JPH09121864A - ６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲ
ナーゼをコードするＤＮＡ断片、当該ＤＮＡ断片を含有
する組換え体ＤＮＡ、当該組換え体ＤＮＡを保有する形
質転換体細胞、および当該形質転換体細胞の利用。 【効果】 この組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細
胞を用いれば、活性の高い６−ヒドロキシニコチン酸モ
ノオキシゲナーゼを多量に製造することができ、６−ヒ
ドロキシニコチン酸から２，５−ジヒドロキシピリジン
の工業的生産が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は６−ヒドロキシニコ
チン酸から２，５−ジヒドロキシピリジンを生合成する
酵素である６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲナー
ゼ（以下、６−ＨＮＡＭＯと略す）をコードするＤＮＡ
断片、該ＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ、該組換
え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞、該形質転換体細
胞を用いた６−ＨＮＡＭＯの製造法、およびこの製法に
より得られた６−ＨＮＡＭＯを用いた２，５−ジヒドロ
キシピリジンの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】６−ＨＮＡＭＯは、６−ヒドロキシニコ
チン酸から２，５−ジヒドロキシピリジンを生合成する
酵素であり、農薬等の原料として用いられる２，５−ジ
ヒドロキシピリジンの生産に重要な役割を果たしてい
る。この６−ＨＮＡＭＯは、従来シュードモナス属に属
する微生物が産生することは知られているが、その活性
収率は低く、充分満足すべきものではなかった。従っ
て、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を見出し、該遺伝子によって
コードされる６−ＨＮＡＭＯを量産することは２，５−
ジヒドロキシピリジンの生産に極めて重要である。

【０００３】一方、酵素などのタンパク質の量産技術と
して組換えＤＮＡ技術の発展は近年めざましく、数多く
の酵素、生理活性タンパク質等が組換えＤＮＡ技術を利
用した量産化に成功している。しかしながら、６−ＨＮ
ＡＭＯに関しては、そのアミノ酸配列の解析および該酵
素をコードする遺伝子の分離はなされていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えＤＮＡ技術により、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を分離し
て、該遺伝子がコードする６−ＨＮＡＭＯの活性を増強
することにより６−ＨＮＡＭＯ、ひいては２，５−ジヒ
ドロキシピリジンを量産する技術を提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは６−ＨＮＡ
ＭＯおよび２，５−ジヒドロキシピリジンの量産技術に
ついて鋭意研究を行った結果、組換えＤＮＡ技術を利用
して６−ヒドロキシニコチン酸から２，５−ジヒドロキ
シピリジンを生合成する能力を有する微生物より６−Ｈ
ＮＡＭＯ遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、その塩基配
列およびアミノ酸配列を明らかにすることに成功した。
更に該遺伝子の組換え体ＤＮＡおよび該組換え体ＤＮＡ
の形質転換体細胞を作製し、その形質転換体細胞を用い
て６−ＨＮＡＭＯを製造すること、またこの６−ＨＮＡ
ＭＯを用いて２，５−ジヒドロキシピリジンを製造する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明は配列番号１で示される６−
ＨＮＡＭＯのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を提
供するものである。また、本発明はこの６−ＨＮＡＭＯ
遺伝子のＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ、および
該組換え体ＤＮＡを保持する形質転換体細胞を提供する
ものである。更に本発明は該組換え体ＤＮＡを保持する
形質転換体細胞を培養し、該培養物から採取することを
特徴とする６−ＨＮＡＭＯの製造法を提供するものであ
る。更にまた、本発明はこの形質転換細胞の培養により
得られた６−ＨＮＡＭＯを６−ヒドロキシニコチン酸に
作用させることを特徴とする６−ＨＮＡＭＯの製造法を
提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明ＤＮＡ断片の分離には、微
生物の宿主−ベクター系を用いることができる。該ＤＮ
Ａ断片は、例えば組換えＤＮＡ技術を利用して次の如く
して製造される。

【０００８】即ち、まずＤＮＡ供与体として６−ヒドロ
キシニコチン酸から２，５−ジヒドロキシピリジンを生
合成する能力を有する微生物を用い、該微生物からゲノ
ムＤＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断しＤＮＡ断
片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベクターＤ
ＮＡを制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が挿入可
能な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮＡ断片
と直鎖状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼを用い
て結合させて、組換え体ＤＮＡを得る。該組換え体ＤＮ
Ａを宿主細胞に移入し、目的の組換え体ＤＮＡを保有す
る形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞より目的
の組換え体ＤＮＡを分離することにより製造される。次
いで、目的に応じて該組換え体ＤＮＡより新たなる組換
え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主細胞へ移
入する。該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞を
培養することにより６−ＨＮＡＭＯを生産でき、該酵素
の作用によって６−ヒドロキシニコチン酸から２，５−
ジヒドロキシピリジンを効率よく製造することができ
る。

【０００９】以下、上記各工程を詳細に説明する。本発
明のＤＮＡ供与体としては、６−ヒドロキシニコチン酸
から２，５−ジヒドロキシピリジンを生合成する能力を
有する微生物であれば特に制限されない。例えば、シュ
ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の微生物等が
挙げられるが、特にシュードモナス フルオレッセンス
ＴＮ５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ ＴＮ５、ＦＥＲＭＰ−１５２１５）が好ましい。

【００１０】該微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、該
微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質
処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アル
コールによるゲノムＤＮＡの沈澱、遠心分離などの方法
を適宜組み合わせて行うのが好ましい。

【００１１】分離されたゲノムＤＮＡを断片化するに
は、例えば該ゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行わ
れる。

【００１２】ベクターとしては、宿主微生物内で自立的
に増殖し得るファージ又はプラスミドから組換えＤＮＡ
を目的として構築されたものを用いるのが好ましい。プ
ラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ３
２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ
１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−３等が好ま
しい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてＤ
ＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製し、必要に応
じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。

【００１３】ゲノムＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の
結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ等を用いて行うのが好ましい。

【００１４】得られた組換え体ＤＮＡを移入させる宿主
微生物としては、該組換え体ＤＮＡが安定にかつ自立的
に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発
現するものであれば良いが、例えば大腸菌を用いること
ができる。

【００１５】宿主微生物に組換え体ＤＮＡを移入する方
法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション
法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法等のいずれの方法も用いること
ができる。

【００１６】形質転換体の選択は、用いたベクターの選
択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲
得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質
転換体の中から目的の組換え体ＤＮＡを含有する形質転
換体の選択は、例えば６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分的な
ＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダ
イゼーション法により行うのが好ましい。このプローブ
の標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニ
ン、酵素等のいずれも用いることができる。

【００１７】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換え体ＤＮＡを抽出するには、常法により抽出す
れば良く、例えば大腸菌の溶菌法（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いることができ
る。

【００１８】抽出される組換え体ＤＮＡは、必要に応じ
て再び組換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができ
る。得られる組換え体ＤＮＡから、本発明のＤＮＡ断片
を切り出すには、制限酵素などを用いることができる。

【００１９】かくして得られる本発明のＤＮＡ断片の塩
基配列は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定するこ
とができる。配列番号２に６−ＨＮＡＭＯをコードする
ＤＮＡ断片の塩基配列を、配列番号１に当該ＤＮＡ塩基
配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号３に後記
実施例で分離したＤＮＡ断片の塩基配列及び推定アミノ
酸配列を示す。

【００２０】本発明ＤＮＡ断片を発現させ、６−ＨＮＡ
ＭＯを生産するには、本発明ＤＮＡ断片を有する組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体細胞、例えば上記形質転
換体細胞、本発明のＤＮＡ断片を強力なプロモーターを
有する発現ベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有
する形質転換体細胞、本発明のＤＮＡ断片を細胞内での
コピー数の高いベクターに組み込んだ組換え体ＤＮＡを
保有する形質転換体細胞、または本発明のＤＮＡ断片を
強力なプロモーターを有するコピー数の高い発現ベクタ
ーに組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体細
胞を培養し、その培養物から採取すればよい。この場合
における培養は、用いる形質転換体細胞の性質に応じて
行われる。

【００２１】本発明の形質転換体細胞を用いれば６−Ｈ
ＮＡＭＯを多量に製造することができるので、この６−
ＨＮＡＭＯを６−ヒドロキシニコチン酸に作用させるこ
とにより２，５−ジヒドロキシピリジンを工業的に有利
に製造することができる。なお、２，５−ジヒドロキシ
ピリジンの生産にあたっては、本発明の形質転換細胞を
用いて製造した６−ＨＮＡＭＯを用いてもよいが、本発
明の形質転換細胞を直接６−ヒドロキシニコチン酸に作
用させて６−ＨＮＡＭＯを生産しつつ反応を行ってもよ
い。

【００２２】このときの反応は、６−ＨＮＡＭＯを、pH
６．０〜９．０、好ましくはpH７．０〜８．０の緩衝液
中に懸濁し、これに６−ヒドロキシニコチン酸を１〜３
０mM添加して、温度１０〜５０℃、より好ましくは２０
〜４０℃にて、１０分〜２４時間行う。また、この反応
には、補酵素としてＮＡＤＨ、ＦＡＤ（フラビンアデニ
ンジヌクレオチド）を添加することもできる。

【００２３】反応中、ＨＰＬＣ分析などの常法により原
料である６−ヒドロキシニコチン酸の残量、２，５−ジ
ヒドロキシピリジンの生成量を分析し、反応時間などを
決定することができるが、６−ヒドロキシニコチン酸の
残量が低下した場合、更に６−ヒドロキシニコチン酸を
添加して反応を継続することもできる。

【００２４】反応液からの２，５−ジヒドロキシピリジ
ンの回収は、常法によることができる。例えば、遠心分
離、限外濾過などにより６−ＨＮＡＭＯを除去し、反応
液を濃縮し、再結晶あるいは酢酸エチルなどの有機溶媒
による溶媒抽出の後、蒸発乾固させることにより、２，
５−ジヒドロキシピリジンを得ることができる。

【００２５】また、本発明の６−ＨＮＡＭＯは、６−ヒ
ドロキシニコチン酸の他、相対活性は低いが、２−ヒド
ロキシニコチン酸、オルトヒドロキシ安息香酸、メタヒ
ドロキシ安息香酸、パラヒドロキシ安息香酸、６−ヒド
ロキシ−２−ピラジンカルボン酸などにも作用する。

【００２６】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではな
い。

【００２７】実施例１ （１） ６−ＨＮＡＭＯのアミノ酸配列解析 液体培地（ニコチン酸２ｇ／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、
リン酸２水素カリウム１ｇ／ｌ、リン酸水素２ナトリウ
ム１２水和物１ｇ／ｌ、リン酸２水素ナトリウム２水和
物２ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／ｌ、
ｐＨ７．０）にてシュードモナス フルオレッセンス
ＴＮ５を、３０℃にて２４時間、好気的条件下で培養
し、遠心分離にて集菌した。この集菌した菌株について
１５０Ｗ、１０分間の超音波破砕機による細胞破砕処理
を行った後、１００，０００×ｇにて３０分間の遠心分
離を行った。

【００２８】その上清を硫安分画し、硫安濃度３０〜７
０重量％の分画を回収して、イオンクロマトグラフィー
（ファルマシア社、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃ
Ｌ−６Ｂ）、疎水クロマトグラフィー（ファルマシア
社、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）
および吸着クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａ
ｔｉｔｅ）による酵素精製を行った。６−ＨＮＡＭＯ活
性のある分画を回収した。

【００２９】カラム精製を行った該精製物は、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥの結果、単一バンドであることを確認し、単一
に精製したことを確認した。

【００３０】この単離した６−ＨＮＡＭＯの部分的なア
ミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（アプライドバイ
オシステムズ社）により解析した。この決定した該酵素
の部分的なアミノ酸配列を配列番号４に示す。

【００３１】尚、６−ＨＮＡＭＯ活性は２，５−ジヒド
ロキシピリジンの定量により評価し、次の如くして行っ
た。最終濃度が表１になるように６−ＨＮＡＭＯ活性測
定用の反応液３mlを調製した。その際、酵素精製液を最
後に加えて反応を開始し、２５℃にて６０分間反応し
た。ＨＰＬＣシステム（日本分光社、８８０−ＰＵ）を
用いて、Ｍ＆ＳパックＣ１８カラム（エムエス機器社、
逆相、４．６×１５０mm）と移動相（１０ｍＭリン酸２
水素カリウム−リン酸ｐＨ２．５、２％（ｖ／ｖ）アセ
トニトリル、１．０ml／min）にて前記反応液を送液
し、カラムからの溶出液は２１０ｎｍの波長でモニター
し、該反応液中の６−ヒドロキシニコチン酸及び２，５
−ジヒドロキシピリジンを分析した。

【００３２】

【表１】

【００３３】（２） ６−ＨＮＡＭＯの遺伝子プローブ
の作製 シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５を試験管内
の培地（ポリペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス０．５ｇ／
ｌ、肉エキス５ｇ／ｌ、食塩２ｇ／ｌ、ｐＨ７．０）へ
接種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製した。こ
の前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と同様の
培地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培養液の
遠心により集菌した。

【００３４】該菌体をＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に懸濁した後、最終濃度
０．５％ ＳＤＳおよび最終濃度１００μｇ／mlプロテ
アーゼＫにて３７℃、１時間処理し、１／６容の５Ｍ食
塩を混合した。次いで、１０％ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅ
ｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍ
ｉｄｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６５℃で
１０分間静置した。等量のクロロホルム−イソアミルア
ルコール液にて抽出し、得られた水層を等量のフェノー
ル−クロロホルム液にて抽出を行った。この水層に含ま
れるゲノムＤＮＡをエタノール沈殿にて取得し、減圧乾
燥の後ＴＥを加え溶解した。

【００３５】配列番号４に示す６−ＨＮＡＭＯの部分的
なアミノ酸配列を用いて、このアミノ酸配列をコードす
る６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分的な塩基配列を逆翻訳し
た。これらの知見から、該遺伝子をＰＣＲにより部分的
に増幅することを目的として、配列番号５及び配列番号
６に示す塩基配列を有する合成ヌクレオチドを化学合成
により作製し、１対のＰＣＲプライマーとした。シュー
ドモナス フルオレッセンス ＴＮ５のゲノムＤＮＡを
鋳型ＤＮＡとして、該プライマーにより６−ＨＮＡＭＯ
遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅した。

【００３６】尚、このＰＣＲは次の如くして行った。ま
ず、１０ｍＭトリス塩酸ｐＨ８．３、５０ｍＭ塩化カリ
ウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％（Ｗ
／Ｖ）ゼラチン、２μＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｎｇ／
μｌゲノムＤＮＡ、１μＭＰＣＲプライマー、０．５μ
Ｃｉ／μｌ ［α−³⁵Ｓ］ｄＣＴＰを含む反応液を調製
した。この反応液は９２℃にて５分間熱処理した後、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社、ＴａＫａＲａ Ｔ
ａｑ）を０．０５Ｕ／μｌになるように加え、４０℃に
て６分間放置した。続いて、サイクル反応（熱変性反応
９４℃にて３０秒間、アニーリング反応４０℃にて２分
間、伸長反応７２℃にて３０秒間）を４０回繰り返した
後、７２℃にて５分間反応した。

【００３７】この増幅したＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ
（Ａ）という）を８％変性ウレアゲルにて電気泳動を行
い、オートラジオグラフィーにて放射性同位元素にて標
識したＤＮＡ（Ａ）を検出し、ゲルより抽出した。

【００３８】この増幅したＤＮＡ（Ａ）を鋳型ＤＮＡと
して、上記と同一のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲに
て、再び６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分的なＤＮＡ断片を
増幅した。尚、この２回目のＰＣＲについて、更に詳し
くは次の如くして行った。まず、１０ｍＭトリス塩酸ｐ
Ｈ８．３、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグ
ネシウム、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼラチン、２０μＭ
ｄＮＴＰ混合液、ＤＮＡ（Ａ）、１μＭ ＰＣＲプラ
イマーを含む反応液を調製した。この反応液は９２℃に
て５分間熱処理した後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造社、ＴａＫａＲａ Ｔａｑ）を０．０２５Ｕ／μｌ
になるように加え、４０℃にて６分間放置した。続い
て、サイクル反応（熱変性反応９４℃にて３０秒間、ア
ニーリング反応４０℃にて２分間、伸長反応７２℃にて
３０秒間）を４０回繰り返した後、７２℃にて５分間反
応した。

【００３９】この増幅したＤＮＡ断片を２０％ポリアク
リルアミドゲルにて電気泳動を行い、エチジウムブロマ
イドで染色により検出し、ゲルより抽出した。

【００４０】得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、
その塩基配列及び推測されるアミノ酸配列を配列番号７
に示す。推測されるアミノ酸配列が６−ＨＮＡＭＯのア
ミノ酸配列の一部と一致し、ＰＣＲにて増幅したＤＮＡ
断片が６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の一部であることを確認し
た。

【００４１】該ＤＮＡ断片の塩基配列の解析は、Ｔ７シ
ークエンシングキット（ファルマシアバイオテク社）を
用いたＭ１３ダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．，
ｅｔｃ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．， ７４， ５４６３−５４６７（１９７
７））にてシークエンシング反応を行い、自動レーザー
蛍光シークエンシング装置（ファルマシアバイオテク
社）を用いた。

【００４２】次いで、解明された６−ＨＮＡＭＯ遺伝子
の部分的な塩基配列から配列番号８に示す合成ヌクレオ
チドをデザインし、化学合成により作製した。Ｔ４ ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社）にて該合成ヌクレ
オチドへ〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを結合し、ゲル濾過により
精製を行った（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ（１９８９））。かくして、放射性同位元素 ³²Ｐを標
識した６−ＨＮＡＭＯ遺伝子のプローブを作製した。

【００４３】（３） 遺伝子ライブラリーの調製 実施例１−（２）に記載する方法にてシュードモナス
フルオレッセンス ＴＮ５のゲノムＤＮＡを抽出し、精
製した。

【００４４】該ゲノムＤＮＡを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒
造社）により部分消化し、１％アガロースゲル（和光純
薬工業社、アガロース１６００）にて電気泳動した。緩
衝液としてＴＡＥ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ， Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉ
ｏｎ（１９８９））を用いた。電気泳動後のアガロース
ゲルは１μｇ／mlエチジウムブロマイドに１５分間浸せ
きした後水洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍光を
確認した。サイズマーカーとしてλファージＤＮＡのＥ
ｃｏＴ１４Ｉ消化物（宝酒造社）を同時に電気泳動し、
該ＤＮＡ断片の泳動距離からゲノムＤＮＡ消化物の分子
量を求めた。

【００４５】約０．９ｋｂｐのゲノムＤＮＡのＡｐａＩ
部分消化物を含むアガロースゲルを切り出し、Ｇｅｎｅ
ｃｌｅａｎIIキット（ＢＩＯ １０１社）にてＤＮＡ断
片の精製を行った。

【００４６】プラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔII ＳＫ（＋）を制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社）によ
り完全消化した。同反応液にアルカリホスファターゼ
（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔａｓｅ）（宝酒造社）を添加し、制限酵素にて開
裂したベクターの末端の脱リン酸化を行った。

【００４７】上記反応液に１／１０倍容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムｐＨ５．２と２倍容量のエタノールを添加し−
８０℃にて２時間冷却し、９，０００×ｇにて１０分間
遠心し、ベクターＤＮＡのペレットを得た。７０％エタ
ノールを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、このリ
ンス液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥したベク
ターＤＮＡをＴＥに溶解した。

【００４８】前記のシュードモナス フルオレッセンス
ＴＮ５由来の約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片およびベク
ターＤＮＡを、ライゲーションキット（宝酒造社）を用
いて結合した。

【００４９】ハナハン法（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ．， Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ １６６， ｐ５５７−５８０， １９８３）にて
大腸菌ＤＨ５をコンピテントセルとして調製し、該大腸
菌を宿主として上記反応液を形質転換した。該形質転換
体大腸菌は最終濃度が１００μｇ／mlになるようにアン
ピシリンを添加したＬＢ平板培地（ＬＢに寒天１５ｇ／
ｌを添加して調製する）に塗布し、３７℃にて終夜培養
した。出現したコロニーを、大腸菌ＤＨ５を宿主とした
シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５の遺伝子ラ
イブラリーとした。

【００５０】（４） ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含む形質
転換体細胞の選択 実施例１−（３）にて取得した大腸菌ＤＨ５の形質転換
体細胞から成るコロニーから目的の６−ＨＮＡＭＯ遺伝
子を含む形質転換体細胞の選択には、実施例１−（２）
にて作製した標識した合成ヌクレオチドを６−ＨＮＡＭ
Ｏ遺伝子のプローブとして、コロニーハイブリダイゼー
ションを行った。

【００５１】尚、このコロニーハイブリダイゼーション
は次の如くして行った。実施例１−（３）にて取得した
大腸菌ＤＨ５の形質転換体細胞から成るコロニーを、ナ
イロンメンブレン（アマシャム社）へ転写した。このナ
イロンメンブレンをアルカリ変性液（０．５Ｍ水酸化ナ
トリウム、１．５Ｍ食塩）を浸した３ＭＭ濾紙（ワット
マン）上に７分間、室温にて静置してアルカリ変性処理
した。次いで、該ナイロンメンブレンを中和液（１．５
Ｍ食塩、０．５Ｍトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ
ＥＤＴＡ）を浸した３ＭＭ濾紙（ワットマン）上に３
分間、室温にて静置して中和処理した。再び、新しい中
和液にて中和処理を行った。更に、該ナイロンメンブレ
ンを２×ＳＳＣ（３００ｍＭ食塩、３０ｍＭクエン酸ナ
トリウムｐＨ７．０）を浸した３ＭＭ濾紙（ワットマ
ン）上に５分間、室温にて静置した。該ナイロンメンブ
レンを新しい３ＭＭ濾紙（ワットマン）上に放置して水
分を取り除き、８０℃にて２時間放置した。

【００５２】該ナイロンメンブレンをハイブリダイゼー
ション液（５×ＳＳＰＥ（９００ｍＭ食塩、５０ｍＭリ
ン酸２水素ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．
７）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ（１ｇ／ｌフィコール、１
ｇ／ｌウシ血清アルブミン、１ｇ／ｌポリビニールピロ
リドン）、０．５ｍｇ／ｌ熱変性したサケ精子ＤＮＡ）
に６５℃で３時間浸した。該ナイロンメンブレンを新し
く用意したプレハイブリダイゼーション液へ移し、上記
放射性同位元素で標識した６−ＨＮＡＭＯ遺伝子のプロ
ーブを加えナイロンバッグに密封し、３７℃で１２時間
浸した。

【００５３】次いで、該ナイロンメンブレンは洗浄液１
（０．１％ ＳＤＳ、２×ＳＳＰＥ）にて室温で１０分
間洗浄し、再度洗浄液１にて洗浄操作を同様に繰り返し
た。更に該メンブレンは、洗浄液２（０．１％ ＳＤ
Ｓ、１×ＳＳＰＥ）にて３７℃で１５分間、洗浄液３
（０．１％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＰＥ）にて３７℃で
１５分間、洗浄液３にて４２℃で１５分間洗浄を行っ
た。キムサービスペーパーでナイロンメンブレンの水分
を除き、該ナイロンメンブレン上の放射能をＸ線フィル
ム（富士フィルム社）にて感光し、６−ＨＮＡＭＯ遺伝
子を保有する形質転換体から成るコロニーを選択した。

【００５４】（５） ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡ、ｐＯＸＡの分離 実施例１−（４）記載のコロニーハイブリダイゼーショ
ンにて選択した６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含む形質転換体
を最終濃度が１００μｇ／mlになるようにアンピシリン
を添加したＬＢ液体培地１mlへ接種して３７℃で終夜培
養した。遠心により集菌し、ＴＥ（１０ｍＭトリス塩酸
ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）１００μｌに懸濁し、
室温で５分間放置した。溶液II（１％ ＳＤＳ、０．２
Ｍ水酸化ナトリウム）２００μｌを添加し、氷中にて５
分間冷却した。更に溶液III（５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ
４．８）１５０μｌを添加し、氷中にて５分間冷却し
た。遠心分離にて、上清をデカンテーションにより分離
した。次いで、フェノール−クロロホルム抽出を行い、
２倍容量のエタノールを添加し−８０℃にて２時間冷却
した。１５，０００×ｇにて１０分間遠心し、ＤＮＡの
ペレットを得た。７０％エタノールを適量加え遠心管の
壁面を２回リンスし、エタノールを簡単に除去した後減
圧乾燥し、精製プラスミドｐＯＸＡを得た。

【００５５】（６） ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含む組換
え体ＤＮＡ、ｐＥＶＸの分離 実施例１−（２）に記載する方法にて、シュードモナス
フルオレッセンスＴＮ５のゲノムＤＮＡを抽出し、精
製した。上記ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶおよび
ＸｈｏＩにて完全消化してＤＮＡ断片とした。実施例１
−（３）に記載する方法にて、約２．９ｋｂｐのＤＮＡ
断片を回収し、該ＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
II ＳＫ（＋）へ挿入した。該組換え体ＤＮＡを大腸菌
ＤＨ５へ形質転換し遺伝子ライブラリーとした。

【００５６】実施例１−（５）で取得したｐＯＸＡにつ
いて、挿入されている約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を６
−ＨＮＡＭＯ遺伝子のプローブとして、上記遺伝子ライ
ブラリーから６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含有する形質転換
体から成るコロニーを選択した。

【００５７】尚、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子のプローブの標
識及び目的とする遺伝子を含有する形質転換体細胞の検
出には、非ＲＩ−ＤＮＡ標識・検出キット（ベーリンガ
ー・マンハイム社、ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡキット）を用い
た。実施例１−（５）に記載する方法にて、該形質転換
体細胞からプラスミドを抽出し、ｐＥＶＸを取得した。

【００５８】（７） ｐＯＸＡ及びｐＥＶＸの解析 実施例１−（５）で取得したプラスミドｐＯＸＡ及び実
施例１−（６）で取得したプラスミドｐＥＶＸを適当な
緩衝液中で過剰量の制限酵素（ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＶ、
ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、ＰｓｔＩ）で完全消化した。実施
例１−（３）に記載する電気泳動を行い、制限酵素消化
により生じた各ＤＮＡ断片の分子量を解析し、制限酵素
地図を作成した。その結果、ｐＯＸＡ及びｐＥＶＸは図
１に示される構造を有していた。つまり、プラスミドベ
クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＳＫ（＋）のクローニ
ングサイトに、各々約０．９ｋｂｐ、２．９ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を挿入した構造を有していた。

【００５９】実施例１−（２）に記載する方法にて、ｐ
ＯＸＡに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を決定し
た。次いで、ｐＥＶＸに挿入されているＤＮＡ断片の塩
基配列を部分的に決定した。以上の塩基配列解析結果か
ら、ｐＯＸＡ及びｐＥＶＸは、互いに異なる６−ＨＮＡ
ＭＯ遺伝子の部分的なＤＮＡ断片を含み、互いに重複し
て同一のＤＮＡ領域を含有することを確認した。

【００６０】（８） ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の構築 ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分的なＤＮＡ断片を含むｐＯ
ＸＡ及びｐＥＶＸから、完全長の６−ＨＮＡＭＯ遺伝子
を含むプラスミドｐＥＶＡおよびｐＭＯＮＯを作製した
（図２、図３）。次いで、ｐＭＯＮＯの挿入されている
遺伝子断片が一部欠損したｐＭＯＰＤを作製した（図
４）。

【００６１】ｐＥＶＡの作製は次の如くして行った。ま
ず、ｐＥＶＸに含まれる６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分Ｄ
ＮＡ断片約２．９ｋｂｐをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消
化した後実施例１−（３）に記載する電気泳動を行い、
６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分ＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ
（Ｂ））約２．９ｋｂｐを精製した。一方、プラスミド
ベクターｐＨＳＧ３９６をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消
化し、アルカリホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）にて脱リ
ン酸処理を行った。次いで、実施例１−（３）に記載す
る電気泳動を行い、該ＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ
（Ｃ））を精製した。ＤＮＡ（Ｂ）とＤＮＡ（Ｃ）をラ
イゲーションキット（宝酒造社）にて結合し、実施例１
−（３）に記載する大腸菌形質転換法にて組換え体プラ
スミドを含む形質転換体細胞を作製した。実施例１−
（５）に記載する方法にて形質転換体細胞よりプラスミ
ドを抽出した。該プラスミドの制限酵素消化反応にて目
的の組換え体ＤＮＡであるｐＨＳＧＥＶＸを確認した。
ｐＨＳＧＥＶＸをＥｃｏＲＩとＸｈｏＩにて消化した後
実施例１−（３）に記載する電気泳動を行い、６−ＨＮ
ＡＭＯ遺伝子の部分ＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ（Ｄ））
約２．９ｋｂｐを精製した。一方、ｐＯＸＡをＥｃｏＲ
ＩとＸｈｏＩにて消化し、アルカリホスファターゼ（Ｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａ
ｔａｓｅ）にて脱リン酸処理を行った。次いで、実施例
１−（３）に記載する電気泳動を行い、該ＤＮＡ断片
（以下、ＤＮＡ（Ｅ））約３．５ｋｂｐを精製した。Ｄ
ＮＡ（Ｄ）とＤＮＡ（Ｅ）をライゲーションキット（宝
酒造社）にて結合し、実施例１−（３）に記載する大腸
菌形質転換法にて組換え体プラスミドを含む形質転換体
細胞を作製した。実施例１−（５）に記載する方法にて
形質転換体細胞よりプラスミドを抽出した。該プラスミ
ドの制限酵素消化反応にて目的の組換え体ＤＮＡである
ことを確認し、ｐＥＶＡを作製した。

【００６２】ｐＭＯＮＯの作製は次の如くして行った。
前記ｐＨＳＧＥＶＸをＮｃｏＩにて消化し、Ｔ４ ＤＮ
Ａポリメラーゼ（宝酒造社）にて平滑化した。次いで、
ＸｈｏＩにて消化し、実施例１−（３）に記載する電気
泳動を行い、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の部分ＤＮＡ断片
（以下、ＤＮＡ（Ｆ））約１．２ｋｂｐを精製した。一
方、ｐＯＸＡをＥｃｏＲＶとＸｈｏＩにて消化し、アル
カリホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌ
ｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）にて脱リン酸処理を
行った。次いで、実施例１−（３）に記載する電気泳動
を行い、該ＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ（Ｇ））約３．５
ｋｂｐを精製した。ＤＮＡ（Ｆ）とＤＮＡ（Ｇ）をライ
ゲーションキット（宝酒造社）にて結合し、実施例１−
（３）に記載する大腸菌形質転換法にて組換え体プラス
ミドを含む形質転換体細胞を作製した。実施例１−
（５）に記載する方法にて形質転換体細胞よりプラスミ
ドを抽出した。該プラスミドの制限酵素消化反応にて目
的の組換え体ＤＮＡであることを確認し、ｐＭＯＮＯと
した。

【００６３】次いで、完全長の６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を
含むｐＭＯＮＯを用いて、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を一部
欠損したｐＭＯＰＤを作製した。ｐＭＯＰＤの作製は次
の如くして行った。ｐＭＯＮＯをＰｓｔＩにて消化し、
実施例１−（３）に記載する電気泳動を行い、約１ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ（Ｈ））を精製した。一
方、ｐＭＯＮＯをＰｓｔＩにて消化し、アルカリホスフ
ァターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）にて脱リン酸処理した後、実施
例１−（３）に記載する電気泳動を行い約３ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片（以下、ＤＮＡ（Ｉ））を精製した。ＤＮＡ
（Ｈ）とＤＮＡ（Ｉ）をライゲーションキット（宝酒造
社）にて結合し、実施例１−（３）に記載する大腸菌形
質転換法にて組換え体プラスミドを含む形質転換体細胞
を作製した。実施例１−（５）に記載する方法にて形質
転換体細胞よりプラスミドを抽出した。該プラスミドの
制限酵素消化反応にて目的の組換え体ＤＮＡであること
を確認し、ｐＭＯＰＤとした。

【００６４】（９） ６−ＨＮＡＭＯ活性の測定 ｐＯＸＡ、ｐＥＶＸ、ｐＥＶＡ、ｐＭＯＮＯ、ｐＭＯＰ
Ｄを保有する大腸菌（ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ）の有する６
−ＨＮＡＭＯ活性の測定結果を表２に示した。その結
果、ｐＥＶＡおよびｐＭＯＮＯに６−ＨＮＡＭＯ遺伝子
が機能的に発現することを確認した。また、ｐＭＯＮＯ
の形質転換体細胞に６−ＨＮＡＭＯ活性を確認したた
め、６−ＨＮＡＭＯ遺伝子をｐＭＯＮＯに含まれる約
１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片に限定した。

【００６５】上記形質転換体細胞の有する６−ＨＮＡＭ
Ｏ活性の測定は次の如くして行った。アンピシリンとＩ
ＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）をそれ
ぞれ最終濃度が１００μｇ／mlと１ｍＭになるように添
加したＬＢ液体培地５０mlへ、ｐＯＸＡ、ｐＥＶＸ、ｐ
ＥＶＡ、ｐＭＯＮＯ、ｐＭＯＰＤを保有する大腸菌ＸＬ
−１ Ｂｌｕｅを接種して３７℃で終夜振とう培養し
た。該培養液４０mlを遠心により集菌し、生理食塩水に
て菌体を洗浄した。この菌体を１mlの生理食塩水にて懸
濁し、菌体懸濁液とした。

【００６６】該菌体懸濁液へ、リン酸カリウム緩衝液ｐ
Ｈ７．０と６−ヒドロキシニコチン酸をそれぞれ最終濃
度が７０ｍＭと３０ｍＭになるように添加し、反応液を
調製した。その際、６−ヒドロキシニコチン酸を最後に
添加して反応を開始し、３０℃にて５時間往復振とう機
（タイテック社、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｌｔ−１０Ｆ、１
６０ストローク／分）にて反応を行った。反応液量の１
／２量のアセトニトリルを添加して反応を停止した後、
遠心により上清を得た。

【００６７】ＨＰＬＣシステム（日本分光社、ＰＵ−８
８０、ＵＶ−９７０、８０７−ＩＴ）を用いて、Ｍ＆Ｓ
パックＣ１８カラム（エムエス機器社、逆相、４．６×
１５０mm）と移動相（１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ２．
５、２％アセトニトリル、１．０ml／min）にて前記反
応液を溶出し、溶出液は２１０ｎｍの波長でモニター
し、該反応液中の６−ヒドロキシニコチン酸及び２，５
−ジヒドロキシピリジンを分析した。

【００６８】

【表２】

【００６９】（１０） ６−ＨＮＡＭＯ遺伝子の塩基配
列解析 実施例１−（２）に記載の方法を用いて、６−ＨＮＡＭ
Ｏ遺伝子を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列
を解析した。その塩基配列とコードされているアミノ酸
配列を配列番号３に示した。

【００７０】

【発明の効果】本発明の組換え体ＤＮＡを保有する形質
転換体細胞を用いれば、６−ＨＮＡＭＯを多量に製造す
ることができ、２，５−ジヒドロキシピリジン等の工業
的生産が可能となる。

【００７１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ser Gln Ser Pro Arg Ile Ala Val Val Gly Ala Gly Leu Gly Gly 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Lys Leu Leu Leu Gln Glu Gly Phe Asn Val Arg Val 20 25 30 Tyr Glu Gln Ala Pro Ser Phe Ser Arg Leu Gly Ala Gly Ile His Val 35 40 45 Gly Pro Asn Val Met Lys Ile Leu Arg Arg Ile Gly Ile Glu Asp Ala 50 55 60 Leu Asn Glu Gln Gly Ser His Pro Asp Tyr Trp Tyr Ser Arg His Trp 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asp Val Leu Ala Gln Ile Pro Leu Gly Asp Tyr Ala Val 85 90 95 Lys Glu Tyr Gly Ala Ser Tyr Leu Thr Val His Arg Gly Asp Phe His 100 105 110 Ala Leu Leu Val Glu Ala Leu Pro Asp Ser Val Met Ala Tyr Gly Lys 115 120 125 Phe Leu Thr Lys Val Glu Asp Arg Gly Asn Val Val Val Met His Phe 130 135 140 Ala Asp Gly Thr Thr Glu Glu Ala Asp Ile Val Ile Gly Pro Asp Gly 145 150 155 160 Val Asn Ser Arg Ile Arg Glu Glu Leu Leu Gly Pro Glu Leu Pro Lys 165 170 175 Tyr Ala Gly Tyr Leu Ala His Arg Ala Val Phe Pro Thr Pro Glu Val 180 185 190 Lys Ala Gly Met Leu Pro Phe Asp Ala Cys Val Lys Trp Trp Ser Asp 195 200 205 Asp Arg His Met Met Thr Tyr Phe Val Thr Gly Lys Ala Asp Glu Leu 210 215 220 Tyr Tyr Val Thr Gly Val Pro Val Glu Lys Trp Asp Leu Asn Asp Arg 225 230 235 240 Trp Leu Glu Ser Ser Lys Glu Glu Met Arg Glu Ala Phe Ser Gly Trp 245 250 255 His Pro Thr Val Gln Ala Leu Ile Asp Ala Thr Val Glu Val Thr Lys 260 265 270 Trp Ser Leu Leu Glu Arg Asp Pro Leu Pro Leu Trp Ser Arg Gly Arg 275 280 285 Leu Val Leu Leu Gly Asp Ala Cys His Pro Met Lys Pro His Met Ala 290 295 300 Gln Gly Ala Ala Met Ala Ile Glu Asp Gly Ala Met Leu Ala Arg Cys 305 310 315 320 Leu Lys Glu Val Gly Ala His Asn His Glu Leu Ala Phe Ala Leu Tyr 325 330 335 Glu Ala Asn Arg Ala Glu Arg Ala Ser Lys Val Gln Arg Ile Ser His 340 345 350 Asp Asn Thr Trp Leu Arg Thr Asn Glu Asp Pro Ser Trp Cys Phe Gly 355 360 365 Tyr Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val Glu Pro Lys Val Lys Ala Ala 370 375 380 Ala 385

【００７２】配列番号：２ 配列の長さ：１１５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス フルオレッセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） 株名 ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＴＮ５（ＦＥＲ Ｍ Ｐ−１５２１５） 配列： GTGTCTCAAT CCCCTCGAAT CGCCGTTGTC GGCGCCGGTC TCGGCGGGGC TGCAGCTGCC 60 AAGCTGCTGC TCCAGGAAGG CTTCAATGTC CGCGTCTATG AGCAGGCGCC CAGCTTCTCG 120 CGCCTGGGAG CCGGCATCCA CGTCGGGCCC AATGTGATGA AGATCCTGCG CCGCATCGGC 180 ATCGAGGACG CGCTCAACGA GCAGGGCTCG CATCCCGACT ACTGGTACAG CCGCCACTGG 240 CAGACGGGCG ACGTGCTGGC CCAGATTCCG CTGGGCGACT ACGCCGTCAA GGAATACGGC 300 GCCAGCTACC TGACCGTGCA CCGTGGCGAC TTCCATGCGC TGCTGGTCGA GGCCCTGCCC 360 GACAGCGTGA TGGCCTACGG CAAGTTCCTG ACCAAGGTGG AGGACCGCGG CAATGTGGTC 420 GTCATGCACT TTGCGGACGG CACGACCGAG GAGGCGGACA TCGTCATCGG GCCCGATGGC 480 GTGAACTCCC GCATCCGCGA GGAACTCCTG GGCCCCGAGC TTCCCAAGTA CGCGGGCTAC 540 CTGGCCCACC GCGCCGTGTT CCCCACGCCC GAGGTCAAGG CCGGCATGCT GCCCTTCGAT 600 GCCTGCGTGA AGTGGTGGAG CGATGACCGC CACATGATGA CCTACTTCGT CACCGGCAAG 660 GCCGACGAGC TGTACTACGT GACCGGCGTG CCCGTCGAGA AGTGGGATCT CAACGACCGC 720 TGGCTGGAAA GCAGCAAGGA AGAGATGCGC GAGGCCTTCT CGGGCTGGCA TCCCACCGTG 780 CAGGCACTGA TCGACGCCAC CGTGGAAGTG ACCAAGTGGT CGCTGCTCGA GCGCGATCCG 840 CTGCCGCTGT GGAGCCGTGG CCGCCTGGTG CTGCTGGGCG ATGCCTGCCA CCCCATGAAG 900 CCCCACATGG CCCAGGGCGC CGCCATGGCC ATCGAGGACG GCGCCATGCT GGCGCGCTGC 960 CTCAAGGAAG TCGGCGCGCA CAACCATGAG CTGGCCTTCG CTCTGTACGA GGCCAACCGT 1020 GCCGAGCGCG CCAGCAAGGT GCAGCGCATC TCGCACGACA ACACCTGGCT GCGCACCAAC 1080 GAAGATCCGT CCTGGTGCTT CGGCTACGAC GTGTTCAACG TGCCCCTGGT CGAGCCCAAG 1140 GTCAAGGCAG CGGCC 1155

【００７３】配列番号：３ 配列の長さ：１５４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス フルオレッセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ） 株名 ：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ＴＮ５（ＦＥＲ Ｍ Ｐ−１５２１５） 配列： CCTGCAGCAT GGCCGGCACC TCGGTCTCCA TGGTGGTGTT GGAGCTGGGG ACGATCTGGC 60 CGATGCGGAA CGTTTTGGTC ATGGACTTGC CTTTGCGAAG TTTCGAGGGT TTCTGATCAG 120 AATCAACTGA GTGTGTACGC TTTATTCTTG CAAAAGACGT GCCGCCTTGC AAATGAGAAT 180 TTTCTCGGGG TTTGTACTGA TTTGGTGCAG AAATTGCACC AAAAACGGCG AACTTCAATT 240 TATTCTGCCG CCCTATGGTG CATGCGTCGA TTTGAAAAAT TCAAGCGCAT ACACCTGAAT 300 TAAGTGTTTT GTTGCCTGGC ACGCTTCCTG CTCTACACCC TGCAAGGACG CGCCGAAGCA 360 ACGGTTGCCC CGTCTGGCTT TCAACATTCC TGCAAGGAGA AAACT GTG TCT CAA TCC 417 Met Ser Gln Ser CCT CGA ATC GCC GTT GTC GGC GCC GGT CTC GGC GGG GCT GCA GCT GCC 465 Pro Arg Ile Ala Val Val Gly Ala Gly Leu Gly Gly Ala Ala Ala Ala 5 10 15 20 AAG CTG CTG CTC CAG GAA GGC TTC AAT GTC CGC GTC TAT GAG CAG GCG 513 Lys Leu Leu Leu Gln Glu Gly Phe Asn Val Arg Val Tyr Glu Gln Ala 25 30 35 CCC AGC TTC TCG CGC CTG GGA GCC GGC ATC CAC GTC GGG CCC AAT GTG 561 Pro Ser Phe Ser Arg Leu Gly Ala Gly Ile His Val Gly Pro Asn Val 40 45 50 ATG AAG ATC CTG CGC CGC ATC GGC ATC GAG GAC GCG CTC AAC GAG CAG 609 Met Lys Ile Leu Arg Arg Ile Gly Ile Glu Asp Ala Leu Asn Glu Gln 55 60 65 GGC TCG CAT CCC GAC TAC TGG TAC AGC CGC CAC TGG CAG ACG GGC GAC 657 Gly Ser His Pro Asp Tyr Trp Tyr Ser Arg His Trp Gln Thr Gly Asp 70 75 80 GTG CTG GCC CAG ATT CCG CTG GGC GAC TAC GCC GTC AAG GAA TAC GGC 705 Val Leu Ala Gln Ile Pro Leu Gly Asp Tyr Ala Val Lys Glu Tyr Gly 85 90 95 100 GCC AGC TAC CTG ACC GTG CAC CGT GGC GAC TTC CAT GCG CTG CTG GTC 753 Ala Ser Tyr Leu Thr Val His Arg Gly Asp Phe His Ala Leu Leu Val 105 110 115 GAG GCC CTG CCC GAC AGC GTG ATG GCC TAC GGC AAG TTC CTG ACC AAG 801 Glu Ala Leu Pro Asp Ser Val Met Ala Tyr Gly Lys Phe Leu Thr Lys 120 125 130 GTG GAG GAC CGC GGC AAT GTG GTC GTC ATG CAC TTT GCG GAC GGC ACG 849 Val Glu Asp Arg Gly Asn Val Val Val Met His Phe Ala Asp Gly Thr 135 140 145 ACC GAG GAG GCG GAC ATC GTC ATC GGG CCC GAT GGC GTG AAC TCC CGC 897 Thr Glu Glu Ala Asp Ile Val Ile Gly Pro Asp Gly Val Asn Ser Arg 150 155 160 ATC CGC GAG GAA CTC CTG GGC CCC GAG CTT CCC AAG TAC GCG GGC TAC 945 Ile Arg Glu Glu Leu Leu Gly Pro Glu Leu Pro Lys Tyr Ala Gly Tyr 165 170 175 180 CTG GCC CAC CGC GCC GTG TTC CCC ACG CCC GAG GTC AAG GCC GGC ATG 993 Leu Ala His Arg Ala Val Phe Pro Thr Pro Glu Val Lys Ala Gly Met 185 190 195 CTG CCC TTC GAT GCC TGC GTG AAG TGG TGG AGC GAT GAC CGC CAC ATG 1041 Leu Pro Phe Asp Ala Cys Val Lys Trp Trp Ser Asp Asp Arg His Met 200 205 210 ATG ACC TAC TTC GTC ACC GGC AAG GCC GAC GAG CTG TAC TAC GTG ACC 1089 Met Thr Tyr Phe Val Thr Gly Lys Ala Asp Glu Leu Tyr Tyr Val Thr 215 220 225 GGC GTG CCC GTC GAG AAG TGG GAT CTC AAC GAC CGC TGG CTG GAA AGC 1137 Gly Val Pro Val Glu Lys Trp Asp Leu Asn Asp Arg Trp Leu Glu Ser 230 235 240 AGC AAG GAA GAG ATG CGC GAG GCC TTC TCG GGC TGG CAT CCC ACC GTG 1185 Ser Lys Glu Glu Met Arg Glu Ala Phe Ser Gly Trp His Pro Thr Val 245 250 255 260 CAG GCA CTG ATC GAC GCC ACC GTG GAA GTG ACC AAG TGG TCG CTG CTC 1233 Gln Ala Leu Ile Asp Ala Thr Val Glu Val Thr Lys Trp Ser Leu Leu 265 270 275 GAG CGC GAT CCG CTG CCG CTG TGG AGC CGT GGC CGC CTG GTG CTG CTG 1281 Glu Arg Asp Pro Leu Pro Leu Trp Ser Arg Gly Arg Leu Val Leu Leu 280 285 290 GGC GAT GCC TGC CAC CCC ATG AAG CCC CAC ATG GCC CAG GGC GCC GCC 1329 Gly Asp Ala Cys His Pro Met Lys Pro His Met Ala Gln Gly Ala Ala 295 300 305 ATG GCC ATC GAG GAC GGC GCC ATG CTG GCG CGC TGC CTC AAG GAA GTC 1377 Met Ala Ile Glu Asp Gly Ala Met Leu Ala Arg Cys Leu Lys Glu Val 310 315 320 GGC GCG CAC AAC CAT GAG CTG GCC TTC GCT CTG TAC GAG GCC AAC CGT 1425 Gly Ala His Asn His Glu Leu Ala Phe Ala Leu Tyr Glu Ala Asn Arg 325 330 335 340 GCC GAG CGC GCC AGC AAG GTG CAG CGC ATC TCG CAC GAC AAC ACC TGG 1473 Ala Glu Arg Ala Ser Lys Val Gln Arg Ile Ser His Asp Asn Thr Trp 345 350 355 CTG CGC ACC AAC GAA GAT CCG TCC TGG TGC TTC GGC TAC GAC GTG TTC 1521 Leu Arg Thr Asn Glu Asp Pro Ser Trp Cys Phe Gly Tyr Asp Val Phe 360 365 370 AAC GTG CCC CTG GTC GAG CCC AAG GTC AAG GCA GCG GCC TGATACTCGC 1570 375 380 385 TGCCTTGCCG GACGAGGGGA GGGGAGGGAA TCCCCCCCTC CTGTCCGGCC GGCAGAACGC 1630 CGACATCCTG AACCGCAGCC AAGTTGCAAG AGCCTCGTCC CATGGGAACC CCAGTCCATC 1690 CAAGCAGTAC CCCCAGCCCC ATCCGCCTGC AGGTCAATGC ACGCGCATGC GAGGTGCCGG 1750 CAGCGCCCGG GACGGCGCTG CTGCATGTGC TGCGCAATGA CCTGGAGCTG AACGGGCCC 1809

【００７４】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Glu Val Gly Ala His Asn His Glu Leu Ala Phe Ala Leu Tyr Glu Ala 5 10 15 Asn Arg

【００７５】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状、混合物（２５６種類） 配列の種類：化学合成ＤＮＡ

【００７６】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状、混合物（２５６種類） 配列の種類：化学合成ＤＮＡ

【００７７】配列番号：７ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＰＣＲにて作製したＤＮＡ 配列： GAG GTT GGG GCG CAT AAC CAT GAG CTG GCC TTC GCT CTG TAC GAA GCC 48 Glu Val Gly Ala His Asn His Glu Leu Ala Phe Ala Leu Tyr Glu Ala 5 10 15 AAT AG 53 Asn

【００７８】配列番号：８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：化学合成ＤＮＡ 配列： ACCATGAGCT GGCCTTCGCT

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５由
来の６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含むプラスミドにおける挿
入ＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す説明図である。

【図２】シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５由
来の６−ＨＮＡＭＯ遺伝子を含むプラスミドｐＥＶＡの
調製手順を示す説明図である。

【図３】シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５由
来の６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲナーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＭＯＮＯの調製手順を示す説明図
である。

【図４】シュードモナス フルオレッセンス ＴＮ５由
来の６−ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲナーゼ遺伝
子を含むプラスミドｐＭＯＰＤの調製手順を示す説明図
である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１１月２４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００６】即ち、本発明は配列番号１で示される６−
ＨＮＡＭＯのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を提
供するものである。また、本発明はこの６−ＨＮＡＭＯ
遺伝子のＤＮＡ断片を含有する組換え体ＤＮＡ、および
該組換え体ＤＮＡを保持する形質転換体細胞を提供する
ものである。更に本発明は該組換え体ＤＮＡを保持する
形質転換体細胞を培養し、該培養物から採取することを
特徴とする６−ＨＮＡＭＯの製造法を提供するものであ
る。更にまた、本発明はこの形質転換細胞の培養により
得られた６−ＨＮＡＭＯを６−ヒドロキシニコチン酸に
作用させることを特徴とする２，５−ジヒドロキシピリ
ジンの製造法を提供するものである。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 山根 恒夫 愛知県名古屋市千種区若水３−22−１ (72)発明者 長澤 透 岡山県岡山市津島中１−２ ＲＦ401

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示される６−ヒドロキシニ
   コチン酸モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列をコードす
   るＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   ものである請求項１記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載のＤＮＡ断片を含
   有する組換え体ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換え体ＤＮＡを保持す
   る形質転換体細胞。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体細胞を培養
   し、該培養物から採取することを特徴とする６−ヒドロ
   キシニコチン酸モノオキシゲナーゼの製造法。
6. 【請求項６】 請求項５記載の方法により得られた６−
   ヒドロキシニコチン酸モノオキシゲナーゼを６−ヒドロ
   キシニコチン酸に作用させることを特徴とする２，５−
   ジヒドロキシピリジンの製造法。