JPH10108679A - ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びピルベートオルトフォスフェートジキナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】１．配列番号１で表されるアミノ酸配列、
又は該アミノ酸配列のうちの１若しくは複数のアミノ酸
が付加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含み、
ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ活性をもた
らすポリペプチドをコードするピルベートオルトフォス
フェートジキナーゼ遺伝子。 ２．上記のピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ
遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮ
Ａ。 ３．エッシェリシア属に属し、上記２記載の組み換え体
ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得られる培養
物からピルベートオルトフォスフェートジキナーゼを採
取することを特徴とするピルベートオルトフォスフェー
トジキナーゼの製造法。 【効果】 本発明により、ピルベートオルトフォスフェ
ートジキナーゼ遺伝子及びピルベートオルトフォスフェ
ートジキナーゼの製造法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ピルベートオルト
フォスフェートジキナーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組み
換え体ＤＮＡ及びピルベートオルトフォスフェートジキ
ナーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ピルベートオルトフォスフェートジキナ
ーゼ（以下「ＰＰＤＫ」という）は、アデノシン５’−
一リン酸（AMP）とホスホエノールピルビン酸及びピロ
リン酸から、アデノシン５’−三リン酸（ATP）とピル
ビン酸及びリン酸を生成する反応を触媒する酵素であ
る。そして、該酵素は、例えばピロリン酸の定量などに
用いられている（特開昭61-12300号）。更に、該酵素
は、生物発光法において発光量を高水準のまま、しかも
長時間減衰することなく安定に保つために利用されてい
る（榊原他 日本薬学会第１１６年会 講演要旨集４
１５４頁）。永崎らは、低温域における保存に安定で、
且つ、凍結・融解などにも耐え得る新規なＰＰＤＫを、
ミクロビスポーラ属に属する菌株より見いだした（特開
平8-168375号)。しかしながら、該菌株を培養してＰＰ
ＤＫを生産する場合には、該酵素の生産量が少量である
という問題があった。また、該菌株の培養には３日程度
必要であり、培養中に他の微生物による汚染を受けやす
いという問題もあった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＰＰＤＫ遺
伝子、該遺伝子を含む組み換え体ＤＮＡ及びＰＰＤＫの
製造法を提供することを目的とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、マイクロ
ビスポーラ属に属する微生物よりＰＰＤＫ遺伝子を単離
することに成功し、本発明を完成した。すなわち、本発
明は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は該アミ
ノ酸配列のうちの１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠
失若しくは置換されたアミノ酸配列を含み、且つＰＰＤ
Ｋ活性をもたらすポリペプチドをコードするＰＰＤＫ遺
伝子である。ここで、「１若しくは複数のアミノ酸が付
加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列」とあるの
は、目的とするＰＰＤＫ活性が得られる限り、配列番号
１で表されるアミノ酸配列が、該アミノ酸配列とは異な
る配列に付加、欠失又は置換されてもよいことを意味す
る。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列の第１
番目のメチオニンが欠失しても、本発明の目的とするＰ
ＰＤＫ活性が得られる限り、かかる欠失した配列も本発
明に含まれることを意味する。

【０００５】さらに、本発明は、前記ＰＰＤＫ遺伝子が
ベクターＤＮＡに組み込まれた組み換え体ＤＮＡであ
る。さらに、本発明は、エッシェリシア属に属し、前記
組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得
られる培養物からＰＰＤＫを採取することを特徴とする
ＰＰＤＫの製造法である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下に、本発明のＰＰＤＫ（以下
「本酵素」という）をコードする遺伝子（すなわち「Ｐ
ＰＤＫ遺伝子」）の単離法、該遺伝子が組み込まれた組
み換え体ＤＮＡを含有する組み換え微生物を用いて本酵
素を生産する方法、及び本酵素の活性測定法について詳
細に説明する。 １．ＰＰＤＫ遺伝子の単離法 ＰＰＤＫ遺伝子は、例えば、本酵素の生産能を有する微
生物の染色体ＤＮＡ、又はｃＤＮＡを由来とする野生型
遺伝子をクローニングすることにより得られる。この
他、本酵素のアミノ酸配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型としてポリメラー
ゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）を行うことによ
り、該遺伝子を増幅することもできる。さらには化学合
成法を用いて該遺伝子を構築することも可能である。以
下、マイクロビスポーラ属に属し、本酵素の生産能を有
する微生物の染色体ＤＮＡのライブラリー（以下「ゲノ
ミックＤＮＡライブラリー」という）からＰＰＤＫ遺伝
子をクローニングする方法を例にとり、ＰＰＤＫ遺伝子
の単離法について説明する。

【０００７】（１）ゲノミックＤＮＡライブラリーの作
成 マイクロビスポーラ属に属し、本酵素の生産能を有する
微生物としては、例えばマイクロビスポーラ・サーモロ
ーザ（Microbispora thermorosea IFO14047)等が使用
できる。上記微生物は、例えば、IFO指定の培地（IFO m
edium No.231）等で培養したものを使用することができ
る。上記の微生物から染色体ＤＮＡを抽出する方法とし
ては、公知のいずれの方法もが使用できる。その例とし
ては、実施例記載の方法、或いはHoffman 等の方法（Ge
ne,57,267-272,1987）等が挙げられる。得られた染色体
ＤＮＡを適当な制限酵素により完全消化し、染色体ＤＮ
Ａの断片を得る。次いで、該断片を通常のアガロースゲ
ル電気泳動法に供し、目的の大きさの 断片を含むゲル
を切り出す。次いで、切り出したゲル中のＤＮＡ断片
を、GENE CLEAN II（フナコシ社製）等により精製し、
適当なベクターＤＮＡに挿入して組み換え体ＤＮＡを作
成し、該組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞を形質転
換又は形質導入すれば、ゲノミックＤＮＡライブラリー
を作成することができる。

【０００８】ＤＮＡ 断片を挿入するためのベクターＤ
ＮＡは、宿主細胞で複製可能なものであれば如何なるも
のでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオフ
ァージＤＮＡ等が挙げられる。宿主細胞が大腸菌である
場合は、プラスミドpUC118（宝酒造社製）、 pBluescri
pt SK+(Stratagene社製)、pMAL-C2（NEW England Labs
社製）、pGEX-5X-1（ファルマシア社製）、pXa1（ベー
リンガーマンハイム社製）等が使用できる。この他、温
度感受性バクテリオファージ（特開昭58-212781号公
報、FERM BP-133)等を使用することも可能である。宿主
細胞としては、真核細胞及び原核細胞のいずれをも用い
ることができる。真核細胞としては動物、植物、昆虫、
酵母等の細胞が、原核細胞としては大腸菌、枯草菌、放
線菌等が挙げられる。具体的には、エッシェリシア属に
属する微生物、例えば大腸菌TG1（Amersham社製）、XL1
-Blue（Stratagene社製）、JM109（宝酒造社製）、HB10
1(ATCC33694)等が好適に使用され得る。

【０００９】組み換え体ＤＮＡを用いて、宿主細胞、例
えば大腸菌TG1等を形質転換或いは形質導入することに
より、種々の遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を含有する
組み換え微生物を得ることができる。本発明において
は、形質転換は、例えばD.M.Morrisonの方法（Methods
in Enzymology,68,326-331,1979)により、形質導入は、
例えばB.Hohnの方法（Method in Enzymology,68,299-30
9,1979）により行うことができる。尚、本発明において
は、宿主細胞に遺伝子を導入する方法として、上記の方
法の他に、相同組換えにより遺伝子を宿主細胞の染色体
ＤＮＡに挿入する方法を用いることができる。相同組換
えによる遺伝子導入は、具体的には、例えばマイクロイ
ンジェクション法等により行うことができる。

【００１０】（２）ＰＰＤＫ遺伝子の単離 上記で作成したゲノミックＤＮＡライブラリーより、Ｐ
ＰＤＫ遺伝子を含有する組み換え微生物をスクリーニン
グするには、ＰＰＤＫ遺伝子の一部に対応するＤＮＡ断
片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション
〔Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Int
erscience,1989)〕、プラークハイブリダイゼーション
等を行えばよい。プローブとして用いるＤＮＡ断片は、
ＰＣＲ法を用いて調製することができる。先ず、本酵素
のＮ末端アミノ酸配列に基づいてオリゴヌクレオチドを
合成し、これを５’プライマーとする。次いで、従来公
知のＰＰＤＫにおいて、保存性の高い領域のアミノ酸配
列に基づいてオリゴヌクレオチドを合成し、これを３’
プライマーとする。従来公知のＰＰＤＫとしては、クロ
ストリディウム・シンビオサム（Clostridium symbiosu
m）、とうもろこし、フラベリア・トリネルビア（Flave
ria trinervia）を由来とするもの等を挙げることがで
きる。また、大腸菌由来のフォスフォエノールピルベー
トシンターゼ及びエンザイムＩは、ＰＰＤＫとの相同性
が高いことが知られており、これらの酵素のアミノ酸配
列に基づいてプライマーを合成することも可能である。

【００１１】これらのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プ
ライマーとし、マイクロビスポーラ・サーモローザの染
色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、ＰＰ
ＤＫ遺伝子の一部に対応するＤＮＡ断片を増幅すること
ができる。尚、ＰＣＲ用プライマーを合成する際に使用
するコドンは、マイクロビスポーラ属に属する微生物に
おいて高頻度で使用されるコドンを選択することが好ま
しい。プローブは、ジゴギシゲニン（ベーリンガーマン
ハイム社製）等の非放射性物質、或いは〔γ−32P〕ATP
（アマシャム ジャパン社製）等の放射性同位体によ
り標識することができる。ＰＰＤＫ遺伝子を含有する組
み換え微生物より純化された組み換え体ＤＮＡを得るに
は、例えばQIAGEN Plasmid Mini Kit（フナコシ社
製）、超遠心塩化セシウム濃度勾配分離法等の方法を用
いればよい。

【００１２】（３）遺伝子の解析 上記で得られた組み換え体ＤＮＡに組み込まれているＰ
ＰＤＫ遺伝子の塩基配列は、ジデオキシ法(Methods in
Enzymology,101,20-78,1983）により決定することがで
きる。決定したＰＰＤＫ遺伝子の塩基配列に基づいて、
本酵素のアミノ酸配列を確定する。このアミノ酸配列
は、配列番号１に示される通りである。配列番号１のア
ミノ酸配列において、ＰＰＤＫ活性を失うことのない限
り、１もしくは複数のアミノ酸が、付加、欠失もしくは
置換されていてもよい。ＰＰＤＫ活性を失うことのない
範囲でアミノ酸配列が変異されたポリペプチドをコード
する遺伝子は、全て本発明に含まれる。

【００１３】上記の変異型ＰＰＤＫ遺伝子は、野生型の
ＰＰＤＫ遺伝子に変異を導入することにより得られる。
遺伝子に変異を導入する方法としては、野生型遺伝子と
変異原となる薬剤、具体的にはヒドロキシルアミン、亜
硝酸、亜硫酸、５−ブロモウラシル等を接触させる方法
を挙げることができる。この他、紫外線照射法、カセッ
ト変異法、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異導入法等の
方法を広く用いることができる。更には、化学合成した
ＤＮＡをアニーリングして、所望の部位に変異を有する
変異型ＰＰＤＫ遺伝子を構築することも可能である。

【００１４】２．組み換え微生物による本酵素の生産 ＰＰＤＫ遺伝子が、適当なプロモーターの下流に組み込
まれた組み換え体ＤＮＡを含有する組み換え微生物を培
養すれば、本酵素を生産することができる。培養方法
は、通常の固体培養法でもよいが、液体培養法を採用す
ることが好ましい。組み換え微生物を培養する培地とし
ては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーン
スティープリカー又は大豆もしくは小麦ふすまの浸出液
等から選ばれる１種以上の窒素源に、リン酸二水素カリ
ウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
第二鉄、硫酸第二鉄又は硫酸マンガン等の無機塩類の１
種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等
を適宜添加したものが用いられる。又、必要により培地
にイソプロピル-β-チオガラクトサイド（IPTG）等を添
加して、ＰＰＤＫ遺伝子の発現を誘導してもよい。

【００１５】培地の初発pHは７〜９に調節するのが適当
である。培養は、25〜42℃、好ましくは37℃前後で６〜
24時間、通気攪拌培養、振盪培養、静置培養等により行
うことが好ましい。培養終了後、培養物より本酵素を採
取するには、通常の酵素採取手段を用いることができ
る。すなわち、リゾチーム等の酵素を用いた溶菌処理、
超音波破砕処理、磨砕処理等により菌体を破壊し、本酵
素を菌体外に排出させる。次いで、濾過又は遠心分離等
を用いて不溶物を除去することにより、本酵素を含有す
る粗酵素液を得ることができる。本発明では、該粗酵素
液をそのまま本酵素標品としてもよく、以下の精製手法
によりさらに純度を高めてもよい。

【００１６】上記の粗酵素液から、本酵素をさらに精製
するには、通常のタンパク質精製法を使用することがで
きる。具体的には、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオ
ン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、
ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィ
ー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動法等
が、単独又は適宜組み合わせて用いられる。遺伝子工学
的手法により生産される本酵素の理化学的性質は、ＤＮ
Ａ供与体であるマイクロビスポーラ属に属する微生物が
生産するＰＰＤＫの理化学的性質と全く同様である。

【００１７】３．本酵素の活性測定法 以下に、本酵素の活性測定法を示す。該測定法は、本酵
素の触媒反応によって生成するＡＴＰを、発光法を用い
て定量する方法である。先ず、３ｍＭ 硫酸マグネシウ
ム、２５ｍＭ 硫酸アンモニウム、２ｍＭ ２メルカプ
トエタノール、２ｍＭ ピロリン酸、２ｍＭ ホスホエ
ノールピルビン酸及び０．１ｍＭ ＡＭＰを含む５０ｍ
Ｍ ＢＩＳ−ＴＲＩＳ ＰＲＯＰＡＮＥ緩衝液（ｐＨ
６．８）１８０μｌをマイクロチューブにとり、温度平
衡を３７℃に到達させる。次いで、本酵素を含有する溶
液２０μｌを加え、１５分間反応させ、沸騰水中で３分
間煮沸し反応を止める。この反応液の希釈液５０μｌを
試験管にとり、そこに「ルシフェールＬＵ」（キッコー
マン社製）溶液を５０μｌ滴下し、発光量を測定する。
別にあらかじめ既知濃度のＡＴＰの標準溶液を用いて、
その発光量との関係を調べたグラフを用意する。このグ
ラフを用いて、３７℃で１分間あたりに生成されるＡＴ
Ｐのμｍｏｌを計算し、この数字を使用酵素液中の活性
単位とする。なお、３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌ
のＡＴＰを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００１８】

【実施例】次に、実施例により本発明を更に具体的に説
明する。但し、本発明はこれら実施例になんら限定され
るものではない。

【００１９】(1) 染色体ＤＮＡの調製 染色体ＤＮＡは、以下の方法により調製した。すなわ
ち、マイクロビスポーラ・サーモローザ（Microbispora
thermorosea IFO14047)を、IFO指定の培地（IFOmedium
No.231）50 mlに接種して45℃で72時間振盪培養した
後、遠心分離により集菌した。得られた菌体500 mgを、
５mlの破砕溶液〔２mg/ml リゾチーム、25mM エチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA）、25 mMトリス
〔トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン〕-塩酸（p
H 8.0 ）、0.3 Mショ糖〕に懸濁した後、試験管に移
し、37℃で30分、時々攪拌しながら溶菌した。次いで25
0 μlの10% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、24μlの
プロテイナーゼＫ溶液（20 mg/ml）を加え、37℃で60
分、更に溶菌した。次いで、800 μlの５M NaCl、640μ
lの10％ CTAB(セチルトリメチルアンモニウムブロミド)
／0.7M NaCl を加え、65℃で10分間静置した。その後、
常法に従い、クロロホルム抽出、イソプロパノール沈
澱、エタノール沈殿を行い、100 μg の染色体ＤＮＡを
得た。

【００２０】(2) サザンブロット分析 プローブとして用いるＤＮＡ断片は、ＰＣＲ法を用いて
調製した。先ず、特開平8-168375号記載の方法に基づい
て、マイクロビスポーラ・サーモローザ(IFO14047)の培
養物よりＰＰＤＫを精製し、そのＮ末端アミノ酸配列
を、プロテインシーケンサー（473A型; アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いて２８残基決定した。その結
果を配列番号２に示した。Ｎ末端アミノ酸配列の情報及
びマイクロビスポーラ属でのコドン利用頻度に基づいて
オリゴヌクレオチドを合成し、これを５’プライマー
（TACGACTTCACCGAGGGCAACAAGGAC：配列番号３）とし
た。オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ Synthesizer
Model 392（アプライド バイオシステムズ社製）を用
いて行った。

【００２１】次に、従来公知のＰＰＤＫ〔クロストリデ
ィウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、と
うもろこし、フラベリア・トリネルビア（Flaveria tri
nervia）等を由来とするもの〕や、大腸菌由来のフォス
フォエノールピルベートシンターゼ及びエンザイムＩお
いて、保存性の高い領域〔領域Ａ：M. Niersbach eta
l., Mol. Gen. Genet., 231, 332-336 (1992), Fig.3〕
のアミノ酸配列及びマイクロビスポーラ属でのコドン利
用頻度に基づいて逆鎖のオリゴヌクレオチドを合成し、
これを３’プライマー（GCGGTAGACGATGGCGCGCGGGTTGTCC
CA：配列番号４）とした。該３’プライマーは、クロス
トリディウム・シンビオサム由来のＰＰＤＫのアミノ酸
配列の一部（Trp Asp Asn Pro Arg Ala Ile Val Tyr Ar
g：配列番号５）に対応している。

【００２２】次いで、（１）で得られた染色体ＤＮＡ
0.1 μgと、５’及び３’プライマー各１ pmolとを混合
し、ＤＮＡ Thermal Cycler (Perkin Elmer社・製)及び
KOD DNAポリメラーゼ(TOYOBO社製)を用いてＰＣＲを行
った結果、約650bp のＤＮＡ断片が増幅された。該ＰＣ
Ｒ産物をアガロースゲル電気泳動に供した後、GENE CLE
AN II（フナコシ）により精製し、プラスミドpUC118
（宝酒造社製）のSmaI部位に挿入した。該ＰＣＲ産物の
塩基配列を、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequenc
ing Ready Reaction Kit（アプライド バイオシステム
ズ社製）を用いて決定したところ、該ＰＣＲ産物が、Ｐ
ＰＤＫ遺伝子の一部に対応する塩基配列を有しているこ
とが確認された。染色体ＤＮＡを、制限酵素BamHIまた
はBglIIにより完全消化した後、アガロースゲル電気泳
動法に供し、ゲル中のＤＮＡ断片をナイロンメンブレン
フィルター（Hybond-N+；アマシャム社製）に転写し
た。次いで、上記のＰＣＲ産物をプローブとしてサザン
ブロット分析を行い、ＰＰＤＫ遺伝子を含有するBamHI
断片、BglII断片の鎖長が、それぞれ約3 kb、約7.5kbで
あることを確認した。

【００２３】尚、プローブは、DIG-Labeling Kit（ベー
リンガーマンハイム社製）を用いてジゴキシゲニン標識
した。

【００２４】(3) ゲノミックＤＮＡライブラリーの作成 10μgの染色体ＤＮＡを、制限酵素BamHI（宝酒造社製）
により完全消化した後、それぞれ0.7 ％アガロースゲル
電気泳動に供した。次いで、約3 kbの鎖長のBamHI 断片
を含有するゲルを切り出した。ゲル中のＤＮＡ断片を、
GENE CLEAN II（フナコシ社製）により回収し、約１ μ
gのBamHI 断片を得た。一方、プラスミドpUC118（宝酒
造社製）１μgを、BamHI を用いて切断した後、大腸菌
由来のアルカリホスファターゼ（宝酒造社製）を用いて
脱リン酸化した。このようにして得られたBamHI断片１
μgと、BamHIで切断したpUC118とを連結した後、D.M.Mo
rrisonの方法に従って大腸菌TG1（Amersham社製）を形
質転換し、約10,000個の組み換え大腸菌のコロニーを得
た（以下「BamHIライブラリー」という）。大腸菌のコ
ロニーを、ナイロンメンブレンフィルター（Hybond-N
+；アマシャム社製）に転写した。

【００２５】同様に、約7.5 kbのBglII断片がpUC118のB
amHI部位に挿入されたプラスミドを持つ大腸菌TG1のコ
ロニーを約10,000個得て（以下「BglIIライブラリー」
という）、ナイロンメンブレン上に転写した。 (4) コロニーハイブリダイゼーションによるＰＰＤＫ遺
伝子の単離 ＰＰＤＫ遺伝子は、(3)で作成したゲノミックＤＮＡラ
イブラリーを、(2)で調製したプローブを用いてスクリ
ーニングして得た。スクリーニングは、コロニーハイブ
リダイゼーション法を用いて行い、BamHIライブラリー
及びBglIIライブラリーより、陽性コロニーをそれぞれ
数個ずつ得た。

【００２６】BamHIライブラリー由来の陽性コロニーの
うち１個を選び、菌体に含まれる組み換え体プラスミド
を、QIAGEN Plasmid Mini Kit（フナコシ社製）を用い
て精製した。該組み換え体プラスミドを、プラスミドpP
DK21（この中に、約3 kbのBamHI断片が含まれている）
と命名した。同様に、BglIIライブラリーを由来とする
陽性コロニーの１つに含まれる組み換え体プラスミドを
精製し、プラスミドpPDK8（この中に、約7.5 kbのBglII
断片が含まれている）と命名した。

【００２７】(5) ＰＰＤＫ遺伝子の解析 プラスミドpPDK21に含まれるBamHI断片、及びpPDK8に含
まれるBglII断片中のＰＰＤＫ遺伝子の塩基配列を決定
した。その結果、BamHI断片にはＰＰＤＫ遺伝子の５’
側が、BglII断片にはＰＰＤＫ遺伝子の３’側が含まれ
ており、両断片は一部で重複しており、両断片を併せる
と全長ＰＰＤＫ遺伝子を含むことが明らかになった。Ｐ
ＰＤＫ遺伝子は、2,634 bのコーディング領域をもち
（配列番号１）、878個のアミノ酸をコードしていた
（配列番号１）。なお、プロテインシーケンサーを用い
て決定した本酵素のＮ末端アミノ酸は、配列番号１で表
されるアミノ酸配列の第２番目のプロリンであった。

【００２８】(6)組み換え大腸菌TG1[pPDK35]の調製 2μgの pPDK8を制限酵素BamHIとHindIII（宝酒造社製）
で消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。ゲル
中のDNＡ断片（約5.5 ｋｂ）を、GENE CLEAN II（フナ
コシ社製）により回収し、約1μgのHindIII-BamHI断片
を得た。該断片には、ＰＰＤＫ遺伝子の3'側が含まれて
いる。一方、3μgの pPDK21をHindIIIで切断後、BamHI
で部分分解し、1μgの約６．５ｋｂの断片を得た。該Hi
ndIII-BamHI断片には、ＰＰＤＫ遺伝子の5'側及びベク
ターＤＮＡが含まれている。これらのHindIII-BanHI断
片を連結し、ＰＰＤＫ遺伝子の全長を含むプラスミドpP
DK30を得た（図１）。

【００２９】ＰＰＤＫ遺伝子の開始コドン付近のオリゴ
ヌクレオチド（CGGCGAAGGAGCGTCATATGCCGAAGTACGTT：配
列番号６）、及び終始コドン付近の逆鎖のオリゴヌクレ
オチド（GTCCGGGGGAAAACCATATGTCATCGGGTGTCGGA：配列
番号７）を合成し、ＰＣＲプライマーとした。これらの
プライマーの配列中には制限酵素NdeI部位（下線部）が
組み込まれている。従って、ＰＣＲ産物をNdeIで消化す
ると、ＰＰＤＫ遺伝子のコーディング領域のみを得るこ
とができる。両プライマー各1 pmol及び上記のプラスミ
ドpPDK30（2 ng）を混合した後、DNA Thermal Cycler
(Perkin Elmer社製)及びKOD DNAポリメラーゼ(TOYOBO社
製)を用いてＰＣＲを行い、ＰＰＤＫ遺伝子の全長を増
幅した。上記で得られたＰＣＲ産物をNdeI（宝酒造社
製）で消化後、発現ベクターpUTE500K'（特開平8-20586
1号）のNdeI部位に挿入し、プラスミドpPDK35を得た。
該プラスミドは、ラクトースプロモーターの支配下で全
長ＰＰＤＫ遺伝子を発現することができる。次いで、pP
DK35を用いて大腸菌TG1を形質転換し、組み換え大腸菌T
G1[pPDK35]を得た。大腸菌TG1[pPDK35]は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−５６８６と
して寄託されている。

【００３０】(7)組み換え大腸菌による本酵素の生産 0.2 mMのIPTGを含むLB培地（１％ペプトン、0.5％酵母
エキス、0.5％ NaCl、pH 7.2 ）に、大腸菌TG1[pPDK35]
の一夜培養液を２％植菌し、37℃で６時間振盪培養し
た。培養液を超音波により破砕した後、遠心分離により
不溶物を除き、菌体破砕上清を得た。該菌体破砕上清中
のＰＰＤＫの活性を、上述の活性測定法に基づいて測定
した。また、対照として、発現ベクターpUTE500K'のみ
を含む組み換え大腸菌TG1[pUTE500K']の菌体破砕上清に
ついても、そのＰＰＤＫ活性を測定した。更に、ＤＮＡ
供与体であるマイクロビスポーラ・サーモローザ(IFO14
047)を、特開平8-1683375号に記載の方法に基づいて培
養し、得られた菌体破砕上清のＰＰＤＫ活性を測定し
た。結果を表１に示す。

【００３１】

【００３２】表１から明らかなように、ＰＰＤＫ遺伝子
を含有する組み換え大腸菌TG1[pPDK35]を用いることに
より、本酵素を効率的に生産することができる。特開平
8-168375号記載の方法に基づいて、大腸菌TG1[pPDK35]
の菌体破砕上清より、本酵素を精製し、その理化学的性
質を調べた。本酵素の理化学的性質は、ＤＮＡ供与体で
あるマイクロバイスポーラ・サーモローザ（IFO14047）
の生産するＰＰＤＫの理化学的性質と全く同様であっ
た。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、ＰＰＤＫ遺伝子が提供さ
れ、また、本酵素を短時間で大量に生産することができ
る。

【００３４】

【配列表】

配列番号１ 配列の数：2634 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：Microbispora thermorosea 株名：IFO 14047 配列： ATG CCG AAG TAC GTT TAC GAC TTC ACC GAG GGG AAC AAG GAC CTC AAA 48 Met Pro Lys Tyr Val Tyr Asp Phe Thr Glu Gly Asn Lys Asp Leu Lys 1 5 10 15 GAT CTG CTC GGT GGC AAG GGT GCC AAT CTG GCG GAA ATG ACC AAC ATC 96 Asp Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Thr Asn Ile 20 25 30 GGC CTT CCG GTG CCT CCC GGC TTC ACG ATC ACG ACC GAG GCC TGC CGC 144 Gly Leu Pro Val Pro Pro Gly Phe Thr Ile Thr Thr Glu Ala Cys Arg 35 40 45 CAC TAT CTC CAG CAC GGT GGC ATG CCC GAT GGG CTG GCG GAG GAG ATT 192 His Tyr Leu Gln His Gly Gly Met Pro Asp Gly Leu Ala Glu Glu Ile 50 55 60 GAC GAG CAC CTT GCC GCC CTC GAG GAG CGG ATG GGC AAG CGC CTG GGC 240 Asp Glu His Leu Ala Ala Leu Glu Glu Arg Met Gly Lys Arg Leu Gly 65 70 75 80 CAG GCG GAC GAC CCG TTG CTG GTC AGT GTG AGG TCG GGA GCC AAG TTC 288 Gln Ala Asp Asp Pro Leu Leu Val Ser Val Arg Ser Gly Ala Lys Phe 85 90 95 TCG ATG CCG GGC ATG ATG GAG ACG GTC CTC AAC ATC GGC CTC AAC GAC 336 Ser Met Pro Gly Met Met Glu Thr Val Leu Asn Ile Gly Leu Asn Asp 100 105 110 GAC TCG GTC GTC GGG CTG GCC AAG CAG TCG GGC AAC GAC CGC TTC GCC 384 Asp Ser Val Val Gly Leu Ala Lys Gln Ser Gly Asn Asp Arg Phe Ala 115 120 125 TGG GAC TCC TAC CGC CGG CTC ATC CAG ATG TTC GGC AAG ACC GTC CTG 432 Trp Asp Ser Tyr Arg Arg Leu Ile Gln Met Phe Gly Lys Thr Val Leu 130 135 140 GGC ATC GAC GGC GAG CTG TTC GAG AAC GCG ATG GAC GAG CTC AAG GGG 480 Gly Ile Asp Gly Glu Leu Phe Glu Asn Ala Met Asp Glu Leu Lys Gly 145 150 155 160 GAG CGG GAC GAC ACC GAC CTC GAG GCC GCC GAC CTC CAG CGG CTG GTG 528 Glu Arg Asp Asp Thr Asp Leu Glu Ala Ala Asp Leu Gln Arg Leu Val 165 170 175 GAC ACC TTC AAG CGC ATC GTC CGC GAC CAG ACC GGA CGC GAC TTC CCC 576 Asp Thr Phe Lys Arg Ile Val Arg Asp Gln Thr Gly Arg Asp Phe Pro 180 185 190 GCC GAC CCC CGG GAG CAG ATG GAC CTG GCC GTC CGC GCG GTC TTC GAC 624 Ala Asp Pro Arg Glu Gln Met Asp Leu Ala Val Arg Ala Val Phe Asp 195 200 205 TCC TGG AAC GCC CCG CGC GCG ATC CTC TAC CGG CGC CAG GAA CGC ATC 672 Ser Trp Asn Ala Pro Arg Ala Ile Leu Tyr Arg Arg Gln Glu Arg Ile 210 215 220 CCC GCC GAC CTC GGC ACC GCC GTC AAC GTC GTC GCC ATG GTG TTC GGC 720 Pro Ala Asp Leu Gly Thr Ala Val Asn Val Val Ala Met Val Phe Gly 225 230 235 240 AAC ATG GGC CCC GAC TCG GGC ACC GGC GTG GCC TTC ACC CGC GAC CCC 768 Asn Met Gly Pro Asp Ser Gly Thr Gly Val Ala Phe Thr Arg Asp Pro 245 250 255 GGC TCG GGA CGC CAG GGC GTC TAC GGC GAC TAC CTG CGC AAC GCC CAG 816 Gly Ser Gly Arg Gln Gly Val Tyr Gly Asp Tyr Leu Arg Asn Ala Gln 260 265 270 GGT GAG GAC GTC GTC GCC GGC ATC CGC AAC ACC ATC CCC CTG CAG GAG 864 Gly Glu Asp Val Val Ala Gly Ile Arg Asn Thr Ile Pro Leu Gln Glu 275 280 285 CTG GAG AGC ATC AAC CCG CAG GCC TAC CGC GAG CTC CTG GAC ATC ATG 912 Leu Glu Ser Ile Asn Pro Gln Ala Tyr Arg Glu Leu Leu Asp Ile Met 290 295 300 GCG ACC CTG GAG CGG CAC TAC CGC GAC CTG TGC GAC ATC GAG TTC ACG 960 Ala Thr Leu Glu Arg His Tyr Arg Asp Leu Cys Asp Ile Glu Phe Thr 305 310 315 320 ATC GAG CGC GGC AAG CTG TGG ATG CTG CAG ACC CGG GTC GGC AAG CGC 1008 Ile Glu Arg Gly Lys Leu Trp Met Leu Gln Thr Arg Val Gly Lys Arg 325 330 335 ACG GCC GAG GCC GCG TTC CGC ATC GCC ACC CAG CTC GTG GAC GAG GGC 1056 Thr Ala Glu Ala Ala Phe Arg Ile Ala Thr Gln Leu Val Asp Glu Gly 340 345 350 CTG ATC GAC ATG GAC GAG GCG GTC GCC CGG GTC ACC GGC GAC CAG CTC 1104 Leu Ile Asp Met Asp Glu Ala Val Ala Arg Val Thr Gly Asp Gln Leu 355 360 365 GCC CAG CTC ATG TTC CCC CGG TTC GCG GCG ACG GCG GAC GCC CGG AGG 1152 Ala Gln Leu Met Phe Pro Arg Phe Ala Ala Thr Ala Asp Ala Arg Arg 370 375 380 CTG ACC ACC GGC ATG AAC GCC TCC CCG GGG GCC GCC GTG GGC AAG GCC 1200 Leu Thr Thr Gly Met Asn Ala Ser Pro Gly Ala Ala Val Gly Lys Ala 385 390 395 400 GTC TTC AGC TCG GAG CGG GCC GTC GAA CTG GCT GGC CAG GGC GAG GCG 1248 Val Phe Ser Ser Glu Arg Ala Val Glu Leu Ala Gly Gln Gly Glu Ala 405 410 415 GTC ATC CTC GTA CGG CGC GAG ACC AAC CCC GAC GAC CTC GCC GGG ATG 1296 Val Ile Leu Val Arg Arg Glu Thr Asn Pro Asp Asp Leu Ala Gly Met 420 425 430 ATC GCC GCC CGG GGC GTG CTC ACC TCC AGG GGC GGC AAG ACC TCC CAC 1344 Ile Ala Ala Arg Gly Val Leu Thr Ser Arg Gly Gly Lys Thr Ser His 435 440 445 GCC GCC GTC GTG GCC CGC GGC ATG GGC AAG ACC TGC GTG TGC GGG GCC 1392 Ala Ala Val Val Ala Arg Gly Met Gly Lys Thr Cys Val Cys Gly Ala 450 455 460 GAG GAA CTG GAA GTG GAC CCG CAC GCC CGC CGC TTC ACC GCG CCC GGC 1440 Glu Glu Leu Glu Val Asp Pro His Ala Arg Arg Phe Thr Ala Pro Gly 465 470 475 480 GGG ATC GTC GTG AAC GAG GGC GAG GTG ATC TCG ATC GAC GGA AGC ACC 1488 Gly Ile Val Val Asn Glu Gly Glu Val Ile Ser Ile Asp Gly Ser Thr 485 490 495 GGG GCC GTG TAC CTC GGC GAG GTC CCG GTC ACC GCC TCG CCG GTC GCC 1536 Gly Ala Val Tyr Leu Gly Glu Val Pro Val Thr Ala Ser Pro Val Ala 500 505 510 AGG TAC TTC GAG GGC GAG CCC GCC GAG GAC GAG CTG GTC CGG GCC GTC 1584 Arg Tyr Phe Glu Gly Glu Pro Ala Glu Asp Glu Leu Val Arg Ala Val 515 520 525 GAC CGG ATC ATG ACC CAC GCC GAC TCC GTG CGC AGG CTC GCC GTA CGG 1632 Asp Arg Ile Met Thr His Ala Asp Ser Val Arg Arg Leu Ala Val Arg 530 535 540 GCC AAC GCC GAC ACG CCC GAG GAC GCC GCC CGC GCC CGC CGC TAC GGC 1680 Ala Asn Ala Asp Thr Pro Glu Asp Ala Ala Arg Ala Arg Arg Tyr Gly 545 550 555 560 GCG CAG GGC ATC GGG CTG TGC CGT ACG GAG CAC ATG TTC CTG GGC GAG 1728 Ala Gln Gly Ile Gly Leu Cys Arg Thr Glu His Met Phe Leu Gly Glu 565 570 575 CGG CGG CGG CTC GTG GAG GAC CTG ATC CTC GCC GCG ACC CCC GAG GAG 1776 Arg Arg Arg Leu Val Glu Asp Leu Ile Leu Ala Ala Thr Pro Glu Glu 580 585 590 CGG CAG GCG GCG CTC GAC GCG CTC GAA CCC CTG CAG ACC GAA GAC TTC 1824 Arg Gln Ala Ala Leu Asp Ala Leu Glu Pro Leu Gln Thr Glu Asp Phe 595 600 605 ACC GGG ATC TTC ACG GCC ATG CGC GGG CTG CCG GTG ACG ATC CGG CTG 1872 Thr Gly Ile Phe Thr Ala Met Arg Gly Leu Pro Val Thr Ile Arg Leu 610 615 620 ATC GAC CCG CCG CTG CAC GAG TTC CTG CCC GAC CTC ACC GAG CTC GCG 1920 Ile Asp Pro Pro Leu His Glu Phe Leu Pro Asp Leu Thr Glu Leu Ala 625 630 635 640 GTC AAG GTG GCC GTC GCG GGG GAG GCG GCG GAC GAC CGC GAC CGC AGG 1968 Val Lys Val Ala Val Ala Gly Glu Ala Ala Asp Asp Arg Asp Arg Arg 645 650 655 CTC CTG GAG GCG GTC AAG CGG CTG CAC GAG CAG AAC CCG ATG CTC GGC 2016 Leu Leu Glu Ala Val Lys Arg Leu His Glu Gln Asn Pro Met Leu Gly 660 665 670 CTG CGC GGC GTA CGG CTC GGC CTG ACG ATC CCC GGC CTG TTC GCC ATG 2064 Leu Arg Gly Val Arg Leu Gly Leu Thr Ile Pro Gly Leu Phe Ala Met 675 680 685 CAG GTG CGG GCC ATC GCC GCG GCG GCG CGG CGG GTG GAG GAC GCC CGC 2112 Gln Val Arg Ala Ile Ala Ala Ala Ala Arg Arg Val Glu Asp Ala Arg 690 695 700 GCG GAG ATC ATG ATC CCG CTG GTC GGC GCG GTG CAG GAG CTG GAG ATC 2160 Ala Glu Ile Met Ile Pro Leu Val Gly Ala Val Gln Glu Leu Glu Ile 705 710 715 720 GTC CGT GAG GAG GCG GAG CGG ATC CTC GCC GAG GCG GGC GTG ACG GCG 2208 Val Arg Glu Glu Ala Glu Arg Ile Leu Ala Glu Ala Gly Val Thr Ala 725 730 735 GCG ATC GGC ACG ATG ATC GAG GTG CCG CGG GCG GCG CTG ACG GCC GGG 2256 Ala Ile Gly Thr Met Ile Glu Val Pro Arg Ala Ala Leu Thr Ala Gly 740 745 750 CAG ATC GCC GAG GCC GCG GAG TTC TTC TCG TTC GGC ACC AAC GAT CTC 2304 Gln Ile Ala Glu Ala Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr Asn Asp Leu 755 760 765 ACC CAG ATG ACC TGG GGG TTC TCC CGG GAC GAC GTG GAG AGC GCC TTC 2352 Thr Gln Met Thr Trp Gly Phe Ser Arg Asp Asp Val Glu Ser Ala Phe 770 775 780 TTC GGC CAG TAC CTC GAC CTG GGC GTC TTC GGC GTC TCG CCG TTT GAG 2400 Phe Gly Gln Tyr Leu Asp Leu Gly Val Phe Gly Val Ser Pro Phe Glu 785 790 795 800 TCC ATC GAC CGG GAG GGC GTC GGC CGG CTG ATG CGG ATC GCG GTC GAG 2448 Ser Ile Asp Arg Glu Gly Val Gly Arg Leu Met Arg Ile Ala Val Glu 805 810 815 GAG GGC AGG CGT GCC CGC CCC GGC CTC AAG CTC GGC ATC TGC GGC GAG 2496 Glu Gly Arg Arg Ala Arg Pro Gly Leu Lys Leu Gly Ile Cys Gly Glu 820 825 830 CAC GGC GGG GAC CCC GAC TCG GTG CGG TTC TGC CAC GAG ATC GGC CTC 2544 His Gly Gly Asp Pro Asp Ser Val Arg Phe Cys His Glu Ile Gly Leu 835 840 845 GAC TAC GTC TCC TGC TCG CCG TTC CGC ATT CCG GTG GCC CGG CTG GAG 2592 Asp Tyr Val Ser Cys Ser Pro Phe Arg Ile Pro Val Ala Arg Leu Glu 850 855 860 GCG GGC CGG GCG GCG CTG ACG TGC GCG GCG TCC GAC ACC CGA 2634 Ala Gly Arg Ala Ala Leu Thr Cys Ala Ala Ser Asp Thr Arg 865 870 875

【００３５】配列番号２ 配列の数：２８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Pro Lys Tyr Val Tyr Asp Phe Thr Glu Gly Asn Lys Asp Leu Lys Asp 5 10 15 Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met 20 25

【００３６】配列番号：３ 配列の数：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： TACGACTTCA CCGAGGGCAA CAAGGAC 27

【００３７】配列番号：４ 配列の数：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GCGGTAGACG ATGGCGCGCG GGTTGTCCCA 30

【００３８】配列番号５ 配列の数： 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質

【００３９】配列番号：６ 配列の数：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： CGGCGAAGGA GCGTCATATG CCGAAGTACG TT 32

【００４０】配列番号：７ 配列の数：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列： GTCCGGGGGA AAACCATATG TCATCGGGTG TCGGA 35

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpPDK30の構築図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長原 歩 千葉県野田市野田339番地 キッコーマン 株式会社内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１で表されるアミノ酸配列、又は
   該アミノ酸配列のうちの１若しくは複数のアミノ酸が付
   加、欠失若しくは置換されたアミノ酸配列を含み、且つ
   ピルベートオルトフォスフェートジキナーゼ活性をもた
   らすポリペプチドをコードするピルベートオルトフォス
   フェートジキナーゼ遺伝子。
2. 【請求項２】請求項１記載のピルベートオルトフォスフ
   ェートジキナーゼ遺伝子がベクターＤＮＡに組み込まれ
   た組み換え体ＤＮＡ。
3. 【請求項３】エッシェリシア属に属し、請求項２記載の
   組み換え体ＤＮＡを含有する微生物を培地に培養し、得
   られる培養物からピルベートオルトフォスフェートジキ
   ナーゼを採取することを特徴とするピルベートオルトフ
   ォスフェートジキナーゼの製造法。