JPH01101887A - リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物 - Google Patents
リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物Info
- Publication number
- JPH01101887A JPH01101887A JP62260083A JP26008387A JPH01101887A JP H01101887 A JPH01101887 A JP H01101887A JP 62260083 A JP62260083 A JP 62260083A JP 26008387 A JP26008387 A JP 26008387A JP H01101887 A JPH01101887 A JP H01101887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- microorganism
- bacillus stearothermophilus
- manufacturing
- malic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 52
- 101710104378 Putative malate oxidoreductase [NAD] Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 50
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims abstract description 49
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 49
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 11
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 23
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 claims description 7
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 7
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims 4
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 claims 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 abstract description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract description 5
- 241001603151 Philus Species 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 5
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 5
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 5
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 5
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 5
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 5
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 3
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 2
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000911 decarboxylating effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- -1 for example Proteins 0.000 description 2
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 2-[(1s,2s,3r,4s)-1,2,3,4,5-pentahydroxypentyl]-1,3-thiazolidine-4-carboxylic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C1NC(C(O)=O)CS1 JEPVUMTVFPQKQE-AAKCMJRZSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O UGXYFDQFLVCDFC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 102100034229 Citramalyl-CoA lyase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N H4atta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC1=CC=CC(C=2N=C(C=C(C=2)C=2C3=CC=CC=C3C=C3C=CC=CC3=2)C=2N=C(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)C=CC=2)=N1 OOFLZRMKTMLSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O HIZYETOZLYFUFF-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108020004687 Malate Synthase Proteins 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Propanedioic acid Natural products OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002781 deodorant agent Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 1
- 239000011976 maleic acid Substances 0.000 description 1
- 150000004701 malic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 239000001057 purple pigment Substances 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 108010066529 ribonuclease M Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、バチルス・ステアロサーモフィルスに由来し
、リンゴ酸酵素を発現しうるＤＮＡ 、そのＤＮＡが組
み込まれた組み換え体ＤＮＡおよびその組み換え体ＤＮ
Ａを含む微生物に関する。さらに本発明は、その微生物
を用いたリンゴ酸酵素の製造方法、およびそのリンゴ酸
酵素を触媒とするリンゴ酸の製造方法に関する。
、リンゴ酸酵素を発現しうるＤＮＡ 、そのＤＮＡが組
み込まれた組み換え体ＤＮＡおよびその組み換え体ＤＮ
Ａを含む微生物に関する。さらに本発明は、その微生物
を用いたリンゴ酸酵素の製造方法、およびそのリンゴ酸
酵素を触媒とするリンゴ酸の製造方法に関する。
（従来の技術）
リンゴ酸は植物に広く分布しており、特にリンゴやブド
ウの果実に大量に含まれている。このリンゴ酸は２例え
ば清涼飲料水などの飲料あるいは菓子類などの加工食品
への酸味剤や消臭剤として利用されており、その用途は
広い。リンゴ酸は。
ウの果実に大量に含まれている。このリンゴ酸は２例え
ば清涼飲料水などの飲料あるいは菓子類などの加工食品
への酸味剤や消臭剤として利用されており、その用途は
広い。リンゴ酸は。
工業的にはマレイン酸あるいはフマル酸に高圧条件下で
水を付加させることにより製造されている。
水を付加させることにより製造されている。
このようにリンゴ酸の製造には高圧を使用するため大規
模な設備を必要とする。リンゴ酸を緩和な条件下で容易
に製造しうる方法としては酵素の利用が考えられる。リ
ンゴ酸は、生体内においてはクエン酸回路およびグリオ
キシル酸回路の中間体であり、フマル酸ヒドラターゼ（
フマラーゼ）によるフマル酸への水の付加、リンゴ酸シ
ンターゼによるグリオキシル酸とアセチルＣｏＡとの縮
合あるいはリンゴ酸酵素によるピルビン酸のカルボキシ
ル化などにより産生される。酵素によるリンゴ酸の合成
には９例えば上記リンゴ酸酵素を使用する方法が考えら
れ１発明者らはこの酵素についての検討を行った。しか
し、リンゴ酸酵素の作用は可逆的であり１通常、その平
衡は、ピルビン酸と炭酸ガスとからリンゴ酸を生成する
方向ではなく。
模な設備を必要とする。リンゴ酸を緩和な条件下で容易
に製造しうる方法としては酵素の利用が考えられる。リ
ンゴ酸は、生体内においてはクエン酸回路およびグリオ
キシル酸回路の中間体であり、フマル酸ヒドラターゼ（
フマラーゼ）によるフマル酸への水の付加、リンゴ酸シ
ンターゼによるグリオキシル酸とアセチルＣｏＡとの縮
合あるいはリンゴ酸酵素によるピルビン酸のカルボキシ
ル化などにより産生される。酵素によるリンゴ酸の合成
には９例えば上記リンゴ酸酵素を使用する方法が考えら
れ１発明者らはこの酵素についての検討を行った。しか
し、リンゴ酸酵素の作用は可逆的であり１通常、その平
衡は、ピルビン酸と炭酸ガスとからリンゴ酸を生成する
方向ではなく。
リンゴ酸から脱炭酸してピルビン酸を生成する方向に著
しく偏っている。そのため、このような酵素を利用する
とリンゴ酸の収率が極めて低くなる。
しく偏っている。そのため、このような酵素を利用する
とリンゴ酸の収率が極めて低くなる。
さらに、リンゴ酸酵素の大部分は、耐熱性に劣り。
５０℃付近でほぼ失活する。そのため工業的に利用する
には不利である。
には不利である。
他方、好熱菌と総称される微生物の中には耐熱性を有す
るリンゴ酸酵素を生産するものもある。
るリンゴ酸酵素を生産するものもある。
しかし、それらの微生物を使用しても、酵素の生成量は
極めて少なく、それらを有利に単離することは困難であ
った。
極めて少なく、それらを有利に単離することは困難であ
った。
ところで、最近では遺伝子操作技術の発達が目覚ましく
、外来遺伝子由来のタンパクを微生物を用いて大量に生
産することが可能となっている。
、外来遺伝子由来のタンパクを微生物を用いて大量に生
産することが可能となっている。
従って、この遺伝子操作技術により優れた性質のリンゴ
酸酵素を量産し、これを用いてリンゴ酸を有利に生産す
ることも可能であると考えられる。
酸酵素を量産し、これを用いてリンゴ酸を有利に生産す
ることも可能であると考えられる。
しかし９例えば、リンゴ酸を有利に生産することが可能
でかつ耐熱性に優れたリンゴ酸酵素の遺伝情報をになう
ＤＮＡ配列やそれを用いた組み換え体は全く知られてい
ない。
でかつ耐熱性に優れたリンゴ酸酵素の遺伝情報をになう
ＤＮＡ配列やそれを用いた組み換え体は全く知られてい
ない。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明は上記従来の欠点を解決するものであり。
その目的とするところは、リンゴ酸を有利に生産しかつ
耐熱性に優れたリンゴ酸酵素の遺伝情報をになうＤＮＡ
を提供することにある。本発明の他の目的は、該ＤＮＡ
が組み込まれた組み換え体ＤＮＡを提供することにある
。本発明のさらに他の目的は。
耐熱性に優れたリンゴ酸酵素の遺伝情報をになうＤＮＡ
を提供することにある。本発明の他の目的は、該ＤＮＡ
が組み込まれた組み換え体ＤＮＡを提供することにある
。本発明のさらに他の目的は。
該組み換え体ＤＮＡを含む微生物（形質転換体）を提供
することにある。本発明−のさらに他の目的は。
することにある。本発明−のさらに他の目的は。
該微生物によりリンゴ酸酵素を生産すること、および該
リンゴ酸酵素を用いてリンゴ酸を有利に製造する方法を
提供することにある。
リンゴ酸酵素を用いてリンゴ酸を有利に製造する方法を
提供することにある。
（問題点を解決するための手段）
本発明のＤＮＡは、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバ
チルス・ステアロサーモフィルス由来のＤＮＡである。
チルス・ステアロサーモフィルス由来のＤＮＡである。
本発明の組み換え体ＤＮＡは、耐熱性リンゴ酸酵素をコ
ードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＤＮ
Ａが、ベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
である。
ードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＤＮ
Ａが、ベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
である。
本発明の形質転換された微生物は、耐熱性リンゴ酸酵素
をコードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来の
ＤＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａを、宿主微生物に導入して得られる。
をコードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来の
ＤＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａを、宿主微生物に導入して得られる。
本発明のリンゴ酸酵素の製造方法は、耐熱性リンゴ酸酵
素をコードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来
のＤＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体Ｄ
ＮＡを宿主微生物に導入し９形質転換された微生物を得
る工程；該形質転換体微生物を培養する工程；および該
微生物菌体に蓄積したリンゴ酸酵素を採取する工程を包
含する。
素をコードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来
のＤＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体Ｄ
ＮＡを宿主微生物に導入し９形質転換された微生物を得
る工程；該形質転換体微生物を培養する工程；および該
微生物菌体に蓄積したリンゴ酸酵素を採取する工程を包
含する。
本発明のリンゴ酸の製造方法は、耐熱性リンゴ酸酵素を
コードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＤ
ＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
を宿主微生物に導入し、形質転換された微生物を培養す
る工程；該形質転換体微生物を培養する工程；および該
形質転換体微生物により生産されたリンゴ酸酵素を触媒
とし、 ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを補酵素と
して、ピルビン酸と炭酸ガスおよび／または炭酸塩とか
らリンゴ酸を製造する工程を包含する。
コードするバチルス・ステアロサーモフィルス由来のＤ
ＮＡがベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡ
を宿主微生物に導入し、形質転換された微生物を培養す
る工程；該形質転換体微生物を培養する工程；および該
形質転換体微生物により生産されたリンゴ酸酵素を触媒
とし、 ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨを補酵素と
して、ピルビン酸と炭酸ガスおよび／または炭酸塩とか
らリンゴ酸を製造する工程を包含する。
本発明に用いられるリンゴ酸酵素を産生ずる菌としては
、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するバチルス・
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｅ
ａｒｏ−旦肛凹■旦旦）が用いられる。この菌は好熱菌
であり、比較的高温で作用するリンゴ酸酵素を生産する
。この菌については、特開昭６０−６２９８４号および
６１−８１７８８号に、耐熱性ガラクトシダーゼを取得
する方法が、さらに、特開昭６１−２６８１８３号には
。
、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属するバチルス・
ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｔｅ
ａｒｏ−旦肛凹■旦旦）が用いられる。この菌は好熱菌
であり、比較的高温で作用するリンゴ酸酵素を生産する
。この菌については、特開昭６０−６２９８４号および
６１−８１７８８号に、耐熱性ガラクトシダーゼを取得
する方法が、さらに、特開昭６１−２６８１８３号には
。
該ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡを含む組み換え
体ＤＮＡおよびそれらを含む微生物が記載されている。
体ＤＮＡおよびそれらを含む微生物が記載されている。
本発明に使用するバチルス・ステアロサーモフィルスと
しては、特にバチルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７
８８株（微工研菌寄第５１４１号）が好適である。
しては、特にバチルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７
８８株（微工研菌寄第５１４１号）が好適である。
上記リンゴ酸酵素を産生ずる菌から本発明のＤＮＡを得
るには１通常のＤＮＡの単離方法２例えば９次に示すフ
ェノール法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ、。
るには１通常のＤＮＡの単離方法２例えば９次に示すフ
ェノール法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａ
ｃｔａ、。
７２、６１９〜６２９）が採用され得る。まず、上記菌
株を培養し、集菌して菌体を適当な緩衝液に懸濁させる
。これにリゾチーム、およびラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤を加えて溶菌させた後、上記緩衝液を飽
和させたフェノールにて不純物を抽出・除去する。次に
、得られた水層に酢酸ナトリウム溶液およびエタノール
を加えて染色体ＤＮＡ精製物を析出させる。得られた染
色体ＤＮＡ精製物はりボヌクレアーゼを用いて処理し、
含有させるＲＮＡが分解・除去される。
株を培養し、集菌して菌体を適当な緩衝液に懸濁させる
。これにリゾチーム、およびラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤を加えて溶菌させた後、上記緩衝液を飽
和させたフェノールにて不純物を抽出・除去する。次に
、得られた水層に酢酸ナトリウム溶液およびエタノール
を加えて染色体ＤＮＡ精製物を析出させる。得られた染
色体ＤＮＡ精製物はりボヌクレアーゼを用いて処理し、
含有させるＲＮＡが分解・除去される。
このようにして得られる精製染色体ＤＮＡは既知のベク
ターＤＮＡへ組み込まれて遺伝子ライブラリーが作成さ
れる。上記ベクターＤＮＡとしてはＰＯＣｌ２゜Ｃｏ１
Ｃ１，ｐＭＢ９． ｐ１５八、 ＰＢＲ３２２およびｐ
ＡｃＹｃ１７７などが挙げられる。これらのベクターＤ
ＮＡは適当な制限酵素によって切断される。上記精製さ
れた染色体ＤＮＡも適当な制限酵素により切断され、上
記制限酵素によって切断されたベクターＤＮＡに連結さ
れる。上記制限酵素としては、 Ｐ ｓ ｔｌ ＋ Ｂ
ａｍＨＩ＋ Ｂｇ Ｉ Ｕ ＋ＥｃｏＲＩ、 Ｍｌｕ
Ｉ 、 Ｓａｌ ＩおよびＸｈｏ Ｉが挙げられる。
ターＤＮＡへ組み込まれて遺伝子ライブラリーが作成さ
れる。上記ベクターＤＮＡとしてはＰＯＣｌ２゜Ｃｏ１
Ｃ１，ｐＭＢ９． ｐ１５八、 ＰＢＲ３２２およびｐ
ＡｃＹｃ１７７などが挙げられる。これらのベクターＤ
ＮＡは適当な制限酵素によって切断される。上記精製さ
れた染色体ＤＮＡも適当な制限酵素により切断され、上
記制限酵素によって切断されたベクターＤＮＡに連結さ
れる。上記制限酵素としては、 Ｐ ｓ ｔｌ ＋ Ｂ
ａｍＨＩ＋ Ｂｇ Ｉ Ｕ ＋ＥｃｏＲＩ、 Ｍｌｕ
Ｉ 、 Ｓａｌ ＩおよびＸｈｏ Ｉが挙げられる。
上記ベクターＤＮＡへの連結は、 ＤＮＡ リガーゼを
用い、 ＡＴＰとＤＴＴとを含有する溶液中で行われる
。
用い、 ＡＴＰとＤＴＴとを含有する溶液中で行われる
。
ＤＮＡ リガーゼとしては２例えば、 Ｔ４ファージ由
来のＤＮＡ リガーゼが用いられる。
来のＤＮＡ リガーゼが用いられる。
このようにして得られる組み換え体ＤＮＡは適当な宿主
微生物に導入される。宿主微生物としては。
微生物に導入される。宿主微生物としては。
大腸菌（ＬＣｏｌｔ）などが挙げられる。大腸菌が容易
に入手し得るため好適であり２例えば、ＬＣ９ＵｉＪＭ
１０３株が有利に使用され得る。上記組み換え体ＤＮＡ
は、常法により宿主微生物に導入される。
に入手し得るため好適であり２例えば、ＬＣ９ＵｉＪＭ
１０３株が有利に使用され得る。上記組み換え体ＤＮＡ
は、常法により宿主微生物に導入される。
例えば、塩化カルシウム法（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ
、＋皿。
、＋皿。
１５４ （１９７０））が用いられる。例えば、まず大
腸菌（ＥＬＣｏｌｔ）を液体培養し、集菌して適当な緩
衝液に懸濁させ、塩化カルシウムと接触させる。処理後
の大腸菌と上記組み換え体ＤＮＡとを塩化カルシウム存
在下にて接触させた後、熱処理を行うと形質転換体が得
られる。
腸菌（ＥＬＣｏｌｔ）を液体培養し、集菌して適当な緩
衝液に懸濁させ、塩化カルシウムと接触させる。処理後
の大腸菌と上記組み換え体ＤＮＡとを塩化カルシウム存
在下にて接触させた後、熱処理を行うと形質転換体が得
られる。
このようにして得られた組み換え体ＤＮＡを含む微生物
群からリンゴ酸酵素を生産する菌株がスクリーニングさ
れる。このスクリーニングは酵素反応およびその他の反
応を組み合わせた検出方法を利用して行われ得る。例え
ば、上記形質転換体を含む微生物群のコロニーから菌を
採取し、溶菌させた後にリンゴ酸酵素活性を調べる。こ
こでリンゴ酸酵素はリンゴ酸を酸化的に脱炭酸してピル
ビン酸を生成する反応、およびピルビン酸と炭酸ガスと
からリンゴ酸を生成する反応を可逆約６こ触媒するので
、そのいずれかの反応系を用いて酵素活性が測定されう
る。通常、リンゴ酸を基質として用いる前者の系が色素
カップリング法と組み合わせて好適に用いられる（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｉｃａＩ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋４９．１１３７〜１１４１） 、
このような反応系は例えばリンゴ酸、 ＰＥＳ、 ＭＴ
ＴおよびＮＡＤ”″を含み。
群からリンゴ酸酵素を生産する菌株がスクリーニングさ
れる。このスクリーニングは酵素反応およびその他の反
応を組み合わせた検出方法を利用して行われ得る。例え
ば、上記形質転換体を含む微生物群のコロニーから菌を
採取し、溶菌させた後にリンゴ酸酵素活性を調べる。こ
こでリンゴ酸酵素はリンゴ酸を酸化的に脱炭酸してピル
ビン酸を生成する反応、およびピルビン酸と炭酸ガスと
からリンゴ酸を生成する反応を可逆約６こ触媒するので
、そのいずれかの反応系を用いて酵素活性が測定されう
る。通常、リンゴ酸を基質として用いる前者の系が色素
カップリング法と組み合わせて好適に用いられる（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ＢｉｏｌｏｇｉｃａＩ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋４９．１１３７〜１１４１） 、
このような反応系は例えばリンゴ酸、 ＰＥＳ、 ＭＴ
ＴおよびＮＡＤ”″を含み。
リンゴ酸の酸化により青紫色の色素が生成する。
このようにしてリンゴ酸酵素を生成する微生物が検出さ
れる。このようなリンゴ酸酵素をコードする遺伝子が挿
入された形質転換体のうち、リンゴ酸酵素活性が高く、
かつ生成するリンゴ酸酵素の性質（例えば耐熱性）が優
れたものが選択される。
れる。このようなリンゴ酸酵素をコードする遺伝子が挿
入された形質転換体のうち、リンゴ酸酵素活性が高く、
かつ生成するリンゴ酸酵素の性質（例えば耐熱性）が優
れたものが選択される。
発明者らは、これらの形質転換体のうち優れた株を選択
し、これを培養し、その菌体からＤＮＡを抽出し、ジデ
オキシ法によりＤＮＡ配列の決定を行った。そのＤＮＡ
配列を以下に示す。
し、これを培養し、その菌体からＤＮＡを抽出し、ジデ
オキシ法によりＤＮＡ配列の決定を行った。そのＤＮＡ
配列を以下に示す。
ＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＣＧＡＴ
ＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ
ＡＧＣＣＡ ＴＧＡ ＡＣＡＴＴ ＡＣＧ ＡＴＴＣＧ
ＴＣＴＣＣＡ ＧＴＴＣＧ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ ＧＡ
ＴＡＴＣＧＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣ
ＧＣＣＧＣＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＧＧＣＧＧ Ｇ
Ｇ Ａ ＣＡ ＴＴＧＴＣＧＧＧ ＡＴＴＧ ＡＣＧＴ
ＣＡ ＴＴｒＣｃｒｃＡＡ ｃｃ Ａ Ａ Ａ ＧＴＴ
ＣＡＣＡＣＧＧＴ Ｇ ＣＧ ＣＧＡＴＡＴＴＡ ＣＣ
ＧＴＣＡ ＧＣＧＣＣＣＴＣＧ ＡＴ ＡＣＧ Ａ Ａ
Ｇ ＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＴＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＣＡＡ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧ
ＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡ
ＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣ（：ＣＡＧ
ＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧ
ＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＣ
ＧＴＣＴＧＣＡ ＣＧＧＣＧ Ａ ＴＴＧＣＣＧ Ａ
Ａ ＧＡ ＴＣＣＧＣＧＡ Ａ Ａ ＧＧＣＧＴＡ Ｔ
ＴＣＧＣＴＧＡ ＣＧＡ ＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＡＣ
ＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＧ
ＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＧ
ＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴ
ＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＧ
ＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＧＣＧＴＴＣＣ
ＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＣ
ＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＡ
ＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡ
ＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣＣＣＣ
ＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣＧＧ
ＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＣＣＧ
ＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣ
ＧＧＣＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧ
ＣＴＴＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡ八ＴＣＧＴＴＧＡＣＡ
ＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＴ
ＣＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣ
ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＧ
ＣＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＣＧＧ
ＧＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣ
ＣＧＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴ
ＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＣＡＣ
ＧＡＡＣＣＣＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣ
ＴＴＧＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧ
ＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣ
ＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ
ＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＣＣＧＡＴＣ
ＧＴＧＴＴＴＧＣＧ Ａ ＴＧＧＣＣＡ ＡＣＣＣＧ
Ａ ＴＴＣＣＧＧ Ａ Ａ Ａ ＴＴ Ｇ ＡＴＣＣＧ
Ｇ Ａ ＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＣＧＴＧＣＧ
ＣＧＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＡＣ
ＴＡＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＣＣ
ＴＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＣＣＧＣＧＧ
ＧＧＣＧＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡ
ＡＴＴＡ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴＣ
ＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ
ＴＣＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＣＧＡ
ＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＣ
ＡＡＣＡＧＣＡ ＡＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＴＣ
ＡＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣＧＡ ＡＧＣＧＧＣＴ
ＴＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＡ ＡＧ
ＧＡＣＡ ＡＴＡＴＣＣＣＧ ＧＴＴＧＧＣＧＧＡＴＡ
ＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣ
ＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＴ
ＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣ
ＴＧＣ（１）上記配列（１）において下線部はプロモー
ター領域である。このＤＮＡ配列（１）により発現され
るアミノ酸の配列（ｎ）は次のとおりである。
ＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＣ
ＡＧＣＣＡ ＴＧＡ ＡＣＡＴＴ ＡＣＧ ＡＴＴＣＧ
ＴＣＴＣＣＡ ＧＴＴＣＧ Ａ Ａ Ａ Ａ Ａ ＧＡ
ＴＡＴＣＧＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣ
ＧＣＣＧＣＧＡＴＴＧＧＣＡＡＡＧＣＧＧＧＣＧＧ Ｇ
Ｇ Ａ ＣＡ ＴＴＧＴＣＧＧＧ ＡＴＴＧ ＡＣＧＴ
ＣＡ ＴＴｒＣｃｒｃＡＡ ｃｃ Ａ Ａ Ａ ＧＴＴ
ＣＡＣＡＣＧＧＴ Ｇ ＣＧ ＣＧＡＴＡＴＴＡ ＣＣ
ＧＴＣＡ ＧＣＧＣＣＣＴＣＧ ＡＴ ＡＣＧ Ａ Ａ
Ｇ ＣＡＧＴＧＣＧＡＣＴＴＧＡＴＣＡＴＴＧＡＧＧ
ＣＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＧＴＣＡＡ
ＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧ
ＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＣＡＴＣＧＧＧＧＧＧＡＡＡＡ
ＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣ（：ＣＡＧ
ＴＧＡＡＡＡＣＡＣＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＧＴＣＧＣＧ
ＧＧＴＡＴＡＣＡＣＧＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＣＧＣＧＣ
ＧＴＣＴＧＣＡ ＣＧＧＣＧ Ａ ＴＴＧＣＣＧ Ａ
Ａ ＧＡ ＴＣＣＧＣＧＡ Ａ Ａ ＧＧＣＧＴＡ Ｔ
ＴＣＧＣＴＧＡ ＣＧＡ ＴＴＡＡＡＣＧＧＡＡＴＡＣ
ＧＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＣＧＧＣＡＣＧ
ＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＧＧＣＧＡＣＡＴＣＧ
ＧＴＣＣＧＴＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＴＣＡＴ
ＧＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＴＴＡＡＧ
ＧＡＡＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＴＧＧＡＣＧＣＧＴＴＣＣ
ＣＧＡＴＴＴＧＴＴＴＧＧＡＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＡＣ
ＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＴＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＡ
ＧＣＧＡＴＣＧＣＣＣＣＧＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＧＣＡ
ＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＡＴＴＴＣＣＧＣＣＣＣ
ＡＣＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＣＧＧ
ＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＡＴＴＣＣＣＧ
ＴＧＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＣ
ＧＧＣＧＧＴＣＧＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧ
ＣＴＴＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＡＡ八ＴＣＧＴＴＧＡＣＡ
ＡＡＡＡＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＧＴ
ＣＴＴＡＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＧＣ
ＡＴＣＧＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＣＴＴＧ
ＣＧＧＣＣＧＧＣＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＴＴＡＴＣＧＧ
ＧＧＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣ
ＣＧＣＧＡＴＧＡＡＡＣＧＴＡＣＧＡＡＡＡＴＣＣＧＴ
ＡＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＧＣＡＡＣＴＣＡＣ
ＧＡＡＣＣＣＧＧＡＴＡＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＣ
ＴＴＧＴＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＧＣＡＧ
ＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＣＧＧＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＣ
ＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴ
ＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＣＧＣＧＣＧＡＴＣＣＧＡＴＣ
ＧＴＧＴＴＴＧＣＧ Ａ ＴＧＧＣＣＡ ＡＣＣＣＧ
Ａ ＴＴＣＣＧＧ Ａ Ａ Ａ ＴＴ Ｇ ＡＴＣＣＧ
Ｇ Ａ ＧＣＴＧＧＣＣＧＡＡＣＣＧＴＡＣＧＴＧＣＧ
ＣＧＴＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＧＡＣ
ＴＡＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＴＣＣ
ＴＴＴＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＴＴＴＴＣＣＧＣＧＧ
ＧＧＣＧＣＴＴＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡ
ＡＴＴＡ ＡＣＧ ＡＧＧ ＡＡＡＴＧＡＡＧＣＴＣ
ＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＣＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧ
ＴＣＧＴＧＡＣＧＧＡＧＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＣＧＡ
ＡＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＧＡＧＣＧＴＣＴＴＣ
ＡＡＣＡＧＣＡ ＡＡＧＴＣＧＴＣＧＡＡＣＧＣＧＴＣ
ＡＧＡＣＡＡＧＣＧＧＴＣＧＴＣＧＡ ＡＧＣＧＧＣＴ
ＴＡＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＡ ＡＧ
ＧＡＣＡ ＡＴＡＴＣＣＣＧ ＧＴＴＧＧＣＧＧＡＴＡ
ＴＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＧＧＡＡＴＧＣ
ＧＡＴＧＧＡＡＣＣＧＡＣＧＧＡＣＧＧＣＴＴＣＣＴＴ
ＴＡＴＡＧＧＧＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＣ
ＴＧＣ（１）上記配列（１）において下線部はプロモー
ター領域である。このＤＮＡ配列（１）により発現され
るアミノ酸の配列（ｎ）は次のとおりである。
ＭｅｔＡ１ａＬｅｕＰｒｏＧｌｙＧ］ｙＡ１ａＡ１ａＭ
ｅｔＡｓｎＩＩｅＴｈｒＩ １ｅＡｒｇＬｅｕＧ １ｎ
ＰｈｅＧ １ｕＬｙｓＡｓ ｐ Ｉ １ ｅＶａ １ｓ
ｅｒＰｈｅｓｅｒＡｓ ｐ Ｉ １ｅＡ ｌ ａＡ １
ａＡ ＩａＩＩｅＧ１ｙＬ３１ｓＡ１ａＧ１ｙＧ１ｙＡ
ｓｐＩ １ｅＶａＩＧｌｙ１１ｅＡｓｐＶａｌ １１ｅ
ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｙｓＶａ ｌ Ｈｉ ５ＴｈｒＶ
ａ ＩＡｒｇＡｓｐ Ｉ １ｅＴｈｒＶａ ｌ５ｅｒＡ
１ａＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｙｓＧ １ｎＣｙｓＡｓｐ
Ｌｅｕ Ｉ ｌｅ Ｉ １ｅＧ １ ｕＡ ｌ ａＬｅ
ｕＬｙｓＬｙｓ Ｉ ｌｅＡｒｇＧ ｌ ｙＶａ １Ｌ
ｙｓ Ｉ ｌ ｅＶａ ＩＡｓｎＶａ ｌ ＳｅｒＡｓ
ｐＡｒｇＴｈｒＰｈｅＬｅｕＭｅ ｔＩＩ ｉｓ Ｉ
ｌ ｅＧｌｙＧｌ ｙＬｙｓ Ｉ ｌｅＧ １ｕＴｈｒ
ＡｓｎＳｅｒＬｙｓ ｌ１ｅＰｒｏＶａ ＩＬｙｓＴｈ
ｒＡｒｇＡｓｐＡｓｐＬｅｕＳｅｒＡｒｇＶａｌＴｙｒ
ＴｈｒＰｒｏＧｌｙＶａＩＡｌａＡｒｇＶａｌＣｙｓＴ
ｈｒＡ ｌａＩ ｌｅＡｌａＧｌｕＡｓｐＰｒｏＡｒｇ
ＬｙｓＡＩａＴｙｒＳｅｒＬｅｕＴｈｒｒＩｅＬｙｓＡ
ｒｇＡｓｎＴｈｒＶａｌＡＩａＶａＩＶａＩＳｅｒＡｓ
ｐＧｌｙＴｈｒＡＩａＶａ Ｉ ＬｅｕＧ Ｉ ｙＬｅ
ｕＧ １ ｙＡｓｐ Ｉ １ ｅＧ １ｙＰｒｏＴｙｒ
Ａ ｌａＡ ＩａＭｅ ｔＰｒｏＶａ ＩＭｅｔＧ１ｕ
ＧＩｙＬｙｓＡｌａＭｅｔＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧ１ｕＰ
ｈｅＡ１ａＧ１ｙＶａＩＡｓｐ＾１ａＰｈｅＰｒｏＩ
１ｅＣｙｓＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｙｓＡｓｐＴｈｒＧ１
ｕＧ１ｕＩ ＩｅＩ １ｅＧｉｎＩｌｅＶａｌＬｙｓＡ
ｌａＩｌｅＡ１ａＰｒｏＡ１ａＰｈｅＧｌｙＧ１ｙｌｌ
ｅＡｓｎＬｅｕＧ ｌｕ Ａｓｐ Ｉ １ ｅＳｅｒＡ
ｌ ａＰｒｏＡｒｇｃｙｓＰｈｅＧ ｌｕ Ｉ １ｅ
Ｇ １ ｕＬｙｓＡｒｇＬｅｕＬｙｓＧ １ｕＧ １ｕ
ＬｅｕＡｓｐＩ １ ｅＰｒｏＶａ １ＰｈｅＨｉｓＡ
ｓｐＡｓｐＧ１ ｎＨｔｓＧ １ｙＴｈｒＡ ｌ ａＶ
ａ Ｉ Ｖａ ｌ ＬｅｕＬｅｕＡ １ ａＧ １ ｙ
ＬｅｕＬｅｕＡｓｎＡ １ａＬｅｕＬｙｓ Ｉ １ ｅ
ＶａｌＡｓｐＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｕＡｓｐＩｌｅＬ
ｙｓＶａｌＶａＩＬｅｕＴｈｒＧｌｙＩｌｅＧｌｙＡｌ
ａＡｌａＧｌｙＩ １ｅＡ１ａＣｙｓＴｈｒＬｙｓＩｌ
ｅＬｅｕＬｅｕＡ１ａＡ１ａＧ１ｙＶａ ＩＡｒｇＡｓ
ｎ Ｉ Ｉｅ Ｉ １ｅＧ １ｙＶａ ＩＡｓｐＡｒｇ
ＨｉｓＧ １ｙＡ ｌａ Ｉ １ ｅＨｉ ｓＡｒｇ＾
５ｐＧ１ｕＴｈｒＴｙｒＧ１ｕＡｓｎＰｒｏＴｙｒＴｒ
ｐＧＩｎＧｌｕＴｙｒＡＩａＧｌｎＬｅｕＴｈｒＡｓｎ
ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＬｅｕＬｙｓＧｌｙｓｅｒＬｅｕｓ
ｅｒＡｓｐＶａＩＩＩｅＡｌａＧ２ｙＡ１ａＡｓｐＶａ
ｌＰｈｅｌｌｅＧＩｙＶａｌＳｅｒＡ］ａＰｒｏＧｌｙ
１１ｅＬｅｕＬｙｓＶａＩＧｌｕＡｓｐＶａｌＬｙｓＬ
ｙｓＭｅｔＡ１ａＡｒｇＡｓｐＰｒｏＩ ｌｅＶａＩＰ
ｈｅＡｌａＭｅｔＡｌａＡｓｎＰｒｏｌｌｅＰｒｏＧｌ
ｕｌｌｅＡｓｐＰｒｏＧｌｕＬｓｕＡｌａＧｌｕＰｒ。
ｅｔＡｓｎＩＩｅＴｈｒＩ １ｅＡｒｇＬｅｕＧ １ｎ
ＰｈｅＧ １ｕＬｙｓＡｓ ｐ Ｉ １ ｅＶａ １ｓ
ｅｒＰｈｅｓｅｒＡｓ ｐ Ｉ １ｅＡ ｌ ａＡ １
ａＡ ＩａＩＩｅＧ１ｙＬ３１ｓＡ１ａＧ１ｙＧ１ｙＡ
ｓｐＩ １ｅＶａＩＧｌｙ１１ｅＡｓｐＶａｌ １１ｅ
ＳｅｒＳｅｒＳｅｒＬｙｓＶａ ｌ Ｈｉ ５ＴｈｒＶ
ａ ＩＡｒｇＡｓｐ Ｉ １ｅＴｈｒＶａ ｌ５ｅｒＡ
１ａＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｙｓＧ １ｎＣｙｓＡｓｐ
Ｌｅｕ Ｉ ｌｅ Ｉ １ｅＧ １ ｕＡ ｌ ａＬｅ
ｕＬｙｓＬｙｓ Ｉ ｌｅＡｒｇＧ ｌ ｙＶａ １Ｌ
ｙｓ Ｉ ｌ ｅＶａ ＩＡｓｎＶａ ｌ ＳｅｒＡｓ
ｐＡｒｇＴｈｒＰｈｅＬｅｕＭｅ ｔＩＩ ｉｓ Ｉ
ｌ ｅＧｌｙＧｌ ｙＬｙｓ Ｉ ｌｅＧ １ｕＴｈｒ
ＡｓｎＳｅｒＬｙｓ ｌ１ｅＰｒｏＶａ ＩＬｙｓＴｈ
ｒＡｒｇＡｓｐＡｓｐＬｅｕＳｅｒＡｒｇＶａｌＴｙｒ
ＴｈｒＰｒｏＧｌｙＶａＩＡｌａＡｒｇＶａｌＣｙｓＴ
ｈｒＡ ｌａＩ ｌｅＡｌａＧｌｕＡｓｐＰｒｏＡｒｇ
ＬｙｓＡＩａＴｙｒＳｅｒＬｅｕＴｈｒｒＩｅＬｙｓＡ
ｒｇＡｓｎＴｈｒＶａｌＡＩａＶａＩＶａＩＳｅｒＡｓ
ｐＧｌｙＴｈｒＡＩａＶａ Ｉ ＬｅｕＧ Ｉ ｙＬｅ
ｕＧ １ ｙＡｓｐ Ｉ １ ｅＧ １ｙＰｒｏＴｙｒ
Ａ ｌａＡ ＩａＭｅ ｔＰｒｏＶａ ＩＭｅｔＧ１ｕ
ＧＩｙＬｙｓＡｌａＭｅｔＬｅｕＰｈｅＬｙｓＧ１ｕＰ
ｈｅＡ１ａＧ１ｙＶａＩＡｓｐ＾１ａＰｈｅＰｒｏＩ
１ｅＣｙｓＬｅｕＡｓｐＴｈｒＬｙｓＡｓｐＴｈｒＧ１
ｕＧ１ｕＩ ＩｅＩ １ｅＧｉｎＩｌｅＶａｌＬｙｓＡ
ｌａＩｌｅＡ１ａＰｒｏＡ１ａＰｈｅＧｌｙＧ１ｙｌｌ
ｅＡｓｎＬｅｕＧ ｌｕ Ａｓｐ Ｉ １ ｅＳｅｒＡ
ｌ ａＰｒｏＡｒｇｃｙｓＰｈｅＧ ｌｕ Ｉ １ｅ
Ｇ １ ｕＬｙｓＡｒｇＬｅｕＬｙｓＧ １ｕＧ １ｕ
ＬｅｕＡｓｐＩ １ ｅＰｒｏＶａ １ＰｈｅＨｉｓＡ
ｓｐＡｓｐＧ１ ｎＨｔｓＧ １ｙＴｈｒＡ ｌ ａＶ
ａ Ｉ Ｖａ ｌ ＬｅｕＬｅｕＡ １ ａＧ １ ｙ
ＬｅｕＬｅｕＡｓｎＡ １ａＬｅｕＬｙｓ Ｉ １ ｅ
ＶａｌＡｓｐＬｙｓＬｙｓＬｅｕＧｌｕＡｓｐＩｌｅＬ
ｙｓＶａｌＶａＩＬｅｕＴｈｒＧｌｙＩｌｅＧｌｙＡｌ
ａＡｌａＧｌｙＩ １ｅＡ１ａＣｙｓＴｈｒＬｙｓＩｌ
ｅＬｅｕＬｅｕＡ１ａＡ１ａＧ１ｙＶａ ＩＡｒｇＡｓ
ｎ Ｉ Ｉｅ Ｉ １ｅＧ １ｙＶａ ＩＡｓｐＡｒｇ
ＨｉｓＧ １ｙＡ ｌａ Ｉ １ ｅＨｉ ｓＡｒｇ＾
５ｐＧ１ｕＴｈｒＴｙｒＧ１ｕＡｓｎＰｒｏＴｙｒＴｒ
ｐＧＩｎＧｌｕＴｙｒＡＩａＧｌｎＬｅｕＴｈｒＡｓｎ
ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＬｅｕＬｙｓＧｌｙｓｅｒＬｅｕｓ
ｅｒＡｓｐＶａＩＩＩｅＡｌａＧ２ｙＡ１ａＡｓｐＶａ
ｌＰｈｅｌｌｅＧＩｙＶａｌＳｅｒＡ］ａＰｒｏＧｌｙ
１１ｅＬｅｕＬｙｓＶａＩＧｌｕＡｓｐＶａｌＬｙｓＬ
ｙｓＭｅｔＡ１ａＡｒｇＡｓｐＰｒｏＩ ｌｅＶａＩＰ
ｈｅＡｌａＭｅｔＡｌａＡｓｎＰｒｏｌｌｅＰｒｏＧｌ
ｕｌｌｅＡｓｐＰｒｏＧｌｕＬｓｕＡｌａＧｌｕＰｒ。
ＴｙｒＶａＩＡｒｇＶａｌＭｅｔＡｌａＴｈｒＧＩｙＡ
ｒｇＳｅｒＡｓｐＴｙｒＰｒｏＡｓｎＧｌｎｌ １ ｅ
ＡｓｎＡｓｎＶａ Ｉ ＬｅｕＣｙｓ ＰｈｅＰｒｏＧ
１ ｙ Ｉ １ ｅＰｈｅＡｒｇＧ １ ｙＡ １
ａＬｅｕＡｓｐＣｙｓＡｒｇＡ ＩａＡｒｇＧ ｌｕ
Ｉ １ ｅＡｓｎＧ ｌｕＧ ｌｕＭｅ ｔＬｙｓＬｅ
ｕＡ ｌａＡ １ａＡｌａＬｙｓＡｌａＩ １ｅＡＩａ
ＳｅｒＶａＩＶａＩＴｈｒＧ１ｕＡｓｐＧＩｕＥＩｕＡ
ｓｎＧＩｕＴｈｒＴｙｒ ｒｌｅ ｒ ＩｅＰｒｏＳｅ
ｒＶａ ＩＰｈｅＡ ｓ ｎ ５ｅｒＬｙｓ Ｖａ Ｉ
Ｖａ ＩＧ Ｉ ｕＡｒｇＶａ ＩＡｒｇＧＩｎＡｌ
ａＶａＩＶａＩＧｌｕＡ ｌａＡ ＩａＴｙｒＡｒｇＴ
ｈｒＧｌｙＶａ ｌ Ａ ＩａＡｒｇＬｙｓＡｓｐＡｓ
ｎｌｌｅＰｒｏＶａｌＧＩｙＧｌｙＴｙｒＴｈｒＧｌｙ
Ｇｌｎ （ＩＩ ）上記形質転換された微生物を用い
てリンゴ酸酵素が製造される。例えば、この微生物を培
養すると酵素が菌体内に蓄積される。この菌体をフレン
チプレスなどで物理的に破砕した後に熱処理し。
ｒｇＳｅｒＡｓｐＴｙｒＰｒｏＡｓｎＧｌｎｌ １ ｅ
ＡｓｎＡｓｎＶａ Ｉ ＬｅｕＣｙｓ ＰｈｅＰｒｏＧ
１ ｙ Ｉ １ ｅＰｈｅＡｒｇＧ １ ｙＡ １
ａＬｅｕＡｓｐＣｙｓＡｒｇＡ ＩａＡｒｇＧ ｌｕ
Ｉ １ ｅＡｓｎＧ ｌｕＧ ｌｕＭｅ ｔＬｙｓＬｅ
ｕＡ ｌａＡ １ａＡｌａＬｙｓＡｌａＩ １ｅＡＩａ
ＳｅｒＶａＩＶａＩＴｈｒＧ１ｕＡｓｐＧＩｕＥＩｕＡ
ｓｎＧＩｕＴｈｒＴｙｒ ｒｌｅ ｒ ＩｅＰｒｏＳｅ
ｒＶａ ＩＰｈｅＡ ｓ ｎ ５ｅｒＬｙｓ Ｖａ Ｉ
Ｖａ ＩＧ Ｉ ｕＡｒｇＶａ ＩＡｒｇＧＩｎＡｌ
ａＶａＩＶａＩＧｌｕＡ ｌａＡ ＩａＴｙｒＡｒｇＴ
ｈｒＧｌｙＶａ ｌ Ａ ＩａＡｒｇＬｙｓＡｓｐＡｓ
ｎｌｌｅＰｒｏＶａｌＧＩｙＧｌｙＴｙｒＴｈｒＧｌｙ
Ｇｌｎ （ＩＩ ）上記形質転換された微生物を用い
てリンゴ酸酵素が製造される。例えば、この微生物を培
養すると酵素が菌体内に蓄積される。この菌体をフレン
チプレスなどで物理的に破砕した後に熱処理し。
その遠心上清を採取することにより粗酵素液が得られる
。これをゲル濾過クロマトグラフィーにより分画するこ
とにより精製リンゴ酸酵素が得られる。このようにして
得られるリンゴ酸酵素の性質を以下に示す。
。これをゲル濾過クロマトグラフィーにより分画するこ
とにより精製リンゴ酸酵素が得られる。このようにして
得られるリンゴ酸酵素の性質を以下に示す。
（１）作用
炭酸ガスおよび／または炭酸塩の存在下でＮＡＤＨおよ
び／またはＮＡＤＰＨを補酵素として。
び／またはＮＡＤＰＨを補酵素として。
下記式の反応を触媒する：
（以下余白）
ピルビン酸＋炭酸ガス（炭酸塩） 十ＮＡＤＨ（ＮＡＤ
ＰＨ）ぐ世リンゴ酸＋ＮＡＤ” （ＮＡＤＰ”）オキサ
ロ酢酸十ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）は含すンゴ酸十ＮＡＤ
” （ＮＡＤＰつ上記補酵素としては、 ＮＡＤＰ”よ
りもＮＡＤ”がより高い活性を示す。
ＰＨ）ぐ世リンゴ酸＋ＮＡＤ” （ＮＡＤＰ”）オキサ
ロ酢酸十ＮＡＤＨ（ＮＡＤＰＨ）は含すンゴ酸十ＮＡＤ
” （ＮＡＤＰつ上記補酵素としては、 ＮＡＤＰ”よ
りもＮＡＤ”がより高い活性を示す。
（２）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
ピルビン酸→リンゴ酸
至適ｐ）Ｉ ６．０
安定ｐＨ範囲５．５〜８．０
リンゴ酸→ピルビン酸
至適ｐＨ８，０
安定ｐＨ範囲５．０〜９．５
（３）至適温度および安定温度範囲
至適温度 ５０℃
安定温度範囲 ０〜６５℃
（４）イオンの影響
Ｍｎ”、 Ｍｇ”、 Ｇｏ”およびＺｎ”よりなる群か
ら選択される金属イオンの一種を要求する。
ら選択される金属イオンの一種を要求する。
Ｋ” 、 （Ｎｌ（４”）により活性化される。
（５）平均分子量
ＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーによる平均分子量
は２０万であり、そして、 ５ＯＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による平均分子量は５万であった。この
結果より酵素は分子量５万の単量体から構成される４量
体と推定される。
は２０万であり、そして、 ５ＯＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による平均分子量は５万であった。この
結果より酵素は分子量５万の単量体から構成される４量
体と推定される。
このように、上記リンゴ酸酵素は１反応型適温度が高く
、かつ耐熱性に優れる。このようなリンゴ酸酵素を使用
すると比較的高温で反応が行われ。
、かつ耐熱性に優れる。このようなリンゴ酸酵素を使用
すると比較的高温で反応が行われ。
リンゴ酸が有利に製造される。リンゴ酸を得るには、ピ
ルビン酸、炭酸ガスおよび／または炭酸塩。
ルビン酸、炭酸ガスおよび／または炭酸塩。
上記リンゴ酸酵素、およびＮＡＤＨおよび／またはＮＡ
ＤＰ）Ｉを含む適当な緩衝液を４０〜６５°Ｃの温度範
囲で反応させる。上記４種の反応成分のうち３種を含む
混合溶液を調製しておき、これに残りの成分を徐々に加
えて反応させる方法が好適である。このようにして反応
液中に生成したリンゴ酸は高速液体クロマトグラフィー
などの手段により単離される。
ＤＰ）Ｉを含む適当な緩衝液を４０〜６５°Ｃの温度範
囲で反応させる。上記４種の反応成分のうち３種を含む
混合溶液を調製しておき、これに残りの成分を徐々に加
えて反応させる方法が好適である。このようにして反応
液中に生成したリンゴ酸は高速液体クロマトグラフィー
などの手段により単離される。
（実施例）
本発明の詳細な説明するため、以下に実施例を記載する
。
。
（Ａ） ＤＮＡの単離：バチルス・ステアロサーモフィ
ルスＵＫ７８８株（微工研菌寄第５１４１号）の培養菌
体１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） １２０ｍｊ！に懸濁し、リ
ゾチーム溶液（リゾチームを２０ｍｇ／ｍｌの割合で、
２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ ）リス塩酸緩衝
液に溶解させたもの＞ １５ｍ１！を加え、３０°Ｃで
１時間放置した。これに２０％ラウリル硫酸ナトリウム
溶液１５ｍ２を加え、ゆっくりと撹拌した。次にこの溶
液に１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩
衝液を飽和したフェノール１５０戚を加え、充分に撹拌
した。この溶液を遠心分離にかけ。
ルスＵＫ７８８株（微工研菌寄第５１４１号）の培養菌
体１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） １２０ｍｊ！に懸濁し、リ
ゾチーム溶液（リゾチームを２０ｍｇ／ｍｌの割合で、
２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ ）リス塩酸緩衝
液に溶解させたもの＞ １５ｍ１！を加え、３０°Ｃで
１時間放置した。これに２０％ラウリル硫酸ナトリウム
溶液１５ｍ２を加え、ゆっくりと撹拌した。次にこの溶
液に１ ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩
衝液を飽和したフェノール１５０戚を加え、充分に撹拌
した。この溶液を遠心分離にかけ。
水層（１５０＋＋ｊりを分取した。このようなフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０戚
に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍ２を加え、さらに
エタノール３００成を加えた。析出した染８色体ＤＮＡ
をガラス棒にて巻き取り、乾固させた。次いでこれを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液３
０ｒｒｄｌに溶解させ、リボヌクレアーゼを５０μｇ／
ｍとなるように加え、３７°Ｃで３０分間放置した。前
述と同様のフェノール抽出操作を行った後、水層に２．
５６酢酸ナトリウム溶液３ ｍｌおよびエタノール６０
ｄを加え、−２０℃に１６時間放置した。遠心分離し、
得られたベレットを７０％エタノール溶液にて洗浄し。
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０戚
に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍ２を加え、さらに
エタノール３００成を加えた。析出した染８色体ＤＮＡ
をガラス棒にて巻き取り、乾固させた。次いでこれを１
ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液３
０ｒｒｄｌに溶解させ、リボヌクレアーゼを５０μｇ／
ｍとなるように加え、３７°Ｃで３０分間放置した。前
述と同様のフェノール抽出操作を行った後、水層に２．
５６酢酸ナトリウム溶液３ ｍｌおよびエタノール６０
ｄを加え、−２０℃に１６時間放置した。遠心分離し、
得られたベレットを７０％エタノール溶液にて洗浄し。
乾固して染色体ＤＮＡ １０■を得た。これを１ ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液に懸濁さ
せた。
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液に懸濁さ
せた。
（Ｂ）組み換え体ＤＮＡの調製：上記染色体ＤＮＡ １
ｄｇを含む懸濁液に制限酵素Ｐｓｔｌを加えて消化を行
った。別にベクターＰＣ０１２１ｕｇを含む溶液２０μ
２にＰｓｔｌを加えて消化を行った後、２μｌのＩＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加え、アルカリフォ
スファターゼ処理を６５°Ｃで１時間行った。
ｄｇを含む懸濁液に制限酵素Ｐｓｔｌを加えて消化を行
った。別にベクターＰＣ０１２１ｕｇを含む溶液２０μ
２にＰｓｔｌを加えて消化を行った後、２μｌのＩＭ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を加え、アルカリフォ
スファターゼ処理を６５°Ｃで１時間行った。
消化された上記染色体ＤＮＡおよびベクターＤＮＡを上
記と同様の方法によりフェノール抽出およびエタノール
沈澱操作に供して精製を行った。精製染色体ＤＮＡ １
１００ｎおよび精製ベクターＤＮＡ ２０ｎｇを。
記と同様の方法によりフェノール抽出およびエタノール
沈澱操作に供して精製を行った。精製染色体ＤＮＡ １
１００ｎおよび精製ベクターＤＮＡ ２０ｎｇを。
６６ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，６） 、 ６６
ｍＭ塩化マグネシウム、 １０ｍＭ ＤＴＴおよび０．
１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に採り、 Ｔ４リガーゼ
をＩ Ｕｎｉｔ／１０ｕ４２となるように加えて１４°
Ｃで１６時間反応させ２両方のＤＮＡを連結させて組み
換え体ＤＮＡを得た。
ｍＭ塩化マグネシウム、 １０ｍＭ ＤＴＴおよび０．
１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に採り、 Ｔ４リガーゼ
をＩ Ｕｎｉｔ／１０ｕ４２となるように加えて１４°
Ｃで１６時間反応させ２両方のＤＮＡを連結させて組み
換え体ＤＮＡを得た。
（Ｃ）組み換え体ＤＮＡを導入した大腸菌の調製二大腸
菌（Ｌ 匹旦） ＪＭ１０３株をＬＢ液体培地（１％ト
リプトン、０．５％酵母エキスおよび１％ＮａＣ１を含
む、 ｐＨ７，５） ５戚に植菌し３７°Ｃで１６時間
液体培養したものを、新たなＬＢ培地４０ｄに１０％移
し。
菌（Ｌ 匹旦） ＪＭ１０３株をＬＢ液体培地（１％ト
リプトン、０．５％酵母エキスおよび１％ＮａＣ１を含
む、 ｐＨ７，５） ５戚に植菌し３７°Ｃで１６時間
液体培養したものを、新たなＬＢ培地４０ｄに１０％移
し。
３７°Ｃで２時間培養を行った。１０００回転で１分間
遠心分離して集めた菌を、０°Ｃの５０ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液（あらかじめ滅菌）２０戚中に分散させ、０°
Ｃにて２０分間静置した。その後、再び１０００回転で
１分間遠心分離をして集菌した。その菌を、 ５０ｍＭ
塩化カルシウム溶液４ｍに懸濁させ、０°Ｃにて６時間
放置した。その懸濁液と、（Ｂ）項で得られた組み換え
体ＤＮＡを含む溶液とを０゛Ｃで６時間接触させた。次
いで４２℃で３分間熱処理後、再び０℃に１分間放置し
た。この混合液を５０μｇ／・ｍｌのアンピシリン、
０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．００４％の５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを含むＬＢ寒天平板培地に播種した。
遠心分離して集めた菌を、０°Ｃの５０ｍＭ塩化カルシ
ウム溶液（あらかじめ滅菌）２０戚中に分散させ、０°
Ｃにて２０分間静置した。その後、再び１０００回転で
１分間遠心分離をして集菌した。その菌を、 ５０ｍＭ
塩化カルシウム溶液４ｍに懸濁させ、０°Ｃにて６時間
放置した。その懸濁液と、（Ｂ）項で得られた組み換え
体ＤＮＡを含む溶液とを０゛Ｃで６時間接触させた。次
いで４２℃で３分間熱処理後、再び０℃に１分間放置し
た。この混合液を５０μｇ／・ｍｌのアンピシリン、
０．１ｍＭのＩＰＴＧおよび０．００４％の５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシドを含むＬＢ寒天平板培地に播種した。
上記の方法により得られた白色のコロニーを培養し、こ
れを濾紙に写しとった。この濾紙にリゾチーム溶液（４
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５戚お
よび２０ｗＭ ＥＤＴＡ ０．５＃＋１！を混合した
液にリゾチーム２Ｉｌ１ｇを溶かしたもの）５ｄを付与
し、３０〜３７°Ｃで２０分間放置した。この液を吸引
除去した後。
れを濾紙に写しとった。この濾紙にリゾチーム溶液（４
０ｍＭ ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５） ０．５戚お
よび２０ｗＭ ＥＤＴＡ ０．５＃＋１！を混合した
液にリゾチーム２Ｉｌ１ｇを溶かしたもの）５ｄを付与
し、３０〜３７°Ｃで２０分間放置した。この液を吸引
除去した後。
１％トリドアＸ−１００水溶液５Ｉｄを付与し、２５〜
３０°Ｃで５分間放置した。水溶液を除去し、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） １０ｒ１１を加え、６０°Ｃ
で４０分間熱処理を行った。この緩衝液を除去した後、
１００ｍＭリンゴ酸、 ０．５ｍＭ ＰＢＳ、 ０．
５ｍＭ ＭＴＴ、 ５０μＭ ＮＡＤ”および２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液ＰＨ８，０を含む基質混合液５ｄを
加え、３７°Ｃの暗所に放置した。対照として、上記同
一のコロニーを２枚の濾紙に写しとっておき、うち１枚
には上述の基質混合液からリンゴ酸を除いた液を付与し
た。コロニーの中で、青紫色に変化したものが、リンゴ
酸を酸化する酵素遺伝子をクローン化した形質転換体で
ある。
３０°Ｃで５分間放置した。水溶液を除去し、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） １０ｒ１１を加え、６０°Ｃ
で４０分間熱処理を行った。この緩衝液を除去した後、
１００ｍＭリンゴ酸、 ０．５ｍＭ ＰＢＳ、 ０．
５ｍＭ ＭＴＴ、 ５０μＭ ＮＡＤ”および２０ｍＭ
）リス塩酸緩衝液ＰＨ８，０を含む基質混合液５ｄを
加え、３７°Ｃの暗所に放置した。対照として、上記同
一のコロニーを２枚の濾紙に写しとっておき、うち１枚
には上述の基質混合液からリンゴ酸を除いた液を付与し
た。コロニーの中で、青紫色に変化したものが、リンゴ
酸を酸化する酵素遺伝子をクローン化した形質転換体で
ある。
このようにして得られた形質転換体をＬＢ培地で培養し
、集菌した後、上記方法に準じてプラスミドＤＮＡを取
り出し、その配列をジデオキシ法により決定した。その
ＤＮＡ配列は「問題点を解決するための手段」の項に記
載されたＤＮＡ配列（Ｉ）と同一であった。この挿入Ｄ
ＮＡ断片とバチルス・ステアロサーモフィルス染色体Ｄ
ＮＡとのサザン・ハイブリダイゼーションを行ったとこ
ろ、このプロモーター領域を含むＤＮＡ配列がバチルス
・ステアロサーモフィルス由来であることが確認された
。
、集菌した後、上記方法に準じてプラスミドＤＮＡを取
り出し、その配列をジデオキシ法により決定した。その
ＤＮＡ配列は「問題点を解決するための手段」の項に記
載されたＤＮＡ配列（Ｉ）と同一であった。この挿入Ｄ
ＮＡ断片とバチルス・ステアロサーモフィルス染色体Ｄ
ＮＡとのサザン・ハイブリダイゼーションを行ったとこ
ろ、このプロモーター領域を含むＤＮＡ配列がバチルス
・ステアロサーモフィルス由来であることが確認された
。
（Ｄ） リンゴ酸酵素の製造：（Ｃ）項で得られた形
質転換株を５ ｍｌのＬＢ培地（５０ｇｇ７ｍｌｌのア
ンピシリンを含む）に植菌し１６時間前培養した後に、
同質の新たな培地で５０°Ｃにて１時間培養し、さらに
３７“Ｃで８時間培養を行った。これを遠心分離して菌
体を分離した。菌体５ｇを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）２０ｇｇｏｄに懸濁し、フレンチプレスにかけ
て菌体を破砕した。遠心分離後、上澄液をフラクション
コレクターチューブに採り、６０℃で２０分間熱処理を
行った。再び遠心分離し、上澄液をＤＥＡＥ −セファ
デックスＡ−５０カラムにかけ活性画分を分画した。カ
ラムクロマトグラフィーの開始時の溶離液は３０ｍＭリ
ン酸緩衝波緩衝液 ７．５であり、 Ｏ〜０．５Ｍ食
塩水２１を用い直線的勾配で溶出させた。得られた両分
の酵素活性をリンゴ酸を基質とした酵素反応におけるＮ
Ａ Ｄ Ｉの増加（Ａ、４゜の増加）で測定した。
質転換株を５ ｍｌのＬＢ培地（５０ｇｇ７ｍｌｌのア
ンピシリンを含む）に植菌し１６時間前培養した後に、
同質の新たな培地で５０°Ｃにて１時間培養し、さらに
３７“Ｃで８時間培養を行った。これを遠心分離して菌
体を分離した。菌体５ｇを３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７，５）２０ｇｇｏｄに懸濁し、フレンチプレスにかけ
て菌体を破砕した。遠心分離後、上澄液をフラクション
コレクターチューブに採り、６０℃で２０分間熱処理を
行った。再び遠心分離し、上澄液をＤＥＡＥ −セファ
デックスＡ−５０カラムにかけ活性画分を分画した。カ
ラムクロマトグラフィーの開始時の溶離液は３０ｍＭリ
ン酸緩衝波緩衝液 ７．５であり、 Ｏ〜０．５Ｍ食
塩水２１を用い直線的勾配で溶出させた。得られた両分
の酵素活性をリンゴ酸を基質とした酵素反応におけるＮ
Ａ Ｄ Ｉの増加（Ａ、４゜の増加）で測定した。
得られた活性画分をウルトラ・フィルターＵＰ−２０で
濃縮した。濃縮物に、 ０．１Ｍ、リン酸緩衝液ｐｌ＋
７．０およびそれと当量のＯ，１Ｍ食塩を含む水溶液
を加えて溶解させ、トーヨーパールＧ３０００ＳＷを固
相としたＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーにより分
画し。
濃縮した。濃縮物に、 ０．１Ｍ、リン酸緩衝液ｐｌ＋
７．０およびそれと当量のＯ，１Ｍ食塩を含む水溶液
を加えて溶解させ、トーヨーパールＧ３０００ＳＷを固
相としたＨＰＬＣゲル濾過クロマトグラフィーにより分
画し。
リンゴ酸酵素５■を得た。得られたリンゴ酸酵素の性質
は「問題点を解決するための手段」の項に示したリンゴ
酸酵素の性質と同一であった。
は「問題点を解決するための手段」の項に示したリンゴ
酸酵素の性質と同一であった。
（Ｅ） リンゴ酸の製造＝（Ｅ）項で得られたリンゴ
酸酵素および表■の組成の成分を含む溶液１００ ｍｌ
に、炭酸水素カリウム１％水溶液（１２ｍＭに相当する
）１２ｉｊ！を５０゛Ｃで撹拌しながら１時間かけて加
えた。１時間後に溶液中のリンゴ酸の生成量を酵素法に
より測定したところ、 ０．１２ｇ （９ｍＭ）である
ことが確認された。反応液中のリンゴ酸は各種クロマト
グラフィーなどの手段により容易に単離され得る。
酸酵素および表■の組成の成分を含む溶液１００ ｍｌ
に、炭酸水素カリウム１％水溶液（１２ｍＭに相当する
）１２ｉｊ！を５０゛Ｃで撹拌しながら１時間かけて加
えた。１時間後に溶液中のリンゴ酸の生成量を酵素法に
より測定したところ、 ０．１２ｇ （９ｍＭ）である
ことが確認された。反応液中のリンゴ酸は各種クロマト
グラフィーなどの手段により容易に単離され得る。
表Ｉ
（発明の効果）
本発明によれば、このように、バチルス・ステアロサー
モフィルス由来の耐熱性リンゴ酸酵素をコードするＤＮ
Ａが単離される。さらに、このＤＮＡをベクターに組み
込んだ組み換え体ＤＮＡＸおよび該組み換え体ＤＮＡを
含む微生物が調製される。この微生物は、耐熱性に優れ
たリンゴ酸酵素を生成する。このリンゴ酸酵素を用い、
比較的高温下において、効果的にピルビン酸からリンゴ
酸が製造される。
モフィルス由来の耐熱性リンゴ酸酵素をコードするＤＮ
Ａが単離される。さらに、このＤＮＡをベクターに組み
込んだ組み換え体ＤＮＡＸおよび該組み換え体ＤＮＡを
含む微生物が調製される。この微生物は、耐熱性に優れ
たリンゴ酸酵素を生成する。このリンゴ酸酵素を用い、
比較的高温下において、効果的にピルビン酸からリンゴ
酸が製造される。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバチルス・ステア
ロサーモフィルス由来のＤＮＡ。 ２、前記バチルス・ステアロサーモフィルス由来のプロ
モーター領域を含む特許請求の範囲第１項に記載のＤＮ
Ａ。 ３、下記の塩基配列（ I ）を有する特許請求の範囲第
１項に記載のＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】 ４、下記のアミノ酸配列（II）に対応する塩基配列を含
む特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】 ５、前記バチルス・ステアロサーモフィルスが、バチル
ス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８株（微工研菌寄
第５１４１号）である特許請求の範囲第１項に記載のＤ
ＮＡ。 ６、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバチルス・ステア
ロサーモフィルス由来のＤＮＡが、ベクターＤＮＡに組
み込まれた組み換え体ＤＮＡ。 ７、前記ＤＮＡが、前記バチルス・ステアロサーモフィ
ルス由来のプロモーター領域を含む特許請求の範囲第６
項に記載の組み換え体ＤＮＡ。 ８、前記ＤＮＡが、下記の塩基配列（ I ）を有する特
許請求の範囲第６項に記載の組み換え体ＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】 ９、前記ＤＮＡが、下記のアミノ酸配列（II）に対応す
る塩基配列を含む特許請求の範囲第６項に記載の組み換
え体ＤＮＡ： 【遺伝子配列があります】 １０、前記ベクターＤＮＡが、ＰＵＣ１２、ＣｏｌＥ１
、ｐＭＢ９、ｐ１５Ａ、ＰＢＲ３２２およびｐＡＣＹＣ
１７７でなる群より選択される少なくとも一種である特
許請求の範囲第６項に記載の組み換え体ＤＮＡ。 １１、前記バチルス・ステアロサーモフィルスがバチル
ス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８株（微工研菌寄
第５１４１号）である特許請求の範囲第６項に記載の組
み換え体ＤＮＡ。 １２、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバチルス・ステ
アロサーモフィルス由来のＤＮＡがベクターＤＮＡに組
み込まれた組み換え体ＤＮＡを、宿主微生物に導入し、
形質転換された微生物。 １３、前記ＤＮＡが前記バチルス・ステアロサーモフィ
ルス由来のプロモーター領域を含む特許請求の範囲第１
２項に記載の組成物。 １４、前記ＤＮＡが下記の塩基配列（ I ）を有する特
許請求の範囲第１２項に記載の微生物： 【遺伝子配列があります】 １５、前記ＤＮＡの塩基配列が下記のアミノ酸配列（I
I）に対応する特許請求の範囲第１２項に記載の微生物
： 【遺伝子配列があります】 １６、前記ベクターＤＮＡが、ＰＵＣ１２、ＣｏｌＥ１
、ｐＭＢ９、ｐ１５Ａ、ＰＢＲ３２２およびｐＡＣＹＣ
１７７でなる群より選択される少なくとも一種である特
許請求の範囲第１２項に記載の微生物。 １７、前記バチルス・ステアロサーモフィルスが、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８株（微工研菌
寄第５１４１号）である特許請求の範囲第１２項に記載
の微生物。 １８、前記宿主微生物が大腸菌（￥Ｅ．￥￥Ｃｏｌｉ￥
）である特許請求の範囲第１２項に記載の微生物。 １９、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバチルス・ステ
アロサーモフィルス由来のＤＮＡがベクターＤＮＡに組
み込まれた組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入し、形
質転換された微生物を得る工程、 該形質転換体微生物を培養する工程、および該微生物菌
体に蓄積したリンゴ酸酵素を採取する工程、 を包含するリンゴ酸酵素の製造方法。 ２０、前記ＤＮＡが前記バチルス・ステアロサーモフィ
ルス由来のプロモーター領域を含む特許請求の範囲第１
９項に記載の製造方法。 ２１、前記ＤＮＡが下記の塩基配列（ I ）を有する特
許請求の範囲第１９項に記載の製造方法： 【遺伝子配列があります】 ２２、前記ＤＮＡの塩基配列が下記のアミノ酸配列（I
I）に対応する特許請求の範囲第１９項に記載の製造方
法： 【遺伝子配列があります】 ２３、前記ベクターＤＮＡが、ＰＵＣ１２、ＣｏｌＥ１
、ｐＭＢ９、ｐ１５Ａ、ＰＢＲ３２２およびｐＡＣＹＣ
１７７でなる群より選択される少なくとも一種である特
許請求の範囲第１９項に記載の製造方法。 ２４、前記ＤＮＡが、前記バチルス・ステアロサーモフ
ィルス由来のプロモーター領域を含む特許請求の範囲第
１９項に記載の製造方法。 ２５、前記宿主微生物が大腸菌（￥Ｅ．￥￥Ｃｏｌｉ￥
）である特許請求の範囲第１９項に記載の製造方法。 ２６、耐熱性リンゴ酸酵素をコードするバチルス・ステ
アロサーモフィルス由来のＤＮＡがベクターＤＮＡに組
み込まれた組み換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入し、形
質転換された微生物を培養する工程、該形質転換体微生
物を培養する工程、および該形質転換体微生物により生
産されたリンゴ酸酵素を触媒としＮＡＤＨおよび／また
はＮＡＤＰＨを補酵素として、ピルビン酸と炭酸ガスお
よび／または炭酸塩とからリンゴ酸を製造する工程、 を包含するリンゴ酸の製造方法。 ２７、前記ＤＮＡが前記バチルス・ステアロサーモフィ
ルス由来のプロモーター領域を含む特許請求の範囲第２
６項に記載の製造方法。 ２８、前記ＤＮＡが下記の塩基配列（ I ）を有する特
許請求の範囲第２６項に記載の製造方法： 【遺伝子配列があります】 ２９、前記ＤＮＡが下記のアミノ酸（II）に対応する塩
基配列を含む特許請求の範囲第２６項に記載の製造方法
： 【遺伝子配列があります】 ３０、前記ベクターＤＮＡが、ＰＵＣ１２、ＣｏｌＥ１
、ｐＭＢ９、ｐ１５Ａ、ＰＢＲ３２２およびｐＡＣＹＣ
１７７でなる群より選択される少なくとも一種である特
許請求の範囲第２６項に記載の製造方法。 ３１、前記バチルス・ステアロサーモフィルスが、バチ
ルス・ステアロサーモフィルスＵＫ７８８株（微工研菌
寄第５１４１号）である特許請求の範囲第２６項に記載
の製造方法。 ３２、前記宿主微生物が大腸菌（￥Ｅ．￥￥Ｃｏｌｉ￥
）である特許請求の範囲第２６項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62260083A JPH01101887A (ja) | 1987-10-14 | 1987-10-14 | リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62260083A JPH01101887A (ja) | 1987-10-14 | 1987-10-14 | リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01101887A true JPH01101887A (ja) | 1989-04-19 |
Family
ID=17343065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62260083A Pending JPH01101887A (ja) | 1987-10-14 | 1987-10-14 | リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01101887A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2796080A1 (fr) * | 1999-06-18 | 2001-01-12 | Orsan | Procede de production de la l-lysine par surexpression de l'enzyme malique |
-
1987
- 1987-10-14 JP JP62260083A patent/JPH01101887A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2796080A1 (fr) * | 1999-06-18 | 2001-01-12 | Orsan | Procede de production de la l-lysine par surexpression de l'enzyme malique |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6225099B1 (en) | Alcohol dehydrogenase and its use for the enzymatic production of chiral hydroxy compounds | |
| WO2002036779A1 (en) | Novel glucose dehydrogenase and process for producing the dehydrogenase | |
| US5352599A (en) | Co-enzyme-independent L-sorbosone dehydrogenase of gluconobacter oxydans: isolation, characterization, and cloning and autologus expression of the gene | |
| Sauvageot et al. | Purification, characterization and subunits identification of the diol dehydratase of Lactobacillus collinoides | |
| JP4272231B2 (ja) | キラルなヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法 | |
| JP4668176B2 (ja) | トリテルペン水酸化酵素 | |
| US8383375B2 (en) | Thermostable gluconate dehydratase and use thereof | |
| JP4216719B2 (ja) | ハロゲン化合物耐性新規ギ酸脱水素酵素及びその製造方法 | |
| CA2365092A1 (en) | Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof | |
| AU636500B2 (en) | Cloning and overexpression of glucose-6-phosphate dehydrogenase from leuconostoc dextranicus | |
| JPH01101887A (ja) | リンゴ酸酵素をコードするｄｎａ，該ｄｎａを含む組み換え体ｄｎａおよび該組み換え体ｄｎａにより形質転換された微生物 | |
| JP4036667B2 (ja) | 新規グルコース脱水素酵素及びそれをコードする遺伝子 | |
| JP5115708B2 (ja) | 新規過酸化水素生成型ｎａｄｈオキシダーゼ及びそれをコードするｄｎａ | |
| JP2009089649A (ja) | クロストリジウム・クルベリのジアホラーゼ遺伝子およびその利用 | |
| WO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 | |
| US6869785B1 (en) | Cytochrome c oxidase enzyme complex | |
| JP2004504025A (ja) | 大腸菌における、コマモナスのシクロペンタノン１，２−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子 | |
| JP4039041B2 (ja) | 死菌化方法 | |
| JP2005102511A (ja) | 新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子 | |
| JP2005528098A (ja) | マンニトール−２−デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列並びにｄ−マンニトールの製造方法 | |
| JP5954539B2 (ja) | １−ベンジル−４−ヒドロキシ−３−ピペリジンカルボン酸アルキルエステルの製造方法 | |
| JP3032779B2 (ja) | 好熱性デヒドロゲナーゼ、それをコードするｄｎａ、その製造方法、及びその使用 | |
| JP3335287B2 (ja) | ヘキソキナーゼ遺伝子 | |
| JP2006500018A (ja) | エノンレダクターゼ遺伝子およびレボディオンの微生物産生 | |
| JP2011205921A (ja) | ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌組換体及びそれを用いた光学活性（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法 |