JP4039041B2 - 死菌化方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換微生物の死菌化方法、より詳しくは、形質転換微生物が産生した有用酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物を死菌化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の進歩により、酵素を用いた有機合成反応に形質転換微生物の産生する酵素が用いられるようになってきている。一方、形質転換微生物は自然界に存在しない微生物であるため、安全を確保する観点から、環境への伝播、拡散を防止することが求められており、この方法として、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法及び形質転換微生物を殺菌する方法が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、形質転換微生物の産生する酵素を有機合成反応に利用する場合、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法は、大規模な設備が必要となるため、製造設備の点からは必ずしも有利な方法とは言えず、また、形質転換微生物を死菌化する方法は、一般に形質転換微生物を死菌化する条件下で有用物質生産に利用される酵素が失活する場合が多かった。
そこで、本発明はある種の形質転換微生物を用いた有機合成反応を特殊な設備を用いることなく行うために、形質転換微生物が産生した酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物を死菌化させる方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記のような状況に鑑み、有用物質生産に用いられる酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換微生物を、その形質転換微生物が産生した有用物質生産に用いられる酵素の活性を失活させることなく、死菌化する条件を種々検討した結果、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することにより、該形質転換微生物が産生する熱変性温度値が５０℃以上である酵素を失活させることなく、形質転換微生物が死菌化できることを見出し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死菌化方法（以下、本発明死菌化方法と記すこともある。）等を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明死菌化方法に用いられる、形質転換微生物の宿主微生物にはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物が用いられる。この中でも、形質転換微生物の作製の容易さ等の点から好ましくはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種の微生物が用いられ、より好ましくは、エシェリヒアコリ ＪＭ１０５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５）株の微生物が用いられる。
【０００７】
本発明死菌化方法に用いられる形質転換微生物に導入されるＤＮＡは、熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。ここで、酵素の熱変性温度とは、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）中に約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ程度の割合で精製酵素を含む溶液を試料として、かつ測定波長２２２ｎｍで温度（例えば、４０℃以上７０℃以下の温度範囲を含む温度）を変化（例えば、約１℃／１ｍｉｎ以下の昇温勾配）させながら円二色性スペクトルを円二色性分散計を用いて測定する場合において、測定値の変化率が最も大きい温度をいう。
【０００８】
熱変性温度が５０℃以上である酵素とは、通常、５０℃以上８０℃以下の熱変性温度を有する酵素であって、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酸化還元酵素、熱変性温度が５０℃以上である転移酵素、熱変性温度が５０℃以上である加水分解酵素、熱変性温度が５０℃以上である脱離酵素、熱変性温度が５０℃以上である異性化酵素、熱変性温度が５０℃以上である合成酵素等が挙げられ、好ましくはアスペルギルス属由来のエステラーゼ、アルスロバクター属由来のエステラーゼ、クロモバクテリウム属由来のエステラーゼ等が挙げられる。これら熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、当該酵素に耐熱性を付与する等のために特異的変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列でも特異的変異を持たないアミノ酸配列をコードする塩基配列でもどちらでも構わない。
【０００９】
熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸を優先的に生産する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列。
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ菊酸または菊酸誘導体のエステルを不斉加水分解する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３で示される塩基配列。
（ｆ）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、アルギニン
【００１０】
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１１】
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭＢＰ−３６５８）等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１２】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、クロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１３】
このようにして得られたＤＮＡに下記の部位特異的変異を導入するには、原型のＤＮＡ（ここでは野生型の遺伝子である）が組み込まれたプラスミドの１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩基配列を含む合成オリゴヌクレオシドをプライマーとして変異型の遺伝子を合成すればよい。例えば、Smithら（Genetic Engineering ３１ Setlow,J. and Hollaender,A Plenum: New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye,M :Academic Press, New York）、Hos.N.Hunt ら（Gene, 77,51,1989）の方法等をあげることができる。
本発明では、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目および／１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸の置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入することが好ましい。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、アルギニン
尚、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目および１８９番目のアミノ酸に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
【００１４】
本発明において、あるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダイゼーション方法において、（１）高イオン条件下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が挙げられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりあるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１Ｘ ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分保温した後でも該ハイブリッドが維持されるようなＤＮＡをいう。
【００１５】
本発明死菌化方法に用いられる形質転換微生物は、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと宿主微生物とから「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている通常の方法に準じて作製することができる。
【００１６】
上記の方法で作製した形質転換微生物は、例えば、発酵工学の基礎（１９８９）学会出版センター，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、石崎文彬訳に記載されている通常の方法で培養することにより、導入したＤＮＡを発現させ、有用物質生産に有用な酵素を産生させることができる。
【００１７】
本発明死菌化方法は、このようにして得られる形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することにより達成される。
【００１８】
本発明死菌化方法に用いられる炭素数１〜３の１価のアルコールとは、メタノール、エタノール、プロパノール又はイソプロパノールである。
【００１９】
形質転換されたエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合する方法としては、例えば、前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物含有液に炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンを加えた後、攪拌又は振盪する方法、同じ反応容器に前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンとを攪拌又は振盪しながら並行して加える方法等があげられる。
【００２０】
本発明死菌化方法を完結するために必要な時間は、培養終了時における微生物含有液中の形質転換微生物の密度、使用される酵素の熱変性温度、微生物含有液に添加されるアルコールまたはアセトンの量等に応じて変化し得るが、例えば、５分間〜４日間であり、好ましくは１５分間〜２日間、より好ましくは３０分間〜２日間、特に好ましくは６時間〜２日間である。
【００２１】
本発明死菌化方法の終了、すなわち形質転換微生物が死滅したことは、微生物含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合した液の一部を、形質転換微生物が生育可能な寒天培地に塗布し、コロニーを形成しなくなることによって判断できる。
本発明では、酵素の熱変性温度が高いほど、添加されるアルコール及び／またはアセトンの量を多くすることが可能となり、また添加されるアルコール及び／またはアセトンの量が多いほど、死菌化完結時間を短くすることが可能である。
【００２２】
本発明死菌化方法により得られる死菌化液は、そのままの状態または当該死菌化液を処理した後、有機合成反応に用いることができる。
死菌化液を処理する方法としては、例えば、（１）死菌化液をダイノミル等により菌体を破砕し、膜濾過、遠心分離等により菌体破砕物を取り除く方法、（２）膜濾過、遠心分離等により菌体を取り除いた後、限外濾過により低分子成分等を取り除く方法、（３）死菌化液から目的とする酵素を粗精製酵素、精製酵素の形態で単離する方法、（４）死菌化液から単離した粗精製酵素、精製酵素を通常の方法で固定化する方法等があげられる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により、さらに詳しく説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
後述参考例１記載の方法により、エシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
実施例２
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２５】
実施例３
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２６】
実施例４
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４２．５ｍｌとエタノール７．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２７】
実施例５
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２８】
実施例６
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２９】
実施例７
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
実施例８
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｇとメタノール１２ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、２５℃で５時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９２％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３０】
実施例９
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３１】
実施例１０
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３２】
実施例１１
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３３】
実施例１２
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４５ｍｌとアセトン６．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３４】
上記実施例１〜１２におけるエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル０．０２ｇ、ｔ−ブチルメチルエーテル１．０ｍｌおよび１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３．５ｍｌを１０ｍｌ容ねじ口試験管に入れ、これを３５℃で１５分間保温した。この試験管にエステラーゼ活性を測定する試料液２００μｌを加え、３５℃で１６分間往復振盪（１２０str/min）した。
ついで、この混合液４００μｌにｔ−ブチルメチルエーテル１ｍｌを加えて攪拌した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）した。得られた水層のうち２００μｌを２０ｍＭリン酸一カリウム水／アセトニトリル＝９０／１０に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、高速液体クロマトグラフィーでＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸を定量分析した（絶対検量線法による）。
【００３５】
上記実施例１〜１２における生菌数測定は、以下の方法で行なった。
生菌数を測定する試料液を約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育したコロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００３６】
次に、実施例で使用した形質転換体及びその培養液の製造について、参考例を示す。
参考例１
アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株から「バイオ総合カタログ１９９７／９８ Ｖｏｌ．１遺伝子工学Ｅ−２４〜２７」記載の方法に基づいてｃＤＮＡライブラリーを作製した。 配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドと、ＳＰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とをプライマーに用い、前記のｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った（パーキンエルマー・キコーテック社製のＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ ＰＣＲキットを使用）。ＰＣＲ条件を以下に示す。
【００３７】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液 １μｌ
ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） １０μｌ
プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） 各１μｌ×２種
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ） １０μｌ
ＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ（２．５Ｕ／μｌ） １μｌ
超純水 ７６μｌ
［ＰＣＲ条件］
反応混合液の入った容器をＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）にセットし、９８℃（７分間）加熱処理した後、９７℃（０．３分間）−４５℃（１分間）−７２℃（２分間）を２０サイクル繰り返し、次いで９４℃（１分間）−５０℃（０．３分間）−７５℃（２．５分間）を２０サイクル繰り返し、さらに７０℃（７分間）の処理を行った。
【００３８】
こうして得られた配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをＴＯＰＯT MＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）付属のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターのＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイトにライゲーションしてベクターｐＹＨＮＫ１を得た。
このライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシア バイオテック社製）に添加して、ライゲーション反応により作製されたベクターｐＹＨＮＫ１が導入された形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、該キット添付のプロトコールに従い、多量のベクターｐＹＨＮＫ１を調製した。
【００３９】
一方、表１に示すオリゴヌクレオチドＡＦ１とオリゴヌクレオチドＡＲ２とを、また、オリゴヌクレオチドＡＦ２とオリゴヌクレオチドＡＲ３とを、それぞれ９０℃で５分間保温してアニーリングさせ二本鎖ＤＮＡを得た。得られた２種の２本鎖オリゴヌクレオチドと予めＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによって切断し開環されたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）とをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結し、分泌用ベクターを作製した（以下、分泌用ベクターＡと記す。）。該分泌用ベクターに挿入されたリンカー領域にコードされているアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】
さらに、ベクターｐＹＨＮＫ１からＥｃｏＲＩによって切り出されたＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）を上記分泌用ベクターＡのＥｃｏＲＩサイトに挿入することによりプラスミドｐＹＨＮＫ２を得た。
このようにして得られたプラスミドｐＹＨＮＫ２を含む反応液をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシアバイオテック社製）に添加し、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ｐｏｗｄｅｒ（宝酒造社製））を用いて選抜することにより、プラスミドｐＹＨＮＫ２が導入された形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を得た。
【００４２】
試験管に、液体培地（水１ｌにグリセロール５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム４ｇ、リン酸２カリウム９．３ｇを溶解したもの）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにE.coli JM105/pYHNK2株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で９時間振盪培養した。
３ｌ容の培養槽に液体培地（水１５００ｍｌにグリセロール２２．５ｇ、酵母エキス１５ｇ、総合アミノ酸Ｆ２２．５ｇ、リン酸１カリウム６ｇ、硫酸マグネシウム３．６ｇ、硫酸第１鉄７水和物０．０６ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０６ｇを溶解し、４Ｍリン酸水溶液と１４％（ｗ／ｗ）アンモニア水でｐＨ７．０としたもの）１５００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を０．７５ｍｌ加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養開始から、１８時間後に、isopropyl thio β-D-galactoside（ＩＰＴＧ）を５０μＭとなるように加えた。また、培養開始から１４時間後滅菌した培地（水１１０ｇにグリセロール１５０ｇ、酵母エキス２８ｇ及び総合アミノ酸Ｆ４２ｇを溶解したもの）を徐々に加えて培養した。
培養開始から、４０時間培養することにより、培養液（１）を得た。
【００４３】
さらに実施例で使用したアスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株由来のエステラーゼの熱変性温度の測定の例を参考例２に記す。
参考例２
上記の参考例１記載の培養液（１）５００ｍｌを遠心して得た菌体に３００ｍｌの１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え攪拌した後、当該菌懸濁液を遠心しその上清を得た。この上清を粗酵素液とした。この粗酵素液５０ｍｌを用いて弱イオン交換クロマト（カラム：ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、カラム（３０ｍｌ）、（緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）、流速；４ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。次に得られた画分を濃縮して、これをゲル濾過クロマト（カラム；ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘｇ２００（１２０ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０ ０、２Ｍ ＮａＣｌ、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。得られた画分を次に強陰イオン交換クロマト（カラム；Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（１ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３０ｍｌ）、緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ（３０ｍｌ）、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。この画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであった。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定することにより熱変性温度を調べた。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、５μｇ／ｍｌ精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を、３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；５０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は５３．１℃であった。
【００４４】
さらに上記の実施例で調製した死菌化液を用いた反応の例を参考例３に記す。
参考例３
Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル１．０１ｇ、ヘプタン０．５６ｇおよび蒸留水１．２ｇを５ｍｌのサンプル瓶に入れ、実施例４で得られた混合液０．０６ｇを加え、１０℃で２４時間攪拌した。
その後、反応液を遠心分離（10000rpm、10分）し、得られた水層を分析したところ、Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸が反応に使用したＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチルに対して４９％の収率で生成していた。
【００４５】
実施例１３
後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）４５ｇとエタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４６】
実施例１４
後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４７】
上記実施例１３〜１４におけるエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
培養液もしくは死菌化液の希釈液（生理食塩水）５ｍｌに２，２−ジクロロ−３−（１−プロペニル）シクロプロパン−１−カルボン酸メチルエステル（１Ｒ体／１Ｓ体＝５０／５０、トランス体／シス体＝９８／２）１ｇを加えてｐＨ１０．０となるように調整しながら４５℃で３０分間攪拌した。ここで反応液の一部を取り、これに塩酸を加え酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出物に内部標準物質（けい皮酸メチル）を加えた後、ガスクロマトグラフィ−（カラム：ＨＲ２０−Ｍ ０．５３φ ３０ｍ １ミクロン ＵＬＢＯＮ製）により分析することにより、加水分解率を求めた。この加水分解率よりエステラーゼ活性を算出した。
【００４８】
実施例１５
後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株（特開平７−２１３２８０）を培養した培養液（３）４５ｇとエタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４９】
実施例１６
後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を培養した培養液（３）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００５０】
上記実施例１５〜１６記載のエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
２％（Ｗ／Ｖ）アセトンに溶解したｐ−ニトロフェニルアセテート４０μＭを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）に培養液もしくは死菌化液を加え、３７℃でインキュベートした後、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加に基づき定量分析した。
【００５１】
上記実施例１３〜１６における生菌数測定は、以下の方法で行なった。
生菌数を測定する試料液を約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育したコロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００５２】
次に、実施例で使用した形質転換体及びその培養液の製造について、参考例を示す。
参考例４
上記実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株は特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて調製した。即ち、特開平５−５６７８７号公報記載のアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を、制限酵素Ｎｓｐ(7524)ＶおよびＨｉｎｄIIIで消化することによりエステラーゼ遺伝子の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これを特開平５−５６７８７号公報に記載のようにエステラーゼ遺伝子の開始コドンとその近傍のＤＮＡ配列を変換するために合成したＤＮＡ断片、およびｌａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）の制限酵素ＢａｍＨI、ＨｉｎｄIII消化物とライゲーションした。このようにして、ｌａｃプロモーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを調製し、これをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５株に導入した。
【００５３】
参考例５
試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪培養した。
５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養開始から２４時間培養することにより、培養液（２）を得た。
【００５４】
参考例６
上記実施例で使用したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準して調製した。ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼとは、前述にある、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつ１８９番目のアミノ酸がチロシンに置換される特異的変異が導入された耐熱性酵素である。
【００５５】
参考例７
試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪培養した。
５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養開始から１２時間培養することにより、培養液（３）を得た。
【００５６】
実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼの熱変性温度の測定の例を参考例８に記す。
参考例８
５００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム９ｇおよびリン酸2カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ、リン酸１カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇおよび硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを入れ、これに上記の培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養し、対数増殖期中期（培養開始１０〜１５時間後）にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように培養液に添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を続け４０時間培養し、培養液を得た。
得られた培養液２０００ｍｌを遠心することにより得た菌体を純水で洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に全量が１０００ｍｌになるように懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得た。この上清に１ＭになるようにＮａＣｌを添加した後、６０℃、３０分間熱処理を行なった。熱処理を行なった後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得た。この熱処理後の上清に３５％飽和濃度の硫安を添加し、再度遠心することにより沈殿を得た。得られた沈殿を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）約５０ｍｌに溶解し、２００倍の体積の０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に対して透析を行なった。透析した液を遠心することにより上清を得た。この上清を用いて陰イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ４００ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；０、６Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、流速；１２ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであったが、銀染色法ではマイナーバンドがあった。そこで、この画分をフラクトゲル−ＥＭＡＥ（カラム；スパーフォーマンスカラム（直径１０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）、ベッド；フラクトゲル−ＴＭＡＥ ＥＭＤ ６５０（Ｓ）（ＭＥＲＣＫ社製）、緩衝液Ａ；２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ 緩衝液Ｂ；１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０、流速；１．５ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４０μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を４０から８０℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は６７．０℃であった。
【００５７】
実施例で使用したクロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株由来のエステラ−ゼ（即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼ）の熱変性温度の測定の例を参考例９に記す。
参考例９
２００ｍｌの三角フラスコに５０ｍｌのＭ９培地（硫酸マグネシウム２ｍＭ、塩化カルシウム０．１ｍＭ、グルコース５ｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム3．4ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム０．６７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム０．２２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にチアミンを２．０ｍｇ／Ｌ、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように添加した培地を入れ、同じ組成の培地のプレートで静置培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を１白金耳植菌し、３７℃で１２時間攪拌培養した。２０００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル４ｇ、酵母エキス２４ｇ、トリプトン１２ｇ、リン酸１カリウム２．３ｇおよびリン酸2カリウム１２．５ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）３００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加えた培地に上記培養液３ｍｌを植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６６０が２に到達した時に、ＩＰＴＧを終濃度0．１ｍＭとなるように培養液に添加した後、さらに６時間培養を続け、培養液を得た。得られた培養液全量を遠心することにより湿菌体約４３ｇを得た。この湿菌体をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同じ緩衝液にＯＤ６６０が６０になるように懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、３２０００ｇ、１０分間遠心した後、１１００００ｇ、６０分間遠心することにより上清を得た。この上清液を限外濾過膜を用いて濃縮し５０ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を用いて陰イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ３２０ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；０、３５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、流速；３ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する各分を得た。この画分を疎水クロマト（カラム；ブチルトヨパール ６５０Ｓ（直径１６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、緩衝液Ａ；１０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ），緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ）、流速；２ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は６２．６℃であった。因みに、クロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株が本来有する野生型のエステラーゼの熱変性温度は５０．５℃であった。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、有用物質生産に用いられる酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを導入した形質転換微生物を、前記酵素の活性を失活させることなく、死菌化させることができる。
【００５９】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００６０】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、形質転換微生物の死菌化方法、より詳しくは、形質転換微生物が産生した有用酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物を死菌化する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の遺伝子組換え技術の進歩により、酵素を用いた有機合成反応に形質転換微生物の産生する酵素が用いられるようになってきている。一方、形質転換微生物は自然界に存在しない微生物であるため、安全を確保する観点から、環境への伝播、拡散を防止することが求められており、この方法として、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法及び形質転換微生物を殺菌する方法が行われている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、形質転換微生物の産生する酵素を有機合成反応に利用する場合、形質転換微生物を物理的に封じ込める方法は、大規模な設備が必要となるため、製造設備の点からは必ずしも有利な方法とは言えず、また、形質転換微生物を死菌化する方法は、一般に形質転換微生物を死菌化する条件下で有用物質生産に利用される酵素が失活する場合が多かった。
そこで、本発明はある種の形質転換微生物を用いた有機合成反応を特殊な設備を用いることなく行うために、形質転換微生物が産生した酵素の活性を失活させることなく、形質転換微生物を死菌化させる方法を提供することを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記のような状況に鑑み、有用物質生産に用いられる酵素をコードする遺伝子を組み込んだ形質転換微生物を、その形質転換微生物が産生した有用物質生産に用いられる酵素の活性を失活させることなく、死菌化する条件を種々検討した結果、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することにより、該形質転換微生物が産生する熱変性温度値が５０℃以上である酵素を失活させることなく、形質転換微生物が死菌化できることを見出し、本発明に至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、熱変性温度値が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死菌化方法（以下、本発明死菌化方法と記すこともある。）等を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明死菌化方法に用いられる、形質転換微生物の宿主微生物にはエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物が用いられる。この中でも、形質転換微生物の作製の容易さ等の点から好ましくはエシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種の微生物が用いられ、より好ましくは、エシェリヒアコリ ＪＭ１０５（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０５）株の微生物が用いられる。
【０００７】
本発明死菌化方法に用いられる形質転換微生物に導入されるＤＮＡは、熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡである。ここで、酵素の熱変性温度とは、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）中に約１μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ程度の割合で精製酵素を含む溶液を試料として、かつ測定波長２２２ｎｍで温度（例えば、４０℃以上７０℃以下の温度範囲を含む温度）を変化（例えば、約１℃／１ｍｉｎ以下の昇温勾配）させながら円二色性スペクトルを円二色性分散計を用いて測定する場合において、測定値の変化率が最も大きい温度をいう。
【０００８】
熱変性温度が５０℃以上である酵素とは、通常、５０℃以上８０℃以下の熱変性温度を有する酵素であって、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酸化還元酵素、熱変性温度が５０℃以上である転移酵素、熱変性温度が５０℃以上である加水分解酵素、熱変性温度が５０℃以上である脱離酵素、熱変性温度が５０℃以上である異性化酵素、熱変性温度が５０℃以上である合成酵素等が挙げられ、好ましくはアスペルギルス属由来のエステラーゼ、アルスロバクター属由来のエステラーゼ、クロモバクテリウム属由来のエステラーゼ等が挙げられる。これら熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、当該酵素に耐熱性を付与する等のために特異的変異を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列でも特異的変異を持たないアミノ酸配列をコードする塩基配列でもどちらでも構わない。
【０００９】
熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、例えば、以下のものが挙げられる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列。
（ｂ）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸を優先的に生産する能力を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号２で示される塩基配列。
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ菊酸または菊酸誘導体のエステルを不斉加水分解する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｅ）配列番号３で示される塩基配列。
（ｆ）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のアミノ酸からなるＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（ｇ）前記（ｆ）からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ前記（ｆ）によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素と同等な触媒機能を有する酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、アルギニン
【００１０】
配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１１】
配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、アルスロバクターＳＣ−６−９８−２８（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号 ＦＥＲＭＢＰ−３６５８）等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１２】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡは、例えば、クロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株（工業技術院 生命工学技術研究所 寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１４００９）等の微生物から通常の方法でｃＤＮＡライブラリーを作製し、このｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。
【００１３】
このようにして得られたＤＮＡに下記の部位特異的変異を導入するには、原型のＤＮＡ（ここでは野生型の遺伝子である）が組み込まれたプラスミドの１本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異を導入する塩基配列を含む合成オリゴヌクレオシドをプライマーとして変異型の遺伝子を合成すればよい。例えば、Smithら（Genetic Engineering ３１ Setlow,J. and Hollaender,A Plenum: New York）、Vlasukら（Experimental Manipulation of Gene Expression, Inouye,M :Academic Press, New York）、Hos.N.Hunt ら（Gene, 77,51,1989）の方法等をあげることができる。
本発明では、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目および／１８９番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸の置換されるように変異プライマーを調製し、ＰＣＲ法による増幅を行えばよい。好ましくは、１６０番目のアミノ酸が下記のＡ群から選ばれるアミノ酸に置換され、かつ１８９番目のアミノ酸が下記のＢ群から選ばれるアミノ酸に置換されるような特異的変異を導入することが好ましい。
（Ａ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン
（Ｂ群）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、チロシン、アルギニン
尚、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目および１８９番目のアミノ酸に同時に部位特異的変異を導入してもよい。
【００１４】
本発明において、あるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、「クローニングとシークエンス」（渡辺格監修、杉浦昌弘編集、１９８９、農村文化社発行）等に記載されるサザンハイブリダイゼーション方法において、（１）高イオン条件下［例えば、６ＸＳＳＣ（９００ｍＭの塩化ナトリウム、９０ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が挙げられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズさせることによりあるＤＮＡとＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、（２）低イオン濃度下［例えば、０．１Ｘ ＳＳＣ（１５ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム）等が用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分保温した後でも該ハイブリッドが維持されるようなＤＮＡをいう。
【００１５】
本発明死菌化方法に用いられる形質転換微生物は、例えば、熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡと宿主微生物とから「Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition」（1989）, Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols in Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons, Inc. ISBNO-471-50338-X等に記載されている通常の方法に準じて作製することができる。
【００１６】
上記の方法で作製した形質転換微生物は、例えば、発酵工学の基礎（１９８９）学会出版センター，Ｐ．Ｆ．Ｓｔａｎｂｕｒｙ，Ａ．Ｗｈｉｔａｋｅｒ著、石崎文彬訳に記載されている通常の方法で培養することにより、導入したＤＮＡを発現させ、有用物質生産に有用な酵素を産生させることができる。
【００１７】
本発明死菌化方法は、このようにして得られる形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することにより達成される。
【００１８】
本発明死菌化方法に用いられる炭素数１〜３の１価のアルコールとは、メタノール、エタノール、プロパノール又はイソプロパノールである。
【００１９】
形質転換されたエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物を含む液と、該微生物含有液に対し１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合する方法としては、例えば、前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物含有液に炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンを加えた後、攪拌又は振盪する方法、同じ反応容器に前記微生物の培養液、懸濁液等の微生物含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンとを攪拌又は振盪しながら並行して加える方法等があげられる。
【００２０】
本発明死菌化方法を完結するために必要な時間は、培養終了時における微生物含有液中の形質転換微生物の密度、使用される酵素の熱変性温度、微生物含有液に添加されるアルコールまたはアセトンの量等に応じて変化し得るが、例えば、５分間〜４日間であり、好ましくは１５分間〜２日間、より好ましくは３０分間〜２日間、特に好ましくは６時間〜２日間である。
【００２１】
本発明死菌化方法の終了、すなわち形質転換微生物が死滅したことは、微生物含有液と炭素数１〜３の１価のアルコール及び／またはアセトンとを混合した液の一部を、形質転換微生物が生育可能な寒天培地に塗布し、コロニーを形成しなくなることによって判断できる。
本発明では、酵素の熱変性温度が高いほど、添加されるアルコール及び／またはアセトンの量を多くすることが可能となり、また添加されるアルコール及び／またはアセトンの量が多いほど、死菌化完結時間を短くすることが可能である。
【００２２】
本発明死菌化方法により得られる死菌化液は、そのままの状態または当該死菌化液を処理した後、有機合成反応に用いることができる。
死菌化液を処理する方法としては、例えば、（１）死菌化液をダイノミル等により菌体を破砕し、膜濾過、遠心分離等により菌体破砕物を取り除く方法、（２）膜濾過、遠心分離等により菌体を取り除いた後、限外濾過により低分子成分等を取り除く方法、（３）死菌化液から目的とする酵素を粗精製酵素、精製酵素の形態で単離する方法、（４）死菌化液から単離した粗精製酵素、精製酵素を通常の方法で固定化する方法等があげられる。
【００２３】
【実施例】
以下、本発明を実施例等により、さらに詳しく説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【００２４】
実施例１
後述参考例１記載の方法により、エシェリヒア コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ） ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
実施例２
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２５】
実施例３
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとエタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２６】
実施例４
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４２．５ｍｌとエタノール７．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２７】
実施例５
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２８】
実施例６
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００２９】
実施例７
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとメタノール１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
実施例８
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｇとメタノール１２ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、２５℃で５時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９２％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３０】
実施例９
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３１】
実施例１０
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で６時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３２】
実施例１１
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４０ｍｌとアセトン１０ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で４８時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３３】
実施例１２
後述参考例１記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を培養した培養液（１）４５ｍｌとアセトン６．５ｍｌとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（１）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００３４】
上記実施例１〜１２におけるエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル０．０２ｇ、ｔ−ブチルメチルエーテル１．０ｍｌおよび１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）３．５ｍｌを１０ｍｌ容ねじ口試験管に入れ、これを３５℃で１５分間保温した。この試験管にエステラーゼ活性を測定する試料液２００μｌを加え、３５℃で１６分間往復振盪（１２０str/min）した。
ついで、この混合液４００μｌにｔ−ブチルメチルエーテル１ｍｌを加えて攪拌した後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、５分間）した。得られた水層のうち２００μｌを２０ｍＭリン酸一カリウム水／アセトニトリル＝９０／１０に溶解し、０．２μｍフィルターで濾過した後、高速液体クロマトグラフィーでＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸を定量分析した（絶対検量線法による）。
【００３５】
上記実施例１〜１２における生菌数測定は、以下の方法で行なった。
生菌数を測定する試料液を約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育したコロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００３６】
次に、実施例で使用した形質転換体及びその培養液の製造について、参考例を示す。
参考例１
アスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株から「バイオ総合カタログ１９９７／９８ Ｖｏｌ．１遺伝子工学Ｅ−２４〜２７」記載の方法に基づいてｃＤＮＡライブラリーを作製した。 配列番号５で示されるオリゴヌクレオチドと、ＳＰ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とをプライマーに用い、前記のｃＤＮＡライブラリーを鋳型に用いて、ＰＣＲを行った（パーキンエルマー・キコーテック社製のＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ ＰＣＲキットを使用）。ＰＣＲ条件を以下に示す。
【００３７】
［反応液組成］
ｃＤＮＡライブラリー原液 １μｌ
ｄＮＴＰ（各２ｍＭ−ｍｉｘ） １０μｌ
プライマー（５ｐｍｏｌ／μｌ） 各１μｌ×２種
１０ｘｂｕｆｆｅｒ（ｗｉｔｈ ＭｇＣｌ） １０μｌ
ＴａｑポリメラーゼＧｏｌｄ（２．５Ｕ／μｌ） １μｌ
超純水 ７６μｌ
［ＰＣＲ条件］
反応混合液の入った容器をＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ社製）にセットし、９８℃（７分間）加熱処理した後、９７℃（０．３分間）−４５℃（１分間）−７２℃（２分間）を２０サイクル繰り返し、次いで９４℃（１分間）−５０℃（０．３分間）−７５℃（２．５分間）を２０サイクル繰り返し、さらに７０℃（７分間）の処理を行った。
【００３８】
こうして得られた配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡをＴＯＰＯT MＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇキットＶｅｒ．Ｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）付属のｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターのＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ挿入サイトにライゲーションしてベクターｐＹＨＮＫ１を得た。
このライゲーション反応液をＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシア バイオテック社製）に添加して、ライゲーション反応により作製されたベクターｐＹＨＮＫ１が導入された形質転換体を得た。この形質転換体を培養し、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、該キット添付のプロトコールに従い、多量のベクターｐＹＨＮＫ１を調製した。
【００３９】
一方、表１に示すオリゴヌクレオチドＡＦ１とオリゴヌクレオチドＡＲ２とを、また、オリゴヌクレオチドＡＦ２とオリゴヌクレオチドＡＲ３とを、それぞれ９０℃で５分間保温してアニーリングさせ二本鎖ＤＮＡを得た。得られた２種の２本鎖オリゴヌクレオチドと予めＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩによって切断し開環されたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）とをライゲーションキット（宝酒造製）を用いて連結し、分泌用ベクターを作製した（以下、分泌用ベクターＡと記す。）。該分泌用ベクターに挿入されたリンカー領域にコードされているアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４０】
【表１】
さらに、ベクターｐＹＨＮＫ１からＥｃｏＲＩによって切り出されたＤＮＡ断片（約８００ｂｐ）を上記分泌用ベクターＡのＥｃｏＲＩサイトに挿入することによりプラスミドｐＹＨＮＫ２を得た。
このようにして得られたプラスミドｐＹＨＮＫ２を含む反応液をＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５コンピテントセル（ファルマシアバイオテック社製）に添加し、１００μｌ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（Ｌ−ｂｒｏｔｈ ｐｏｗｄｅｒ（宝酒造社製））を用いて選抜することにより、プラスミドｐＹＨＮＫ２が導入された形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＹＨＮＫ２株を得た。
【００４２】
試験管に、液体培地（水１ｌにグリセロール５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム４ｇ、リン酸２カリウム９．３ｇを溶解したもの）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにE.coli JM105/pYHNK2株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で９時間振盪培養した。
３ｌ容の培養槽に液体培地（水１５００ｍｌにグリセロール２２．５ｇ、酵母エキス１５ｇ、総合アミノ酸Ｆ２２．５ｇ、リン酸１カリウム６ｇ、硫酸マグネシウム３．６ｇ、硫酸第１鉄７水和物０．０６ｇ、塩化カルシウム２水和物０．０６ｇを溶解し、４Ｍリン酸水溶液と１４％（ｗ／ｗ）アンモニア水でｐＨ７．０としたもの）１５００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を０．７５ｍｌ加え、３０℃で通気攪拌培養した。培養開始から、１８時間後に、isopropyl thio β-D-galactoside（ＩＰＴＧ）を５０μＭとなるように加えた。また、培養開始から１４時間後滅菌した培地（水１１０ｇにグリセロール１５０ｇ、酵母エキス２８ｇ及び総合アミノ酸Ｆ４２ｇを溶解したもの）を徐々に加えて培養した。
培養開始から、４０時間培養することにより、培養液（１）を得た。
【００４３】
さらに実施例で使用したアスペルギルス・フラバス（Ａａｐｅｒｇｉｌｌｕｓｆｌａｖｕｓ）ＡＴＣＣ１１４９２株由来のエステラーゼの熱変性温度の測定の例を参考例２に記す。
参考例２
上記の参考例１記載の培養液（１）５００ｍｌを遠心して得た菌体に３００ｍｌの１００ｍＭリン酸１カリウム−リン酸２カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加え攪拌した後、当該菌懸濁液を遠心しその上清を得た。この上清を粗酵素液とした。この粗酵素液５０ｍｌを用いて弱イオン交換クロマト（カラム：ＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ、カラム（３０ｍｌ）、（緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ（３００ｍｌ）、流速；４ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。次に得られた画分を濃縮して、これをゲル濾過クロマト（カラム；ＨｉＬｏａｄ １６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘｇ２００（１２０ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０ ０、２Ｍ ＮａＣｌ、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。得られた画分を次に強陰イオン交換クロマト（カラム；Ｈｉｔｒａｐ Ｑ（１ｍｌ）、緩衝液Ａ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０（３０ｍｌ）、緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．０、１Ｍ ＮａＣｌ（３０ｍｌ）、流速；１ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。この画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであった。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定することにより熱変性温度を調べた。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、５μｇ／ｍｌ精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を、３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；５０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は５３．１℃であった。
【００４４】
さらに上記の実施例で調製した死菌化液を用いた反応の例を参考例３に記す。
参考例３
Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチル１．０１ｇ、ヘプタン０．５６ｇおよび蒸留水１．２ｇを５ｍｌのサンプル瓶に入れ、実施例４で得られた混合液０．０６ｇを加え、１０℃で２４時間攪拌した。
その後、反応液を遠心分離（10000rpm、10分）し、得られた水層を分析したところ、Ｎ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸が反応に使用したＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチルに対して４９％の収率で生成していた。
【００４５】
実施例１３
後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）４５ｇとエタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４６】
実施例１４
後述参考例５記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を培養した培養液（２）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（２）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４７】
上記実施例１３〜１４におけるエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
培養液もしくは死菌化液の希釈液（生理食塩水）５ｍｌに２，２−ジクロロ−３−（１−プロペニル）シクロプロパン−１−カルボン酸メチルエステル（１Ｒ体／１Ｓ体＝５０／５０、トランス体／シス体＝９８／２）１ｇを加えてｐＨ１０．０となるように調整しながら４５℃で３０分間攪拌した。ここで反応液の一部を取り、これに塩酸を加え酸性とした後、酢酸エチルで抽出した。抽出物に内部標準物質（けい皮酸メチル）を加えた後、ガスクロマトグラフィ−（カラム：ＨＲ２０−Ｍ ０．５３φ ３０ｍ １ミクロン ＵＬＢＯＮ製）により分析することにより、加水分解率を求めた。この加水分解率よりエステラーゼ活性を算出した。
【００４８】
実施例１５
後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株（特開平７−２１３２８０）を培養した培養液（３）４５ｇとエタノール５ｇとを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００４９】
実施例１６
後述参考例６記載の方法により、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を培養した培養液（３）３７．５ｇとエタノール１２．５ｇを１００ｍｌ容ガラス製ネジ口瓶に入れ、３０℃で２４時間攪拌した。
その後のこの混合液のエステラーゼ活性は培養液（３）の９５％以上であり、生菌数は０cfu/mlであった。
【００５０】
上記実施例１５〜１６記載のエステラーゼ活性測定は、以下の方法で行なった。
２％（Ｗ／Ｖ）アセトンに溶解したｐ−ニトロフェニルアセテート４０μＭを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.２）に培養液もしくは死菌化液を加え、３７℃でインキュベートした後、遊離するｐ−ニトロフェノール量を４０５ｎｍの吸光度の増加に基づき定量分析した。
【００５１】
上記実施例１３〜１６における生菌数測定は、以下の方法で行なった。
生菌数を測定する試料液を約１ｍｌを４℃に冷却した生理食塩水で希釈した。この希釈液１００μｌをアンピシリン１００μｇ／ｍｌ含有したＬＢ培地プレート（L-Broth Ager(BIO 101社製)）に塗布し３７℃で１〜２日静置した。その後、生育したコロニー数から試料液の生菌数を計算した。
【００５２】
次に、実施例で使用した形質転換体及びその培養液の製造について、参考例を示す。
参考例４
上記実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株は特開平５−５６７８７号公報記載の方法に準じて調製した。即ち、特開平５−５６７８７号公報記載のアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＡＧＥ−１を、制限酵素Ｎｓｐ(7524)ＶおよびＨｉｎｄIIIで消化することによりエステラーゼ遺伝子の翻訳領域を含むＤＮＡ断片を切り出し、これを特開平５−５６７８７号公報に記載のようにエステラーゼ遺伝子の開始コドンとその近傍のＤＮＡ配列を変換するために合成したＤＮＡ断片、およびｌａｃプロモーターを有する発現ベクターｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社）の制限酵素ＢａｍＨI、ＨｉｎｄIII消化物とライゲーションした。このようにして、ｌａｃプロモーターの下流にアルスロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを調製し、これをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０５株に導入した。
【００５３】
参考例５
試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪培養した。
５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養開始から２４時間培養することにより、培養液（２）を得た。
【００５４】
参考例６
上記実施例で使用したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラーゼ遺伝子導入大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株は特開平７−２１３２８０号公報記載の方法に準して調製した。ここで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼとは、前述にある、配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつ１８９番目のアミノ酸がチロシンに置換される特異的変異が導入された耐熱性酵素である。
【００５５】
参考例７
試験管に、L-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｌを入れて、滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｇ／ｍｌとなるように加え、さらにＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株のグリセロールストック０．１ｍｌを加え、３０℃で１６時間振盪培養した。
５００ｍｌ容のバッフル付三角フラスコにL-Broth培地（ＳＩＧＭＡ社製）１００ｍｌを入れて滅菌した。ここにアンピシリンを５０μｌ／ｍｌとなるように加え、さらにここに、上記の試験管で培養した培養液を１ｍｌ加え、３０℃で攪拌培養した。培養開始から、４時間後にＩＰＴＧを１ｍＭとなるように加えた。培養開始から１２時間培養することにより、培養液（３）を得た。
【００５６】
実施例で使用したアルスロバクタ−ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラ−ゼの熱変性温度の測定の例を参考例８に記す。
参考例８
５００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ、リン酸１カリウム９ｇおよびリン酸2カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加え、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＥＡＲ５株を斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオエンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ、リン酸１カリウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇおよび硫酸第一鉄０．１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを入れ、これに上記の培養液１５ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養し、対数増殖期中期（培養開始１０〜１５時間後）にＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように培養液に添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培養を続け４０時間培養し、培養液を得た。
得られた培養液２０００ｍｌを遠心することにより得た菌体を純水で洗浄後、５０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に全量が１０００ｍｌになるように懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得た。この上清に１ＭになるようにＮａＣｌを添加した後、６０℃、３０分間熱処理を行なった。熱処理を行なった後、１００００ｒｐｍ、３０分間遠心することにより上清を得た。この熱処理後の上清に３５％飽和濃度の硫安を添加し、再度遠心することにより沈殿を得た。得られた沈殿を２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）約５０ｍｌに溶解し、２００倍の体積の０．１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．０）に対して透析を行なった。透析した液を遠心することにより上清を得た。この上清を用いて陰イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ４００ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；０、６Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０（２００ｍｌ）、流速；１２ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、単一バンドであったが、銀染色法ではマイナーバンドがあった。そこで、この画分をフラクトゲル−ＥＭＡＥ（カラム；スパーフォーマンスカラム（直径１０ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）、ベッド；フラクトゲル−ＴＭＡＥ ＥＭＤ ６５０（Ｓ）（ＭＥＲＣＫ社製）、緩衝液Ａ；２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０ 緩衝液Ｂ；１．０Ｍ ＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０、流速；１．５ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４０μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を４０から８０℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は６７．０℃であった。
【００５７】
実施例で使用したクロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株由来のエステラ−ゼ（即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株が産生するエステラーゼ）の熱変性温度の測定の例を参考例９に記す。
参考例９
２００ｍｌの三角フラスコに５０ｍｌのＭ９培地（硫酸マグネシウム２ｍＭ、塩化カルシウム０．１ｍＭ、グルコース５ｇ／Ｌ、リン酸水素ナトリウム3．4ｇ／Ｌ、リン酸１カリウム０．６７ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム０．２２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．１１ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）にチアミンを２．０ｍｇ／Ｌ、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように添加した培地を入れ、同じ組成の培地のプレートで静置培養したＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５／ｐＣＣ１６０Ｓ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ株を１白金耳植菌し、３７℃で１２時間攪拌培養した。２０００ｍｌ三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセロ−ル４ｇ、酵母エキス２４ｇ、トリプトン１２ｇ、リン酸１カリウム２．３ｇおよびリン酸2カリウム１２．５ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）３００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌになるように加えた培地に上記培養液３ｍｌを植菌し、３７℃で振とう培養した。ＯＤ６６０が２に到達した時に、ＩＰＴＧを終濃度0．１ｍＭとなるように培養液に添加した後、さらに６時間培養を続け、培養液を得た。得られた培養液全量を遠心することにより湿菌体約４３ｇを得た。この湿菌体をＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した後、同じ緩衝液にＯＤ６６０が６０になるように懸濁した。この懸濁液を氷水中で超音波破砕した後、３２０００ｇ、１０分間遠心した後、１１００００ｇ、６０分間遠心することにより上清を得た。この上清液を限外濾過膜を用いて濃縮し５０ｍｌの濃縮液を得た。この濃縮液を用いて陰イオン交換クロマト（カラム；ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔｆｌｏｗ（直径２６ｍｍ、長さ３２０ｍｍ）、緩衝液Ａ；０、１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、緩衝液Ｂ；０、３５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（５００ｍｌ）、流速；３ｍｌ/ｍｉｎ）を行い、エステラーゼ活性を有する各分を得た。この画分を疎水クロマト（カラム；ブチルトヨパール ６５０Ｓ（直径１６ｍｍ、長さ３００ｍｍ）、緩衝液Ａ；１０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ），緩衝液Ｂ；１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液 ｐＨ７．５（２００ｍｌ）、流速；２ｍｌ/ｍｉｎ）に供試し、エステラーゼ活性を有する画分を得た。このエステラーゼ活性を有する画分を精製酵素とした。
つぎにこの精製酵素を用いて円二色性スペクトルを測定し熱変性温度を測定した。円二色性分散計Ｊ−７２０（日本分光社製）を用い、４μｇ／ｍｌの上記精製酵素（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）を３０℃から７０℃の範囲（温度スロープ；２０℃／時間）、波長２２２ｎｍの条件で円二色性スペクトルを測定した。得られた円二色性スペクトルから熱変性曲線を求めた結果、本精製酵素の熱変性温度は６２．６℃であった。因みに、クロモバクテリウム（Chromobacterium）SC-YM-1株が本来有する野生型のエステラーゼの熱変性温度は５０．５℃であった。
【００５８】
【発明の効果】
本発明により、有用物質生産に用いられる酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡを導入した形質転換微生物を、前記酵素の活性を失活させることなく、死菌化させることができる。
【００５９】
［配列表フリーテキスト］
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００６０】
【配列表】
Claims (7)
- 熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、下記（１）から（４）のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し、１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死菌化方法。
（１）配列番号１で示される塩基配列。
（２）配列番号１で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつラセミ体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸エチルエステルを不斉加水分解し、（Ｓ）体のＮ−ベンジルアゼチジン−２−カルボン酸を優先的に生産する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
（３）配列番号２で示される塩基配列。
（４）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつ２，２−ジクロロ−３−（１−プロペニル）シクロプロパン−１−カルボン酸メチルエステルを加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列。 - 熱変性温度が５０℃以上である酵素のアミノ酸配列をコードする（１）配列番号３で示される塩基配列、（２）配列番号３で示される塩基配列に併記されるアミノ酸配列において１６０番目のアミノ酸がセリンに置換され、かつ１８９番目のアミノ酸がチロシンに置換されてなるアミノ酸配列をコードする塩基配列、または（３）前記（２）の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列であって、かつｐ−ニトロフェノールアセテートを加水分解する能力を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡをエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物に導入した形質転換微生物を含む液と、該微生物含有液に対し、１０重量％以上３５重量％以下の量の炭素数１〜３の１価のアルコール及び／又はアセトンとを２５℃以上３５℃未満で混合することを特徴とする形質転換微生物の死菌化方法。
- 前記酵素が加水分解酵素であることを特徴とする請求項１または２記載の死菌化方法。
- 前記酵素が６０℃以上の熱変性温度を有し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０重量％以上３５重量％以下であることを特徴とする請求項１記載の死菌化方法。
- 前記酵素が５３℃以上の熱変性温度を有し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０重量％以上３０重量％以下であることを特徴とする請求項１記載の死菌化方法。
- 前記酵素が５０℃以上の熱変性温度を有し、かつ前記アルコール及び／又はアセトンの量が１０重量％以上２５重量％以下であることを特徴とする請求項１記載の死菌化方法。
- エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物が、エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）種であることを特徴とする請求項１または２記載の死菌化方法。
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