JPH0779775A

JPH0779775A - Ｎａｄ（ｈ）結合型酸化還元不均化酵素およびその遺伝子

Info

Publication number: JPH0779775A
Application number: JP5190048A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Kato; 暢夫加藤; Eiji Yanase; 英司簗瀬; Keiko Kita; 恵子喜多
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1995-03-28

Abstract

(57)【要約】【構成】ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ
６１株からＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵素のｃ
ＤＮＡをクローニングして、そのＤＮＡ配列およびそれ
より推定されるアミノ酸配列を決定した。【効果】本発明のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化
酵素を用いることにより、各種のＣ₁ 化合物が関与する
化学反応を効率よく行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化
還元不均化酵素およびその遺伝子に関し、詳細にはホル
ムアルデヒドジスムターゼ、その遺伝子（ｃＤＮＡ）、
および該遺伝子を含有する形質転換体による組換えホル
ムアルデヒドジスムターゼの産生方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】一酸
化炭素、二酸化炭素、メタン、メタノール等の分子内に
炭素原子を１個含む化合物を原料として有用な化学品を
生産する体系は、Ｃ₁ 化学と呼ばれ、石油に依存しない
新しい化学として従来より研究が行われている。Ｃ₁ 化
合物、すなわち前記した分子内に炭素原子を１個含む化
合物は、メチロトローフによる分解や、細胞構成成分の
合成の過程でさまざまな酵素反応を受けることが知られ
ている。また生態系における物質循環の多様性を考慮す
ると、有機物質の分解で生ずるＣ₁ 化合物は、メチロト
ローフの増殖基質になるだけではなく、他の微生物によ
る部分的な反応も受けていることが推定される。

【０００３】このような観点から、本発明者らは微生物
によるＣ₁化合物代謝の中心物質であり、高濃度では毒
性を示すホルムアルデヒドを対象物質とし、これらに何
らかの化学変化を引き起こして増殖する微生物をスクリ
ーニングした結果、ホルムアルデヒドに高い耐性を示す
ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６１株（Ｆ
ＥＲＭＰ−７１６５）を分離した。そしてこのＰ．ｐ
ｕｔｉｄａＦ６１株に、ホルムアルデヒドをメタノー
ルとギ酸へ不均化する新規な酸化還元酵素、ホルムアル
デヒドジスムターゼ（以下、「ＦＤＭ」と略す）を見出
した（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４７，３９
（１９８３）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５
６，５９（１９８６）等）。

【０００４】ＦＤＭは、分子量４４，０００のサブツニ
ットの４量体であり、サブユニット当たり１分子のＮＡ
Ｄ（Ｈ）と２原子の亜鉛を結合している。またＦＤＭは
酵素活性中心に非共有的に強く結合したＮＡＤ（Ｈ）を
持ち、これにより系外からＮＡＤ（Ｈ）を添加すること
なしに、（１）アルデヒド類の酸とアルコールへの不均
化、（２）異種アルデヒド間の交叉不均化、（３）アル
コールとアルデヒドの分子種を交換するアルコール・ア
ルデヒド酸化還元反応、を触媒する。（１）２ＲＣＨＯ＋Ｈ₂ Ｏ → ＲＣＯＯＨ＋ＲＣＨ
₂ ＯＨ（２）ＲＣＨＯ＋Ｒ’ＣＨＯ＋Ｈ₂ Ｏ → ＲＣＯＯ
Ｈ＋Ｒ’ＣＨ₂ ＯＨ（３）ＲＣＨ₂ ＯＨ＋Ｒ’ＣＨＯ → ＲＣＨＯ＋
Ｒ’ＣＨ₂ ＯＨこれら一連の反応において、一般のＮＡＤ（Ｈ）関与酸
化還元酵素とは異なり、ＦＤＭではＮＡＤ（Ｈ）が反応
生成物と共に酵素タンパク質から離れることはなく、基
質として加えたアルデヒドやアルコールにより酸化型、
還元型を繰り返す。このようにＦＤＭは極めてユニーク
な性質を有しているにもかかわらず、その分子レベルで
の一次構造は明らかにされていなかった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＦＤＭの分
子レベルでの解析を目的として検討を重ねてきた結果、
ＦＤＭの一次構造を初めて明らかにし、その結果遺伝子
工学的手法により天然型のＦＤＭと同等の活性を有する
組換え体を産生することに成功し、本発明を完成するに
至った。

【０００６】すなわち本発明の要旨は、配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列で表されることを特徴とする
ＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵素、それをコード
する遺伝子、および該遺伝子を含有する形質転換体によ
る当該酵素の生産方法に存する。以下、本発明につき詳
細に説明する。

【０００７】本発明のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均
化酵素は、例えばシュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）Ｆ６１株（ＦＥＲＭＰ−
７１６５）より得ることができる。具体的には、特公平
５−９９５号公報等に記載の条件下で培養したＰ．ｐｕ
ｔｉｄａＦ６１株の培養物を、超音波処理、硫安分
別、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等の公知
の方法により分離・精製してＦＤＭ精製酵素を得、これ
を常法に従ってアミノ酸分析を行うことによりアミノ酸
配列を決定することができる。また以下の実施例に示す
ように、まずＦＤＭをコードするＤＮＡ断片を得、これ
から該ＤＮＡがコードするポリペプチドを求めることも
できる。以下後者の方法につき、より具体的に説明す
る。

【０００８】本発明のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均
化酵素をコードする遺伝子ＤＮＡ断片は、例えば次のよ
うな方法によって得ることができる。ＮＡＤ（Ｈ）結合
型酸化還元不均化酵素をコードする遺伝子を含有するＤ
ＮＡライブラリーとしては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａＦ６１株（ＦＥＲＭＰ−７１６５）か
ら調製してきた染色体ＤＮＡをＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓら
の方法（「モレキュラークローニング」，コールド
スプリングハーバーラボラトリー，８５，１９８２
年）により宿主大腸菌に形質転換し培養したＤＮＡライ
ブラリーが利用できる。そして培養後に形成されたコロ
ニーを、ウェスタンブロッティング等でスクリーニング
することにより、目的とするＤＮＡを含む陽性コロニー
を得ることができる。

【０００９】さらに上記のスクリーニングで陽性のコロ
ニーから、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「モレキュ
ラークローニング」，コールドスプリングハーバ
ーラボラトリー，８５，１９８２年）によりＤＮＡを調
製し、ＳａｌＩ等の適当な制限酵素で切断後、ｐＵＣ１
１８等のプスミドにクローニングし、Ｓａｎｇｅｒらの
ジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））によって目
的ＤＮＡ断片の塩基配列が決定できる。

【００１０】このようにして決定されるＤＮＡ断片の塩
基配列は、例えば配列表の配列番号１に示すものが挙げ
られるが、かかるＤＮＡ断片がコードするポリペプチド
がＦＤＭ活性を有する範囲においては、一部の塩基を改
変しても差し支えない。また本発明のＮＡＤ（Ｈ）結合
型酸化還元不均化酵素は、配列表の配列番号１に示すア
ミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、ＦＤＭ活性
を損なわない範囲で一部のアミノ酸を除去、置換、修飾
または付加するなどの改変を行ったものも、本発明のＮ
ＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵素に包含される。

【００１１】上記のようにして得られるＤＮＡ断片は、
その５’末端を修飾して公知の発現ベクターにそれ自体
公知の方法でプロモーターの下流に挿入され、次いで上
記のＤＮＡ断片が挿入された発現ベクターは、大腸菌、
酵母、動物細胞等の宿主細胞中にそれ自体公知の方法に
より導入される。本発明のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元
不均化酵素の産生方法につき詳細に説明すると、発現ベ
クターとしては上記のようにして得られたＤＮＡ断片を
転写できる位置にプロモーターを含有しているものが使
用される。例えば大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とす
るときには、発現ベクターはプロモーター、リボゾーム
結合（ＳＤ）配列、ＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化
酵素をコードする遺伝子、転写終結配列、およびプロモ
ーターを制御する遺伝子より成ることが好ましい。

【００１２】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、ラムダファージ
ＰL 、ＰR 、Ｔ5 ファージの初期遺伝子のプロモーター
であるＰ25、Ｐ26プロモーター等が挙げられる。また、
これらは例えばｐａｃプロモーター（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，９８３（１９８８））のよう
に独自に改変、設計された配列でも良い。

【００１３】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。

【００１４】更にこれらの発現に必要な因子の発現プラ
スミド上での配列順序は、５’上流から、プロモータ
ー、ＳＤ配列、ＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵素
をコードする遺伝子、転写終結因子の順に並ぶ事が望ま
しい。また発現ベクター上のＳＤ配列とＮＡＤ（Ｈ）結
合型酸化還元不均化酵素をコードする遺伝子とのユニッ
トを複数個同方向に挿入することにより、ベクター上の
転写単位のコピー数を増加させる方法（特開平１−９５
７９８号公報）を用いることもできる。

【００１５】発現ベクターとして使用できるものとして
は、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公報）や市販
のｐＫＫ２３３−２（ファルマシア社製）等がある。ま
た、融合蛋白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシ
リーズ（ファルマシア社製）等も同様にして使用でき
る。宿主の形質転換法としては、常法に従い行うことが
できる。

【００１６】形質転換体の培養は、モレキュラークロ
ーニング（コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー，１９８２年）に記載の方法を参考にして行うことが
できる。培養温度としては、２８〜４２℃が適当であ
る。また、形質転換に用いる宿主としては、例えば後述
の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とくに大腸菌
に限定されるものではなく、他の微生物、動物細胞、昆
虫細胞などの宿主生物を用いることができる。

【００１７】上記形質転換体を培養して得られるＮＡＤ
（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵素は、公知の方法で宿主
から単離・精製される。かくして得られる組換え酵素
（組換えＦＤＭ）を用いて、前記（１）〜（３）に示す
反応を行うことができる。かかる反応には、上記で得ら
れた組換えタンパク質の他に、形質転換体の培養液、分
離菌体、菌体処理物、固定化菌体、粗酵素液、酵素処理
物、固定化酵素等が用いられる。

【００１８】

【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。

【００１９】実施例１ＦＤＭ染色体ＤＮＡの調製ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６１株（Ｆ
ＥＲＭＰ−７１６５）をホルムアルデヒド含有（０．
０２％）プレートに画線した後、単一コロニーをＡ培地
［０．５％ＮａＣｌ，０．１％Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ，０．
５％ペプトン，０．５％ｒｅｎｄｅｒｅｘｔｒａ
ｃｔ（ｐＨ７．０）］５ｍｌに植菌し、３０℃で一晩振
とう培養した。Ａ培地５００ｍｌに前記培養液５ｍｌを
移し、３０℃で一晩振とう培養した。培養液を遠心分離
し（０℃、４０００ｒｐｍ、１０分間）、上澄み液を捨
てて沈殿物をＳＥ［０．１５ＭＮａＣｌ，０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ，ＨＣｌでｐＨ８．０に調整］５０ｍｌに懸濁
した。遠心分離およびＳＥへの懸濁を再度繰り返した
後、リゾチーム１０ｍｇを加えて３７℃で６０分間イン
キュベートした後、凍結−再融解を繰り返して細胞を破
壊した。次に２５％ＳＤＳ２ｍｌを、最終濃度が１％
となるように穏やかに振とうしながら加え、６０℃で１
０分間加熱した。ＲＮａｓｅ２６０μｌを最終濃度が
５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３〜４時間
静置した。更にプロテイナーゼＫ（シグマ社製）２６０
μｌを終濃度５０μｇ／ｍｌになるよう加えて３７℃で
一晩インキュベートした。次に等量のＴＥ飽和フェノー
ル［核酸抽出用のフェノール５００ｇ，８−ヒドロキシ
キノリン０．５ｇ，ＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍ
ＭＥＤＴＡ，ＨＣｌでｐＨ８．０に調整）３００ｍ
ｌ］を加えて穏やかに混合し、遠心分離（２０℃、７０
００ｒｐｍ、２０分間）した後、等量のイソ・クロ［ク
ロロホルム４８０ｍｌにイソアミルアルコール２０
ｍｌを加えたもの］を加えて穏やかに混合し、遠心分離
（２０℃、７０００ｒｐｍ、２０分間）した。上層をと
り、ＴＮＥ［ＴＥ＋１０ｍＭＮａＣｌ］で一晩透
析して（４℃）、染色体ＤＮＡを回収した。

【００２０】実施例２染色体ライブラリーの作成上記実施例１で得られた染色体ＤＮＡ１００μｌ、１
０×Ｈバッファー［１０倍濃度のＨバッファー。Ｈバッ
ファー：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），
１０ｍＭＭｇＣｌ2 ，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ
ＮａＣｌ］２０μｌおよび滅菌した蒸留水８０μｌよ
りなる溶液を調製し、エッペンドルフチューブに分注し
てＳａｕ３ＡＩ１μｌ（５ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加え
て穏やかに混合した。３７℃で１時間程静置した後、
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１μｌを加えてよく
混合し、反応を停止させた。ＴＢＥ［０．８９ＭＴｒ
ｉｓ，０．８９Ｍホウ酸，０．０２ＭＥＤＴＡ］で
電気泳動を行い、約２３〜２５ｋｂ付近のバンドが最も
濃いゲノム部分消化断片を用いて、ショ糖密度勾配遠心
法によるＤＮＡの分画により２３〜２５ｋｂサイズのゲ
ノムを調製した。

【００２１】一方、コスミドベクターｐＬＡＦＲ３（Ｆ
ｒｉｅｄｍａｎＡ．Ｍ．ら，Ｇｅｎｅ，１８，２８９
（１９８２））を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ
ＩＩでそれぞれ消化し、ＣＩＰ（ＣａｌｆＩｎｔｅｓ
ｔｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理を行った。さ
らに、この２つの断片をＢａｍＨＩで消化した。次にＴ
ａＫａＲａｌｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（宝酒造製）を
用いて、２３〜２５ｋｂのゲノムＤＮＡとコスミドベク
ターｐＬＡＦＲ３を連結した。続いてＧｉｇａｐａｃｋ
TMＩＩｐｌｕｓＫｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）を用いてインビトロパッケージングを行い、これ
を大腸菌Ｓ１７−１株に感染させた。テトラサイクリン
を１０μｇ／ｍｌ含有するＬＢプレート［１％バクト
−トリプトン，０．５％バクト−イーストエキストラ
クト，１％ＮａＣｌ，１．５％寒天］に植菌し、４
５４３個の組換え体を得た。このゲノムライブラリーか
ら、目的とする組換え体をＦＤＭ抗体を用いたウエスタ
ンブロッティング法により選択した。その結果、６個の
陽性を示す菌株が得られ、この菌株を再度ウエスタンブ
ロッティング法により選択し、単一なコロニーとして単
離した。これら６個の組換え株から、アルカリＳＤＳ法
によりプラスミドを単離して常法により解析を行ったと
ころ、約２３ｋｂの挿入断片を有する組換えプラスミド
（ｐＦＤＭ１〜６）を確認した。

【００２２】実施例３メチルレッドアッセイによるギ
酸の生成確認実施例２で得られた６個の組換え株および対象としてＰ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６１株を用い
て、ホルムアルデヒドからギ酸への不均化反応を行っ
た。各菌の培養液１．０ｍｌを１．５ｍｌエッペンド
ルフチューブにとり、遠心分離（４℃、５０００ｒｐ
ｍ、５分間）した。アスピレーターで上澄み液を除去し
た後、冷１０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．０）５００μｌに
て懸濁した。トルエンを１０μｌ加え、３０℃で１５分
間振とうした後、メチルレッド溶液２μｌおよびホル
ムアルデヒド液２μｌを加えた。ギ酸が生成される
と、溶液が黄色から赤色に変化する。その結果、６個の
組換え株はいずれもＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株と同程
度の速さで陽性を示した。

【００２３】また生成したギ酸を１０ｍＭＮａＯＨで
滴定してＦＤＭの活性を測定したところ、６個の組換え
株すべてがＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株と同程度のＦＤ
Ｍ活性を示した。実施例４組換えプラスミドの縮小化実施例３において、ＦＤＭ活性が最も安定して再現性を
示した株の組換えプラスミドｐＦＤＭ６をＳａｌＩで消
化し、クローニングベクターｐＵＣ１１８のＳａｌＩサ
イトに連結した。これをコンピテントセルである大腸菌
ＪＭ１０９に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢプレートに植菌し
た。ＦＤＭ抗体を用いたウエスタンブロッティング法に
より陽性クローンを２２株選択し、これらについてさら
にメチルレッドアッセイを行ったところ、１株のみが陽
性を示した。この株のプラスミドをアルカリＳＤＳ法に
より単離して解析を行ったところ、約６．３ｋｂの挿入
断片を有する組換えプラスミドであることが確認され
た。このプラスミドをｐＦＳＡ１８とした。

【００２４】実施例５遺伝子の位置の決定実施例４で作成した組換えプラスミドｐＦＳＡ１８を、
Ｋｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ用ＤｅｌｉｔｉｏｎＫ
ｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用いて種々の制限酵素で消化し
てデリーションクローンを作成した。詳細はＫｉｔに添
付の説明書に従った。得られたクローン株につき、メチ
ルレッドアッセイを行った。結果を図１に示す。この結
果、メチルレッドアッセイで陽性を示した最小の断片
は、ＢｇｌＩＩとＢａｍＨＩ間の約３ｋｂ断片であっ
た。また組換えプラスミドｐＦＢＧ１とｐＦＢＧ２で
は、ｌａｃプロモーターの転写方向が逆であるにもかか
わらず、メチルレッドアッセイにおいて陽性を示した。
このことから、この約３ｋｂ断片上にＰ．ｐｕｔｉｄａ
Ｆ６１株由来の自製のプロモーターが存在していると
考えらる。

【００２５】実施例６組換えＦＤＭタンパクの発現大腸菌クローン株４種（Ｓ１７−１株（ｐＦＤＭ６），
ＪＭ１０９株（ｐＦＳＡ１８），ＪＭ１０９株（ｐＦＢ
Ｇ１），ＪＭ１０９株（ｐＦＢＧ２））およびコントロ
ールとしてＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株、大腸菌Ｓ１７
−１株（ｐＬＡＦＲ３）、大腸菌ＪＭ１０９株（ｐＵＣ
１１８）の無細胞抽出液を調製し、精製したＦＤＭ酵素
とともにＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

【００２６】次にＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株のＦＤＭ
抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。その
結果、どの大腸菌クローン株もＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６
１株のＦＤＭと同じ位置（サブユニット分子量が４４，
０００）にバンドが検出された。この結果から、組換え
大腸菌クローン株内でもＦＤＭタンパク質が発現してい
ることが明らかになった。

【００２７】また上記の無細胞抽出液を用いて、ＩＰＴ
Ｇ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノ
シド）の添加の有無によるＦＤＭ遺伝子の発現を比活性
として測定した。その結果、約３ｋｂ断片を有する組換
えプラスミドｐＦＢＧ１とｐＦＢＧ２は、Ｐ．ｐｕｔｉ
ｄａＦ６１株と比較して４倍程度高い発現が認めら
れ、ＩＰＴＧの有無による影響はほとんど認められなか
った。このことより、Ｐ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株由来
のプロモーターが大腸菌内でも十分に機能していること
が確認された。

【００２８】実施例７組換えＦＤＭタンパクの性質組換えプラスミドｐＦＢＧ１を導入した大腸菌の無細胞
抽出液から、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌおよびハイド
ロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにより、３
２％の回収率で７．５倍に精製し、電気泳動的に均一な
標品として単離した。

【００２９】この酵素標品を用いて、ゲルろ過法および
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量を決定した。その結果、
組換えＦＤＭタンパクはＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株の
ＦＤＭ酵素と同じサブユニット分子量４４，０００の４
量体であることが確認された。次にＰ．ｐｕｔｉｄａ
Ｆ６１株のＦＤＭ抗体を用いて組換えＦＤＭタンパクと
の免疫二重拡散法を行ったところ、両酵素のタンパク沈
降線が完全に融合した。よって両酵素はタンパク質的に
も同分子種であることが明らかになった。また組換えＦ
ＤＭタンパクの紫外線吸収スペクトルを測定した。この
結果、ＰｐｕｔｉｄａＦ６１株のＦＤＭ酵素と同様に
ＮＡＤ結合型酵素に特徴的な３２５ｎｍでの吸収が認め
られた（この吸収は、還元型ＮＡＤＨを測定したことに
よる）。これにより、組換えプラスミドｐＦＢＧ１を導
入した大腸菌が発現する組換えＦＤＭタンパクも、酵素
タンパク質へのＮＡＤの結合が明らかになった。

【００３０】実施例８組換えＦＤＭタンパクを用いた
ホルムアルデヒドの不均化反応組換えプラスミドｐＦＢＧ１を導入した大腸菌が発現す
る組換えＦＤＭタンパクとＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株
のＦＤＭにおけるホルムアルデヒドの不均化反応を検討
した。ホルムアルデヒドを基質として、ＦＤＭにより生
成したメタノールとギ酸の量を測定した。この結果、組
換えＦＤＭタンパクもＰ．ｐｕｔｉｄａＦ６１株由来の
ＦＤＭと同様に、ホルムアルデヒドの減少にともないメ
タノールとギ酸を１対１の割合で生成した。よって組換
えプラスミドｐＦＢＧ１を導入した大腸菌が発現する組
換えＦＤＭタンパクも酵素タンパク質にＮＡＤ（Ｈ）が
結合しており、天然型の酵素と同様に活性型の酵素とし
て機能していることが明らかになった。

【００３１】実施例９配列の決定約３ｋｂ断片からなるＤＮＡの塩基配列を、組換えプラ
スミドｐＦＢＧ１およびそれから調製したデリーション
クローンを用いて、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｈｉｇｈ
（東洋紡社製）により決定した。決定した塩基配列を、
配列表の配列番号１に示す。

【００３２】この約３ｋｂ断片中に、ＦＤＭをコードす
る遺伝子と推定されるオープンリーディングフレーム
（ＯＲＦ）見られる。それは、配列表の配列番号１に記
載の塩基配列で６２３番目のＡから始まり、１８２２番
目のＡで終了すると推定した。またこのＯＲＦがコード
するアミノ酸配列を、配列表の配列番号１に併せて示し
た。

【００３３】この推定結果から、ＯＲＦは１２００ｂｐ
でアミノ酸３９８残基よりなり、推定分子量は４２８４
７．６３Ｄａであった。この分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより得られた値（４４，０００Ｄａ）とよく一致し
た。このアミノ酸配列には、天然のＦＤＭタンパク質か
ら求めた２０残基のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列
番号２）に一致する配列も認められ、また天然のＦＤＭ
タンパク質をリジルエンドペプチダーゼ消化により得ら
れた内部アミノ酸配列の２０残基（配列表の配列番号
３）に一致する配列も認められた。この配列の上流に
は、ＳＤ配列や大腸菌のプロモーター領域に相当する類
似の配列も認められた。さらに、Ｃ末端の下流にターミ
ネーターと推定されるインバーテッドリピートの配列も
存在した。またこのアミノ酸配列の中には、ＮＡＤを補
酵素とする酵素に特徴的なＮＡＤ結合モチーフと推定さ
れるＧＸＧＸＸＧの配列も存在した。

【００３４】

【発明の効果】本発明により、ＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化
還元不均化酵素（ＦＤＭ）のアミノ酸配列を有し、ＦＤ
Ｍ活性を有するポリペプチドをコードする新規なＤＮＡ
断片が得られ、その塩基配列が明らかにされた。そして
本発明で構築した発現プラスミドを有する形質転換体を
培養することにより得られる菌体、菌体抽出物等を用い
ることにより各種のＣ₁ 化合物が関与する化学反応を効
率よく行うことができる。

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２９５２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状起源生物名：ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６
１直接の起源クローン名：ｐＦＢＧ１配列 GGATCTACAA AAACCCTCAC AACGGTGAAA TGGTTGAAAC CAAGAGCGGC AACCATAAAA 60 TCCTCAAGGC TTGGAAAGGT GAGTATGGTG GCGATGTGGT TAAGTCTTGG CTAGTTCAAT 120 AAGCTACCAG ATTAACGCGA CAGCCACTCC AATGGAGTGG CTTGTTTTGC GATCTGGTGG 180 TGAACGCTCG ATGAACAGAC CTTTCATAAT CCCCTAAAGG CAATTGTGTT CGTTTACTTT 240 CTAGCAGGCG CTATCACTCC TGTCGTCAAT ATCAAGCGCC AGCGAAGCCA TCCTAATCTT 300 GAGATCAGCA GGATTATGGG TGATGTGGAT GTAATTGGTT GATGTTTTTT GCGGTCTCCT 360 ATATGGATTT TATAGGTTAA ACAGTTGATT TGGTCGGCTC TTTTGGGGAA AGATTATTTC 420 GATCTTTGTT AATGCCTCCT ATATGTTTTC GTCTAAAATG TTTAATTGTT TTTTGCGAAG 480 ATTAGATAGC CCAAAGGAAT TTTTTCAAAA AACAGCCTTG ACAGGGCTTT GTTCCCGTCT 540 ATCATTTAAG TTCCGTGGTG CGAAAAGTAA AGGAAGACTG AGCACTTAAA GCTAGTTAAC 600 GTTAGCTGAA GGGGTGTTTG CG ATG GCC GGT AAT AAA AGC GTC GTC TAT CAT 652 Met Ala Gly Asn Lys Ser Val Val Tyr His 1 5 10 GGG ACC CGT GAT CTT CGG GTT GAA ACA GTT CCT TAT CCC AAG CTT GAG 700 Gly Thr Arg Asp Leu Arg Val Glu Thr Val Pro Tyr Pro Lys Leu Glu 15 20 25 CAC AAT AAT CGA AAG CTT GAA CAT GCG GTG ATT TTA AAG GTT GTA TCA 748 His Asn Asn Arg Lys Leu Glu His Ala Val Ile Leu Lys Val Val Ser 30 35 40 ACA AAT ATT TGT GGT TCA GAT CAA CAC ATT TAT CGT GGG CGC TTT ATC 796 Thr Asn Ile Cys Gly Ser Asp Gln His Ile Tyr Arg Gly Arg Phe Ile 45 50 55 GTT CCT AAA GGT CAC GTG CTC GGG CAC GAA ATT ACT GGG GAA GTG GTA 844 Val Pro Lys Gly His Val Leu Gly His Glu Ile Thr Gly Glu Val Val 60 65 70 GAA AAG GGC TCG GAT GTC GAA TTA ATG GAC ATC GGC GAT TTA GTG TCT 892 Glu Lys Gly Ser Asp Val Glu Leu Met Asp Ile Gly Asp Leu Val Ser 75 80 85 90 GTG CCT TTT AAT GTT GCG TGC GGG CGG TGC CGC AAC TGT AAA GAG GCG 940 Val Pro Phe Asn Val Ala Cys Gly Arg Cys Arg Asn Cys Lys Glu Ala 95 100 105 CGA TCT GAC GTT TGT GAA AAT AAC CTG GTC AAC CCA GAT GCG GAT TTA 988 Arg Ser Asp Val Cys Glu Asn Asn Leu Val Asn Pro Asp Ala Asp Leu 110 115 120 GGT GCC TTT GGC TTT GAC TTG AAA GGG TGG TCT GGT GGT CAA GCT GAG 1036 Gly Ala Phe Gly Phe Asp Leu Lys Gly Trp Ser Gly Gly Gln Ala Glu 125 130 135 TAT GTT CTT GTT CCT TAT GCT GAC TAT ATG CTG CTC AAG TTT GGT GAT 1084 Tyr Val Leu Val Pro Tyr Ala Asp Tyr Met Leu Leu Lys Phe Gly Asp 140 145 150 AAA GAA CAG GCG ATG GAA AAA ATA AAA GAC CTG ACG CTT ATC TCA GAT 1132 Lys Glu Gln Ala Met Glu Lys Ile Lys Asp Leu Thr Leu Ile Ser Asp 155 160 165 170 ATT CTA CCG ACA GGT TTT CAC GGT TGC GTT TCT GCT GGA GTG AAG CCA 1180 Ile Leu Pro Thr Gly Phe His Gly Cys Val Ser Ala Gly Val Lys Pro 175 180 185 GGT AGC CAT GTT TAC ATT GCA GGT GCA GGT CCA GTA GGA CGT TGT GCG 1228 Gly Ser His Val Tyr Ile Ala Gly Ala Gly Pro Val Gly Arg Cys Ala 190 195 200 GCG GCG GGG GCG CGA CTG TTA GGA GCG GCA TGT GTG ATC GTG GGC GAC 1276 Ala Ala Gly Ala Arg Leu Leu Gly Ala Ala Cys Val Ile Val Gly Asp 205 210 215 CAG AAT CCT GAG CGC CTG AAG CTG CTA TCT GAT GCC GGT TTT GAA ACG 1324 Gln Asn Pro Glu Arg Leu Lys Leu Leu Ser Asp Ala Gly Phe Glu Thr 220 225 230 ATC GAC TTA CGT AAC TCT GCA CCG CTG CGC GAT CAG ATT GAT CAG ATA 1372 Ile Asp Leu Arg Asn Ser Ala Pro Leu Arg Asp Gln Ile Asp Gln Ile 235 240 245 250 CTA GGT AAG CCG GAA GTC GAC TGT GGT GTA GAT GCG GTT GGT TTT GAA 1420 Leu Gly Lys Pro Glu Val Asp Cys Gly Val Asp Ala Val Gly Phe Glu 255 260 265 GCA CAT GGC CTT GGT GAC GAA GCT AAT ACT GAG ACG CCT AAC GGT GCC 1468 Ala His Gly Leu Gly Asp Glu Ala Asn Thr Glu Thr Pro Asn Gly Ala 270 275 280 CTA AAT AGC CTC TTT GAT GTA GTC CGA GCA GGT GGC GCA ATC GGA ATT 1516 Leu Asn Ser Leu Phe Asp Val Val Arg Ala Gly Gly Ala Ile Gly Ile 285 290 295 CCG GGT ATT TAT GTA GGG AGC GAC CCT GAT CCT GTT AAT AAA GAT GCA 1564 Pro Gly Ile Tyr Val Gly Ser Asp Pro Asp Pro Val Asn Lys Asp Ala 300 305 310 GGG AGC GGA CGC TTG CAT CTT GAC TTC GGC AAG ATG TGG ACA AAA TCC 1612 Gly Ser Gly Arg Leu His Leu Asp Phe Gly Lys Met Trp Thr Lys Ser 315 320 325 330 ATA CGG ATT ATG ACT GGA ATG GCA CCA GTG ACA AAC TAC AAT CGC CAT 1660 Ile Arg Ile Met Thr Gly Met Ala Pro Val Thr Asn Tyr Asn Arg His 335 340 345 CTG ACC GAA GCA ATA CTT TGG GAT CAA ATG CCT TAT TTG TCC AAG GTG 1708 Leu Thr Glu Ala Ile Leu Trp Asp Gln Met Pro Tyr Leu Ser Lys Val 350 355 360 ATG AAT ATT GAA GTG ATT ACA CTT GAT CAA GCA CCG GAT GGG TAT GCG 1756 Met Asn Ile Glu Val Ile Thr Leu Asp Gln Ala Pro Asp Gly Tyr Ala 365 370 375 AAA TTC GAT AAG GGG TCT CCC GCT AAG TTT GTT ATC GAT CCG CAT GGC 1804 Lys Phe Asp Lys Gly Ser Pro Ala Lys Phe Val Ile Asp Pro His Gly 380 385 390 ATG TTG AAG AAT AAA TGA GCTAGCATTT GAGGTGTTTC GCGAATGGCG 1852 Met Leu Lys Asn Lys stop 395 ATGCTCTGGC AGTATTGTTA ACGGGCTAAA ATGAGTGTTT TGTAGTGAGT GAAAGCCTGC 1912 CCCACTAAAT TTGTGGGGCA GGCCGTAAGA TCCAGGTGCT CGCACCGTTC AGTCATTCAT 1972 ACTACCCATA GAACTGCCGC TCCCTAATTA CCTGGGAGAG GCAAGGCTCT TGACAAGCAG 2032 GGCCTTTATA AGGCTCGTGA AGTTAATTCG TTGTTCACTG GCTTCGGTAA TTTCTGGTTG 2092 TTTGTCAATG GTTAGCTGAG TATGCAGTTT ATTGGCTGTC GCAGAGGGGG AAGATTTTTG 2152 CAGTCCAGCG CACCTAGTAT GTCCCGCTCG ATGACTCGAA CCATTGCATC TGTAGGAAGG 2212 TCATTTTCTT CTCGTCCAAA AGGATCTTCA AGTTCGTTAC TAATGGTGTC TAGTCCCAAG 2272 AAGGTGTAAC TTACGATAGC GGTGAACACG GGGGCCATCC ATCCAAGGGG CTCTGCCATC 2332 GCGAAAGGCA ACAAGATGCA AAATAGATAA ATGGTCCGAT GGAGCAGTAG GGAGTAAGGG 2392 AACGGAATTG GGGTGGTTTT GATACGTTCG CAAATGCCCT GTACTTGTGT AAGCGCATTC 2452 AGTCGTTCTA CTAGTACCAA GTATCGTACA TCGCTAATCA TTTTATCGGT GGCCAAGCGA 2512 GAGCACGTGG CTCCGATATG TTGCAAAATG TGATCGCTGA CATTGTGACT AGAAGTTAGT 2572 GTATCGCTAG AAAGCCATGA GCTAGCTGCT TGAGCCTCAT GCTCATTGCG AAGTTTGGCA 2632 TTTAGAGCAT GTGCGAACCC ACAGAGACTG CGCAGTATGT CTTCTCTAAG AGATTGGTCA 2692 GATATGGCTG CACTCTCGCG TATAAATGAG CGTATCTCAA TGATCATCAT ACCCCATGCT 2752 TTGCGTCCTT CCCACCAACG ATCATAGCAG GCATTATTGC GGAAGTTCAT GAAAATAGAA 2812 AGGGATAGGC CAAGTAGGGT GAATGGTGTT GCGCTAACAT GTAAAAAATA TTCAGGATGA 2872 CGACTCTCGA TCAAAACTAT CAAGGACGCC AAGATGGCAA TCATCAGGCA TCGTGTCGCG 2932 ATGCGTCTAA CAATGGATCC 2952

【００３６】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状フラグメント型：Ｎ末端フラグメント起源生物名：ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６
１配列 Ala Gly Asn Lys Ser Val Val Tyr His Gly Thr Arg Asp Leu Arg Val 1 5 10 15 Glu Thr Val Pro 20

【００３７】配列番号：３配列の長さ：２０配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状フラグメント型：中間部フラグメント起源生物名：ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＦ６
１配列 Gly Trp Ser Gly Gly Gln Ala Glu Thr Val Leu Val Pro Tyr Ala Asp 1 5 10 15 Tyr Met Leu Leu 20

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えプラスミドｐＦＳＡ１８およびそれのデ
リーションクローンにおけるＤＮＡ断片の長さおよびそ
れらにつきメチルレッドアッセイを行った結果を表す図
面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:40）Ｃ１２Ｒ 1:40）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列で表されることを特徴とするＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化
還元不均化酵素。
【請求項２】請求項１に記載のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸
化還元不均化酵素をコードする遺伝子。
【請求項３】配列表の配列番号１に記載の塩基配列で
表されることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子。
【請求項４】請求項２または３に記載の遺伝子により
コードされるポリペプチドを発現する組換え発現ベクタ
ー。
【請求項５】請求項４に記載の組換え発現ベクター
で、宿主細胞を形質転換させて得られた形質転換体。
【請求項６】請求項５に記載の形質転換体を培養して
請求項１に記載のＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均化酵
素を産生させる方法。
【請求項７】組換えＮＡＤ（Ｈ）結合型酸化還元不均
化酵素。