｕｅｌｓ ＡＧ、個人貸し出し品） 展開剤Ａ：メタノール７００ｍｌ、酢酸アンモニウム３
００ｍｌ（０．０１Ｍ）、氷酢酸０．５ｍｌ 流速：１ｍｌ／分 試料容量：２０μｌ 検出：ＵＶ−ＶＩＳ ２２５ｎｍ 勾配：一定（ｉｓｏｋｒａｔｉｓｃｈ） ９．Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ ルリダか
らのＡＡＲの精製 非相同性過剰発現したＡＡＲの精製を、細胞溶解後に３
工程で行った： １．細胞溶解：トリス／ＨＣｌを含有する３０％の細胞
懸濁液（ｐＨ７．５）及び１．５倍のガラス玉（直径
０．３ｍｍ）を混合し、ディスインテグレーター（Ｄｉ
ｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）Ｓ中で（２回、１５分間）分
解した。
【００７０】２．５０℃で３０分間の加熱沈澱。
【００７１】３．Ｑ−セファロースによるアニオン交換
クロマトグラフィー処理（高速流；Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）、約２５％の展開剤Ｂでの溶離。
クロマトグラフィー処理（高速流；Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）、約２５％の展開剤Ｂでの溶離。
【００７２】４．フェニル−セファロースによる疎水性
相互作用クロマトグラフィー（流線；Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）、約４０％の展開剤Ｂでの溶離。
相互作用クロマトグラフィー（流線；Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）、約４０％の展開剤Ｂでの溶離。
【００７３】溶離を、それぞれ、５０ｍＭのトリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５（展開剤Ａ）を用いて、５０ｍＭのト
リス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（展開剤Ｂ）中の０．５Ｍの
（ＮＨ4）2ＳＯを用いる線状勾配により行った。配列表
Ｃｌ、ｐＨ７．５（展開剤Ａ）を用いて、５０ｍＭのト
リス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５（展開剤Ｂ）中の０．５Ｍの
（ＮＨ4）2ＳＯを用いる線状勾配により行った。配列表
【００７４】
【表６】
【００７５】
【表７】
【００７６】
【表８】
【００７７】
【表９】
【００７８】
【表１０】
【００７９】
【表１１】
【００８０】
【表１２】
【００８１】
【表１３】
【００８２】
【表１４】
【図１】ＡＡＲ−遺伝子を有するプラスミドｐＡＡＲ１
−２１Ｉを示す図。
−２１Ｉを示す図。
【図２】ＡＲ−遺伝子を有する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ
フラグメントの制限図。
フラグメントの制限図。
【図３】ｐＡＡＲ２−２１Ｉを示す図。
【図４】ｐＡＡＲ３−２１Ｉを示す図。
【図５】ＡＡＲが、ｐＨ８でｐＨ最適値を有することを
示す線図。
示す線図。
【図６】種々の濃度で標準酵素評価において試験した結
果、Ｍｎ及びＭｇが、コバルトに比して、約４０％の活
性を有することを示す図。
果、Ｍｎ及びＭｇが、コバルトに比して、約４０％の活
性を有することを示す図。
【図７】種々の濃度で酵素評価において試験した結果、
基質阻害が、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダからのＡＡＲの際に２００ｍＭを上回るＮ−アセ
チル−Ｄ−メチオニンの基質濃度の場合に生じているこ
とを示す図。
基質阻害が、Ａ．オリエンタリス サブスペーシーズ
ルリダからのＡＡＲの際に２００ｍＭを上回るＮ−アセ
チル−Ｄ−メチオニンの基質濃度の場合に生じているこ
とを示す図。
【図８】Ｎ−アセチル−Ｄ−メチオニンの比活性を示す
図。
図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:04） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:04） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:04） (Ｃ１２Ｐ 13/04 Ｃ１２Ｒ 1:04） (72)発明者 マリア−レギーナ クーラ ドイツ連邦共和国 ニーダーツィーア ゼ ルゲンブッシュ 12 (72)発明者 アンドレアス ボンマリウス ドイツ連邦共和国 フランクフルト アム マイン ヴァイトマンシュトラーセ ７ (72)発明者 カールハインツ ドラウツ ドイツ連邦共和国 フライゲリヒト ツア マリエンルーエ 13
Claims (9)
- 【請求項１】 アミコラトプシス オリエンタリス サ
ブスペーシーズ ルリダからのＮ−アセチルアミノ酸ラ
セマーゼ。 - 【請求項２】 請求項１に記載のラセマーゼをコーディ
ングする遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の遺伝子を有するプラス
ミド。 - 【請求項４】 請求項２に記載の遺伝子を有するベクタ
ー。 - 【請求項５】 請求項２に記載の遺伝子を有する微生
物。 - 【請求項６】 請求項２に記載の遺伝子のためのプライ
マー。 - 【請求項７】 請求項２に記載の遺伝子のためのゾン
デ。 - 【請求項８】 エナンチオマー蓄積アミノ酸又はその誘
導体の製造のためのプロセスにおける請求項１によるラ
セマーゼの使用。 - 【請求項９】 酵素−膜−反応器中でプロセスを実施す
る、請求項８に記載の使用。
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|---|---|---|---|
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| DE19935268A DE19935268A1 (de) | 1999-07-27 | 1999-07-27 | N-Acetylaminosäureracemase |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001046088A true JP2001046088A (ja) | 2001-02-20 |
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ID=7916232
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|---|---|---|---|
| JP2000222928A Pending JP2001046088A (ja) | 1999-07-27 | 2000-07-24 | Ｎ−アセチルアミノ酸ラセマーゼ、そのコーディング遺伝子、該遺伝子を有するプラスミド、ベクター及び微生物、該遺伝子のためのプライマー及びゾンデ及び該ラセマーゼの使用 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1074628B1 (ja) |
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1199369A3 (de) * | 2000-10-11 | 2002-08-07 | Degussa Aktiengesellschaft | Verwendung der Acetylaminosäureracemase aus Amycolatopsis orientalis zur Racemisierung von Carbamoylaminosäuren |
| JP2007082534A (ja) * | 2005-08-22 | 2007-04-05 | Toyobo Co Ltd | 耐熱性ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ、その製造法およびその用途 |
| WO2010050516A1 (ja) | 2008-10-29 | 2010-05-06 | 株式会社カネカ | Ｌ－アミノ酸の製造方法 |
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|---|---|---|---|---|
| US6664083B2 (en) * | 2000-03-01 | 2003-12-16 | Daichel Chemical Industries, Ltd. | Methods for racemizing N-acylamino acids and producing optically active amino acids |
| DE10050123A1 (de) | 2000-10-11 | 2002-04-25 | Degussa | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren |
| US20030059816A1 (en) * | 2001-08-03 | 2003-03-27 | Thermogen, Inc. | Methods for identifying racemases |
| EP2697373A1 (en) | 2011-04-12 | 2014-02-19 | Dr. Reddy's Laboratories (EU) Limited | Production of enantiomerically purified amino acids |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04365482A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-12-17 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄｎａおよびその用途 |
| JPH06205668A (ja) * | 1990-09-14 | 1994-07-26 | Takeda Chem Ind Ltd | アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4981799A (en) * | 1987-08-21 | 1991-01-01 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Acylamino acid racemase, production and use thereof |
| CA2038202A1 (en) * | 1990-09-14 | 1992-03-15 | Masaharu Tokuyama | Dna and use thereof |
-
1999
- 1999-07-27 DE DE19935268A patent/DE19935268A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-07-24 JP JP2000222928A patent/JP2001046088A/ja active Pending
- 2000-07-25 EP EP00115902A patent/EP1074628B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-25 AT AT00115902T patent/ATE276370T1/de active
- 2000-07-25 DE DE50007747T patent/DE50007747D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-27 US US09/624,390 patent/US6372459B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04365482A (ja) * | 1990-09-14 | 1992-12-17 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｄｎａおよびその用途 |
| JPH06205668A (ja) * | 1990-09-14 | 1994-07-26 | Takeda Chem Ind Ltd | アシルアミノ酸ラセマーゼ生産菌 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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