JP3375834B2 - 組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は組換えＬ−メチオニ
ン γ−リアーゼに関する。さらに詳しくは、組換えＬ
−メチオニン γ−リアーゼを構成する組換えタンパク
質またはその変異体、その多量体からなる酵素、それら
をコードするＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含有するベク
ター、該ベクターを有する宿主細胞、その宿主細胞を用
いる本発明の組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼの製
造方法、該組換えＬ−メチオニンγ−リアーゼまたはそ
の変異体を含有する抗癌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ（ＥＣ
４.４.１.１１）は、Ｌ−メチオニンまたはその誘導体
のα，γ−脱離およびγ−置換を触媒し、さらにはＳ−
置換Ｌ−システインまたはその誘導体のα，β−脱離お
よびβ−置換を触媒する、ピリドキサルリン酸を補酵素
とする酵素である［Tanaka,H.ら、Biochemistry 16,100
-106(1977)］。この酵素は主としてシュードモナス・プ
チダ（Pseudomonas putida）から精製されており、その
物理化学的性質および酵素学的性質が調べられている
［Nakayama,T. ら、Anal.Biochem.138,421-424(198
4)］。また、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの酵素反応
のメカニズムについても種々報告されている［Esaki,N.
ら、FEBS Lett.84,309-312(1977)；Nakayama,T.ら、Bio
chemistry 27,1587-1591(1988)等］。しかしながら、こ
れらの文献が対象としているＬ−メチオニンγ−リアー
ゼはすべてシュードモナス属細菌由来のもの、即ち天然
由来の酵素であり、遺伝子組換え技術によって調製され
るその組換え型酵素については記載も示唆もされていな
い。

【０００３】最近になって、Ｌ−メチオニン γ−リア
ーゼが抗癌活性を有していることが報告された［１９９
４年５月２６日公開のＷＯ９４／１１５３５］。ここで
用いられているＬ−メチオニン γ−リアーゼも、シュ
ードモナス・プチダ培養物から抽出されたものであり、
天然由来のものである。また、ＷＯ９５／１７９０８に
は、組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼのアミノ酸配
列およびそれをコードする塩基配列が記載されている。
しかし、ここには組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼ
をコードするＤＮＡを単離するためのプライマーのみな
らず、そのＤＮＡの供給源も具体的に記載されていな
い。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】医薬として利用される薬物が
純品でなければならないことは当然である。さらには、
相応の需要に耐え得る必要もある。したがって、夾雑物
を伴わない薬物が供給でき、かつ大量生産可能であり得
る遺伝子組換え技術によってＬ−メチオニン γ−リア
ーゼが生産できれば、有用な抗癌剤を提供することが可
能となる。

【０００５】

【課題を解決する手段】本発明者らは、Ｌ−メチオニン
γ−リアーゼを産生しているシュードモナス・プチダ
の一菌株からＬ−メチオニン γ−リアーゼをコードす
るＤＮＡ配列を分離し、それを大腸菌にてクローニング
することに成功し、本発明を完成した。

【０００６】本発明はひとつの態様として、配列番号１
の1番または２番から３９８番のアミノ酸配列からなる
組換えタンパク質、または該アミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付
加の少なくとも１つが生じた、該組換えタンパク質と同
等の機能を示すその変異型タンパク質に関する。好まし
い変異型タンパク質は、配列番号１の１番または２番か
ら３９８番のアミノ酸配列と８５％以上の相同性を示す
アミノ酸配列からなるタンパク質である。本発明の組換
えＬ−メチオニン γ−リアーゼをコードするＤＮＡ配
列を提供するシュードモナス・プチダの一菌株、ＩＣＲ
３４６０株は１９９５年９月２５日から茨城県つくば市
東１丁目１番３号に住所を有する生命工学工業技術研究
所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３８としてブダベス
ト条約の下に寄託されている。

【０００７】以下、本発明をさらに詳細に説明する。 シュードモナス・プチダＩＣＲ３４６０株の諸性状 １．形態 グラム陰性の短桿菌であり、運動性があり、鞭毛の着生
状態は極鞭毛（１本以上）である。好気性であり、嫌気
的条件下では生育しない。細胞の大きさは０．７〜１．
０×２．０〜３．５μｍである。

【０００８】２．培養所見 （１）肉汁寒天平板培地（３０℃、２４〜１６８時間） 形成の遅速：２４時間でコロニー形成 形：円形 表面の状態：平滑 周縁：全縁 高さ：丘状 色調：淡黄色 光沢：温光 光学的性質：不透明

【０００９】（２）肉汁寒天斜面培地（３０℃、２４〜
１６８時間） 生育の良否：良好 形：拡布状 表面の状態：平滑 色調：淡黄色 光沢：温光 光学的性質：不透明 粘稠性：牛酪質

【００１０】（３）肉汁液体培養（３０℃、２４〜１６
８時間） 表面の生育状態：液面に薄膜ができる 濁度：中等度 臭気：臭気が著しい 沈殿：粘土状 沈殿の量：多量

【００１１】３．生化学的諸性状 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）ＭＲテスト：陰性 （３）ＶＰテスト：陰性 （４）インドールの生成：陰性 （５）Ｈ2Ｓの生成：陰性 （６）デンプンの加水分解：陰性 （７）クエン酸の利用：陽性 （８）色素の生成：水溶性の螢光性黄緑色色素を生成 （９）ウレアーゼテスト：陰性 （１０）オキシダーゼテスト：陽性 （１１）カタラーゼテスト：陽性 （１２）ＯＦテスト：酸化により糖を分解 （１３）炭水化物類の利用テスト i) Ｄ−グルコース：陽性 vii) グルコン酸カリウム：陽性 ii) Ｌ−アラビノース：陰性 viii) ｎ−カプリン酸：陽性 iii) Ｄ−マンノース：陰性 ix) アジピン酸：陰性 iv) Ｄ−マンニトール：陰性 x) リンゴ酸：陽性 v) マルトース：陰性 xi) フェニル酢酸：陽性 vi) Ｎ−アセチルグルコサミン：陰性 （１４）アルギニン・ハイドロラーゼ：陽性 （１５）エスクリン加水分解：陰性 （１６）ゼラチン加水分解：陰性 （１７）ＤＮエース産生：陰性 （１８）ＰＮＰＧ：陰性 （１９）アシルアミダーゼ：陰性 （２０）嫌気下の生育：陰性 （２１）酸素に対する態度：好気性

【００１２】以上の結果より、この菌株の分類学的性質
をバージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジー１巻［Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology Vol.1 (1984)］の記載と対比すること
によってシュードモナス・プチダの一菌株であると同定
し、シュードモナス・プチダＩＣＲ３４６０と命名し
た。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は配列番号１に示すアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ配列を大腸菌の宿主／ベクタ
ー系に用いられるベクターに組込み、得られた組換えＤ
ＮＡ分子で形質転換した組換え大腸菌によりＬ−メチオ
ニン γ−リアーゼを製造する方法を包含し、その方法
は以下の工程にて説明される。しかしながら、本発明に
よってＬ−メチオニン γ−リアーゼをコードするＤＮ
Ａ配列が明らかになった後は、これらの工程の一部は省
略または簡略化できることは当業者の認めるところであ
ろう。

【００１４】（１） シュードモナス・プチダに属する
菌株を適当な生産培地、例えばシュードモナス菌が通常
生育できる培地にＬ−メチオニンを加えたものにて２８
℃で一晩培養した培養液より菌体を分離したのち、機械
的に細胞を破砕する。菌体破砕液を遠心分離した後、得
られた上清液よりＬ−メチオニン γ−リアーゼを透
析、２回のイオン交換クロマトグラフィー等により分離
精製し、タンパク質断片化に用いられる適当な化学薬剤
や酵素を用いて消化し、各ペプチド断片を分離した後、
一断片のアミノ末端よりアミノ酸配列を決定する。

【００１５】（２） 得られたＬ−メチオニン γ−リ
アーゼタンパク質に由来するペプチド断片のアミノ酸配
列の一部について、対応する遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
推定し、適当な領域の配列を有するオリゴヌクレオチド
を化学合成し、５’末端を³²Ｐで標識し、遺伝子クロー
ニングのプローブとして使用する。

【００１６】（３） シュードモナス・プチダから染色
体ＤＮＡを抽出し、各種制限エンドヌクレアーゼで消化
したのち、アガロースゲル電気泳動を行ない、Ｌ−メチ
オニン γ−リアーゼタンパク質のＤＮＡ断片を含んで
いると思われるアガロースゲル上の領域を切りだし、Ｄ
ＮＡをゲルから抽出する。

【００１７】（４） 上記工程（３）のＤＮＡを大腸菌
のクローニングベクターに組込み、大腸菌、例えば大腸
菌ＭＶ１１８４株、ＪＭ１０９株に導入したのち、寒天
培地上でコロニーまたはプラークを形成させ、32Ｐ標識
プローブを用いてコロニーまたはプラークハイブリダイ
ゼーションを行なう。プローブと相補性を示す大腸菌の
コロニーまたはプラークを選択し、分離する。

【００１８】（５） 選択した大腸菌の菌株またはファ
ージ粒子より組換えプラスミドを抽出し、制限酵素地図
を作成した後、ベクターに組み込まれたシュードモナス
・プチダ由来のクローン化ＤＮＡ断片の塩基配列を決定
する。決定されたＤＮＡ塩基配列から予測されるアミノ
酸配列を、既に知られているＬ−メチオニン γ−リア
ーゼのアミノ酸部分配列、末端アミノ酸配列、アミノ酸
組成分析の値と照合し、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ
構造遺伝子部分を決定する。

【００１９】（６） 大腸菌由来のプロモーターの後に
Ｌ−メチオニン γ−リアーゼの構造遺伝子が結合する
ように大腸菌の遺伝子発現ベクターに組み込ませて発現
用組換えプラスミドを作成する。

【００２０】（７） 発現用組換えプラスミドを大腸菌
宿主に導入し、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼを産生す
る新規な大腸菌を作成する。

【００２１】上記の工程中で、ＤＮＡの取り扱いに必要
な一般的な操作は当業者ならば容易に行なうことがで
き、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular
Cloning 2nd edition）［Sambrook,Jら、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー(1989)］のような実
験操作書に従えば容易に実施できる。使用される酵素、
試薬等もすべて市販の製品が使用でき、特に断わらない
限り、製品にて指定された使用条件に従って完全に目的
を達成することができる。

【００２２】上記工程（１）においてタンパク質のアミ
ノ酸配列の決定方法は知られている（例えば、市販のア
ミノ酸配列自動シーケンサーが使用できる）。上記工程
（２）において特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチ
ドの合成には市販のＤＮＡ合成装置を用い、その操作手
順に従って実施できる。上記工程（５）におけるＤＮＡ
塩基配列の決定は公知のＭ１３ベクター系を用いた San
ger らの方法［Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.74,5463-54
67(1977)］により決定できる。

【００２３】上記工程（４）においてクローニングに使
用する大腸菌ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ
１１９、ｐＵＣ１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３など
のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０など
のファージベクターが挙げられる。クローニング用およ
び発現用の宿主として使用できる大腸菌としては、エシ
ェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ−１２系統のＨ
Ｂ１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０３株、Ｊ
Ｍ１０５株、ＪＭ１０９株、ＭＶ１１８４株などが使用
可能である。上記のベクターおよび宿主は市販されてお
り容易に入手できる。発現用宿主として酵母を使用すれ
ば、目的の組換えＬ−メチオニン γ−リアーゼは培養
上清から容易に単離することができる。この場合、ベク
ターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などを使用
すればよい。また、宿主としてシュードモナス属細菌を
用い、いわゆるセルフクローニングを行なうこともでき
る。この場合のベクターとしてはＲＳＦ１０１０、ＲＫ
２などを使用すればよい。

【００２４】上記工程（６）において、目的の遺伝子を
大腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを作成
するためには、宿主内で機能する適切なプロモーター
（Lac、Tac、Trc、Trp、λPLなど）とShine-Dalgarno
（ＳＤ）配列を有する発現ベクター（ｐＫＫ２２３−
３、ｐＰＬ−lambda）や、さらに翻訳開始コドンＡＴＧ
を備えたＡＴＧベクター（ｐＫＫ２３３−２、ｐＴｒｃ
９９Ａなど）に目的のＬ−メチオニン γ−リアーゼ構
造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すればよい。この発現
プラスミドを適切な宿主（例えば、E.coli ＪＭ１０３
株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ６００株など）に
導入することにより、効率のよい発現が可能となる。

【００２５】発現されたＬ−メチオニン γ−リアーゼ
は従来の精製方法に従い、遠心分離、ゲル濾過、イオン
交換カラムクロマトグラフィーなどを適当に組み合わせ
て精製すればよい。得られたＬ−メチオニン γ−リア
ーゼのアミノ酸配列中、Ｎ末端にはメチオニンが存在し
ていなくても本来の活性を保持していることが確認され
た。

【００２６】本明細書中、「配列番号１の1番または２
番から３９８番のアミノ酸配列からなる組換えタンパク
質のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残
基が欠失、置換、挿入または付加の少なくとも１つが生
じた、該組換えタンパク質と同等の機能を示すその変異
型タンパク質」とは、その変異型タンパク質の機能また
は活性が実質的に本発明の組換えタンパク質と同じであ
れば、化学的または生化学的な改変、または天然もしく
は非天然のアミノ酸またはアミノ酸配列を含むことので
きる改変タンパク質を意味している。このような変異型
タンパク質は例えば、ＰＣＲ法による部位特異的人工変
異導入など、当業者に周知の手法により調製することが
できる。

【００２７】本発明はさらに、本発明の組換えＬ−メチ
オニン γ−リアーゼまたはその変異体を含有する抗癌
剤をも提供する。本発明の抗癌剤は当業者に周知の賦形
剤を含有でき、典型的には注射剤の形態をとり、凍結乾
燥品とすることもできる。通常は非経口に、数日から数
週間、毎日数十分から数時間かけて注入投与する。投与
量は目的とする効果、患者の性別、年齢、体重、症状の
重篤度等により変動するが、一般には約１−１０００Ｕ
／キログラム体重／日、好ましくは約５０−５００Ｕ／
キログラム体重／日である。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を記載し、本発明をさらに詳細
に説明するが、これらは本発明の限定を意図するもので
ない。なお、以下の実施例中、制限エンドヌクレアーゼ
による消化反応は、各酵素のメーカーのプロトコールに
従い、３７℃にて２時間、所定の緩衝液中にて行なっ
た。また、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによる連結反応は、メー
カーのプロトコールに従い、１６℃にて１６時間、所定
の緩衝液中にて行なった。さらに、プラスミドによる大
腸菌の形質転換はCohenらの方法［Proc. Natl.Acad. Sc
i. U.S.A.69, 2110-2114(1972)］に従って行なった。

【００２９】実施例１ ＤＮＡプローブの合成および末端標識 Nakayama, T. ら、Anal. Biochem. 138,421-424(1984)
に記載の手法に従って、シュードモナス・プチダを、
０．２５％Ｌ−メチオニンを含有する生産培地（０.２
５％Ｌ−メチオニン、０.１％ポリペプトン、０.１％グ
リセロール、０.１％ＫＨ₂ＰＯ₄、０.１％Ｋ₂ＨＰＯ₄、
０.０１％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.０２５％酵母エキ
ス、pH７.２）中で２８℃にて培養した。Nakayama,T.
ら、Anal.Biochem.138,421-424(1984)およびNakayama,
T.ら、Biochemistry 27,1587（1988）に記載の手法に従
って、シュードモナス・プチダの菌体から天然Ｌ−メチ
オニンγ−リアーゼを精製した。精製酵素を臭化シアン
で断片化し、Ｎ末端アミノ配列が含まれる断片を取得
後、そのＮ末端から自動エドマン法によりアミノ酸配列
を決定した。 決定されたアミノ酸配列のうち、Ｎ末端
より１５番目のイソロイシンから２１番目のプロリンま
での配列はＩｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ａｓｐ Ｐｒｏであった（配列番号２）。なお、この配
列は文献未収載である。このアミノ酸配列をコードする
可能性のあるＤＮＡ配列を３９１型ＤＮＡ合成装置［Ap
plied Biosystems］によって種々合成した（図１を参
照）。次いで、得られたＤＮＡプローブの５’末端をMa
xam A. M. およびGilbert W.の方法［Methods Enzymol.
65,499(1980)］に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ［東洋紡］と［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（２２０ＴＢｑ／ｍ
ｍｏｌ）［NEN Research Products］を用いて標識し
た。

【００３０】実施例２ Ｌ−メチオニン γ−リアーゼタンパク質をコードする
ＤＮＡ断片のクローニング １．シュードモナス・プチダからの染色体ＤＮＡの抽出 シュードモナス・プチダＩＣＲ３４６０（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−５２３８）をＬＢ培地で一晩培養、集菌し４ｇの湿
菌体を得た。食塩水−ＥＤＴＡ（０.１５ＭＮａＣｌ、
０.１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０））で２回洗浄した後、
小ローターチューブ（３０ml容）１本に約１ｇの菌体に
なるように食塩水−トリス（０.１ＭＮａＣｌ、０.１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．０１Ｍ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ７．５））に懸濁し、９ｍｌづつ分注した。食
塩水−ＥＤＴＡに溶解した２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム
溶液（ナカライテスク）を１ｍｌ加え、３７℃、２０分
間インキュベートした。次にトリス−ＳＤＳ（食塩水−
トリス−ＥＤＴＡ（０.１４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ト
リス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８.０））中、５％ＳＤＳ）を３ｍｌ加えてチューブを
ゆっくり上下にひっくり返しながら懸濁した後、６０
℃、２０分間インキュベートした。チューブを室温に戻
し、１.５ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ［和光純薬］を
２.５ｍｌ加え、１０時間インキュベートした。これに
フェノール（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.
０）飽和フェノール）を等量加え、３０分間時々ゆっく
り振とうさせながら放置した。３０００ｒｐｍ、１０分
間遠心分離し、水層を冷エタノールの入ったビーカーに
まとめた。ガラス棒でＤＮＡを巻きとり、７０％、８０
％、９０％エタノールの順に洗い、０.１×ＳＳＣ（０.
０１Ｍ ＮａＣｌ、０.００１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム）２０ｍｌに懸濁後、フェノール処理を再度行なった
後、１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ ＡをＤＮＡ溶液に１
００μl加えて３７℃、１時間インキュベートした。そ
の後もう一度フェノール処理を行ない、１５ｍｌの食塩
水−トリス−ＥＤＴＡにＤＮＡを懸濁した。１０,００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄みをＴＥ（１０ｍ
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８.０））で一晩透析（透析チューブは、１ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）と２％Ｎａ₂ＣＯ₃で１０分間煮
沸後、水洗し、再び１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）で１
０分間煮沸したものを用いた）し、２５μlのクロロホ
ルムを加えたものをＤＮＡ標品とした。また、ＤＮＡの
純度は、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度の比を計算す
ることで確認した。湿菌体４ｇから５ｍｇの総ＤＮＡ量
が得られた。

【００３１】次いで、このＤＮＡ８０μｇあたり制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩ５６０ユニットを至適条件化
で反応させた。得られた反応物を通常のアガロースゲル
電気泳動に供した後、Southern の方法［Southern, E.
M. Methods Enzymol. 68,152-176(1979)］により、実施
例１にて合成した³²Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いたサザンブロットハイブリダイゼーションを
行ない、特異的シグナルが検出された１ kb 付近の断片
をアガロースゲルより切り出し、Vogelsteinおよび Gil
lespie の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.76,615
-619(1979)］を用いてゲルよりＤＮＡを抽出した。

【００３２】２．ＰｓｔＩ断片のクローニング プラスミドｐＵＣ１１８［宝酒造］１.５μｇを制限エ
ンドヌクレアーゼＰｓｔＩ２０ユニットで消化した。工
程１にて得られたＰｓｔＩ断片の混合物２μｇをＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼ［Nippon Gene］１０００ユニットと共に
切断ｐＵＣ１１８溶液（２μｌ）に加え、該断片をプラ
スミドｐＵＣ１１８に連結させた。得られた組換えプラ
スミド混合物を用いて大腸菌ＭＶ１１８４株［宝酒造］
を形質転換した。形質転換体を、５０μｇ／ｍｌアンピ
シンを含有するＬ−寒天培地（１％ポリペプトン、０．
５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上に塗
付し、３７℃、１晩インキュベートした。出現した組換
え体に由来するコロニーをナイロン膜［商品名 Hybond
N+, Amersham］に移しとったのち、当業者に周知の所定
の処理によりＤＮＡを膜に固定した。実施例１にて合成
した³²Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた
コロニーハイブリダイゼーション法によってスクリーニ
ングした［Hanahanら、Gene10,63-67(1980)］。これに
より、ＰｓｔＩ断片を含有する組換えプラスミドｐＭＲ
１を有する１個の陽性コロニーが得られた。

【００３３】得られたプラスミドｐＭＲ１のＤＮＡ塩基
配列分析の結果、挿入ＰｓｔＩ断片は９３１ｂｐであ
り、Ｌ−メチオニン γ−リアーゼ遺伝子の５’側領域
４２２ｂｐしか存在しないことが判明した。なお、ＤＮ
Ａ塩基配列分析は、ジデオキシチェーンターミネーショ
ン法［Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.74, 5463
-5467 (1977)］によって行なった。

【００３４】３．再度のゲノムライブラリーの構築 まず、再度のクローニングに先立ち、工程２にて得られ
たプラスミドｐＭＲ１を用い、Ｌ−メチオニン γ−リ
アーゼ遺伝子の５’側領域４２２ｂｐが含まれるＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ領域に対するプローブを次のように
して調製した。プラスミドｐＭＲ１（３０μｇ）を制限
エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ３００ユニットで消
化し、エタノール沈殿により反応を停止させ、次いでＰ
ｓｔＩ３００ユニットで消化し、４５３ｂｐのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＰｓｔＩ断片を入手した。ランダムプライマー
ラベリングキット［宝酒造］を使用して、この断片を
［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（２２０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ［NEN
Research Products］）で標識した。

【００３５】次いで、工程１と同様にしてシュードモナ
ス・プチダＩＣＲ３４６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３
８）から染色体ＤＮＡを入手し、得られたＤＮＡ４０μ
ｇを制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ７５ユニットで消
化した。得られた反応物を通常のアガロースゲル電気泳
動に供した後、工程３で得た標識プローブでサザンブロ
ットハイブリダイゼーションを行ない特異的シグナルが
検出された２．６ｋｂ付近の断片をアガロースゲルより
抽出した。一方、クローニングファージベクターλＺＡ
ＰＩＩ［Stratagene］２．３μｇを同様にＳａｃＩ２０
ユニットで消化した。両ＳａｃＩ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結し、得られたＤＮＡを以下のようにし
てパッケージングした。ファージ粒子形成（パッケージ
ング反応）には、LAMBDA INN in vitro パッケージング
キット［Nippon Gene］を用いた。λZAP IIファージＤ
ＮＡ（０．１μｇ）１μｌをパッケージング抽出液の入
ったチューブに加え、２２℃、２時間インキュベートし
た。ＳＭ緩衝液（０.５８％ ＮａＣｌ、０.２％ ＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７.５、
０.０１％ゼラチン）５００μlを加えて穏やかに混合
し、クロロホルム１滴を加えたものをファージ溶液とし
た。

【００３６】５ｍｌ ＬＢ培地（０.２％マルトース、１
０ｍＭ ＭｇＳＯ4を含む）に大腸菌XL1-Blue株を植菌
し、一晩培養後、１ｍｌをエッペンドルフチューブに分
注し、３,０００ｒｐｍ、７分間遠心した。上清を捨
て、２００−３００μｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ に懸濁
し、１００μｌづつ分注した。これにＳＭ緩衝液で希釈
した先のファージ溶液を１０μｌ感染させ、３７℃、２
０分間インキュベートした。４８℃で保温しておいたＮ
ＺＹ上層アガロース培地（１％ＮＺアミン（カゼイン酵
素分解物）、０．５％ ＮａＣｌ、０．５％酵母エキ
ス、０．２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０．７％ アガロー
ス、ｐＨ７．５）３ｍｌに０.５Ｍ イソプロピル−β−
チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１２５μｇ／ｍ
ｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ
−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）を５０μｌづつ添加した
ものに感染菌を加え、ＮＺＹアガロース培地（１％ＮＺ
アミン（カゼイン酵素分解物）、０.５％ ＮａＣｌ、
０.５％ 酵母エキス、０.２％ ＭｇＳＯ₄-７Ｈ₂Ｏ、１.
５％アガロース、ｐＨ７.５）上に重層した。培地表面
が乾いてから３７℃、６−７時間培養し、プラークを形
成させた。

【００３７】Benton, W. D.および Davis, A, W.、Scie
nce 196, 180-182(1977)手法に従い、プレート上に形成
されたプラークを Hybond N＋ナイロン膜に写しとり、
この膜のＤＮＡを０.４Ｎ ＮａＯＨで固定して、先に調
製したプローブとハイブリダイズし、オートラジオグラ
フィーにかけ、陽性クローン２個を入手した。クローン
化されたＤＮＡ断片を持つ組換えファージＤＮＡをYama
moto らの方法［Virology 40, 734(1970)］により精製
した。挿入されているＤＮＡ断片の制限エンドヌクレア
ーゼ分析により、両者には同じ２．６ｋｂｐのＳａｃＩ
断片が挿入されていることが判明した。

【００３８】４．クローニングベクターの作成 クローニングベクターｐＵＣ１１８（３μｇ）を制限エ
ンドヌクレアーゼＳａｃＩ２０ユニットで消化した。こ
れを工程３にて得られた２．６ｋｂｐのＳａｃＩ断片と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０００ユニットを用いて連結し、
２つのプラスミドを入手した。それらをプラスミドｐＹ
Ｈ１およびｐＹＨ２と命名した。これらのプラスミドを
形質転換によって大腸菌ＭＶ１１８４株に導入し、発現
するＬ−メチオニン γ−リアーゼ活性を調べた。各プ
ラスミドを含有する形質転換体を５０μｇ／ｍｌアンピ
シリン、１ｍＭＩＰＴＧを含有するＬ−ブロス中、３７
℃で１７時間培養し、得られた菌体より、文献記載の手
法［Nakayama,T.ら、Anal.Biochem.138,421-424(198
4)］に従って無細胞抽出液２．５ｍｌを調製した。アッ
セイ系には、りん酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２０
０μｍｏｌ、Ｌ−メチオニン４０μｍｏｌ、ピリドキサ
ール５’−りん酸０．０４μｍｏｌおよび上記の無細胞
抽出液を最終容量１．６ｍｌ中に含ませた。３７℃にて
５分間、インキュベートを行ない、５０％トリクロロ酢
酸０．２ｍｌを加えてその反応を停止させた。遠心上清
を取得後、Sodaの方法［Anal.Biochem.25,228-235(196
8)］に従い、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン・ヒ
ドラゾンを用いて反応生成物であるα−ケト酪酸を測定
した。なお、タンパク質量は、ウシ血清アルブミンを標
品として用い、Lowryら、J.Biol.Chem.193,265-275(195
1)の方法により測定した。

【００３９】この分析により、プラスミドｐＹＨ１を含
有する大腸菌からの細胞抽出液ではＬ−メチオニン γ
−リアーゼ活性が認められたのに対し、他方のプラスミ
ドｐＹＨ２を含有する大腸菌からの細胞抽出液ではＬ−
メチオニン γ−リアーゼ活性は全く認められなかった
（データは後述の表１）。このことから、これら２つの
プラスミドは、ｐＵＣ１１８のＬａｃプロモーターに対
して順方向または逆方向にＳａｃＩ断片が挿入されてい
る点で異なっていることが判明した。

【００４０】実施例３ ＤＮＡ配列決定 実施例２にて調製したプラスミドｐＹＨ１を用い、Ｌ−
メチオニン γ−リアーゼをコードするＤＮＡ領域およ
びその周辺の領域の塩基配列を決定した。まず、ｐＹＨ
１から塩基配列を決定すべき領域を取りだし、ベクター
ｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９にサブクローンする。
次に、Vieraらの方法［MethodsEnzymol. 153,3-11(198
7)］に従い、ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を感染させ
ることにより、それぞれの１本鎖ＤＮＡを調製した。こ
れらの１本鎖ＤＮＡを鋳型として［γ−32Ｐ］ＡＴＰ
（２２０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ：NEN Reserch Products］で
標識したＭ１３シークエンスプライマー、ＢｃａＢＥＳ
Ｔシークエンシングキット［宝酒造］を用いて、ジデオ
キシチェーンターミネーション法によりＤＮＡの塩基配
列を決定した。その結果を配列番号１に示す。６１番目
に位置するＡＴＧから始まる全長１１９４塩基からなる
１つのオープンリーディングフレームが認められた。こ
の領域は３９８アミノ酸残基からなるタンパク質をコー
ドしており、次の事実からこのオープンリーディングフ
レームがＬ−メチオニン γ−リアーゼの構造遺伝子と
結論した： ａ）Ｎ末端のアミノ酸配列が既に決定されているＬ−メ
チオニン γ−リアーゼの配列[Nakayama,T.ら、Bioche
mistry 27,1587-1591(1988)]に一致している； ｂ）コードしているタンパク質の予測されるアミノ酸組
成がＬ−メチオニンγ−リアーゼのそれと良い一致を示
す［Nakayama,T.ら、前掲］； ｃ）予測される分子量［Nakayama,T.ら、Anal.Biochem.
138,421-424(1984)］もＬ−メチオニン γ−リアーゼ
のサブユニット分子量（約４３ｋＤａ）に一致する。

【００４１】実施例４ 発現プラスミドの構築 組換え大腸菌ＭＶ１１８４／ｐＹＨ１は、Ｌ−ブロス
中、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ添加により効率的にＬ−メ
チオニン γ−リアーゼ活性を発現した。しかし、より
高い活性を示すプラスミドを構築すべく、以下の操作を
行なった。ｐＹＨ２（２０μｇ）を１０Ｕの Ｓａｌ Ｉ
で部分消化し、１.５ｋｂのＳａｌ Ｉ断片を調製した。
ついで、ｐＵＣ119［宝酒造］３μｇをＳａｌ Ｉ ２０
Ｕで消化し、得られた３.１４ｋｂの断片と、先に調製
した１.５ｋｂのＳａｌ Ｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼ１
０００Ｕを用いて連結させ、ｐＹＨ１０１を得た。次い
でｐＹＨ１０１ ２μgをＨｉｎｄ III ２００Ｕで消化
し、得られた４.５ｋｂ 断片自身を、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ１０００ユニットを用いて連結させ、形質転換により
大腸菌ＭＶ１１８４株に導入した。５０μｇ／ｍｌアン
ピシンを含有するＬ−寒天培地上、３７℃にて１晩イン
キュベートすることにより形質転換体を選択した。目的
とする組換え体よりｐＹＨ１０３と称する組換えプラス
ミドを入手した。プラスミドｐＹＨ１０３の制限酵素断
片地図を添付の図２に示す。

【００４２】実施例２の工程４に記載の手法に従って、
プラスミドｐＹＨ１０３のＬ−メチオニン γ−リアー
ゼ発現活性を検定した。得られた結果を以下の表に示
す。

【表１】 酵素比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質） ＬＢ ＬＢ（ＩＰＴＧ） ｐＹＨ１ ０．００８ ０．３９ ｐＹＨ２ ＮＡ − ｐＹＨ１０３ − ０．７１ 注：酵素活性１Ｕは、メチオニンを基質として３７℃、１分間にα−ケト酪酸 １μｍｏｌを生成させる酵素の量を意味する。 ＬＢとはＬ−ブロスを意味し、ＬＢ（ＩＰＴＧ）とは、１ｍＭ ＩＰＴＧを含 有するＬ−ブロスを意味する。 ＮＡは「活性なし」を、−は「検定していないこと」をそれぞれ意味する。

【００４３】実施例５ 高い発現活性を示すプラスミドの構築 実施例４にて調製したｐＹＨ１０３（５μｇ）を制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ３０ユニットで消化
し、エタノール沈殿し、次いでＢａｍＨＩ３０ユニット
で切断後、アガロース電気泳動に供した。Ｌ−メチオニ
ン γ−リアーゼの構造遺伝子を含む１．３５ｋｂｐの
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をゲルから抽出し精製
後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）−１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））２０μｌに溶解
した。次に、この液５μｌにクレノー酵素［Nippon Gen
e］２ユニットを添加して、得られた断片を平滑末端化
した。次いで、プラスミドｐＫＫ２２３−３［Pharmaci
a Biotech］３μｇを制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ
３０ユニットで消化した。この溶液３μｌと先に得た平
滑末端化断片の溶液１０μｌと、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１
０００ユニットと共にインキュベートして両者を連結さ
せ、プラスミドｐＹＨ３０１を作成した。プラスミドｐ
ＹＨ３０１の制限酵素断片地図を添付の図３に示す。宿
主として大腸菌ＪＭ１０９株［宝酒造］を使用する以外
は、実施例２の工程４に記載の活性測定手法に従い、プ
ラスミドｐＹＨ３０１の検定を行なった。これにより、
プラスミドｐＹＨ３０１を保持する組換え体は、１ｍＭ
ＩＰＴＧを含有するＬ−ブロス中、３７℃で１７時間
培養した時、菌体から得られた細胞抽出液中に０．８２
Ｕ／ｍｇの比活性を有していることが判明した。

【００４４】

【発明の効果】本発明の組換えＬ−メチオニン γ−リ
アーゼを構成するタンパク質またはその変異体は、組換
え大腸菌を適切な培地で培養し、得られた菌体の可溶性
画分（無細胞抽出液）から自然に４量体からなる活性型
の酵素となる。本発明のタンパク質またはその変異体の
多量体、好ましくは４量体からなる酵素は抗癌剤として
有用である［ＷＯ９４／１１５３５］。

【００４５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 配列 ＴＧＧＡＡＡＡＡＴＴ ＴＡＡＧＣＣＧＧＴＣ ＴＧＴＧＧＡＡＴＡＡ ＧＣＴ
ＴＡＴＡＡＣＡ ＡＡＣＣＡＣＡＡＧＡ ＧＧＣＧＧＴＴＧＣＣ ６０ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＧＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＧＧＡ
ＴＴＴ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＡＴＴ ＣＡＣ １０８ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ １ ５
１０ １５ ＣＡＴ ＧＧＣ ＴＡＣ ＧＡＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＧＣ
ＧＧＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＣＡ ＣＣＧ ＧＴＣ １５６ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｖａｌ ２０ ２５
３０ ＴＡＣ ＣＡＧ ＡＣＣ ＧＣＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＣＣ
ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＡＡ ＴＡＣ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＣＧ ２０４ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ ３５ ４０
４５ ＴＧＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴ
ＴＴＣ ＴＡＣ ＡＧＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＡＣ ２５２ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｈｉｓ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ ５０ ５５
６０ ＣＣＣ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＧＣ
ＡＴＧ ＧＣＣ ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ３００ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ ６５ ７０
７５ ８０ ＧＡＧ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＣＧ ＧＧＣ
ＡＴＧ ＧＧＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＡＣＧ ＴＣＣ ＡＣＧ ３４８ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｙ
Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ８５
９０ ９５ ＣＴＡ ＴＧＧ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ
ＧＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ３９６ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｈｒ １００ １０５
１１０ ＣＴＧ ＴＡＣ ＧＧＣ ＴＧＣ ＡＣＣ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＴＣ ＣＴＧ
ＣＡＣ ＣＡＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＧＡＧ ＴＴＣ ４４４ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｈｅ １１５ １２０
１２５ ＧＧＧ ＧＴＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ ＧＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ
ＧＣＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ４９２ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｍｅｔ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １３０ １３５
１４０ ＧＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＣＧＧ ＧＴＧ
ＡＴＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ５４０ Ａｌａ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｌａ １４５ １５０
１５５ １６０ ＡＡＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＡＣ ＡＴＧ ＧＣＣ ＧＡＴ ＡＴＣ
ＧＣＣ ＧＧＣ ＧＴＧ ＧＣＧ ＡＡＧ ＡＴＴ ＧＣＡ ５８８ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ａｌａ １６５
１７０ １７５ ＣＧＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＣ ＧＣＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＣ
ＧＡＣ ＡＡＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＣＧ ６３６ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｐｒｏ １８０ １８５
１９０ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＧＧ ＣＣＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＧＣ
ＧＣＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＣＡＴ ＴＣＧ ６８４ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｓｅｒ １９５ ２００
２０５ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＡＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＡＴ ＧＧＣ
ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＴＴ ＧＴＧ ７３２ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｖａｌ ２１０ ２１５
２２０ ＧＴＧ ＧＧＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＣ ＣＧＴ
ＡＴＡ ＣＧＴ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ７８０ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＣＣ ＧＧＴ ＧＣＧ ＧＴＧ ＣＴＣ ＴＣＧ ＣＣＣ
ＣＡＴ ＧＡＣ ＧＣＣ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＴＧ ８２８ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔ ２４５
２５０ ２５５ ＣＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＣＴＣ ＡＡＣ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＡＴＧ ＧＡＣ ＣＧＣ ＣＡＣ ＴＧＣ ＧＣＣ ＡＡＣ ８７６ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ ２６０ ２６５
２７０ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＡＧ ＴＴＣ ＣＴＣ ＧＣＣ
ＣＧＧ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＣＴＧ ９２４ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ ２７５ ２８０
２８５ ＡＴＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＧＣ ＴＴＣ
ＣＣＧ ＣＡＧ ＴＡＣ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ９７２ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ ２９０ ２９５
３００ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＴＧ
ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＧＣ １０２０ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｍｅｔ
Ｉｌｅ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＣＣ ＧＧＧ ＣＧＧ ＣＧＧ ＴＴＣ ＡＴＧ
ＡＡＣ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＧＣ １０６８ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ３２５
３３０ ３３５ ＣＧＣ ＧＣＧ ＧＴＧ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＡＧ
ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＣＣＧ ＧＣＡ １１１６ Ａｒｇ Ａｌａ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｌａ ３４０ ３４５
３５０ ＡＧＣ ＡＴＧ ＡＣＴ ＣＡＴ ＴＣＣ ＡＧＣ ＴＡＴ ＡＣＣ ＣＣＡ
ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＧＴ ＧＣＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＧＧＣ １１６４ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ３５５ ３６０
３６５ ＡＴＣ ＴＣＣ ＧＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＧＧ ＴＴＧ ＴＣＧ
ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＣ １２１２ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｓｐ ３７０ ３７５
３８０ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＧＣＡ
ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＣＧ ＡＧＴ ＧＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ １２６０ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ ＊＊＊ ３８５ ３９０
３９５ ＣＧＴＣＡＣＧＧＡＴ ＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧ ＣＡＡＴＧＧＴＧＧＣ ＡＡＴ
ＧＡＴＧＡＡＣ ＣＴＴＧＴＧＣＣＴＧ ＧＣＧＡＣＧＧＣＧＴ １３２０

【００４６】配列番号：２ 配列の長さ：７ 配列の型：ペプチド 配列： Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ １ 5

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｌ−メチオニン γ−リアーゼをコードする
ＤＮＡを単離するためのプローブとして採用し得る種々
の配列である。

【図２】 発現プラスミドｐＹＨ１０３を構築するため
のフローチャートを示す模式図である。

【図３】 発現プラスミドｐＹＨ３０１を構築するため
のフローチャートを示す模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/56 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:40） (72)発明者 稲垣 賢二 岡山市津高台１−2006−14 (72)発明者 江崎 信芳 大津市黒津２−21−12 (56)参考文献 国際公開95／17908（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12N 9/00 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の1番または２番から３９８
   番のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質、または該
   アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基が
   欠失、置換、挿入または付加の少なくとも１つが生じ
   た、その多量体がＬ−メチオニンγリアーゼ活性を示す
   その変異型タンパク質。
2. 【請求項２】 シュードモナス・プチダ由来のＤＮＡ配
   列によってコードされている請求項１に記載のタンパク
   質。
3. 【請求項３】 シュードモナス・プチダＩＣＲ３４６０
   （ＦＥＲＭ ＢＰ−５２３８）由来のＤＮＡ配列によっ
   てコードされている請求項１に記載のタンパク質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のタンパク質の多量体か
   らなる酵素。
5. 【請求項５】 ４量体である請求項４に記載の酵素。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質をコードす
   るＤＮＡ分子。
7. 【請求項７】 請求項１に記載の変異型タンパク質をコ
   ードするＤＮＡ分子。
8. 【請求項８】 配列番号１の６１番または６４番から１
   ２５４番のＤＮＡ配列からなる請求項６に記載のＤＮＡ
   分子。
9. 【請求項９】 請求項６から８までのいずれかに記載の
   ＤＮＡ分子を含有するベクター。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載のベクターによって形
    質転換されている宿主細胞。
11. 【請求項１１】 大腸菌である請求項１０に記載の宿主
    細胞。
12. 【請求項１２】 請求項１０に記載の宿主細胞を培養
    し、得られた菌体から回収精製することを特徴とする、
    請求項４または５に記載の酵素の製造方法。
13. 【請求項１３】 請求項４または５に記載の酵素を含有
    する抗癌剤。