JP2000032988A - 新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞 - Google Patents
新規遺伝子及びその遺伝子を保有する形質転換細胞Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子、当該遺伝子片を含有する組換えベクター、当
該組換えベクターを保有する形質転換体細胞、及び当該
形質転換体細胞の利用。 【効果】 この形質転換体細胞を用いれば、活性の高い
α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミア
ルデヒド デヒドロゲナーゼを多量に製造することがで
き、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の工業的生産が
可能となる。
酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼをコードす
る遺伝子、当該遺伝子片を含有する組換えベクター、当
該組換えベクターを保有する形質転換体細胞、及び当該
形質転換体細胞の利用。 【効果】 この形質転換体細胞を用いれば、活性の高い
α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミア
ルデヒド デヒドロゲナーゼを多量に製造することがで
き、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の工業的生産が
可能となる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はα−ヒドロキシ−γ
−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドを２−ピロ
ン−４，６−ジカルボン酸に変換する酵素であるα−ヒ
ドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒ
ド デヒドロゲナ−ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えベクター及び該遺伝子を保有する形質転換体
細胞、並びに該形質転換体細胞を用いた当該酵素及び２
−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造法に関する。
−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドを２−ピロ
ン−４，６−ジカルボン酸に変換する酵素であるα−ヒ
ドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒ
ド デヒドロゲナ−ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を
含む組換えベクター及び該遺伝子を保有する形質転換体
細胞、並びに該形質転換体細胞を用いた当該酵素及び２
−ピロン−４，６−ジカルボン酸の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼは、α−ヒ
ドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒ
ドを２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する酵素
であり、ポリマーの原料として用いられる２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の生産に重要な役割を果たしてい
る。従って、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を見出
し、該遺伝子にコードされるα−ヒドロキシ−γ−カル
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナー
ゼを量産することは２−ピロン−４，６−ジカルボン酸
の生産に極めて重要である。
酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼは、α−ヒ
ドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒ
ドを２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する酵素
であり、ポリマーの原料として用いられる２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の生産に重要な役割を果たしてい
る。従って、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を見出
し、該遺伝子にコードされるα−ヒドロキシ−γ−カル
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナー
ゼを量産することは２−ピロン−４，６−ジカルボン酸
の生産に極めて重要である。
【０００３】一方、酵素などのタンパク質の量産技術と
して組換えＤＮＡ技術の発展は近年めざましく、数多く
の酵素、生理活性タンパク質等について組換えＤＮＡ技
術を利用した量産化に成功している。しかしながら、α
−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアル
デヒド デヒドロゲナーゼに関しては、該酵素をコード
する遺伝子は分離されていなかった。
して組換えＤＮＡ技術の発展は近年めざましく、数多く
の酵素、生理活性タンパク質等について組換えＤＮＡ技
術を利用した量産化に成功している。しかしながら、α
−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアル
デヒド デヒドロゲナーゼに関しては、該酵素をコード
する遺伝子は分離されていなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、組換
えＤＮＡ技術により、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシ
ムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝
子を分離して、該遺伝子がコードするα−ヒドロキシ−
γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼの活性を増強することにより２−ピロン−４，
６−ジカルボン酸を量産する技術を提供することにあ
る。
えＤＮＡ技術により、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシ
ムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝
子を分離して、該遺伝子がコードするα−ヒドロキシ−
γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロ
ゲナーゼの活性を増強することにより２−ピロン−４，
６−ジカルボン酸を量産する技術を提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは２−ピロン
−４，６−ジカルボン酸の微生物生産について鋭意研究
を行った結果、組換えＤＮＡ技術を利用してα−ヒドロ
キシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドを
２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換するα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼを有する微生物より、α−ヒドロキ
シ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を明らか
にすることに成功した。また、該遺伝子の組換えベクタ
ー及び遺伝子を保有する形質転換体細胞を作製し、当該
酵素及び２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を製造する
方法を見出し、本発明を完成するに至った。
−４，６−ジカルボン酸の微生物生産について鋭意研究
を行った結果、組換えＤＮＡ技術を利用してα−ヒドロ
キシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドを
２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換するα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼを有する微生物より、α−ヒドロキ
シ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デ
ヒドロゲナーゼ遺伝子を単離し、その塩基配列を明らか
にすることに成功した。また、該遺伝子の組換えベクタ
ー及び遺伝子を保有する形質転換体細胞を作製し、当該
酵素及び２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を製造する
方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は配列番号１又は３で示
されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１若しくは
２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有
する組換えベクター及び当該遺伝子を保有する形質転換
体細胞を提供するものである。
されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列の１若しくは
２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミ
ノ酸配列を有し、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子、当該遺伝子を含有
する組換えベクター及び当該遺伝子を保有する形質転換
体細胞を提供するものである。
【０００７】更に本発明は、α−ヒドロキシ−γ−カル
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドの存在下に当該形
質転換体細胞を培養することを特徴とする２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の製造法を提供するものである。
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒドの存在下に当該形
質転換体細胞を培養することを特徴とする２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の製造法を提供するものである。
【０００８】また、本発明は当該形質転換体細胞を培養
し、該培養物からα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とする当該酵素の製造法を提供するもので
ある。
し、該培養物からα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とする当該酵素の製造法を提供するもので
ある。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の遺伝子の分離手段は特に
制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用い
ることができる。該遺伝子は、例えば組換えＤＮＡ技術
を利用して次の如くして製造される。即ち、まずＤＮＡ
供与体としてα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドを２−ピロン−４，６−ジカルボ
ン酸に変換する能力を有する微生物を用い、該微生物か
らゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断しＤ
ＮＡ断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベク
ターＤＮＡを制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が
挿入可能な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮ
Ａ断片と直鎖状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させて、組換えベクターを得る。該組換え
ベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを
保有する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞よ
り目的の組換えベクターを分離することにより製造され
る。
制限されないが、例えば微生物の宿主ベクター系を用い
ることができる。該遺伝子は、例えば組換えＤＮＡ技術
を利用して次の如くして製造される。即ち、まずＤＮＡ
供与体としてα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドを２−ピロン−４，６−ジカルボ
ン酸に変換する能力を有する微生物を用い、該微生物か
らゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素などにより切断しＤ
ＮＡ断片とする。一方、ファージ、プラスミド等のベク
ターＤＮＡを制限酵素等を用いて、ゲノムＤＮＡ断片が
挿入可能な制限酵素末端を作製する。これらゲノムＤＮ
Ａ断片と直鎖状にしたベクターＤＮＡをＤＮＡリガーゼ
を用いて結合させて、組換えベクターを得る。該組換え
ベクターを宿主細胞に移入し、目的の組換えベクターを
保有する形質転換体細胞を選択し、該形質転換体細胞よ
り目的の組換えベクターを分離することにより製造され
る。
【００１０】本発明のＤＮＡ供与体としては、α−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
を２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する能力を
有する微生物であれば特に制限されない。例えば、スフ
ィンゴモナス属の微生物等が挙げられるが、特にスフィ
ンゴモナス エスピーCR-0300100株やその変異株である
スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株(FERM P-1662
4)が好ましい。
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
を２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換する能力を
有する微生物であれば特に制限されない。例えば、スフ
ィンゴモナス属の微生物等が挙げられるが、特にスフィ
ンゴモナス エスピーCR-0300100株やその変異株である
スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株(FERM P-1662
4)が好ましい。
【００１１】該微生物からのゲノムＤＮＡの抽出は、該
微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質
処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アル
コールによるゲノムＤＮＡの沈澱、遠心分離などの方法
を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて
菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質
処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アル
コールによるゲノムＤＮＡの沈澱、遠心分離などの方法
を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
【００１２】分離されたゲノムＤＮＡを断片化するに
は、例えば該ゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行わ
れる。
は、例えば該ゲノムＤＮＡの制限酵素の消化により行わ
れる。
【００１３】ベクターとしては、宿主微生物内で自立的
に増殖し得るファージ又はプラスミドから組換えベクタ
ーを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。
プラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−３、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ＲＳＦ１０１０、ｐＫＴ２３０等が好ま
しい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてＤ
ＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製し、必要に応
じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。
に増殖し得るファージ又はプラスミドから組換えベクタ
ーを目的として構築されたものを用いるのが好ましい。
プラスミドとしては、例えば大腸菌を宿主とするｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｃ１１９、ブルースクリプト、ｐＫＫ２２３−３、ｐＡ
ＣＹＣ１７７、ＲＳＦ１０１０、ｐＫＴ２３０等が好ま
しい。これらのベクターは、例えば制限酵素を用いてＤ
ＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製し、必要に応
じてその末端を脱リン酸処理した後に用いられる。
【００１４】ゲノムＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片の
結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ等を用いて行うのが好ましい。
結合は、公知のＤＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼ等を用いて行うのが好ましい。
【００１５】得られた組換えベクターを移入させる宿主
微生物としては、該組換えベクターが安定にかつ自立的
に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発
現するものであれば良いが、例えば大腸菌やシュードモ
ナス プチダを用いることができる。
微生物としては、該組換えベクターが安定にかつ自立的
に複製可能で、かつ外来性の遺伝子の形質が安定的に発
現するものであれば良いが、例えば大腸菌やシュードモ
ナス プチダを用いることができる。
【００１６】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション
法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法等のいずれの方法も用いること
ができる。
法としては、例えば接合法、エレクトロポレーション
法、コンピテントセル法、マイクロインジェクション
法、パーティクルガン法等のいずれの方法も用いること
ができる。
【００１７】形質転換体の選択は、用いたベクターの選
択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲
得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質
転換体の中から目的の組換えベクターを含有する形質転
換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法
により行うのが好ましい。このプローブの標識として
は、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等の
いずれも用いることができる。
択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲
得する薬剤耐性を指標とすることができる。これら形質
転換体の中から目的の組換えベクターを含有する形質転
換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプ
ローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法
により行うのが好ましい。このプローブの標識として
は、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等の
いずれも用いることができる。
【００１８】このようにして選択された形質転換体細胞
から組換えベクターを抽出するには、常法により抽出す
れば良く、例えばアルカリ溶菌法（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いることができ
る。
から組換えベクターを抽出するには、常法により抽出す
れば良く、例えばアルカリ溶菌法（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎ
ｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９））を用いることができ
る。
【００１９】抽出される組換えベクターは、必要に応じ
て再び組換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができ
る。得られる組換えベクターから、本発明の遺伝子を切
り出すには、制限酵素などを用いることができる。
て再び組換えＤＮＡ技術を利用して組換えることができ
る。得られる組換えベクターから、本発明の遺伝子を切
り出すには、制限酵素などを用いることができる。
【００２０】かくして得られる本発明遺伝子の塩基配列
は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することがで
きる。配列番号２及び４にα−ヒドロキシ−γ−カルボ
キシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１及び３に
当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号
５に後記実施例で分離したＤＮＡ断片の塩基配列及び推
定アミノ酸配列を示す。
は、例えばダイデオキシ法で解読し、決定することがで
きる。配列番号２及び４にα−ヒドロキシ−γ−カルボ
キシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ
をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号１及び３に
当該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、配列番号
５に後記実施例で分離したＤＮＡ断片の塩基配列及び推
定アミノ酸配列を示す。
【００２１】配列番号１は配列番号３の部分アミノ酸配
列である。本発明により生産される酵素は、配列番号３
のアミノ酸配列を有する酵素であっても、配列番号１の
アミノ酸配列を有する酵素であっても同等の酵素活性を
有する。また、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列の
１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
遺伝子であっても、コードするポリペプチドがα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、本発明に包含さ
れる。
列である。本発明により生産される酵素は、配列番号３
のアミノ酸配列を有する酵素であっても、配列番号１の
アミノ酸配列を有する酵素であっても同等の酵素活性を
有する。また、配列番号１又は３記載のアミノ酸配列の
１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加
されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
遺伝子であっても、コードするポリペプチドがα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ活性を有する限り、本発明に包含さ
れる。
【００２２】同様に配列番号２は配列番号４の部分塩基
配列である。そして、また配列番号２又は４記載の塩基
配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付
加された塩基配列であっても、本発明に包含される。
配列である。そして、また配列番号２又は４記載の塩基
配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付
加された塩基配列であっても、本発明に包含される。
【００２３】本発明遺伝子を発現させ、α−ヒドロキシ
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼを生産するには、本発明遺伝子を保有する
形質転換体細胞、例えば上記形質転換体細胞、本発明の
遺伝子を強力なプロモーターを有する発現ベクターに組
み込んだ組換えベクターの形質転換体細胞、本発明の遺
伝子を細胞内でのコピー数の高いベクターに組み込んだ
組換えベクターの形質転換体細胞、又は本発明の遺伝子
を強力なプロモーターを有するコピー数の高い発現ベク
ターに組み込んだ組換えベクターの形質転換体細胞を培
養し、その培養物から採取すればよい。この場合におけ
る培養は、用いる形質転換体細胞の性質に応じて行わ
れ、例えば、pH５〜８、２０〜３７℃で炭素源、窒素
源、ビタミン等を含有する培地で行われる。
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼを生産するには、本発明遺伝子を保有する
形質転換体細胞、例えば上記形質転換体細胞、本発明の
遺伝子を強力なプロモーターを有する発現ベクターに組
み込んだ組換えベクターの形質転換体細胞、本発明の遺
伝子を細胞内でのコピー数の高いベクターに組み込んだ
組換えベクターの形質転換体細胞、又は本発明の遺伝子
を強力なプロモーターを有するコピー数の高い発現ベク
ターに組み込んだ組換えベクターの形質転換体細胞を培
養し、その培養物から採取すればよい。この場合におけ
る培養は、用いる形質転換体細胞の性質に応じて行わ
れ、例えば、pH５〜８、２０〜３７℃で炭素源、窒素
源、ビタミン等を含有する培地で行われる。
【００２４】また、本願形質転換体細胞を培養すれば、
α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミア
ルデヒド デヒドロゲナーゼが高発現するので、当該形
質転換体細胞をα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒドの存在下に培養すれば、２−ピ
ロン−４，６−ジカルボン酸が効率良く生産できる。こ
こで、酵素の基質であるα−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒドは、培地中に添加して
もよいが、形質転換体細胞が例えば３，４−ジヒドロキ
シ安息香酸をα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドに変換する酵素も産生する場合に
は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸を培地中に添加すれ
ば、培養によりα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒドが生成し、次いで２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸が生成する。当該２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の生産の条件は、用いる形質転換
体細胞の性質に応じて行われる。
α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミア
ルデヒド デヒドロゲナーゼが高発現するので、当該形
質転換体細胞をα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒドの存在下に培養すれば、２−ピ
ロン−４，６−ジカルボン酸が効率良く生産できる。こ
こで、酵素の基質であるα−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒドは、培地中に添加して
もよいが、形質転換体細胞が例えば３，４−ジヒドロキ
シ安息香酸をα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸
−ε−セミアルデヒドに変換する酵素も産生する場合に
は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸を培地中に添加すれ
ば、培養によりα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒドが生成し、次いで２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸が生成する。当該２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の生産の条件は、用いる形質転換
体細胞の性質に応じて行われる。
【００２５】また、培養物からの２−ピロン−３，４−
ジカルボン酸の採取は、例えば有機溶媒による抽出等に
より行われる。
ジカルボン酸の採取は、例えば有機溶媒による抽出等に
より行われる。
【００２６】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではな
い。
【００２７】参考例１ （１）２１mm試験管に０．２％のシリンガ酸を含む表１
の組成の培地を１０ml調製し、土壌サンプルを０．５ｇ
ずつ入れ、３０℃で３日間培養した。
の組成の培地を１０ml調製し、土壌サンプルを０．５ｇ
ずつ入れ、３０℃で３日間培養した。
【００２８】
【表１】
【００２９】（２）次に、上記を約５分間静置し、僅か
に濁った上清０．１mlを（１）と同じ組成の新しい試験
管に植え継ぎ、３０℃で３日間培養した。 （３）上記操作を１〜２回繰り返し、最後の上清を滅菌
した蒸留水に適当に希釈し、０．２％のシリンガ酸を含
む表１の組成の寒天培地に展開し、３０℃で３日間培養
し、コロニーを形成させた。 （４）上記コロニーを０．２％のバニリン酸を含む表１
の組成の寒天培地に爪楊枝を用いて接種して、生育して
くる菌株を得た。 （５）バニリン酸で生育した菌株を再び、０．２％のシ
リンガ酸を含む表１の組成の培地を１０mlに植菌して、
３０℃で３日間培養した。培養液を滅菌した蒸留水に適
当に希釈し、ＬＢ寒天培地に展開し、３０℃で１日間培
養し、コロニーを形成させた。 （６）生じたコロニーを同じコロニーについて、０．２
％のバニリン酸及びシリンガ酸を含む表１の組成の２種
の寒天培地に爪楊枝を用いて接種して、生育してくる菌
株を得た。 （７）バニリン酸及びシリンガ酸を含む２種の寒天培地
でともに生育可能な菌株１株を得た。本菌株をＣＲ−０
３００１００とし、菌学的性質を調べたところ、以下の
通りであった。
に濁った上清０．１mlを（１）と同じ組成の新しい試験
管に植え継ぎ、３０℃で３日間培養した。 （３）上記操作を１〜２回繰り返し、最後の上清を滅菌
した蒸留水に適当に希釈し、０．２％のシリンガ酸を含
む表１の組成の寒天培地に展開し、３０℃で３日間培養
し、コロニーを形成させた。 （４）上記コロニーを０．２％のバニリン酸を含む表１
の組成の寒天培地に爪楊枝を用いて接種して、生育して
くる菌株を得た。 （５）バニリン酸で生育した菌株を再び、０．２％のシ
リンガ酸を含む表１の組成の培地を１０mlに植菌して、
３０℃で３日間培養した。培養液を滅菌した蒸留水に適
当に希釈し、ＬＢ寒天培地に展開し、３０℃で１日間培
養し、コロニーを形成させた。 （６）生じたコロニーを同じコロニーについて、０．２
％のバニリン酸及びシリンガ酸を含む表１の組成の２種
の寒天培地に爪楊枝を用いて接種して、生育してくる菌
株を得た。 （７）バニリン酸及びシリンガ酸を含む２種の寒天培地
でともに生育可能な菌株１株を得た。本菌株をＣＲ−０
３００１００とし、菌学的性質を調べたところ、以下の
通りであった。
【００３０】 ａ、形態的特徴 ・細胞の大きさ形 ０．５×１．１〜１．３μｍ 桿菌 ・胞子の有無 なし ・鞭毛 極鞭毛 ・運動性 ＋
【００３１】ｂ、寒天培地における生育状況 ・表１の培地において 円形のコロニー、光沢があ
り、黄色
り、黄色
【００３２】 ｃ、生理学的性質 ・グラム染色性 − ・硝酸塩の還元 − ・ゼラチン溶解性 ＋弱い ・Ｏ−Ｆテスト Ｏ；＋，Ｆ；− ・生育の範囲 pH５．０から７．５、１０℃から４０℃ ・炭素源の利用性 グルコース ＋ シュークロース ＋ ラクトース − グリセロール − スターチ − バニリン ＋ バニリン酸 ＋ シリンガアルデヒド ＋ シリンガ酸 ＋ ・シトクロームオキシダーゼ ＋ ・カタラーゼ ＋
【００３３】 ｄ、化学分類学的性質 ・ＤＮＡのＧ／Ｃ含量（モル％） ６８ ・キノンタイプ Ｑ−１０ ・色素 ＋（疎水性yellow pigment） ・細胞壁脂質 スフィンゴ脂質 ｅ、その他の特性 ・３，４−ジヒドロキシ安息香酸酸化酵素 メタ開裂
【００３４】上記の性質から、ＣＲ−０３００１００株
はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属と同定した。
はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属と同定した。
【００３５】参考例２ （１）参考例１で得られたスフィンゴモナス エスピ
ー．ＣＲ−０３００１００を１００mlのＬＢ培地（トリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、
グルコース１ｇ／Ｌ）を用いて３０℃で２４時間振とう
培養した。遠心にて菌体集菌後、Ｍａｒｍｕｒの方法
（Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．１９６１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２０８−２１８）で全ＤＮＡを抽出し、常法に
より精製した。 （２）（１）で得たスフィンゴモナス エスピー ＣＲ
−０３００１００全ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐ
ｈＩで完全分解し、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｐｈＩで完
全に消化したベクタープラスミドｐＵＣ１９と混合しＴ
４ＤＮＡリガーゼで処理して、ハイブリッドプラスミド
を形成させた。 （３）（２）で得たハイブリッドプラスミドを大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に形質転換し、１００mg／Ｌのアンピシリン
を含むＬＢ培地に、プレート１枚あたり２００〜３００
コロニーが出現するように塗布し、３７℃で１８時間培
養した。 （４）上記で得られたコロニーを１００mg／Ｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培地に、プレート１枚あたり９６個ず
つ継代し、これをマスタープレートとした。この操作で
合計２０００株のコロニーを得た。それぞれを１００mg
／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を０．２ml調製した
９６穴マイクロプレートに植菌した。３７℃でマイクロ
プレートシェーカーを用いて振とう培養した。 （５）１８時間培養後、それぞれのウェルに最終濃度が
５０μｇ／mlとなるようにリゾチームを添加して、３７
℃で２時間インキュベートした。次に３，４−ジヒドロ
キシ安息香酸の２０mM溶液を各ウェルに２μｌずつ添加
し、３０℃で５分間インキュベートした。 （６）上記の処理を行った各ウェルに２Ｍの水酸化ナト
リウムを１０μｌずつ添加したところ、２０００株中１
株において黄色の発色が見られた。 （７）黄色の発色のあった株からプラスミドを抽出し、
いくつかの制限酵素について切断パターンを調べ、この
プラスミドをｐＰＸ１５０と名付けた。
ー．ＣＲ−０３００１００を１００mlのＬＢ培地（トリ
プトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、
グルコース１ｇ／Ｌ）を用いて３０℃で２４時間振とう
培養した。遠心にて菌体集菌後、Ｍａｒｍｕｒの方法
（Ｍａｒｍｕｒ，Ｊ．１９６１．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３：２０８−２１８）で全ＤＮＡを抽出し、常法に
より精製した。 （２）（１）で得たスフィンゴモナス エスピー ＣＲ
−０３００１００全ＤＮＡを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳｐ
ｈＩで完全分解し、制限酵素ＳａｌＩ及びＳｐｈＩで完
全に消化したベクタープラスミドｐＵＣ１９と混合しＴ
４ＤＮＡリガーゼで処理して、ハイブリッドプラスミド
を形成させた。 （３）（２）で得たハイブリッドプラスミドを大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株に形質転換し、１００mg／Ｌのアンピシリン
を含むＬＢ培地に、プレート１枚あたり２００〜３００
コロニーが出現するように塗布し、３７℃で１８時間培
養した。 （４）上記で得られたコロニーを１００mg／Ｌのアンピ
シリンを含むＬＢ培地に、プレート１枚あたり９６個ず
つ継代し、これをマスタープレートとした。この操作で
合計２０００株のコロニーを得た。それぞれを１００mg
／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を０．２ml調製した
９６穴マイクロプレートに植菌した。３７℃でマイクロ
プレートシェーカーを用いて振とう培養した。 （５）１８時間培養後、それぞれのウェルに最終濃度が
５０μｇ／mlとなるようにリゾチームを添加して、３７
℃で２時間インキュベートした。次に３，４−ジヒドロ
キシ安息香酸の２０mM溶液を各ウェルに２μｌずつ添加
し、３０℃で５分間インキュベートした。 （６）上記の処理を行った各ウェルに２Ｍの水酸化ナト
リウムを１０μｌずつ添加したところ、２０００株中１
株において黄色の発色が見られた。 （７）黄色の発色のあった株からプラスミドを抽出し、
いくつかの制限酵素について切断パターンを調べ、この
プラスミドをｐＰＸ１５０と名付けた。
【００３６】参考例３ （１）ｐＰＸ１５０を制限酵素ＡｐａＩで切断し、セル
フライゲーションしたプラスミドｐＰＸ１５１を作成し
た。このプラスミドで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株
及びｐＰＸ１５０で形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株を
１００mg／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１０mlで１
８時間培養し、集菌した。菌体を５０mMのリン酸緩衝液
１mlに懸濁し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。
これを５０００ｇで２０分間遠心して得られた上清２０
μｌを０．２mMの３，４−ジヒドロキシ安息香酸を含む
リン酸緩衝液１mlに添加した。５分間、３０℃でインキ
ュベーションした後に、２Ｍの水酸化ナトリウムを０．
１ml添加したところ、ｐＰＸ１５０で形質転換した大腸
菌ＨＢ１０１株では黄色の発色が見られたが、ｐＰＸ１
５１で形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株では黄色の発色
が見られなかった。 （２）プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア バイオテ
ク社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｂｌｕｎｔｉｎ
ｇ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて平滑化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動によって分離した。 （３）１．３ｋｂｐの断片を上記ゲルから切り出し、フ
ェノール抽出を３度行い、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を精製した。 （４）ｐＰＸ１５１を制限酵素ＡｐａＩで切断し、ｂｌ
ｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて平滑化し
た。これと上記（３）で得られたＤＮＡを混合してｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて連結反応を
行い、大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換した。形質転換し
た大腸菌ＨＢ１０１株は、カナマイシンとアンピシリン
に対して耐性な菌株を選抜し、その株の保有するプラス
ミドとしてｐＰＸ１５２を得た。
フライゲーションしたプラスミドｐＰＸ１５１を作成し
た。このプラスミドで形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株
及びｐＰＸ１５０で形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株を
１００mg／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地１０mlで１
８時間培養し、集菌した。菌体を５０mMのリン酸緩衝液
１mlに懸濁し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕した。
これを５０００ｇで２０分間遠心して得られた上清２０
μｌを０．２mMの３，４−ジヒドロキシ安息香酸を含む
リン酸緩衝液１mlに添加した。５分間、３０℃でインキ
ュベーションした後に、２Ｍの水酸化ナトリウムを０．
１ml添加したところ、ｐＰＸ１５０で形質転換した大腸
菌ＨＢ１０１株では黄色の発色が見られたが、ｐＰＸ１
５１で形質転換した大腸菌ＨＢ１０１株では黄色の発色
が見られなかった。 （２）プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア バイオテ
ク社）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、ｂｌｕｎｔｉｎ
ｇ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて平滑化し、１％アガロ
ースゲル電気泳動によって分離した。 （３）１．３ｋｂｐの断片を上記ゲルから切り出し、フ
ェノール抽出を３度行い、エタノール沈殿によりＤＮＡ
を精製した。 （４）ｐＰＸ１５１を制限酵素ＡｐａＩで切断し、ｂｌ
ｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて平滑化し
た。これと上記（３）で得られたＤＮＡを混合してｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（宝酒造社）を用いて連結反応を
行い、大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換した。形質転換し
た大腸菌ＨＢ１０１株は、カナマイシンとアンピシリン
に対して耐性な菌株を選抜し、その株の保有するプラス
ミドとしてｐＰＸ１５２を得た。
【００３７】参考例４ （１）前実験で得られたプラスミドｐＰＸ１５２を制限
酵素ＸｂａＩで消化し、１％アガロース電気泳動にて分
離し、２．３ｋｂｐの断片を切り出した。次に凍結融解
法によりＤＮＡを抽出し、十分にフェノール抽出を行い
エタノール沈殿により精製した。 （２）スフィンゴモナス エスピー ＣＲ−０３００１
００株をＬＢ液体培地（ナリジキシン酸２５mg／Ｌを含
む）５００mlで２８℃、２３時間培養し氷中で１５分冷
却した。 （３）４℃、１０分、１００００rpm で遠心集菌し、５
００mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄後再び、遠心集菌し
た。続いて２５０mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄後、遠心
集菌した。更に、１２５mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄
後、遠心集菌した。 （４）上記の菌体を１０％グリセロールを含む蒸留水に
懸濁し０℃にて保持した。 （５）（１）のＤＮＡ約０．０５μｇを含む蒸留水４μ
ｌを０．２cmのキュベットに入れ、（４）のコンピテン
トセル４０μｌを加え、（２５μＦ、２５００Ｖ、１２
msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。 （６）上記処理した細胞全量を１０mlのＬＢ液体培地に
接種し、３０℃で６時間培養した。培養後、遠心によっ
て菌体を集め２５mg／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板
に展開し、３０℃で４８時間培養した。 （７）上記の条件で非常に強いカナマイシン耐性株、１
株を得た。本菌株をスフィンゴモナス エスピー ＣＲ
−０３１０２０１株と名付けた。 （８）スフィンゴモナス エスピー ＣＲ−０３１０２
０１株及びＣＲ−０３００１００株をＬＢ培地１０mlで
２４時間培養し、集菌した。菌体を５０mMのリン酸緩衝
液１mlに懸濁し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕し
た。これを５０００ｇで２０分間遠心して得られた上清
１００μｌを０．２mMの３，４−ジヒドロキシ安息香酸
を含むリン酸緩衝液１mlに添加した。５分間、３０℃で
インキュベーションした後に、２Ｍの水酸化ナトリウム
を０．１ml添加したところ、ＣＲ−０３００１００株で
は黄色の発色が見られたが、ＣＲ−０３１０２０１株で
は黄色の発色が全く見られなかった。ＣＲ−０３１０２
０１株は上述の性質及びカナマイシンに耐性及びバリニ
ン酸の資化性が欠損したことを除きＣＲ−０３００１０
０株と全く同一の菌学的性質を示した。本菌株は、工業
技術院生命工学工業研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６６２４
として寄託した。
酵素ＸｂａＩで消化し、１％アガロース電気泳動にて分
離し、２．３ｋｂｐの断片を切り出した。次に凍結融解
法によりＤＮＡを抽出し、十分にフェノール抽出を行い
エタノール沈殿により精製した。 （２）スフィンゴモナス エスピー ＣＲ−０３００１
００株をＬＢ液体培地（ナリジキシン酸２５mg／Ｌを含
む）５００mlで２８℃、２３時間培養し氷中で１５分冷
却した。 （３）４℃、１０分、１００００rpm で遠心集菌し、５
００mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄後再び、遠心集菌し
た。続いて２５０mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄後、遠心
集菌した。更に、１２５mlの０℃蒸留水で穏和に洗浄
後、遠心集菌した。 （４）上記の菌体を１０％グリセロールを含む蒸留水に
懸濁し０℃にて保持した。 （５）（１）のＤＮＡ約０．０５μｇを含む蒸留水４μ
ｌを０．２cmのキュベットに入れ、（４）のコンピテン
トセル４０μｌを加え、（２５μＦ、２５００Ｖ、１２
msec）の条件でエレクトロポレーションにかけた。 （６）上記処理した細胞全量を１０mlのＬＢ液体培地に
接種し、３０℃で６時間培養した。培養後、遠心によっ
て菌体を集め２５mg／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板
に展開し、３０℃で４８時間培養した。 （７）上記の条件で非常に強いカナマイシン耐性株、１
株を得た。本菌株をスフィンゴモナス エスピー ＣＲ
−０３１０２０１株と名付けた。 （８）スフィンゴモナス エスピー ＣＲ−０３１０２
０１株及びＣＲ−０３００１００株をＬＢ培地１０mlで
２４時間培養し、集菌した。菌体を５０mMのリン酸緩衝
液１mlに懸濁し、超音波破砕機を用いて細胞を破砕し
た。これを５０００ｇで２０分間遠心して得られた上清
１００μｌを０．２mMの３，４−ジヒドロキシ安息香酸
を含むリン酸緩衝液１mlに添加した。５分間、３０℃で
インキュベーションした後に、２Ｍの水酸化ナトリウム
を０．１ml添加したところ、ＣＲ−０３００１００株で
は黄色の発色が見られたが、ＣＲ−０３１０２０１株で
は黄色の発色が全く見られなかった。ＣＲ−０３１０２
０１株は上述の性質及びカナマイシンに耐性及びバリニ
ン酸の資化性が欠損したことを除きＣＲ−０３００１０
０株と全く同一の菌学的性質を示した。本菌株は、工業
技術院生命工学工業研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６６２４
として寄託した。
【００３８】実施例１（α−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼの
アミノ酸配列解析） ＬＢ液体培地でスフィンゴモナス エスピーCR-0310201
株を、３０℃にて２４時間、好気的条件下で培養し、遠
心分離にて集菌した。この集菌した菌株について１５０
Ｗ、１０分間の超音波破砕機による細胞破砕処理を行っ
た後、１００，０００ｇにて３０分間の遠心分離を行っ
た。
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼの
アミノ酸配列解析） ＬＢ液体培地でスフィンゴモナス エスピーCR-0310201
株を、３０℃にて２４時間、好気的条件下で培養し、遠
心分離にて集菌した。この集菌した菌株について１５０
Ｗ、１０分間の超音波破砕機による細胞破砕処理を行っ
た後、１００，０００ｇにて３０分間の遠心分離を行っ
た。
【００３９】その上清を硫安分画し、硫安濃度３０〜７
０重量％の分画を回収して、弱アニオンイオン交換クロ
マトグラフィー（パーセプティブ社、ＰＩ（ポリエチル
イミン）カラム）、強アニオン交換クロマトグラフィー
（パーセプティブ社、ＨＱ（第４級ポリエチルイミン）
から疎水クロマトグラフィー（ファルマシア社、Ｐｈｅ
ｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）及び吸着ク
ロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）に
よる酵素精製を行った。α−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活
性のある分画を回収した。カラム精製を行った該精製物
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果単一バンドであることを確
認し、単一に精製したことを確認した。
０重量％の分画を回収して、弱アニオンイオン交換クロ
マトグラフィー（パーセプティブ社、ＰＩ（ポリエチル
イミン）カラム）、強アニオン交換クロマトグラフィー
（パーセプティブ社、ＨＱ（第４級ポリエチルイミン）
から疎水クロマトグラフィー（ファルマシア社、Ｐｈｅ
ｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ）及び吸着ク
ロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ）に
よる酵素精製を行った。α−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活
性のある分画を回収した。カラム精製を行った該精製物
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果単一バンドであることを確
認し、単一に精製したことを確認した。
【００４０】この単離したα−ヒドロキシ−γ−カルボ
キシムコン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの
部分的なアミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（アプ
ライドバイオシステムズ社）により解析した。この決定
した該酵素の部分的なアミノ酸配列を配列番号６、７に
示す。
キシムコン酸−ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼの
部分的なアミノ酸配列をアミノ酸シークエンサー（アプ
ライドバイオシステムズ社）により解析した。この決定
した該酵素の部分的なアミノ酸配列を配列番号６、７に
示す。
【００４１】尚、α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性は以
下のように求めた。
ン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性は以
下のように求めた。
【００４２】（１）２ｇ／Ｌのパラヒドロキシ安息香酸
を含む表１の培地でシュードモナステストステロニ Ｊ
ＭＣ５８３２株を暗所３０℃で２４時間振とう培養し
た。 （２）菌体を遠心分離にて集め、pH７．５のリン酸カリ
ウム緩衝液に懸濁し１５０Ｗ、１０分間の超音波破砕機
による細胞破砕処理を行った後、１０，０００ｇにて３
０分間の遠心分離を行った。 （３）上記のようにして得た上清に等量のエタノールを
加え、１０，０００ｇにて１０分間遠心し、得られた上
清にエタノール濃度が７０％（ｖ／ｖ）となるように加
え、更に１０，０００ｇにて１０分間遠心した。 （４）上記で得られた沈殿を１０％のエタノールを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）で溶解し、１
０％のエタノールを含む２００mMリン酸カリウム緩衝液
（pH７．５）を用いてＤＥＡＥ−セルロースカラムにて
３，４−ジヒドロキシ安息香酸のメタ開裂酵素画分を得
た。 （５）以上のようにして得られた３，４−ジヒドロキシ
安息香酸のメタ開裂酵素溶液を０．２mMの３，４−ジヒ
ドロキシ安息香酸を含む５０mM−Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（pH８．１）０．９mlに５０μｌを加え、３７℃インキ
ュベートし、４１０nmの吸光度を分光光度計（島津、Ｕ
Ｖ−２１００）でモニターした。吸光度が一定になった
ところにα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε
−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素液５０μｌ（蛋
白質量で１mg）を添加した。この操作で吸光度が変化し
ないことを確認し、２０μｌのＮＡＤＰ（１００mM溶
液）を添加して４１０nmの吸光度減少を１００秒間モニ
ターした。以上の操作によるＮＡＤＰ依存性のα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
減少量からα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−
ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を求めた。
を含む表１の培地でシュードモナステストステロニ Ｊ
ＭＣ５８３２株を暗所３０℃で２４時間振とう培養し
た。 （２）菌体を遠心分離にて集め、pH７．５のリン酸カリ
ウム緩衝液に懸濁し１５０Ｗ、１０分間の超音波破砕機
による細胞破砕処理を行った後、１０，０００ｇにて３
０分間の遠心分離を行った。 （３）上記のようにして得た上清に等量のエタノールを
加え、１０，０００ｇにて１０分間遠心し、得られた上
清にエタノール濃度が７０％（ｖ／ｖ）となるように加
え、更に１０，０００ｇにて１０分間遠心した。 （４）上記で得られた沈殿を１０％のエタノールを含む
５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）で溶解し、１
０％のエタノールを含む２００mMリン酸カリウム緩衝液
（pH７．５）を用いてＤＥＡＥ−セルロースカラムにて
３，４−ジヒドロキシ安息香酸のメタ開裂酵素画分を得
た。 （５）以上のようにして得られた３，４−ジヒドロキシ
安息香酸のメタ開裂酵素溶液を０．２mMの３，４−ジヒ
ドロキシ安息香酸を含む５０mM−Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液
（pH８．１）０．９mlに５０μｌを加え、３７℃インキ
ュベートし、４１０nmの吸光度を分光光度計（島津、Ｕ
Ｖ−２１００）でモニターした。吸光度が一定になった
ところにα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε
−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素液５０μｌ（蛋
白質量で１mg）を添加した。この操作で吸光度が変化し
ないことを確認し、２０μｌのＮＡＤＰ（１００mM溶
液）を添加して４１０nmの吸光度減少を１００秒間モニ
ターした。以上の操作によるＮＡＤＰ依存性のα−ヒド
ロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
減少量からα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−
ε−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を求めた。
【００４３】実施例２ α−ヒドロキシ−γ−カルボキ
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子のクローニング （１）遺伝子ライブラリーの調製 スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株を５ｇ／Ｌの
グルコースを含むＬＢ培地（トリプトン；１０ｇ／Ｌ、
酵母エキス；５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、pH７．
０）へ接種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製し
た。この前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と
同様の培地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培
養液の遠心により集菌した。該菌体をＴＥ（１０mMトリ
ス塩酸、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）に懸濁した後、最
終濃度０．５％ ＳＤＳ及び最終濃度１００μｇ／mlプ
ロテアーゼＫにて３７℃、１時間処理し、１／６容の５
Ｍ食塩を混合した。次いで、１０％ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘ
ａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂ
ｒｏｍｉｄｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６
５℃で１０分間静置した。等量のクロロホルム−イソア
ミルアルコール液にて抽出し、得られた水層を等量のフ
ェノール−クロロホルム液にて抽出を行った。この水層
に含まれるゲノムＤＮＡをエタノール沈殿にて取得し、
減圧乾燥の後ＴＥを加え溶解した。
シムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼを
コードする遺伝子のクローニング （１）遺伝子ライブラリーの調製 スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株を５ｇ／Ｌの
グルコースを含むＬＢ培地（トリプトン；１０ｇ／Ｌ、
酵母エキス；５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ；５ｇ／Ｌ、pH７．
０）へ接種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製し
た。この前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と
同様の培地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培
養液の遠心により集菌した。該菌体をＴＥ（１０mMトリ
ス塩酸、１mM ＥＤＴＡ、pH８．０）に懸濁した後、最
終濃度０．５％ ＳＤＳ及び最終濃度１００μｇ／mlプ
ロテアーゼＫにて３７℃、１時間処理し、１／６容の５
Ｍ食塩を混合した。次いで、１０％ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘ
ａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂ
ｒｏｍｉｄｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６
５℃で１０分間静置した。等量のクロロホルム−イソア
ミルアルコール液にて抽出し、得られた水層を等量のフ
ェノール−クロロホルム液にて抽出を行った。この水層
に含まれるゲノムＤＮＡをエタノール沈殿にて取得し、
減圧乾燥の後ＴＥを加え溶解した。
【００４４】該ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝
酒造社）により部分消化し、１％アガロースゲル（和光
純薬工業社、アガロース１６００）にて電気泳動した。
緩衝液としてＴＡＥ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ（１９８９））を用いた。電気泳動後のアガロ
ースゲルは１μｇ／mlエチジウムブロマイドに１５分間
浸せきした後水洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍
光を確認した。サイズマーカーとしてλファージＤＮＡ
のＥｃｏＲI、ＨｉｎｄIII消化物（宝酒造社）を同時に
電気泳動し、該ＤＮＡ断片の泳動距離からゲノムＤＮＡ
消化物の分子量を求めた。
酒造社）により部分消化し、１％アガロースゲル（和光
純薬工業社、アガロース１６００）にて電気泳動した。
緩衝液としてＴＡＥ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ（１９８９））を用いた。電気泳動後のアガロ
ースゲルは１μｇ／mlエチジウムブロマイドに１５分間
浸せきした後水洗し、紫外線照射によりＤＮＡ断片の蛍
光を確認した。サイズマーカーとしてλファージＤＮＡ
のＥｃｏＲI、ＨｉｎｄIII消化物（宝酒造社）を同時に
電気泳動し、該ＤＮＡ断片の泳動距離からゲノムＤＮＡ
消化物の分子量を求めた。
【００４５】１−３ｋｂｐのゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ
部分消化物を含むアガロースゲルを切り出し、セシウム
クロライドを用いた超遠心法にてＤＮＡ断片の精製を行
った。プラスミドベクターｐＵＣ１９ を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（宝酒造社）により完全消化した。同反応液にア
ルカリホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａ
ｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造社）を添
加し、制限酵素にて消化したプラスミドベクターの末端
の脱リン酸化を行った。
部分消化物を含むアガロースゲルを切り出し、セシウム
クロライドを用いた超遠心法にてＤＮＡ断片の精製を行
った。プラスミドベクターｐＵＣ１９ を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ（宝酒造社）により完全消化した。同反応液にア
ルカリホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａ
ｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（宝酒造社）を添
加し、制限酵素にて消化したプラスミドベクターの末端
の脱リン酸化を行った。
【００４６】上記反応液に１／１０倍容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムpH５．２と２倍容量のエタノールを添加し−８
０℃にて２時間冷却し、９，０００ｇにて１０分間遠心
し、ベクターＤＮＡのペレットを得た。７０％エタノー
ルを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、このリンス
液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥したベクター
ＤＮＡをＴＥに溶解した。
トリウムpH５．２と２倍容量のエタノールを添加し−８
０℃にて２時間冷却し、９，０００ｇにて１０分間遠心
し、ベクターＤＮＡのペレットを得た。７０％エタノー
ルを適量加え遠心管の壁面を２回リンスし、このリンス
液を簡単に除去した後減圧乾燥した。乾燥したベクター
ＤＮＡをＴＥに溶解した。
【００４７】前記スフィンゴモナス エスピーCR-03102
01株の１−３ｋｂｐのＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ
を、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社）を用いて結合した。
01株の１−３ｋｂｐのＤＮＡ断片及びベクターＤＮＡ
を、Ｔ４リガーゼ（宝酒造社）を用いて結合した。
【００４８】大腸菌ＨＢ１０１のコンピテントセルを１
００mMの塩化カルシウムを用いて調製し、上記Ｔ４リガ
ーゼ反応液で形質転換した。該大腸菌は最終濃度が１０
０μｇ／mlになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平
板培地（ＬＢに寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）に
塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニー
を、大腸菌ＨＢ１０１を宿主としたスフィンゴモナス
エスピーCR-0310201株の遺伝子ライブラリーとした。
００mMの塩化カルシウムを用いて調製し、上記Ｔ４リガ
ーゼ反応液で形質転換した。該大腸菌は最終濃度が１０
０μｇ／mlになるようにアンピシリンを添加したＬＢ平
板培地（ＬＢに寒天１５ｇ／ｌを添加して調製する）に
塗布し、３７℃にて終夜培養した。出現したコロニー
を、大腸菌ＨＢ１０１を宿主としたスフィンゴモナス
エスピーCR-0310201株の遺伝子ライブラリーとした。
【００４９】（２）α−ヒドロキシ−γ−カルボキシム
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子プローブの作製 スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株を試験管内の
培地（ポリペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス０．５ｇ／
ｌ、肉エキス５ｇ／ｌ、食塩２ｇ／ｌ、pH７．０）へ接
種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製した。この
前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と同様の培
地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培養液の遠
心により集菌した。
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼをコー
ドする遺伝子プローブの作製 スフィンゴモナス エスピーCR-0310201株を試験管内の
培地（ポリペプトン５ｇ／ｌ、酵母エキス０．５ｇ／
ｌ、肉エキス５ｇ／ｌ、食塩２ｇ／ｌ、pH７．０）へ接
種し２８℃にて終夜培養し、前培養液を作製した。この
前培養液をフラスコ内の新しく用意した前記と同様の培
地に接種し２８℃にて再び終夜培養した。該培養液の遠
心により集菌した。
【００５０】該菌体をＴＥ（１０mMトリス塩酸、１mM
ＥＤＴＡ、pH８．０）に懸濁した後、最終濃度０．５％
ＳＤＳ及び最終濃度１００μｇ／mlプロテアーゼＫに
て３７℃、１時間処理し、１／６容の５Ｍ食塩を混合し
た。次いで、１０％ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６５℃で１０
分間静置した。等量のクロロホルム−イソアミルアルコ
ール液にて抽出し、得られた水層を等量のフェノール−
クロロホルム液にて抽出を行った。この水層に含まれる
ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿にて取得し、減圧乾燥の
後ＴＥを加え溶解した。
ＥＤＴＡ、pH８．０）に懸濁した後、最終濃度０．５％
ＳＤＳ及び最終濃度１００μｇ／mlプロテアーゼＫに
て３７℃、１時間処理し、１／６容の５Ｍ食塩を混合し
た。次いで、１０％ ＣＴＡＢ（Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔ
ｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄ
ｅ）、０．７Ｍ食塩を１／１０容量加え、６５℃で１０
分間静置した。等量のクロロホルム−イソアミルアルコ
ール液にて抽出し、得られた水層を等量のフェノール−
クロロホルム液にて抽出を行った。この水層に含まれる
ゲノムＤＮＡをエタノール沈殿にて取得し、減圧乾燥の
後ＴＥを加え溶解した。
【００５１】配列番号６、７に示すα−ヒドロキシ−γ
−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子の部分的なアミノ酸配列を
用いて、このアミノ酸配列をコードするα−ヒドロキシ
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の部分的な塩基配列を逆翻訳した。
これら知見から、該遺伝子をＰＣＲにより部分的に増幅
することを目的として、配列番号８及び配列番号９に示
す塩基配列を有する合成ヌクレオチドを化学合成により
作製し、１対のＰＣＲプライマーとした。スフィンゴモ
ナス エスピーCR-0310201株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮ
Ａとして、該プライマーによりα−ヒドロキシ−γ−カ
ルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し
た。
−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロ
ゲナーゼをコードする遺伝子の部分的なアミノ酸配列を
用いて、このアミノ酸配列をコードするα−ヒドロキシ
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の部分的な塩基配列を逆翻訳した。
これら知見から、該遺伝子をＰＣＲにより部分的に増幅
することを目的として、配列番号８及び配列番号９に示
す塩基配列を有する合成ヌクレオチドを化学合成により
作製し、１対のＰＣＲプライマーとした。スフィンゴモ
ナス エスピーCR-0310201株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮ
Ａとして、該プライマーによりα−ヒドロキシ−γ−カ
ルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナ
ーゼ遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をＰＣＲにて増幅し
た。
【００５２】尚、このＰＣＲは次の如くして行った。ま
ず、１０mMトリス塩酸pH８．３、５０mM塩化カリウム、
１．５mM塩化マグネシウム、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼ
ラチン、２μＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｎｇ／μｌゲノ
ムＤＮＡ、１μＭ ＰＣＲプライマー、を含む反応液を
調製した。この反応液は９２℃にて５分間熱処理した
後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社、ＴａＫａＲ
ａ Ｔａｑ）を０．０５Ｕ／μｌになるように加え、４
０℃にて６分間放置した。続いて、サイクル反応（熱変
性反応９４℃にて３０秒間、アニーリング反応４０℃に
て２分間、伸長反応７２℃にて３０秒間）を４０回繰り
返した後、７２℃にて５分間反応した。
ず、１０mMトリス塩酸pH８．３、５０mM塩化カリウム、
１．５mM塩化マグネシウム、０．００１％（Ｗ／Ｖ）ゼ
ラチン、２μＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｎｇ／μｌゲノ
ムＤＮＡ、１μＭ ＰＣＲプライマー、を含む反応液を
調製した。この反応液は９２℃にて５分間熱処理した
後、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社、ＴａＫａＲ
ａ Ｔａｑ）を０．０５Ｕ／μｌになるように加え、４
０℃にて６分間放置した。続いて、サイクル反応（熱変
性反応９４℃にて３０秒間、アニーリング反応４０℃に
て２分間、伸長反応７２℃にて３０秒間）を４０回繰り
返した後、７２℃にて５分間反応した。
【００５３】この増幅した約６００ｂｐのＤＮＡ断片を
プラスミドベクターｐＵＣ１９に連結したプラスミドｐ
ＰＣＣＨ１を作成した。ｐＰＣＣＨ１を鋳型ＤＮＡとし
て、上記と同一のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲに
て、再びα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε
−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子の部分的な
ＤＮＡ断片を増幅した。尚、この２回目のＰＣＲについ
ては、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）を用い、サイクル反応（熱変性反
応９４℃にて３０秒間、アニーリング反応４０℃にて２
分間、伸長反応７２℃にて３０秒間）を４０回繰り返し
た後、７２℃にて５分間反応した。得られた増幅産物を
アガロースゲル電気泳動にてジゴキシゲニンラベルした
核酸を取り込むことによって分子量が増加した増幅ＤＮ
Ａを分離し切り出したものをα−ヒドロキシ−γ−カル
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナー
ゼ遺伝子プローブとした。
プラスミドベクターｐＵＣ１９に連結したプラスミドｐ
ＰＣＣＨ１を作成した。ｐＰＣＣＨ１を鋳型ＤＮＡとし
て、上記と同一のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲに
て、再びα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε
−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子の部分的な
ＤＮＡ断片を増幅した。尚、この２回目のＰＣＲについ
ては、ＰＣＲ ＤＩＧプローブ合成キット（ベーリンガ
ー・マンハイム社製）を用い、サイクル反応（熱変性反
応９４℃にて３０秒間、アニーリング反応４０℃にて２
分間、伸長反応７２℃にて３０秒間）を４０回繰り返し
た後、７２℃にて５分間反応した。得られた増幅産物を
アガロースゲル電気泳動にてジゴキシゲニンラベルした
核酸を取り込むことによって分子量が増加した増幅ＤＮ
Ａを分離し切り出したものをα−ヒドロキシ−γ−カル
ボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナー
ゼ遺伝子プローブとした。
【００５４】（３）α−ヒドロキシ−γ−カルボキシム
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むプラスミドの取得 上記（１）にて取得したスフィンゴモナス エスピーCR
-0310201株のライブラリーを構成する大腸菌ＨＢ１０１
およそ２０００株をアンピシリンを１００μｇ／ml含む
培地に９ｃｍのシャーレ１枚当たり２００個程度爪楊枝
を用いて植菌した。３７℃でおよそ６時間静置培養の
後、コロニーをナイロンメンブレンにレプリカし、ＤＩ
Ｇディテクションキット（ベーリンガー・マンハイム社
製）を用い、上記（２）で得られたプローブとハイブリ
ダイズするコロニーを選抜した。選抜した大腸菌は、プ
ラスミドｐＣＨＭＳ０１を保有していた。
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むプラスミドの取得 上記（１）にて取得したスフィンゴモナス エスピーCR
-0310201株のライブラリーを構成する大腸菌ＨＢ１０１
およそ２０００株をアンピシリンを１００μｇ／ml含む
培地に９ｃｍのシャーレ１枚当たり２００個程度爪楊枝
を用いて植菌した。３７℃でおよそ６時間静置培養の
後、コロニーをナイロンメンブレンにレプリカし、ＤＩ
Ｇディテクションキット（ベーリンガー・マンハイム社
製）を用い、上記（２）で得られたプローブとハイブリ
ダイズするコロニーを選抜した。選抜した大腸菌は、プ
ラスミドｐＣＨＭＳ０１を保有していた。
【００５５】（４）組み換え体のα−ヒドロキシ−γ−
カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲ
ナーゼ活性の測定 プラスミドｐＣＨＭＳ０１及び幾つかの制限酵素を用い
てｐＣＨＭＳ０１から作成したプラスミドを保有する大
腸菌のα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−
セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性の測定結果を図
１に示した。その結果、ｐＣＨＭＳ０１、ｐＣＨＭＳ０
２、ｐＣＨＭＳ０３にα−ヒドロキシ−γ−カルボキシ
ムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝
子が機能的に発現することを確認した。
カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲ
ナーゼ活性の測定 プラスミドｐＣＨＭＳ０１及び幾つかの制限酵素を用い
てｐＣＨＭＳ０１から作成したプラスミドを保有する大
腸菌のα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−
セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ活性の測定結果を図
１に示した。その結果、ｐＣＨＭＳ０１、ｐＣＨＭＳ０
２、ｐＣＨＭＳ０３にα−ヒドロキシ−γ−カルボキシ
ムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝
子が機能的に発現することを確認した。
【００５６】上記形質転換体細胞の有するα−ヒドロキ
シ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デ
ヒドロゲナーゼ活性の測定は次の如くして行った。アン
ピシリンとＩＰＴＧをそれぞれ最終濃度が１００μｇ／
mlと１mMになるように添加したＬＢ液体培地５０mlへ、
ｐＣＨＭＳ０１、ｐＣＨＭＳ０２、ｐＣＨＭＳ０３、ｐ
ＣＨＭＳ０４を保有する大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地１００mlで２４時間
振とう培養した。遠心集菌後、50mM−Tris−塩酸緩衝液
（pH７．５）で２度洗浄し、50mM−Tris−塩酸緩衝液
（pH７．５）５mlに懸濁した。１５０Ｗ、１０分間の超
音波破砕機によって細胞破砕処理を行い、無細胞抽出を
得た。この無細胞抽出を酵素液とし、α−ヒドロキシ−
γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒド
ロゲナーゼ活性測定を実施例１と同様に行った。反応液
をＨＰＬＣ分析（BONDASPHEARE C18カラム、移動相：２
％酢酸、２０％メタノール、７８％蒸留水）し、２−ピ
ロン−４，６−ジカルボン酸の生成を確認した。
シ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デ
ヒドロゲナーゼ活性の測定は次の如くして行った。アン
ピシリンとＩＰＴＧをそれぞれ最終濃度が１００μｇ／
mlと１mMになるように添加したＬＢ液体培地５０mlへ、
ｐＣＨＭＳ０１、ｐＣＨＭＳ０２、ｐＣＨＭＳ０３、ｐ
ＣＨＭＳ０４を保有する大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地１００mlで２４時間
振とう培養した。遠心集菌後、50mM−Tris−塩酸緩衝液
（pH７．５）で２度洗浄し、50mM−Tris−塩酸緩衝液
（pH７．５）５mlに懸濁した。１５０Ｗ、１０分間の超
音波破砕機によって細胞破砕処理を行い、無細胞抽出を
得た。この無細胞抽出を酵素液とし、α−ヒドロキシ−
γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒド
ロゲナーゼ活性測定を実施例１と同様に行った。反応液
をＨＰＬＣ分析（BONDASPHEARE C18カラム、移動相：２
％酢酸、２０％メタノール、７８％蒸留水）し、２−ピ
ロン−４，６−ジカルボン酸の生成を確認した。
【００５７】（５）α−ヒドロキシ−γ−カルボキシム
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子
の塩基配列解析 次に該組み換えプラスミドｐＣＨＭＳ０２を用いて約
１．４ｋｂｐのＤＮＡ挿入断片の塩基配列の解析を行っ
た。塩基配列の解析は、Ｔ７シークエンシングキット
（ファルマシアバイオテク社）を用いたＭ１３ダイデオ
キシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３−５４６
７（１９７７））にてシークエンシング反応を行い、自
動レーザー蛍光シークエンシング装置（ファルマシアバ
イオテク社）を用いた。塩基配列解析の結果、該ＤＮＡ
断片上に９４５ｂｐの唯一のオープンリーディングフレ
ームが見出された。
コン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子
の塩基配列解析 次に該組み換えプラスミドｐＣＨＭＳ０２を用いて約
１．４ｋｂｐのＤＮＡ挿入断片の塩基配列の解析を行っ
た。塩基配列の解析は、Ｔ７シークエンシングキット
（ファルマシアバイオテク社）を用いたＭ１３ダイデオ
キシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，ｅｔｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４，５４６３−５４６
７（１９７７））にてシークエンシング反応を行い、自
動レーザー蛍光シークエンシング装置（ファルマシアバ
イオテク社）を用いた。塩基配列解析の結果、該ＤＮＡ
断片上に９４５ｂｐの唯一のオープンリーディングフレ
ームが見出された。
【００５８】以上のようにして得られたα−ヒドロキシ
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を解析し
た。その塩基配列とコードされているアミノ酸配列を配
列番号５に示した。
−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を解析し
た。その塩基配列とコードされているアミノ酸配列を配
列番号５に示した。
【００５９】
【発明の効果】本発明の形質転換体細胞を用いれば、α
−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアル
デヒド デヒドロゲナーゼを多量に製造することがで
き、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の工業的生産が
可能となる。
−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアル
デヒド デヒドロゲナーゼを多量に製造することがで
き、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸の工業的生産が
可能となる。
【００６０】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２８０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Ile Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ala Phe Gly Glu Lys His Leu 5 10 15 Asp Gly Leu Lys Asn Ile Asp Gly Val Glu Ile Val Ser Ile Ile Ser 20 25 30 Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Glu Val Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Lys 35 40 45 His Ser Gly Thr Asp Leu Ser Glu Ala Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp 50 55 60 Ala Val Ile Leu Cys Thr Pro Thr Gln Met His Ala Glu Gln Ala Ile 65 70 75 80 Ala Cys Met Asn Ala Gly Lys His Val Gln Val Glu Ile Pro Leu Ala 85 90 95 Asp Ser Trp Ala Asp Ala Glu Ala Val Met Lys Lys Ser Gln Glu Thr 100 105 110 Gly Leu Val Cys Met Val Gly His Thr Arg Arg Phe Asn Pro Ser His 115 120 125 Gln Tyr Ile His Asn Lys Ile Val Ala Gly Glu Leu Ala Ile Gln Gln 130 135 140 Met Asp Val Gln Thr Tyr Phe Phe Arg Arg Lys Asn Met Asn Ala Lys 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Ser Trp Thr Asp His Leu Leu Trp His His Ala Ala 165 170 175 His Thr Val Asp Leu Phe Ala Tyr Gln Ala Gly Lys Ile Val Gln Ala 180 185 190 Asn Ala Val Gln Gly Pro Ile His Pro Glu Leu Gly Ile Ala Met Asp 195 200 205 Met Ser Ile Gln Leu Lys Ser Glu Thr Gly Ala Ile Cys Thr Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Phe Asn Asn Asp Gly Pro Leu Gly Thr Phe Phe Arg Tyr Ile 225 230 235 240 Cys Asp Asn Gly Thr Trp Ile Ala Arg Tyr Asp Asp Leu Val Thr Gly 245 250 255 Lys Glu Glu Pro Val Asp Val Ser Lys Val Asp Val Ser Met Asn Gly 260 265 270 Ile Glu Leu Gln Asp Arg Glu Phe 275 280
【００６１】 配列番号：２ 配列の長さ：８４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：スフィンゴモナス 株名 ：スフィンゴモナス エスピーCR-0310201 配列： ATGAGAATAG CTCTCGCAGG CGCCGGCGCA TTCGGCGAAA AACATCTCGA CGGTCTCAAG 60 AATATCGACG GCGTCGAGAT CGTCTCGATC ATCAGCCGCA AGGCCGAGCA GGCCGCGGAA 120 GTCGCCGCGA AATATGGCGC GAAGCACAGC GGCACCGATC TTTCCGAAGC GCTTGCCCGT 180 GACGATGTCG ACGCGGTGAT CCTCTGCACC CCCACCCAGA TGCATGCCGA GCAGGCCATT 240 GCCTGCATGA ATGCCGGCAA GCATGTCCAG GTGGAAATCC CGCTGGCGGA CAGCTGGGCC 300 GATGCCGAAG CGGTGATGAA GAAGAGCCAG GAAACCGGCC TCGTCTGCAT GGTCGGCCAC 360 ACCCGCCGCT TCAACCCGAG CCACCAGTAT ATCCACAACA AGATCGTGGC CGGCGAGCTC 420 GCCATCCAGC AGATGGACGT GCAGACCTAT TTCTTCCGCC GCAAGAACAT GAACGCCAAG 480 GGCGAGCCGC GGTCCTGGAC GGACCATCTG CTCTGGCACC ATGCCGCGCA CACGGTGGAC 540 CTGTTCGCTT ATCAGGCCGG CAAGATCGTG CAGGCCAATG CCGTGCAGGG GCCGATCCAT 600 CCCGAGCTCG GCATCGCCAT GGACATGTCG ATCCAGCTCA AGAGCGAGAC GGGCGCGATC 660 TGCACCCTGT CCCTCTCGTT CAACAATGAC GGGCCGCTCG GCACCTTCTT CCGCTACATC 720 TGCGACAACG GCACCTGGAT CGCGCGCTAC GACGATCTGG TGACCGGCAA GGAAGAACCC 780 GTGGACGTCA GCAAGGTCGA CGTGTCGATG AACGGGATCG AGCTGCAGGA TCGGGAATTC 840
【００６２】 配列番号：３ 配列の長さ：３１５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Arg Ile Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ala Phe Gly Glu Lys His Leu 5 10 15 Asp Gly Leu Lys Asn Ile Asp Gly Val Glu Ile Val Ser Ile Ile Ser 20 25 30 Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Glu Val Ala Ala Lys Tyr Gly Ala Lys 35 40 45 His Ser Gly Thr Asp Leu Ser Glu Ala Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp 50 55 60 Ala Val Ile Leu Cys Thr Pro Thr Gln Met His Ala Glu Gln Ala Ile 65 70 75 80 Ala Cys Met Asn Ala Gly Lys His Val Gln Val Glu Ile Pro Leu Ala 85 90 95 Asp Ser Trp Ala Asp Ala Glu Ala Val Met Lys Lys Ser Gln Glu Thr 100 105 110 Gly Leu Val Cys Met Val Gly His Thr Arg Arg Phe Asn Pro Ser His 115 120 125 Gln Tyr Ile His Asn Lys Ile Val Ala Gly Glu Leu Ala Ile Gln Gln 130 135 140 Met Asp Val Gln Thr Tyr Phe Phe Arg Arg Lys Asn Met Asn Ala Lys 145 150 155 160 Gly Glu Pro Arg Ser Trp Thr Asp His Leu Leu Trp His His Ala Ala 165 170 175 His Thr Val Asp Leu Phe Ala Tyr Gln Ala Gly Lys Ile Val Gln Ala 180 185 190 Asn Ala Val Gln Gly Pro Ile His Pro Glu Leu Gly Ile Ala Met Asp 195 200 205 Met Ser Ile Gln Leu Lys Ser Glu Thr Gly Ala Ile Cys Thr Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Phe Asn Asn Asp Gly Pro Leu Gly Thr Phe Phe Arg Tyr Ile 225 230 235 240 Cys Asp Asn Gly Thr Trp Ile Ala Arg Tyr Asp Asp Leu Val Thr Gly 245 250 255 Lys Glu Glu Pro Val Asp Val Ser Lys Val Asp Val Ser Met Asn Gly 260 265 270 Ile Glu Leu Gln Asp Arg Glu Phe Ile Ala Ala Ile Arg Glu Gly Arg 275 280 285 Glu Pro Asn Ser Ser Val Ala Arg Val Leu Asp Cys Tyr Arg Val Leu 290 295 300 Gly Glu Leu Glu Val Gln Leu Glu Lys Gln Gly 305 310 315
【００６３】 配列番号：４ 配列の長さ：９４５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：スフィンゴモナス 株名 ：スフィンゴモナス エスピーCR-0310201 配列： ATGAGAATAG CTCTCGCAGG CGCCGGCGCA TTCGGCGAAA AACATCTCGA CGGTCTCAAG 60 AATATCGACG GCGTCGAGAT CGTCTCGATC ATCAGCCGCA AGGCCGAGCA GGCCGCGGAA 120 GTCGCCGCGA AATATGGCGC GAAGCACAGC GGCACCGATC TTTCCGAAGC GCTTGCCCGT 180 GACGATGTCG ACGCGGTGAT CCTCTGCACC CCCACCCAGA TGCATGCCGA GCAGGCCATT 240 GCCTGCATGA ATGCCGGCAA GCATGTCCAG GTGGAAATCC CGCTGGCGGA CAGCTGGGCC 300 GATGCCGAAG CGGTGATGAA GAAGAGCCAG GAAACCGGCC TCGTCTGCAT GGTCGGCCAC 360 ACCCGCCGCT TCAACCCGAG CCACCAGTAT ATCCACAACA AGATCGTGGC CGGCGAGCTC 420 GCCATCCAGC AGATGGACGT GCAGACCTAT TTCTTCCGCC GCAAGAACAT GAACGCCAAG 480 GGCGAGCCGC GGTCCTGGAC GGACCATCTG CTCTGGCACC ATGCCGCGCA CACGGTGGAC 540 CTGTTCGCTT ATCAGGCCGG CAAGATCGTG CAGGCCAATG CCGTGCAGGG GCCGATCCAT 600 CCCGAGCTCG GCATCGCCAT GGACATGTCG ATCCAGCTCA AGAGCGAGAC GGGCGCGATC 660 TGCACCCTGT CCCTCTCGTT CAACAATGAC GGGCCGCTCG GCACCTTCTT CCGCTACATC 720 TGCGACAACG GCACCTGGAT CGCGCGCTAC GACGATCTGG TGACCGGCAA GGAAGAACCC 780 GTGGACGTCA GCAAGGTCGA CGTGTCGATG AACGGGATCG AGCTGCAGGA TCGGGAATTC 840 ATCGCGGCGA TCCGCGAAGG TCGCGAGCCC AATTCGTCGG TGGCGAGAGT GCTCGATTGC 900 TATCGGGTGC TGGGCGAACT CGAGGTCCAG CTCGAAAAGC AGGGC 945
【００６４】 配列番号：５ 配列の長さ：１１７４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：スフィンゴモナス 株名 ：スフィンゴモナス エスピーCR-0310201 配列： CTCGAGGGGA GAGGGTTGGG AGAGGGGTCG CCACGCTGCG GCGTGTCAGC CCGCTCCTCT 60 CCTCCCCGCC CCCCTTCCCG GCCCTCTCCC TCGCAGGTGA GAGGGCGCTC ATGTGAAAGG 120 ACTGCCCC ATG AGA ATA GCT CTC GCA GGC GCC GGC GCA TTC GGC GAA AAA 170 Met Arg Ile Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ala Phe Gly Glu Lys 1 5 10 CAT CTC GAC GGT CTC AAG AAT ATC GAC GGC GTC GAG ATC GTC TCG ATC 218 His Leu Asp Gly Leu Lys Asn Ile Asp Gly Val Glu Ile Val Ser Ile 15 20 25 30 ATC AGC CGC AAG GCC GAG CAG GCC GCG GAA GTC GCC GCG AAA TAT GGC 266 Ile Ser Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Glu Val Ala Ala Lys Tyr Gly 35 40 45 GCG AAG CAC AGC GGC ACC GAT CTT TCC GAA GCG CTT GCC CGT GAC GAT 314 Ala Lys His Ser Gly Thr Asp Leu Ser Glu Ala Leu Ala Arg Asp Asp 50 55 60 GTC GAC GCG GTG ATC CTC TGC ACC CCC ACC CAG ATG CAT GCC GAG CAG 362 Val Asp Ala Val Ile Leu Cys Thr Pro Thr Gln Met His Ala Glu Gln 65 70 75 GCC ATT GCC TGC ATG AAT GCC GGC AAG CAT GTC CAG GTG GAA ATC CCG 410 Ala Ile Ala Cys Met Asn Ala Gly Lys His Val Gln Val Glu Ile Pro 80 85 90 CTG GCG GAC AGC TGG GCC GAT GCC GAA GCG GTG ATG AAG AAG AGC CAG 458 Leu Ala Asp Ser Trp Ala Asp Ala Glu Ala Val Met Lys Lys Ser Gln 95 100 105 110 GAA ACC GGC CTC GTC TGC ATG GTC GGC CAC ACC CGC CGC TTC AAC CCG 506 Glu Thr Gly Leu Val Cys Met Val Gly His Thr Arg Arg Phe Asn Pro 115 120 125 AGC CAC CAG TAT ATC CAC AAC AAG ATC GTG GCC GGC GAG CTC GCC ATC 554 Ser His Gln Tyr Ile His Asn Lys Ile Val Ala Gly Glu Leu Ala Ile 130 135 140 CAG CAG ATG GAC GTG CAG ACC TAT TTC TTC CGC CGC AAG AAC ATG AAC 602 Gln Gln Met Asp Val Gln Thr Tyr Phe Phe Arg Arg Lys Asn Met Asn 145 150 155 GCC AAG GGC GAG CCG CGG TCC TGG ACG GAC CAT CTG CTC TGG CAC CAT 650 Ala Lys Gly Glu Pro Arg Ser Trp Thr Asp His Leu Leu Trp His His 160 165 170 GCC GCG CAC ACG GTG GAC CTG TTC GCT TAT CAG GCC GGC AAG ATC GTG 698 Ala Ala His Thr Val Asp Leu Phe Ala Tyr Gln Ala Gly Lys Ile Val 175 180 185 190 CAG GCC AAT GCC GTG CAG GGG CCG ATC CAT CCC GAG CTC GGC ATC GCC 746 Gln Ala Asn Ala Val Gln Gly Pro Ile His Pro Glu Leu Gly Ile Ala 195 200 205 ATG GAC ATG TCG ATC CAG CTC AAG AGC GAG ACG GGC GCG ATC TGC ACC 794 Met Asp Met Ser Ile Gln Leu Lys Ser Glu Thr Gly Ala Ile Cys Thr 210 215 220 CTG TCC CTC TCG TTC AAC AAT GAC GGG CCG CTC GGC ACC TTC TTC CGC 842 Leu Ser Leu Ser Phe Asn Asn Asp Gly Pro Leu Gly Thr Phe Phe Arg 225 230 235 TAC ATC TGC GAC AAC GGC ACC TGG ATC GCG CGC TAC GAC GAT CTG GTG 890 Tyr Ile Cys Asp Asn Gly Thr Trp Ile Ala Arg Tyr Asp Asp Leu Val 240 245 250 ACC GGC AAG GAA GAA CCC GTG GAC GTC AGC AAG GTC GAC GTG TCG ATG 938 Thr Gly Lys Glu Glu Pro Val Asp Val Ser Lys Val Asp Val Ser Met 255 260 265 270 AAC GGG ATC GAG CTG CAG GAT CGG GAA TTC ATC GCG GCG ATC CGC GAA 986 Asn Gly Ile Glu Leu Gln Asp Arg Glu Phe Ile Ala Ala Ile Arg Glu 275 280 285 GGT CGC GAG CCC AAT TCG TCG GTG GCG AGA GTG CTC GAT TGC TAT CGG 1034 Gly Arg Glu Pro Asn Ser Ser Val Ala Arg Val Leu Asp Cys Tyr Arg 290 295 300 GTG CTG GGC GAA CTC GAG GTC CAG CTC GAA AAG CAG GGC TGAAAACCTG 1083 Val Leu Gly Glu Leu Glu Val Gln Leu Glu Lys Gln Gly 305 310 315 CACCGGAATG AAACGGAAGC CTTGCCGGAG CAATCTGGCA AGGCTTTTTT CTTGGCGGCA 1143 GGCACGCCGT CATTGCATCA TGGCGGTGGA A 1174
【００６５】
【００６６】
【００６７】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：ACGCGGTGAT CCTCTGC 17
【００６８】配列番号：９ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列：CTTGCTGACG TCCACGG 17
【図１】スフィンゴモナス エスピー由来のα−ヒドロ
キシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにおける挿入
ＤＮＡ断片の制限酵素地図及びα−ヒドロキシ−γ−カ
ルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナ
ーゼ活性の有無を示す説明図である。
キシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドにおける挿入
ＤＮＡ断片の制限酵素地図及びα−ヒドロキシ−γ−カ
ルボキシムコン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナ
ーゼ活性の有無を示す説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 福田 雅夫 新潟県長岡市深沢町1769−１ 深沢町宿舎 １−505 (72)発明者 片山 義博 東京都練馬区貫井３−47−４ (72)発明者 西川 誠司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA08 BA80 CA02 CA09 DA06 EA04 FA10 GA14 GA19 HA01 HA12 4B050 CC03 CC04 DD02 EE02 LL05 4B064 AD09 AG01 CA02 CA19 CC24 DA16 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA03 BA25 BB37 CA28 CA60
Claims (6)
- 【請求項１】 配列番号１又は３で示されるアミノ酸配
列又は当該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸
が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、
α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン酸−ε−セミア
ルデヒド デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチド
をコードする遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号２又は４で示される塩基配列又
は当該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換
若しくは付加された塩基配列、又はこれらに相補的な塩
基配列を有するものである請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載の遺伝子を含有する
組換えベクター。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載の遺伝子を保有する
形質転換体細胞。 - 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体細胞を培養
し、該培養物からα−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコ
ン酸−ε−セミアルデヒド デヒドロゲナーゼを採取す
ることを特徴とする該酵素の製造法。 - 【請求項６】 α−ヒドロキシ−γ−カルボキシムコン
酸−ε−セミアルデヒドの存在下に、請求項４記載の形
質転換体細胞を培養することを特徴とする２−ピロン−
４，６−ジカルボン酸の製造法。
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