JP2004504025A - 大腸菌における、コマモナスのシクロペンタノン1,2−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子 - Google Patents
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Abstract
コマモナス(Comamonas)(以前はシュードモナス(Pseudomonas))種NCIMB 9872株由来のシクロペンタノン1,2−モノオキシゲナーゼ(CPMO)は、その細菌が増殖のために唯一の炭素源としてシクロペンタノールを用いることを可能にする、分解経路の第2段階を行う。本発明において、4.3kbのSphI断片上でのCPMOをコードする遺伝子(cpnB)の位置、その配列の決定が報告されている。その遺伝子によりコードされる550アミノ酸のCPMOポリペプチド(分子量62,111)は、アシネトバクター種(Acinetobacter sp.)NCIMB 9871株のシクロヘキサノン1,2−モノオキシゲナーゼ(CHMO)の配列と、36.5%の同一性を有することが見出された。62kDaのCPMOは、IPTG誘導性タンパク質として大腸菌(E.coli)において発現された。
Description
【0001】
技術分野
本発明は、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分、ならびにその単離DNAを含む発現ベクターおよび形質転換細胞に関連する。
【0002】
発明の背景
コマモナス(Comamonas)(以前はシュードモナス(Pseudomonas))種NCIMB 9872は、バイヤー−ビリガー(Baeyer−Villiger)モノオキシゲナーゼを産生することを特徴としてきた数少ない微生物の1つであった(BVMO; Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972; Griffin, M.ら、Eur. J. Biochem. 63:199〜209, 1976; および最近の概説として、Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。BVMOは、過酸−触媒されるケトンのエステルまたはラクトンへの酸化である典型的バイヤー−ビリガー有機化学反応を模倣するフラビンタンパク質である。高い収量および光学純度におけるラクトンの生産についての酵素代替物の使用は、化学的方法を生物学的代替法に置き換えるという方向への研究開発の最近の流れにおいて、魅力的な特徴である(Stinson, S. C., Chem. Eng. News, 83〜104, 1998)。現在まで、最高の特徴をもつBVMO酵素は、アシネトバクター種(Acinetobacter sp.)NCIMB 9871により産生されるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ(CHMO)である(Stewart, J. D., Curr. Org. Chem. 2:195〜216, 1998; Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。これはまた、遺伝子がクローニングされかつ配列決定された唯一のBVMOである(Chenら、J. Bacteriol. 170:781〜789, 1988)。最近、この価値ある資源は、様々な不斉バイヤー−ビリガー酸化をもたらすための細胞全体的アプローチにおける「デザイナー酵母(designer yeast)」を設計するために用いられた(Stewart, J. D.ら、J. Am. Chem. Soc. 120:3541〜3548, 1998)。
【0003】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいCPMOが提供されることは、大いに望ましいと思われる。
【0004】
発明の概要
本発明の一つの目的は、唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいCPMOを提供することである。
【0005】
本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分が提供され、その単離されたDNAは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号:8において表されるDNAの相補体に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする。
【0006】
また、本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードし、かつ以下を含む、単離されたDNAが提供される:
(1)配列番号:8の核酸配列;
(2)遺伝暗号の縮退の範囲における該核酸配列に対応する配列;または
(3)ストリンジェントな条件下で(1)または(2)由来の配列にハイブリダイズし、かつなおシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする配列。
【0007】
さらに本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分が提供され、該単離されたDNAは配列番号:8を有する。
【0008】
本発明は、さらにまた、配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA発現ベクター、または部分が該CPMOをコードする、発現可能な形でのその部分を提供する。
【0009】
本発明に従って、上記のような単離されたDNAを含む組換えベクターもまた提供され、単離されたDNAはシクロペンタノンモノオキシゲナーゼをコードする。
【0010】
本発明の好ましい態様において、単離されたDNAは、配列番号:8の核酸配列または、遺伝暗号の縮重による、その機能的等価物である核酸配列を有する。
【0011】
または本発明に従って、上記の組換えDNAの1つまたは複数のコピーを含む組換えベクターが提供される。
【0012】
組換えベクターは原核生物のベクターであってもよい。組換えベクターはまた、プラスミドであってもよい。
【0013】
それゆえ、本発明に従って、上記のようなDNAを含む、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスDNAベクターもまた提供される。
【0014】
本発明はまた、上記の組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。
【0015】
従って、配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする異種DNA発現構築物、または部分が該CPMOをコードする、発現可能な形でのその部分で形質転換された細胞もまた提供される。
【0016】
細胞は原核生物の細胞であってもよく、またはそれは大腸菌であってもよい。
【0017】
さらに本発明に従って、以下を有する精製されたシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)もまた提供される:
a)配列番号:5に示されるアミノ酸配列;
b)配列番号:8に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;または
c)ストリンジェントな条件下で上記の段階b)の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であり、段階c)においてコードされる該アミノ酸配列はa)におけるアミノ酸配列と同じ活性を有する。
【0018】
本発明はまた、天然のシュードモナス由来のものより優れた、およびより好ましくは、2倍優れた酵素活性を有する組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)も提供する。
【0019】
組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)は、コマモナス種NCIMB 9872から調製されてもよい。組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)は、好ましくは、配列番号:5に示される配列を有する。
【0020】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンの存在下においてインビトロで細胞を増殖させるための方法であるが、該方法は以下の段階含む:
a)上記の発現構築物で細胞を形質転換する段階;および
b)唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において適する条件下で段階a)の細胞を増殖させる段階。
【0021】
この遺伝子の可能性を高めるため、コマモナス(シュードモナス)種NCIMB 9872由来のシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする遺伝子(cpnB)のクローニング、そのDNAおよび周囲の配列の決定ならびに大腸菌におけるCPMO活性およびタンパク質の発現を本発明に従い、本明細書に報告する。
【0022】
好ましい態様の詳細な説明
コマモナス種NCIMB 9872 CPMOをコードする遺伝子のクローニング
本研究において16S rDNAの配列決定によりコマモナスとして同定されるシュードモナス種NCIMB 9872(以下9872株)は、ナショナルコレクションズオブインダストリアルアンドマリンバクテリア社(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd)(NCIMB、アバディーン、スコットランド)から購入され、2 mlのシクロペンタノンを含む、ルリア−ベルターニ(Luria−Bertani)(LB)培地(Sambrook, J.ら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning: a laboratory manual)」、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、N. Y.、1989)、または無機塩培地(MSM)、pH 7.0において30℃で増殖された。MSMの配合はリットルあたり:1.0 gのNH4NO3、1.5 gのKH2PO4、1.5 gのNa2HPO4、0.2 gの MgSO4・7H2O、0.01 gのCaCl2・2H2O、0.005のFeSO・7H2O、0.002 gのMnSO4・4H2Oおよび0.1 gの酵母エキスを含む。寒天はプレートに対して1.5%まで加えられた。9872株のゲノムDNAはマルマー(Marmur)法(Marmur, J., J. Mol. Biol. 3:208〜218, 1961)により調製された。最初に、BamHIで消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーションを、アシネトバクターNCIMB 9871 CHMO−含有遺伝子をプローブとして用いて行った。陽性の結果が得られなかった(ハイブリダイゼーション条件は65℃で行なった)ので、CPMOタンパク質をN末端アミノ酸配列を得るために精製した。シクロペンタノン−増殖細胞からのCPMOタンパク質の精製は、グリフィン(Griffin)およびツルギル(Turgill)に従った(Griffin, M.ら、Eur. J. Biochem. 63:199〜209, 1976)。自動化タンパク質シーケンサー(パーキン−エルマー(Perkin−Elmer)モデル477)を使用して、精製されたCPMOの40残基のアミノ末端配列が得られた(図2)。この配列は、11個のアミノ酸だけ長いが、同じ生物体由来の以前に報告されたものと完全に一致している(Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。2つの変性したオリゴデオキシヌクレオチドプライマー(5’−ACIACIATGA CIACNATGAC−3’(配列番号:1)および5’−ARRTGRTAIARYTGRTA−3’(配列番号:2)、それぞれアミノ酸2〜8および35〜40に対応している)は、9872株から調製された全DNAからの116−bp生成物を増幅するために、合成された。PCR増幅は、パーキンエルマー−モデル2400サーマルサイクラー(Perkin Elmer−Model 2400 Thermal Cycler)(商標)において行われ、増幅条件は、94℃で1分間、50℃で1分間および72℃で1分間の30サイクルであった。増幅産物はpXcmkn12ベクター(Cha, J.ら、Gene 136:369〜370, 1993)に直接的にクローニングされ、大腸菌JM109に形質転換され、そしてその結果生じたプラスミドはpCMP10と名付けられた。増幅産物を遺伝子プローブとして使用する前に、そのヌクレオチド配列を確認した。ヌクレオチドの配列決定は、タックダイデオキシ(Taq DyeDeoxy)ターミネーターサイクル配列決定キットおよびABI プリズム310ジェネティックアナライザー(ABI Prism 310 Genetic Analyzer)(パーキンエルマー(Perkin Elmer))により決定された。プラスミド単離は、バーンボイム(Birnboim)およびドリー(Doly)の方法により行われた(Birnboim, H. C.およびJ. Doly, DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513〜1523, 1979)。
【0023】
図2において、Orf1は、NtrC−型の転写アクチベーターである可能性が最も高い(Morett, E., L. Segovia, J. Bacteriol. 175:6067〜6074, 1993)。ORF1のアミノ酸配列(C末端の391個のアミノ酸)は、NTRC_ECOLI(大腸菌由来の窒素調節タンパク質NR(I);Mirandaら、「大腸菌K12のglnALGオペロンの完全ヌクレオチド配列(The complete nucleotide sequence of the glnALG operon of Escherichia coli K12)」、15:2757〜2770, 1987)、ACOR_ALCEU(ラルストニア・ユトロファ(Ralstonia eutropha)由来のアセトイン異化反応調節タンパク質;Kruger, N.ら、J. Bacteriol. 179:4391〜4400, 1992)のようなタンパク質の対応する領域に38%〜40%の同一性を示した。ORF2のアミノ酸配列は、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーの酵素に類似性を示しているが(Jornvall, H.ら、Biochemistry 34:6003〜6013, 1995)、推定上のマイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)のオキシドレダクターゼCY39.16C(スイスプロット(Swiss Prot)sp:Q10855)およびM. ツベルキュロシスのfadG3(ゲンバンクアクセッション番号Z74025)に最も相同性がある(45%〜46%の同一性)。シュードモナス種HI−201株についてpKOK6.1由来のlacZ−Kmrカセット(Kokotek, W.ら、Gene 84:467〜471, 1989)は、NsiI部位でcpnBへ挿入された。
【0024】
図2において、次の用語は以下のように定義される:tfd、ファージfdの転写終結配列;Kmr、カナマイシン耐性遺伝子;lacZ、b−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。遺伝子およびマーカーは矢印で示されている。
【0025】
CPMO−含有遺伝子をクローニングするために、pCMP10由来のDNA挿入断片を増幅し、メーカーの説明書(ベーリンガーマンハイムGmbH(Boehringer Mannheim GmbH))に従い、ジゴキシゲニン−11−UTPシステムにより標識し、そして様々な制限酵素(BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、NheI、PstI、SalI、SphIおよびXbaI)で消化された9872株ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションを探索するために使用した。結果として、ハイブリダイズしている1つの約4.3kbのSphI断片のバンドが得られた。ハイブリダイゼーションの条件は前記と同様にした。続いて、0.8%アガロースゲル上で分離されたSphI−切断された全DNAの精製された4.0kb〜4.5kbのサイズの断片を、線状化および脱リン酸されている大腸菌プラスミドpUC18へライゲーションした。4.3kb挿入断片を含むクローンは、プローブとしてPCR産物を使用するコロニーハイブリダイゼーションにより、スクリーニングされた;この組換えプラスミドはpCMP200と名付けられた。
【0026】
CPMOをコードする遺伝子(cpnB)および隣接領域のDNA配列
CPMOをコードする遺伝子のヌクレオチドの配列決定は、pCMP10においてクローニングされたPCR産物の配列から設計されたプライマーを使用することにより開始され、そして、その新しい配列から引き出されるオリゴヌクレオチドを使用してさらに拡張された。SphI断片の両方のDNA鎖は配列決定されて、4281塩基対(bp)からなることが見出された。配列は、GENETYX−Mac(ソフトウェアデベロップメント社(Software Development Co., Ltd.)、千葉、日本)およびBLASTプログラム(Altschul, S. F.ら、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402, 1997)により分析された。結果として、同じ方向に配置された3つの読み取り枠(OPF)が予測された(図2)。CPMOをコードする1650−bp ORFのヌクレオチド配列はNtrC−型転写アクチベーターのC末端をコードする部分的ORF1(1173−bp)(Mirandaら、「大腸菌K12のglnALGオペロンの完全ヌクレオチド配列(The complete nucleotide sequence of the glnALG operon of Escherichia coli K12)」、15:2757〜2770, 1987)および短鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼの相同体をコードする完全ORF2(750−bp)(Jornvall, H.ら、Biochemistry 34:6003〜6013, 1995)により先行される。その2つの遺伝子間の領域は、それぞれ、244−bpおよび32−bpである。CPMOをコードする遺伝子を以下では、cpnB(cyclopentanoneおよびBは分解経路の第2段階を意味する、図1参照)と呼ぶ。図5において、CPMOをコードする遺伝子は、ヌクレオチド1822位で始まり、かつ停止コドンを含まない3471位で終わる。したがって、cpnAの境界は3507〜4256である。cpnBに先行する部分的読み取り枠は1〜1174である。
【0027】
図1はグリフィン, M.(Griffin, M.)ら(Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972)から改作されている。命名された遺伝子は:シクロペンタノールデヒドロゲナーゼをコードするcpnA;シクロペンタノン1,2−モノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードするcpnBである。5−バレロラクトン(5−valerolactone)の別名は5−ペンタノリド(5−pentanolide)である。続いて起こる反応段階は、5−ヒドロキシ吉草酸、5−オキソ吉草酸、グルタレート(glutarate)および最終的にアセチルCoAの形成である。
【0028】
CPMO酵素のアミノ酸配列は550残基からなる(図3)。この配列は、アシネトバクター種NCIMB9871株の543残基CHMOに36.5%の同一性および追加の13.6%のアミノ酸類似性を示す。同程度に関連するタンパク質(549のアミノ酸;37.3%の同一性および12.4%の類似性)は、ロドコッカス・ロドクロウスの推定上のステロイドモノオキシゲナーゼ(STMO)(Morii, S.ら、ゲンバンクアクセッション番号AB010439, 1988)である。後者の酵素は、プロゲステロンの酸化を行って酢酸テストステロンを生成する。これらの3つの配列のCLUSTALアラインメントは24.6%の位置的同一性を示した(図3)。
【0029】
図3において、星印は一致するアミノ酸を示し、点は類似したアミノ酸を示し、およびダッシュはアラインメントを最大限にするために導入された空所を示す。エドマン分解により確認されたアミノ末端ペプチド配列は下線が引かれている。エッピンク(Eppink)ら(Eppinkら、Prot. Sci. 6:2454〜2458, 1997)により記載されているコンセンサスFADフィンガープリント配列の位置は、示されているとおりである。第2のFADフィンガープリントとしてフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼに見出される保存GDモチーフもまた示されている。chhhssDGxcSxhRの配列を有するフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのDGモチーフは見られない。小文字は特定の残基の型を同定している:h、疎水性残基、s、小型の残基、c、荷電残基、およびx、任意の残基。DGダブレットはCPMOおよびSTMOの配列において存在することを留意しておきたい。
【0030】
CPMOおよび関連タンパク質に存在する注目すべき配列モチーフは、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したFAD−結合フィンガープリント(GXGXXG)である(Eppinkら、Prot. Sci. 6:2454〜2458, 1997)。フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼ(例えば、フェノールヒドロキシラーゼ、その構造が今では知られている;Enroth, C.ら、Structure 6:605〜617, 1998)は、電子供与体としてNAD(P)Hを用いて基質への酸素分子の1つの原子の挿入を触媒するモノオキシゲナーゼである。これらのタンパク質は、FAD結合についての2つのフィンガープリントモチーフ(フィンガープリント1:GXGXXG;フィンガープリント2:Gly−Asp[GD]モチーフ)の間において、FAD結合およびNAD(P)H結合の両方についての保存された「Asp−Gly(DG)」モチーフを有する。CPMO、STMOおよびCHMOにおける配列モチーフは、反復GXGXXGモチーフ(CPMOの番号付けにおいてアミノ酸24〜33および193〜202)を有することにより、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのそれらとは異なる。CPMOおよび関連タンパク質における第2のFADフィンガープリントがFADおよびNADPH結合という二重の役割を果たしている可能性については、このファミリーのタンパク質の代表的メンバーの構造決定を待つばかりである。2つのクラスのタンパク質に見られるモチーフにおいて、触媒作用における異なる機構が反映されていると仮定することは妥当である。
【0031】
大腸菌におけるcpnB遺伝子の発現
以下の配列の2つのプライマーはcpnB遺伝子を増幅するために合成され、その結果として生じた1.7kbのDNA断片はpSD80プラスミドにクローニングされてpCMP201を生じた。プラスミドpSD80は、マルチクローニングサイト(MCS)の上流にtacプロモーター、MCSの下流にuncターミネーター配列、およびプラスミド上の他の場所にlacIqを含む商業的に入手可能なpKK223−3ベクター(ファルマシア(Pharmacia))系の第三世代である(Smith, S. P.ら、Biochemistry 35:8805−8814, 1996)。プライマーは:
であり、pSD80ベクターの適合性のある部位(SmaIおよびPstI)でのクローニングを容易にするため、それぞれ、組込みのStuIおよびPstI制限部位(下線が引かれている)をもつ。ベント(Vent)DNAポリメラーゼ(ニューイングランドバイオラブズ(New England BioLabs)、ベヴァリー、MA)が使用され、増幅条件は、94℃で1分間、50℃で1分間、および72℃で1分間の30サイクルであった。増幅されたDNA断片はアガロースゲルから精製され、StuIおよびPstIで消化された。その結果として生じた組換えプラスミドの1つをpCMP201と名付けた。DNAの配列決定により、PCR増幅の間にcpnB遺伝子において突然変異は導入されなかったことが確証された。
【0032】
図4は、0.1 mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導される大腸菌JM109(pCMP201)細胞から調製される粗タンパク質抽出物のクーマシーブルー染色SDS−ポリアクリルアミドゲルにおける60kDaのタンパク質の生成を示す。細胞は、0.4〜0.5の吸光度(A600 nm)で誘導され、誘導時間は4時間までであった。観察される分子量は、62kDaのCPMOの予測されるサイズと一致していた。IPTGの非存在下において、このタンパク質のバンドは生成されなかった。また、CPMO酵素活性は、IPTGの存在下において増殖されたそれらの細胞においてのみ観察された。CPMO活性は、1 μモルのシクロペンタノン、0.2 μモルのNADPH、および大腸菌JM109(pCMP201)から調製される粗酵素抽出物を含む50 mMのリン酸緩衝液(pH 7.8)において、340 nmでの吸光度の減少を測定することにより、25℃でアッセイした。これらの細胞は、100 μg/mlのアンピシリンを含む100 mlのLB培地において、25℃で培養された。IPTG−誘導化細胞は、遠心分離により収集され、50 mMのリン酸緩衝液(pH 7.2)で洗浄され、同じ緩衝液の1/20の容量に再懸濁され、そしてブラウン−ソニファイヤー(Braun−Sonifier)(商標)250装置で4回の20秒バーストにより超音波処理された。18,000×gおよび4℃での30分間の遠心分離後、上清は酵素活性の測定のために使用された。活性の1ユニット(U)は、1分間において1 μモルの基質を変換するために要求される酵素量として定義される。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)法(Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72:248〜254, 1976)により測定された。結果として、CPMO酵素の比活性は0.28 U/mgであることが見出された。天然のシュードモナスにおけるCPMOの比活性は0.11 U/mgであると報告されていた(Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972)。
【0033】
図4において、レーン1にはIPTG−誘導化大腸菌の抽出物を載せ、レーン2にはIPTGの非存在下での大腸菌の抽出物を載せた。Mはキロダルトンで示される分子量マーカーを意味する。矢印は所望の60kDaタンパク質の生成を指す。
【0034】
cpnB遺伝子の不活性化
シュードモナス種HI−201株は、可動化可能なpKOK6.1ベクター由来のlacZ−Kmrカセットを用いたcpnB遺伝子の染色体性不活性化により構築された(Kokotek, W.ら、Gene 84:467〜471, 1989)。pKOK6.1において、lacZ遺伝子はプロモーターがなく、Kmrに加えてアンピシリン耐性(Apr)である。lacZ−KmrカセットはPstI−断片として切除され、そしてpCMP200においてcpnB遺伝子間のNsiI部位へ挿入されて、pCMP202を生じた。このプラスミドの9872細胞へのエレクトロポレーションはジーンパルサー(Gene Pulser)(商標)(バイオラッド(BioRads))において行われ、エレクトロポレーションのパラメーターは2.5 kV、25 uFおよび200オームであった。細胞を最初に1 mM HEPES緩衝液で洗浄し、10%グリセロールを含む1 mM HEPESに再懸濁した。KmrコロニーはKm(250 μg/ml)を含むLBプレート上で選択された。二重交差変異体について選択するため、Ap(300 μg/ml)を含むLBプレート上での2番目のスクリーニングが行われた。cpnBの不活性化(図2)はPCR法により確認された。その結果生じた変異体HI−201は、唯一の炭素およびエネルギー源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンで増殖することができないことが見出された。この結果より、cpnBはシクロペンタノールの分解について不可欠であることが示され、かつ9872株においてcpnB遺伝子のたった1つのコピーのみがあることが明らかになった。
【0035】
フラビンタンパク質として予想されたとおり、CPMOのアミノ酸配列は、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したFADフィンガープリントのモチーフを含む。
【0036】
ヌクレオチド配列アクセッション番号
4,281−bpのSphI断片のDNA配列は、DDBJへ提出され、アクセッション番号AB022102を与えられた。このデータの公開は本発明者らの許可を待つばかりである。
【0037】
本発明はその特定の態様に関して記載されているが、さらなる改変が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内での公知または通例の実施の範囲内になる、ならびに上に示されている本質的な特徴に当てはめられ、および添付された特許請求の範囲の中でありうるような本開示からの離脱を含む、本発明のいずれの変形、使用または適応も包含するものであることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】シュードモナス種NCIMB 9872によるシクロペンタノールの分解の最初の2段階を示す。
【図2】シクロペンタノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子(cpnB)および付加的読み取り枠を含むSphI断片におけるコマモナス種NCIMB 9872の遺伝子の構成を示す。
【図3】コマモナス種NCIMB 9872のCPMOのアミノ酸配列の、アシネトバクター種NCIMB 9871由来のCHMOおよびロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のステロイドモノオキシゲナーゼ(STMO)のそれとのアラインメントを示す。
【図4】大腸菌(pCMP201)からの粗抽出物のSDS−PAGEを示す。
【図5】cpnBと名付けられたCPMOをコードする遺伝子を示す。
技術分野
本発明は、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分、ならびにその単離DNAを含む発現ベクターおよび形質転換細胞に関連する。
【0002】
発明の背景
コマモナス(Comamonas)(以前はシュードモナス(Pseudomonas))種NCIMB 9872は、バイヤー−ビリガー(Baeyer−Villiger)モノオキシゲナーゼを産生することを特徴としてきた数少ない微生物の1つであった(BVMO; Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972; Griffin, M.ら、Eur. J. Biochem. 63:199〜209, 1976; および最近の概説として、Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。BVMOは、過酸−触媒されるケトンのエステルまたはラクトンへの酸化である典型的バイヤー−ビリガー有機化学反応を模倣するフラビンタンパク質である。高い収量および光学純度におけるラクトンの生産についての酵素代替物の使用は、化学的方法を生物学的代替法に置き換えるという方向への研究開発の最近の流れにおいて、魅力的な特徴である(Stinson, S. C., Chem. Eng. News, 83〜104, 1998)。現在まで、最高の特徴をもつBVMO酵素は、アシネトバクター種(Acinetobacter sp.)NCIMB 9871により産生されるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ(CHMO)である(Stewart, J. D., Curr. Org. Chem. 2:195〜216, 1998; Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。これはまた、遺伝子がクローニングされかつ配列決定された唯一のBVMOである(Chenら、J. Bacteriol. 170:781〜789, 1988)。最近、この価値ある資源は、様々な不斉バイヤー−ビリガー酸化をもたらすための細胞全体的アプローチにおける「デザイナー酵母(designer yeast)」を設計するために用いられた(Stewart, J. D.ら、J. Am. Chem. Soc. 120:3541〜3548, 1998)。
【0003】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいCPMOが提供されることは、大いに望ましいと思われる。
【0004】
発明の概要
本発明の一つの目的は、唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において細胞を増殖させるために、増大した酵素活性を有する新しいCPMOを提供することである。
【0005】
本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分が提供され、その単離されたDNAは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号:8において表されるDNAの相補体に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする。
【0006】
また、本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードし、かつ以下を含む、単離されたDNAが提供される:
(1)配列番号:8の核酸配列;
(2)遺伝暗号の縮退の範囲における該核酸配列に対応する配列;または
(3)ストリンジェントな条件下で(1)または(2)由来の配列にハイブリダイズし、かつなおシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする配列。
【0007】
さらに本発明に従って、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA、またはその酵素的に活性な部分が提供され、該単離されたDNAは配列番号:8を有する。
【0008】
本発明は、さらにまた、配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA発現ベクター、または部分が該CPMOをコードする、発現可能な形でのその部分を提供する。
【0009】
本発明に従って、上記のような単離されたDNAを含む組換えベクターもまた提供され、単離されたDNAはシクロペンタノンモノオキシゲナーゼをコードする。
【0010】
本発明の好ましい態様において、単離されたDNAは、配列番号:8の核酸配列または、遺伝暗号の縮重による、その機能的等価物である核酸配列を有する。
【0011】
または本発明に従って、上記の組換えDNAの1つまたは複数のコピーを含む組換えベクターが提供される。
【0012】
組換えベクターは原核生物のベクターであってもよい。組換えベクターはまた、プラスミドであってもよい。
【0013】
それゆえ、本発明に従って、上記のようなDNAを含む、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスDNAベクターもまた提供される。
【0014】
本発明はまた、上記の組換えベクターを含む宿主細胞も提供する。
【0015】
従って、配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする異種DNA発現構築物、または部分が該CPMOをコードする、発現可能な形でのその部分で形質転換された細胞もまた提供される。
【0016】
細胞は原核生物の細胞であってもよく、またはそれは大腸菌であってもよい。
【0017】
さらに本発明に従って、以下を有する精製されたシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)もまた提供される:
a)配列番号:5に示されるアミノ酸配列;
b)配列番号:8に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列;または
c)ストリンジェントな条件下で上記の段階b)の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であり、段階c)においてコードされる該アミノ酸配列はa)におけるアミノ酸配列と同じ活性を有する。
【0018】
本発明はまた、天然のシュードモナス由来のものより優れた、およびより好ましくは、2倍優れた酵素活性を有する組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)も提供する。
【0019】
組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)は、コマモナス種NCIMB 9872から調製されてもよい。組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)は、好ましくは、配列番号:5に示される配列を有する。
【0020】
唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンの存在下においてインビトロで細胞を増殖させるための方法であるが、該方法は以下の段階含む:
a)上記の発現構築物で細胞を形質転換する段階;および
b)唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において適する条件下で段階a)の細胞を増殖させる段階。
【0021】
この遺伝子の可能性を高めるため、コマモナス(シュードモナス)種NCIMB 9872由来のシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする遺伝子(cpnB)のクローニング、そのDNAおよび周囲の配列の決定ならびに大腸菌におけるCPMO活性およびタンパク質の発現を本発明に従い、本明細書に報告する。
【0022】
好ましい態様の詳細な説明
コマモナス種NCIMB 9872 CPMOをコードする遺伝子のクローニング
本研究において16S rDNAの配列決定によりコマモナスとして同定されるシュードモナス種NCIMB 9872(以下9872株)は、ナショナルコレクションズオブインダストリアルアンドマリンバクテリア社(National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd)(NCIMB、アバディーン、スコットランド)から購入され、2 mlのシクロペンタノンを含む、ルリア−ベルターニ(Luria−Bertani)(LB)培地(Sambrook, J.ら、「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular cloning: a laboratory manual)」、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールドスプリングハーバー、N. Y.、1989)、または無機塩培地(MSM)、pH 7.0において30℃で増殖された。MSMの配合はリットルあたり:1.0 gのNH4NO3、1.5 gのKH2PO4、1.5 gのNa2HPO4、0.2 gの MgSO4・7H2O、0.01 gのCaCl2・2H2O、0.005のFeSO・7H2O、0.002 gのMnSO4・4H2Oおよび0.1 gの酵母エキスを含む。寒天はプレートに対して1.5%まで加えられた。9872株のゲノムDNAはマルマー(Marmur)法(Marmur, J., J. Mol. Biol. 3:208〜218, 1961)により調製された。最初に、BamHIで消化されたDNAのサザンハイブリダイゼーションを、アシネトバクターNCIMB 9871 CHMO−含有遺伝子をプローブとして用いて行った。陽性の結果が得られなかった(ハイブリダイゼーション条件は65℃で行なった)ので、CPMOタンパク質をN末端アミノ酸配列を得るために精製した。シクロペンタノン−増殖細胞からのCPMOタンパク質の精製は、グリフィン(Griffin)およびツルギル(Turgill)に従った(Griffin, M.ら、Eur. J. Biochem. 63:199〜209, 1976)。自動化タンパク質シーケンサー(パーキン−エルマー(Perkin−Elmer)モデル477)を使用して、精製されたCPMOの40残基のアミノ末端配列が得られた(図2)。この配列は、11個のアミノ酸だけ長いが、同じ生物体由来の以前に報告されたものと完全に一致している(Willetts, A., Trends in Biotech. 15:55〜62, 1997)。2つの変性したオリゴデオキシヌクレオチドプライマー(5’−ACIACIATGA CIACNATGAC−3’(配列番号:1)および5’−ARRTGRTAIARYTGRTA−3’(配列番号:2)、それぞれアミノ酸2〜8および35〜40に対応している)は、9872株から調製された全DNAからの116−bp生成物を増幅するために、合成された。PCR増幅は、パーキンエルマー−モデル2400サーマルサイクラー(Perkin Elmer−Model 2400 Thermal Cycler)(商標)において行われ、増幅条件は、94℃で1分間、50℃で1分間および72℃で1分間の30サイクルであった。増幅産物はpXcmkn12ベクター(Cha, J.ら、Gene 136:369〜370, 1993)に直接的にクローニングされ、大腸菌JM109に形質転換され、そしてその結果生じたプラスミドはpCMP10と名付けられた。増幅産物を遺伝子プローブとして使用する前に、そのヌクレオチド配列を確認した。ヌクレオチドの配列決定は、タックダイデオキシ(Taq DyeDeoxy)ターミネーターサイクル配列決定キットおよびABI プリズム310ジェネティックアナライザー(ABI Prism 310 Genetic Analyzer)(パーキンエルマー(Perkin Elmer))により決定された。プラスミド単離は、バーンボイム(Birnboim)およびドリー(Doly)の方法により行われた(Birnboim, H. C.およびJ. Doly, DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513〜1523, 1979)。
【0023】
図2において、Orf1は、NtrC−型の転写アクチベーターである可能性が最も高い(Morett, E., L. Segovia, J. Bacteriol. 175:6067〜6074, 1993)。ORF1のアミノ酸配列(C末端の391個のアミノ酸)は、NTRC_ECOLI(大腸菌由来の窒素調節タンパク質NR(I);Mirandaら、「大腸菌K12のglnALGオペロンの完全ヌクレオチド配列(The complete nucleotide sequence of the glnALG operon of Escherichia coli K12)」、15:2757〜2770, 1987)、ACOR_ALCEU(ラルストニア・ユトロファ(Ralstonia eutropha)由来のアセトイン異化反応調節タンパク質;Kruger, N.ら、J. Bacteriol. 179:4391〜4400, 1992)のようなタンパク質の対応する領域に38%〜40%の同一性を示した。ORF2のアミノ酸配列は、短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーの酵素に類似性を示しているが(Jornvall, H.ら、Biochemistry 34:6003〜6013, 1995)、推定上のマイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)のオキシドレダクターゼCY39.16C(スイスプロット(Swiss Prot)sp:Q10855)およびM. ツベルキュロシスのfadG3(ゲンバンクアクセッション番号Z74025)に最も相同性がある(45%〜46%の同一性)。シュードモナス種HI−201株についてpKOK6.1由来のlacZ−Kmrカセット(Kokotek, W.ら、Gene 84:467〜471, 1989)は、NsiI部位でcpnBへ挿入された。
【0024】
図2において、次の用語は以下のように定義される:tfd、ファージfdの転写終結配列;Kmr、カナマイシン耐性遺伝子;lacZ、b−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子。遺伝子およびマーカーは矢印で示されている。
【0025】
CPMO−含有遺伝子をクローニングするために、pCMP10由来のDNA挿入断片を増幅し、メーカーの説明書(ベーリンガーマンハイムGmbH(Boehringer Mannheim GmbH))に従い、ジゴキシゲニン−11−UTPシステムにより標識し、そして様々な制限酵素(BamHI、EcoRI、HindIII、KpnI、NheI、PstI、SalI、SphIおよびXbaI)で消化された9872株ゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションを探索するために使用した。結果として、ハイブリダイズしている1つの約4.3kbのSphI断片のバンドが得られた。ハイブリダイゼーションの条件は前記と同様にした。続いて、0.8%アガロースゲル上で分離されたSphI−切断された全DNAの精製された4.0kb〜4.5kbのサイズの断片を、線状化および脱リン酸されている大腸菌プラスミドpUC18へライゲーションした。4.3kb挿入断片を含むクローンは、プローブとしてPCR産物を使用するコロニーハイブリダイゼーションにより、スクリーニングされた;この組換えプラスミドはpCMP200と名付けられた。
【0026】
CPMOをコードする遺伝子(cpnB)および隣接領域のDNA配列
CPMOをコードする遺伝子のヌクレオチドの配列決定は、pCMP10においてクローニングされたPCR産物の配列から設計されたプライマーを使用することにより開始され、そして、その新しい配列から引き出されるオリゴヌクレオチドを使用してさらに拡張された。SphI断片の両方のDNA鎖は配列決定されて、4281塩基対(bp)からなることが見出された。配列は、GENETYX−Mac(ソフトウェアデベロップメント社(Software Development Co., Ltd.)、千葉、日本)およびBLASTプログラム(Altschul, S. F.ら、Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402, 1997)により分析された。結果として、同じ方向に配置された3つの読み取り枠(OPF)が予測された(図2)。CPMOをコードする1650−bp ORFのヌクレオチド配列はNtrC−型転写アクチベーターのC末端をコードする部分的ORF1(1173−bp)(Mirandaら、「大腸菌K12のglnALGオペロンの完全ヌクレオチド配列(The complete nucleotide sequence of the glnALG operon of Escherichia coli K12)」、15:2757〜2770, 1987)および短鎖デヒドロゲナーゼ/レダクターゼの相同体をコードする完全ORF2(750−bp)(Jornvall, H.ら、Biochemistry 34:6003〜6013, 1995)により先行される。その2つの遺伝子間の領域は、それぞれ、244−bpおよび32−bpである。CPMOをコードする遺伝子を以下では、cpnB(cyclopentanoneおよびBは分解経路の第2段階を意味する、図1参照)と呼ぶ。図5において、CPMOをコードする遺伝子は、ヌクレオチド1822位で始まり、かつ停止コドンを含まない3471位で終わる。したがって、cpnAの境界は3507〜4256である。cpnBに先行する部分的読み取り枠は1〜1174である。
【0027】
図1はグリフィン, M.(Griffin, M.)ら(Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972)から改作されている。命名された遺伝子は:シクロペンタノールデヒドロゲナーゼをコードするcpnA;シクロペンタノン1,2−モノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードするcpnBである。5−バレロラクトン(5−valerolactone)の別名は5−ペンタノリド(5−pentanolide)である。続いて起こる反応段階は、5−ヒドロキシ吉草酸、5−オキソ吉草酸、グルタレート(glutarate)および最終的にアセチルCoAの形成である。
【0028】
CPMO酵素のアミノ酸配列は550残基からなる(図3)。この配列は、アシネトバクター種NCIMB9871株の543残基CHMOに36.5%の同一性および追加の13.6%のアミノ酸類似性を示す。同程度に関連するタンパク質(549のアミノ酸;37.3%の同一性および12.4%の類似性)は、ロドコッカス・ロドクロウスの推定上のステロイドモノオキシゲナーゼ(STMO)(Morii, S.ら、ゲンバンクアクセッション番号AB010439, 1988)である。後者の酵素は、プロゲステロンの酸化を行って酢酸テストステロンを生成する。これらの3つの配列のCLUSTALアラインメントは24.6%の位置的同一性を示した(図3)。
【0029】
図3において、星印は一致するアミノ酸を示し、点は類似したアミノ酸を示し、およびダッシュはアラインメントを最大限にするために導入された空所を示す。エドマン分解により確認されたアミノ末端ペプチド配列は下線が引かれている。エッピンク(Eppink)ら(Eppinkら、Prot. Sci. 6:2454〜2458, 1997)により記載されているコンセンサスFADフィンガープリント配列の位置は、示されているとおりである。第2のFADフィンガープリントとしてフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼに見出される保存GDモチーフもまた示されている。chhhssDGxcSxhRの配列を有するフラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのDGモチーフは見られない。小文字は特定の残基の型を同定している:h、疎水性残基、s、小型の残基、c、荷電残基、およびx、任意の残基。DGダブレットはCPMOおよびSTMOの配列において存在することを留意しておきたい。
【0030】
CPMOおよび関連タンパク質に存在する注目すべき配列モチーフは、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したFAD−結合フィンガープリント(GXGXXG)である(Eppinkら、Prot. Sci. 6:2454〜2458, 1997)。フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼ(例えば、フェノールヒドロキシラーゼ、その構造が今では知られている;Enroth, C.ら、Structure 6:605〜617, 1998)は、電子供与体としてNAD(P)Hを用いて基質への酸素分子の1つの原子の挿入を触媒するモノオキシゲナーゼである。これらのタンパク質は、FAD結合についての2つのフィンガープリントモチーフ(フィンガープリント1:GXGXXG;フィンガープリント2:Gly−Asp[GD]モチーフ)の間において、FAD結合およびNAD(P)H結合の両方についての保存された「Asp−Gly(DG)」モチーフを有する。CPMO、STMOおよびCHMOにおける配列モチーフは、反復GXGXXGモチーフ(CPMOの番号付けにおいてアミノ酸24〜33および193〜202)を有することにより、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼのそれらとは異なる。CPMOおよび関連タンパク質における第2のFADフィンガープリントがFADおよびNADPH結合という二重の役割を果たしている可能性については、このファミリーのタンパク質の代表的メンバーの構造決定を待つばかりである。2つのクラスのタンパク質に見られるモチーフにおいて、触媒作用における異なる機構が反映されていると仮定することは妥当である。
【0031】
大腸菌におけるcpnB遺伝子の発現
以下の配列の2つのプライマーはcpnB遺伝子を増幅するために合成され、その結果として生じた1.7kbのDNA断片はpSD80プラスミドにクローニングされてpCMP201を生じた。プラスミドpSD80は、マルチクローニングサイト(MCS)の上流にtacプロモーター、MCSの下流にuncターミネーター配列、およびプラスミド上の他の場所にlacIqを含む商業的に入手可能なpKK223−3ベクター(ファルマシア(Pharmacia))系の第三世代である(Smith, S. P.ら、Biochemistry 35:8805−8814, 1996)。プライマーは:
であり、pSD80ベクターの適合性のある部位(SmaIおよびPstI)でのクローニングを容易にするため、それぞれ、組込みのStuIおよびPstI制限部位(下線が引かれている)をもつ。ベント(Vent)DNAポリメラーゼ(ニューイングランドバイオラブズ(New England BioLabs)、ベヴァリー、MA)が使用され、増幅条件は、94℃で1分間、50℃で1分間、および72℃で1分間の30サイクルであった。増幅されたDNA断片はアガロースゲルから精製され、StuIおよびPstIで消化された。その結果として生じた組換えプラスミドの1つをpCMP201と名付けた。DNAの配列決定により、PCR増幅の間にcpnB遺伝子において突然変異は導入されなかったことが確証された。
【0032】
図4は、0.1 mMのイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)により誘導される大腸菌JM109(pCMP201)細胞から調製される粗タンパク質抽出物のクーマシーブルー染色SDS−ポリアクリルアミドゲルにおける60kDaのタンパク質の生成を示す。細胞は、0.4〜0.5の吸光度(A600 nm)で誘導され、誘導時間は4時間までであった。観察される分子量は、62kDaのCPMOの予測されるサイズと一致していた。IPTGの非存在下において、このタンパク質のバンドは生成されなかった。また、CPMO酵素活性は、IPTGの存在下において増殖されたそれらの細胞においてのみ観察された。CPMO活性は、1 μモルのシクロペンタノン、0.2 μモルのNADPH、および大腸菌JM109(pCMP201)から調製される粗酵素抽出物を含む50 mMのリン酸緩衝液(pH 7.8)において、340 nmでの吸光度の減少を測定することにより、25℃でアッセイした。これらの細胞は、100 μg/mlのアンピシリンを含む100 mlのLB培地において、25℃で培養された。IPTG−誘導化細胞は、遠心分離により収集され、50 mMのリン酸緩衝液(pH 7.2)で洗浄され、同じ緩衝液の1/20の容量に再懸濁され、そしてブラウン−ソニファイヤー(Braun−Sonifier)(商標)250装置で4回の20秒バーストにより超音波処理された。18,000×gおよび4℃での30分間の遠心分離後、上清は酵素活性の測定のために使用された。活性の1ユニット(U)は、1分間において1 μモルの基質を変換するために要求される酵素量として定義される。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)法(Bradford, M. M., Anal. Biochem. 72:248〜254, 1976)により測定された。結果として、CPMO酵素の比活性は0.28 U/mgであることが見出された。天然のシュードモナスにおけるCPMOの比活性は0.11 U/mgであると報告されていた(Griffin, M.ら、Biochem. J. 129:595〜603, 1972)。
【0033】
図4において、レーン1にはIPTG−誘導化大腸菌の抽出物を載せ、レーン2にはIPTGの非存在下での大腸菌の抽出物を載せた。Mはキロダルトンで示される分子量マーカーを意味する。矢印は所望の60kDaタンパク質の生成を指す。
【0034】
cpnB遺伝子の不活性化
シュードモナス種HI−201株は、可動化可能なpKOK6.1ベクター由来のlacZ−Kmrカセットを用いたcpnB遺伝子の染色体性不活性化により構築された(Kokotek, W.ら、Gene 84:467〜471, 1989)。pKOK6.1において、lacZ遺伝子はプロモーターがなく、Kmrに加えてアンピシリン耐性(Apr)である。lacZ−KmrカセットはPstI−断片として切除され、そしてpCMP200においてcpnB遺伝子間のNsiI部位へ挿入されて、pCMP202を生じた。このプラスミドの9872細胞へのエレクトロポレーションはジーンパルサー(Gene Pulser)(商標)(バイオラッド(BioRads))において行われ、エレクトロポレーションのパラメーターは2.5 kV、25 uFおよび200オームであった。細胞を最初に1 mM HEPES緩衝液で洗浄し、10%グリセロールを含む1 mM HEPESに再懸濁した。KmrコロニーはKm(250 μg/ml)を含むLBプレート上で選択された。二重交差変異体について選択するため、Ap(300 μg/ml)を含むLBプレート上での2番目のスクリーニングが行われた。cpnBの不活性化(図2)はPCR法により確認された。その結果生じた変異体HI−201は、唯一の炭素およびエネルギー源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンで増殖することができないことが見出された。この結果より、cpnBはシクロペンタノールの分解について不可欠であることが示され、かつ9872株においてcpnB遺伝子のたった1つのコピーのみがあることが明らかになった。
【0035】
フラビンタンパク質として予想されたとおり、CPMOのアミノ酸配列は、フラビンタンパク質ヒドロキシラーゼにおいて見出されるものと類似したFADフィンガープリントのモチーフを含む。
【0036】
ヌクレオチド配列アクセッション番号
4,281−bpのSphI断片のDNA配列は、DDBJへ提出され、アクセッション番号AB022102を与えられた。このデータの公開は本発明者らの許可を待つばかりである。
【0037】
本発明はその特定の態様に関して記載されているが、さらなる改変が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従い、かつ本発明が属する技術分野内での公知または通例の実施の範囲内になる、ならびに上に示されている本質的な特徴に当てはめられ、および添付された特許請求の範囲の中でありうるような本開示からの離脱を含む、本発明のいずれの変形、使用または適応も包含するものであることは、理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】シュードモナス種NCIMB 9872によるシクロペンタノールの分解の最初の2段階を示す。
【図2】シクロペンタノンモノオキシゲナーゼコード遺伝子(cpnB)および付加的読み取り枠を含むSphI断片におけるコマモナス種NCIMB 9872の遺伝子の構成を示す。
【図3】コマモナス種NCIMB 9872のCPMOのアミノ酸配列の、アシネトバクター種NCIMB 9871由来のCHMOおよびロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)由来のステロイドモノオキシゲナーゼ(STMO)のそれとのアラインメントを示す。
【図4】大腸菌(pCMP201)からの粗抽出物のSDS−PAGEを示す。
【図5】cpnBと名付けられたCPMOをコードする遺伝子を示す。
Claims (20)
- 単離されたDNAが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号:8に表されるDNAの相補体に特異的にハイブリダイズする能力を特徴とする、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする、単離されたDNAまたはその酵素的に活性な部分。
- シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードし、かつ以下を含む、単離されたDNA:
(a)配列番号:8の核酸配列;
(b)遺伝暗号の縮退(degeneration)の範囲で該核酸配列に対応する配列;または
(c)ストリンジェントな条件下で、(a)または(b)由来の配列にハイブリダイズし、かつさらにシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする配列。 - 単離されたDNAが配列番号:8を有する、シクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする、単離されたDNAまたはその酵素的に活性な部分。
- 配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む、酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする単離されたDNA発現ベクター、または該CPMOをコードする、発現可能な形のその部分。
- 単離されたDNAがシクロペンタノンモノオキシゲナーゼをコードする、請求項1から3のいずれか一項記載の単離されたDNAを含む、組換えベクター。
- 単離されたDNAが配列番号:8の核酸配列、または遺伝暗号の縮重(degeneracy)による、その機能的な等価物である核酸配列を有する、請求項5の組換えベクター。
- 請求項1、2または3記載の組換えDNAの、1つまたは複数のコピーを含む、組換えベクター。
- 原核生物のベクターである、請求項4、5、6または7記載の組換えベクター。
- プラスミドである、請求項4、5、6または7記載の組換えベクター。
- 請求項1、2または3において定義されるDNAを含む、生物学的に機能的なプラスミドまたはウイルスDNAベクター。
- 請求項4から9のいずれか一項記載の組換えベクターを含む、宿主細胞。
- 配列番号:8に示される配列を特徴とするDNAを含む、酵素的に活性なシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)をコードする異種DNA発現構築物、または該CPMOをコードする、発現可能な形のその部分で形質転換された細胞。
- 原核細胞である、請求項12において定義される細胞。
- 大腸菌(E.coli)である、請求項12において定義される細胞。
- 以下を含む、精製されたシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO):
(a)配列番号:5に示されるアミノ酸配列;
(b)配列番号:8に示される核酸配列によりコードされる、アミノ酸配列;または
(c)ストリンジェントな条件下で、上記の段階b)の核酸配列に相補的な核酸配列にハイブリダイズする核酸配列によりコードされるアミノ酸配列であり、段階c)においてコードされる該アミノ酸配列が、a)におけるアミノ酸配列と同じ活性を有する、アミノ酸配列。 - 天然に存在するものより優れた酵素活性を有する、組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)。
- CPMOがコマモナス種(Comamonas sp.)NCIMB 9872から調製される、請求項16記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)。
- 配列番号:5に示される配列を有する、請求項16記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)。
- 天然のシュードモナス(Pseudomans)由来のCPMOのものより2倍優れた酵素活性を有する、請求項16記載の組換えシクロペンタノンモノオキシゲナーゼ(CPMO)。
- 以下の段階を含む、唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンが存在する際に、インビトロで細胞を増殖させるための方法:
(a)請求項4、5、6、7、8または9に記載の発現構築物で、細胞を形質転換する段階;および
(b)唯一の炭素源としてシクロペンタノールまたはシクロペンタノンを含む培地において、適する条件下で段階a)の細胞を増殖させる段階。
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