JP4360786B2 - ラクトバシルスからのnadhオキシダーゼ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ラクトバシルスからのNADHオキシダーゼ、並びにこの酵素をコードする核酸及びこの核酸を含有するベヒクル(Vehicle)に関する。特に、本発明はラクトバシルス ブレビス(Lactobacillus brevis)(DSM 20054)からのオキシダーゼに関する。
【0002】
【従来の技術】
E.C.1.1に分類されるデヒドロゲナーゼは、特定の化合物、例えばアルコール及びケトンの酸化及び還元に可逆的に触媒作用をする酵素である。公知デヒドロゲナーゼのいくつかは、補因子依存性であり、言い換えれば、それらは、電子移送プロセスのバランスのために更なる分子を必要とする。例えばNADH及びNADPHはこのような補因子(cofactor)であることが知られている。
【0003】
次の反応式に従って例えばアルコールのケトンまでの酸化の際にNADHが形成される。高価なNAD+の化学量論的量を使用すべきことを避けるために、NAD+の形成を第2酵素系によって開始させることができる(Enzyme Catalysis in Organic Synthesis , Ed.: K. Drauz, H. Waldmann ,VCH, 1st Edition, P. 721; 反応式1)。
【0004】
【化1】
【0005】
文献から公知の系は、NAD+の再生のために、例えばラクテートデヒドロゲナーゼ及びピルベートをラクテートの形成下に、又はケトグルタレート及びアンモニウムと一緒のグルタメートデヒドロゲナーゼをグルタメートの形成下に利用する。この場合の欠点は、補基質(Cosubstrate)、例えばピルベート又はケトグルタレートを使用しなければならず、生成物、例えばラクテート又はグルタメートが形成され、これらを、プレパラテイブな用途のためには実際に形成される生成物から除去しなければならないことである。加えて、これは、反応を完全に進行させることが反応技術的に非常に困難にのみ可能である平衡反応である。
【0006】
選択的に、このような第2酵素系は、酸化された補基質として空気酸素を受容し、NAD+の形成下に同時に水又は過酸化水素を発生するNADHオキシダーゼであってもよい。NADHオキシダーゼは、それにより接触される反応が不可逆的であり、O2が再生基質として利用され、かつH2O又はH2O2が生成物として形成される観点で利点を提供する。二つのグループの酵素(H2O-形成酵素及びH2O2-形成酵素)は、原則的に生化学の文献中に公知である(例えば、H2O-形成酵素に関して Lopez de Felipe, F. et al., J. Bacteriol. Vol. 180 (1998), 3804-08; H2O2-形成酵素に関して Nishiyama, Y. et al.,J. Bacteriol. Vol. 183 (2001), 2431−2438及びそれぞれの文献中に引用されている文献参照)。H2O2-形成酵素は、再生酵素としての使用のためには好適性が低い。それというのも、過酸化物は酵素を害することが知られており、できるだけその場で分解されるべきであり、これは不可能ではないがむしろ不利である方法工程を必要とする。
【0007】
次のものからのNADHオキシダーゼが生化学的に同定されている:エンテロコッカス(及びストレプトコッカス)ファエカリス(Enterococcus 及び Streptococcus faecalis)(Schmidt, H. L. et al., Eur. J. Biochem. 156 (1986), 149- 55 )、ロイコノストック メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)(Koike, J. et al., Biochem.. (Tokyo) 97 (1985), 1279-88 )、ストレプトコッカス ミュウタンス(Streptococcus mutans )( Higuchi , M. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 58 (1994), 1603-07)、マイコプラズマ カプリコルム(Mycoplasma capricolum)( Klomkes, M., Altdorf ,R., Ohlenbusch, H. D., Biol. Chem. Hoppe Seyler 366 (1985), 963-9)、スルホロブス ソルファタリクス (Sulfolobus solfataricus)( Arcari, P. et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 895-900)、テルムス テルモフィルス(Thermus thermophilus)(Erdmann, H. et al., J. Mol. Biol. 230 (1993), 1086-8 )及びテルムスアクアチクス(Thermus aquaticus )(Cocco, D. et al., Eur. J. Biochem. 174 (1988) ,267-71 )。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、デヒドロゲナーゼと組み合わせて使用される場合にNAD+再生のために好適である、高い活性を有するNADHオキシダーゼを提供することであった。特に、このNADHオキシダーゼは、容易に製造でき、かつ工業的規模で有利に使用するために充分な量で入手できるべきである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
この課題は、請求項の記載に従って達成される。請求項1は、ラクトバシルス属からのNADHオキシダーゼ(NOX)に関する。請求項2は、有利な酵素に関する。請求項3は、この酵素をコードする核酸を請求している。請求項4は、本発明による核酸を含有するベヒクルに関し、請求項5は、本発明による核酸とハイブリダイズする核酸に関し、請求項6は、有利なプライマーを保護する。請求項7は、本発明よる核酸から出発するNADHオキシダーゼ(NOX)を改良する方法に関するが、請求項8は、特定の改良されたrec-NADHオキシダーゼ(NOX)及びこれをコードする核酸をその内容としている。請求項9及び10は、本発明よるNADHオキシダーゼ(NOX)又は本発明による核酸の特定の使用に関する。請求項11〜13は、全細胞触媒に関し、請求項14は、ラクトバシルスからNADHオキシダーゼを製造する方法をその内容としている。
【0010】
ラクトバシルス種からのNADHオキシダーゼ(NOX)が入手可能であることにより、前記の課題を有利に解決することが可能である。この際、ラクトバシルス ブレビス、有利にDSM 20054(配列番号2)又はラクトバシルスケフィア(Kefir)(EP 91107067.0; DE 4014573)からのNADHオキシダーゼ(NOX)の使用が全く特別に有利である。
【0011】
冒頭に記載の反応式により、NADHオキシダーゼは、この反応時に生じるNADHをNAD+に変換することができる。O2からH2Oへの反応の不可逆性に基づき、平衡圧により、使用されるラセミ性アルコールのケトンへの完全な変換は、使用アルコールの高度にエナンチオマー富化された未反応の光学的対掌体の残留下に行われる。NADHオキシダーゼ(NOX)の使用例は、特にS-アルコールデヒドロゲナーゼと結びついたR-アルコールの製造、R-アルコールデヒドロゲナーゼと結びついたS-アルコールの製造又はL-アミノ酸デヒドロゲナーゼと結びついたD-アミノ酸の製造である。このような意味において、ヒドロキシ酸-デヒドロゲナーゼ及び全ての他のNADH-依存性デヒドロゲナーゼとの結びつきも同様に可能である。更なる重要な生成物として、デヒドロゲナーゼ反応の酸化生成物、即ち、例えばケトン、ケト酸又はアルデヒドを挙げることができる。
【0012】
もう一つの態様で、本発明は、本発明によるNADHオキシダーゼをコードする核酸に関する。
【0013】
ラクトバシルス菌株の比較的容易な培養可能性及びクロマトグラフィ法によるこの酵素の簡単な入手性にも関わらず、本発明によるNADHオキシダーゼ(NOX)をコードする核酸の詳細により、エナンチオマー富化化合物を得るための酵素-技術的な方法のために必要である酵素を、組み換え技術によって充分な量で入手可能にする物質を得ることが可能になった。この核酸を用いて、迅速に生長する宿主生物から高収率で酵素を得ることが可能である。更に、本発明による遺伝子配列は改良された突然変異体の製造のために使用できる。
【0014】
もう一つの態様で、本発明は、本発明による核酸1つ以上を有するプラスミド又はベクターに関する。
【0015】
プラスミド又はベクターとして、原則的に、この目的のために当業者に提供できる全ての実施形が使用できる。このようなプラスミド及びベクターは、文献 Studier et al., Methods Enzymol. 1990, 185, 61-69 又は Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech or Gibco BRL 社の公開パンフレット中に見出すことができる。更に有利なプラスミド及びベクターは次の文献中に見出すことができる:
【0016】
【外1】
【0017】
それを用いて本発明による核酸を有する遺伝子構造を宿主生物中で非常に有利な方法でクローニングすることのできるプラスミドは、pkk−177−3H(Roche Biochemicals) 、pBTac(Roche Biochemicals)、pkk−233(Stratagene) 又はpET(Novagen) である。カナマイシン-抵抗を組み込んでいるTOPO-系を例外として、全ての他のプラスミドは、アンピシリン抵抗のβ−ラクタマーゼを含有するはずである。
【0018】
同様に、本発明は、本発明による核酸を有する微生物を目的としている。
【0019】
その中で核酸がクローンニングされる微生物は、充分な量の組み換え酵素の増加及び取得のために役立つ。このための方法は、当業者には周知である(後記参照)。微生物として、原則的に当業者にとってこの目的に使用される全ての生物、例えば原核生物又は真核生物、例えばシュードモナス(Pseudomonas)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、アルトロバクター(Arthrobacter)、バシルス(Bacillus)、スタフィロコッカス(Staphylococcus)、E.コリ(coli)、カンジダ(Cndida)、ハンセヌラ(Hansenula)、ピチア(Pichia)及びバクロヴィルス(Baculoviruses)を利用することができる。この目的のために、E.コリ菌株が有利に使用される。最も有利なのは、E.コリ NM522、JM109、JM105、RRI、DH5α、TOP10-又はHB101である。それらを用いて本発明による核酸を有する遺伝子構造が宿主生物中で有利にクローニングされるプラスミドは、更に前に挙げられている。
【0020】
本発明には、厳密な条件下に本発明による一本鎖核酸と又はそれらの相補的一本鎖核酸とハイブリダイズする核酸も包含される。ここで”厳密な条件下で”なる表現は、Sambook等により(Molecular Cloning ,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104 )記載されているような条件であると理解される。1×SSC及び0.1%SDS(ドデシルスルホン酸ナトリウム)で、50℃、好ましくは55℃、より好ましくは62℃、最も好ましくは68℃で1時間洗浄の後に、かつより有利には0.2×SSC及び0.1%SDSで、50℃、好ましくは55℃、より好ましくは62℃及び最も好ましくは68℃で1時間洗浄の後に、なお正のハイブリダイゼーシヨンシグナルが観察される場合に、本発明による厳密なハイブリダイゼーシヨンが存在する。
【0021】
本発明の次の態様は、全てのタイプのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることによる本発明による遺伝子配列の製造のためのプライマーを目的としている。このプライマーには、相応するアミノ酸配列をコードするセンス-及びアンチセンスプライマーが包含される。好適なプライマーは、原則的に当業者に公知の方法で得ることができる。本発明によるプライマーの発見は、公知DNA配列との比較により又は見い出されたアミノ酸配列の当該生物のコドン中への翻訳により行われる(例えばストレプトマイセスに関して:Wright et al., Gene 1991, 113 , 55-65) 。いわゆるスーパーファミリーの蛋白質のアミノ酸配列中の共通性は、この目的のために同様に利用される(Firestine et al., Chemistry & Biology 1996, 3, 779- 783) 。これに関する更なる情報は、次の文献中に見つけることができる:
【0022】
【外2】
【0023】
次のプライマーが極めて有利である:
DIFAAGDSA 配列番号3; AS-プライマー
MKVTVVGCT 配列番号4; S-プライマー。
【0024】
もう一つの次の態様で、本発明は、改良されたrec-NADHの製法及びこれにより得られるrec-NADHオキシダーゼ又はこれをコードする核酸に関し、この際、本発明によるNADHオキシダーゼ(NOX)をコードする本発明による核酸から出発し、
a) 核酸を突然変異誘発させ、
b) a)から得られる核酸を適当なベクター中にクローニングし、これを適当な発現系中に移送し、かつ
c) 改良された活性及び/又は選択性を有する形成された蛋白質を検出しかつ単離する。この工程を一回又は任意の多数回連続的に実施することができる。
【0025】
本発明による酵素を、突然変異誘発法により改良するための処理法は、当業者には従来から公知である。突然変異誘発法として、当業者にこの目的で利用されている全ての方法を使用することができる。特に、これには、飽和突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、シャッフリング法並びに位置指定突然変異誘発が包含される:
【0026】
【外3】
【0027】
得られる新規の核酸配列を下記の方法に従って宿主生物中でクローニングし(文献後記参照)、次いで発現される酵素を検出し、かつ適当なスクリーニング法を用いて検出し、かつ単離する:
【0028】
【外4】
【0029】
本発明は、同様に、本発明により場合により突然変異により改良されたNADHオキシダーゼ(NOX)を用いてキラルなエナンチオマー富化有機化合物、例えばアルコール又はアミノ酸を製造することに関する。この際、この使用は、既に公知の方法に類似の方法と同様に行われる(DE10037101、Enzyme Catalysis in Organic Synthesis , Ed.: K/Drauz, H/Waldmann , VCH. 1st Edition)。
【0030】
更に、本発明による、かつ更に改良された当該NADHオキシダーゼ(NOX)をコードする核酸は、全細胞触媒(whole-cell catalysts)の製造のために優れて好適である( DE 10037115.9 並びにその中に引用されている文献)。
【0031】
同様に、本発明の課題は、クローニングされたデヒドロゲナーゼのための遺伝子及びクローニングされたNADHオキシダーゼのための遺伝子を有する全細胞触媒を提供することである。本発明による全細胞触媒は、有利にラクトバシルスからのNADHオキシダーゼ(NOX)を含有すべきである。この際、ラクトバシルス ブレビス、有利にDSM 20054又はラクトバシルス ケフィアDSM 20587からのNADHオキシダーゼが極めて有利である。このような生物の製造は当業者には周知である(PCT/EP00/08473;PCT/US00/08159;関連文献、下記参照)。
【0032】
このような生物の利点は、双方の酵素系の同時発現であり、これにより、なおrec-生物のみがこの反応ために利用されるはずである。酵素の発現をその反応速度に適合させるために、相応してコードする核酸フラグメントを、異なるコピー数を有する異なるプラスミドに入れ、かつ/又は異なる強度のプロモータのための遺伝子の異なる強度の発現のために使用することができる。このように適合された酵素系においては、有利に、場合による阻害性に作用する中間体の蓄積は現れず、当該反応は最適な全体速度で進行することができる。しかしながら、このことは、当業者にとっては従来から知られている(PCT/EP00/08473;Gellissen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996, 46, 46-54) 。
【0033】
本発明の目的は、同様にラクトバシルスからのNADHオキシダーゼの製法であり、ここでは、NADHオキシダーゼ(NOX)の有利な発現のために、微生物を好気性条件下に培養すべきである。
【0034】
ラクトバシルスは、その他は慣用の嫌気性条件下におけるよりも、好気性条件下に標準培地中で著しく良好に成長することが発見された。ラクトバシルス ブレビス、有利にはDSM 20054又はラクトバシルス ケフィア DSM 20587を使用するのが有利である。好気性条件とは、本発明によれば、有利に微生物が振動培養器としてのフラスコ中での培養又は培養器中での培養の際に測定可能な濃度の酸素の存在下に培養されるような条件であると認められる。”測定可能な酸素濃度”とは、溶解酸素が酸素の飽和値の1%であることを意味し、この際、酸素は、その他は通常の条件下に酸素電極を用いて測定される。
【0035】
従って、本発明による核酸は、rec-NADHオキシダーゼ(NOX)の製造のために有利に使用することができる。当業者にとって従来から公知である組み換え技術(後記参照)により、工業的方法のために充分な量で当該酵素を提供することができる微生物が得られる。本発明によるrec-酵素の製造は、当業者に公知の遺伝子技術法で実施される。
【0036】
【外5】
【0037】
一般的方法(PCR及び融合PCR、逆PCR、クローニング、発現など)に関しては、次の文献及びその中に引用されている文献を参照することができる:
【0038】
【外6】
【0039】
当該酵素は、遊離の形で、均一に精製された化合物として又は組み換え技術により製造された酵素として使用することができる。更に、この酵素は、無傷の宿主生物の成分としても使用されるか、溶解され、かつ任意に高度に精製された宿主生物の細胞物質(cell mass)と組み合わせて使用することもできる。この酵素を固定された形で使用することも同様に可能である(Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey und Ralph A. Messing "Immobilisierte Biomaterialiern -Techniken und Anwendungen"、 Angew. Chem. 1982, 94, 836-852)。この固定化は凍結乾燥により有利に実施される(Dordick et al., J. Am. Chem. Soc. 194,116, 5009-5010; Okahata et al., Tetrehedron Lett.1997, 38, 1971-1974; Adlercreutz et al., Biocatalysis 1992,6,291-305)。この凍結乾燥を、エーロゾルOT又はポリビニルピロリドン又はポリエチレングリコール(PEG)又はBrij 52(ジエチレングリコールモノセチルエーテル)のような界面活性物質の存在下に実施するのが全く特別に有利である(Goto et al., Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378)。CLECsとしての使用も同様に可能である(St Clair et al., Angew Chem Int Ed Engl 2000 Jan, 39(2)、 380-383)。
【0040】
本発明の範囲内での表現”光学的富化(エナンチオマー富化)化合物”とは、他の対掌体との混合物中の光学対掌体が>50モル%の量で存在すると理解すべきである。
【0041】
微生物ラクトバシルス ブレビスDSM 20054又はラクトバシルス ケフィアDSM 20587は、ドイツ微生物及び細胞収集及び培養局(DSM)に当該番号で寄託されており、公に入手可能である。
【0042】
概念”核酸”には、全てのタイプの一本鎖又は二本鎖のDNA並びにRNA又はそれらの混合物が包含される。
【0043】
”改良されたrec-酵素”とは、請求項によれば、特に修飾された基質スペクトルを有し、より活性及び/又はより選択性であるか又は使用反応条件下に安定である酵素を意味すると理解される。
【0044】
請求されているタンパク質配列及び核酸配列は、本発明によれば、このような配列の作用法及び/又は目的が保持されるかぎりにおいて、これら配列の1つについて80%より大きい、好ましくは90%、91%、92%、93%又は94%より大きい、より好ましくは95%又は96%より大きい、かつ特別に好ましくは97%、98%又は99%より大きい相同性(天然の縮重を除く)を有するような配列も包含される。ここで用いられているような表現”相同性”(又は同一性)は、
式:H(%)=[1−V/X]×100(ここで、Hは相同性を表し、Xは比較配列のヌクレオチド塩基の総数/アミノ酸を表し、Vは、比較配列に対する当該配列の異なるヌクレオチド塩基の数/アミノ酸を表す)により定義することができる。いずれの場合でも、概念”アミノ酸配列をコードする核酸”には、遺伝子コードの縮重手段によって出現可能である全ての配列が包含される。
【0045】
この明細書中に引用されている参照文献は、記載の一部と見なされる。
【0046】
【実施例】
1)NADHオキシダーゼを取得するためのラクトバシルス ブレビスの培養ラクトバシルス ブレビスDSM 20054をラクトバシルス類(Lactobacillen)用の標準培地中で培養した。この際、この菌株は、ラクトバシルス菌株に特有の慣用の嫌気性条件下におけるよりも酸素供給下で著しく良好に成長することが観察された。NADHオキシダーゼの活性の酵素試験は、この菌株が殊にこの非慣用の培養条件下でNADHオキシダーゼ(NOX)の高い活性を提示することを示した。
【0047】
従って、酵素精製及び-同定のために細胞を次の条件下に製造した:
培地:1リットル当たり典型的に消化されたカゼインペプトン10g;肉エキス10g;酵母エキス5g;グルコース20g;Tween80 1g;K2HPO42g;酢酸Na5g;クエン酸二アンモニウム2g;MgSO4×7H2O0.2g;MnSO4×H2O 0.05g;pH=6.2〜6.5。
【0048】
振動フラスコ(2バッフルを備える)中、30℃で、撹拌しながら2日間培養を行った。次いで遠心分離により細胞物質を得、これは-20℃でかなり長時間貯蔵することができる。
【0049】
2)酵素単離
a)粗製抽出物取得
細胞をガラスビーズを用いて湿式磨砕することにより溶解させた。このために、湿っている細菌物質(10g)を、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)(30ml)中に懸濁させ、撹拌セルガラスビーズミル(SCP-Desintegrator、Innomed-Konsult AB,Sweden)中、4000rpmで20分間磨砕することにより溶解させた。この溶解細胞を遠心分離し、上澄みを粗製抽出物と称した。
【0050】
4.5の使用pH値は、この粗製抽出物中での酵素収量に決定的な影響を有し;この条件下で粗製抽出プレパレートが17.8U/mgの特異活性を有して、かつ700単位の収量で得られるが、7.4のpHを有する緩衝液を用いる場合には、この特異活性は僅かに2.6U/mgであり、収量は580単位であった。
【0051】
この際、この酵素活性を次の測光試験を用いて測定した(340nm、測定温度30℃):0.1mM NADH;100mM 燐酸カリウム緩衝液(pH 7.5);1mM DTT(=ジチオスレイトール);1ml当たり酵素溶液10μl(必要なら希釈)。1単位のNADH-オキシダーゼ-活性は、NADH1μモル/minを酸化する。
【0052】
b)酵素のクロマトグラフィ精製
4.5のpHを有する緩衝液中での粗製抽出物の製造の後に、この粗製抽出物を直ちに再緩衝させ、かつ50mM TEA(pH7.5)+3mM DTT+200mM NaCl(=緩衝液A)で平衡化されたMarco Q カラム(Firma.Biorad)(カラム体積100ml、流速4ml/min、フラクシヨン10ml)上に載せた。FPLC装置(Pharmacia)を用いてクロマトグラフィを実施した(圧力0.1MPa、室温)。1M NaClまでのNaCl段階勾配(緩衝液B:緩衝液A+1MNaCl)を用いてタンパク質を溶離させ、この際、次の段を用いた:0〜2カラム量:B0%(=200mM NaCl)、2〜5カラム量:B40%、5〜5.5カラム量:B100%。これらのフラクシヨン中で測光法を用いてフラクシヨンの酵素活性及びタンパク質含分を測定した。活性フラクシヨンを集め、ヒドロキシルアパタイト平衡化緩衝液(下記参照)を用いて再緩衝させると同時に、Amicon撹拌セル(YM10膜、50ml)中で濃縮させた。
【0053】
このフラクシヨンプールを、10mM Kpi緩衝液(pH6.7)+3mM DTT+200mM NaCl(=緩衝液A)で平衡化されたヒドロキシルアパタイトセラミックタイプ20μmカラム(Firma. Biorad)上に載せた(カラム体積15ml、流速2ml/min、フラクシヨン5ml;FPLG装置、圧力0.1MPa、室温)。タンパク質を、500mM Kpi(緩衝液B:緩衝液A+500mM Kpi)までの3段勾配を用い、次の段で溶離させた:0〜3カラム量 B0%、3〜7カラム量 B30%、7〜9カラム量 B50%、次いで3カラム量でB100%まで上昇。活性フラクシヨンを集め、かつ前記のように濃縮させ、フェニルセファロースに必要な緩衝液を用いて再緩衝させた。
【0054】
このプレパレートを、硫酸アンモニウムの添加(試料中の最終濃度1.2M)の後に、50mM TEA(pH 7.5)+3mM DTT+1.2M (NH4)2SO4(=緩衝液A)で平衡化されたフェニルセファロースハイサブカラム(High Sub colum:Firma Pharmacia)上に載せた(カラム体積25ml、流速1ml/min、フラクシヨン3ml;FPLC装置、圧力0.1MPa、室温)。次の段の0M硫酸アンモニウム(緩衝液B:硫酸アンモニウムなしの緩衝液A)までの3段勾配を用いて、タンパク質を溶離させた:1カラム量 B0%、1カラム量 B20%、1カラム量 B60%、2カラム量 B100%。活性フラクシヨンを集め、アミコン限外濾過セル中で濃縮させ、引き続き改めて硫酸アンモニウムを添加した。
【0055】
フェニルセファロースハイサブカラムの濃縮されたフラクシヨンを用いて実施された最終精製工程は、50mM TEA(pH7.5)+3mM DTT+1.2M(NH4)2SO4(=緩衝液A)で平衡化されたフェニルセファロース650Cマテリアル(Firma Tosohaas)でのクロマトグラフィによる精製である。
【0056】
クロマトグラフィ条件:カラム体積2ml、流速1ml/min;FPLC装置、圧力0.1MPa、室温、フラクション2ml。次の段の0M硫酸アンモニウム(緩衝液B:硫酸アンモニウムなしの緩衝液A)までの4-段勾配を用いてタンパク質を溶離させる:10カラム量 B0%、5カラム量 B20%、5カラム量 B50%、5カラム量 B70%、10カラム量 B100%。
【0057】
種々のクロマトグラフィ工程での酵素活性及びタンパク質の収率を第1表中にまとめる。
【0058】
【表1】
【0059】
第1表により精製されたフラクシヨンのSDS-PAGEは、最終段の後の酵素フラクシヨンが、なお2種のタンパク質(そのサブユニットは38及び50kDaの分子量を有する)を含有することを示している。これらの2つのタンパク質バンドは、ブロッテイングの後に個々のN-末端配列決定することができ、この際、データバンクで入手可能な配列との比較は、38kDaバンドでは公知ラクテートデヒドロゲナーゼとの非常に高い類似性を示し、他方50kDaバンドでは、NADHオキシダーゼとの非常に高い類似性を有することを示している。
【0060】
3)L.ブレビスからのNADHオキシダーゼの生化学的特性データ
4クロマトグラフィ段で精製された酵素プレパレートを用いて生化学的データを測定した。
【0061】
a)酸化のpH依存性
至適pHを、pH4.0〜10.0の範囲で測定した。pH値に応じて種々の緩衝液を使用した。緩衝液影響の対照として、緩衝液交換時にそのpH値を異なる緩衝液中で2回測定した(pH7.0及びpH 8.5)。そのpH範囲4.0〜7.0を得るために0.1Mクエン酸/Na2PO4を用い、7.0〜8.5のpH範囲を得るために0.1MTEAを用い、8.5〜10.0の範囲のpHを得るために0.1Mグリシン/NaOHを用いた。図1は、NADH酸化の至適がpH8.0〜8.5にあることを示している。
【0062】
b)NADHオキシダーゼのpH安定性
pH安定性の測定のために、NADHオキシダーゼを3a)に記載の緩衝液中で8時間インキュベートし、次いで、標準試験法で残留活性を測定した。図2は、この酵素がpH5.0で第1のシャープな至適安定性を有し、5.5〜7.5の範囲で中程度の安定性であり、pH8.5で第2の至適を示すことを示している。pH8.5では、この酵素はTEA/NaOH緩衝液中でもグリシン/NaOH緩衝液中でも8時間後になお100%安定である。この図は、この酵素が僅かなアルカリ性領域(pH8〜9)で、広い領域で安定であることを明らかにしている。この領域は、酸化のためのNADHオキシダーゼがNADH-依存性デヒドロゲナーゼと結びつけられるべき場合の使用目的のために有用である。それというのも、酸化のための多くのデヒドロゲナーゼの至適pHは、僅かにアルカリ性領域にあるからである。
【0063】
c)NADHオキシダーゼの至適温度
種々な温度での活性試験は、このNADHオキシダーゼが40℃で最大活性を示すことを示している(図3)。
【0064】
d)NADHオキシダーゼの温度安定性
温度安定性の試験のために、酵素試料を30〜42℃で貯蔵し、種々異なる時間にこの試料を取り、残留活性を測定した。評価結果は、この酵素が30℃で 約400分間実質的に安定であり、その後ゆっくりした反応速度で失活することを示している(半価時間約18時間)。この酵素は、42℃で先ず(約120分までに)比較的迅速に失活し始め、その後長時間(少なくとも16時間)にわたり約50%残留活性で安定である。
【0065】
e)NADHオキシダーゼについてのNADHに対するKM値の測定
基質NADHに対して、0.0013〜0.52mMの範囲内で濃度を変更し、活性を測光的に測定した。評価結果は、0.1mMで最大活性に達することを示している。より高いNADH濃度(0.5mMまで)は、弱い過剰-阻害を示すだけである。Km値は、24μMであることが計算される。NADHに対するこの酵素の高い親和性は、NAD+がNADHの酸化により再生されるべき用途のために非常に有利である。それというのも、これはできるだけ完全なNADHの酸化を前提としているからである。
【0066】
4)ラクトバシルス ブレビスからのNADHオキシダーゼのタンパク質化学的特性データ
a)N-末端アミノ酸配列
数回富化の結果として、常に、そのサブユニットがSDS-PAGEで分子量50kDaを示すタンパク質を生じた。N-末端の最初の27アミノ酸をこのタンパク質について測定することができ(アウトラインHPLC 120Aで自動シーケンサー(Automated Sequencer)4774(Applied Biosystems)を用いる自動Edman分解)、この配列はMKVTVVGCTHAGTFAIKQILAEEPDADXXVY(配列番号5)である。この配列中で保存モチーブに下線が付されており、これはNADHオキシダーゼにおいてFAD-結合モチーブとしての作用をし、公知ADP-結合部位GXGXXGの僅かな変更である。データバンク-サーチ(BLAST)は、既に、このタンパク質フラグメントについて公知NADHオキシダーゼとの一致を示している。
【0067】
b)タンパク質-及び遺伝子配列の決定
このデータバンクサーチの結果は、いくつかの部分領域中に、殆ど全てのNADHオキシダーゼ中に又は関連NADHペルオキシダーゼ中に存在する配列を示している。アミノ酸配列DIFAAGDSA(配列番号3)はこのような保存領域と見なされる。この配列を得るために、”C-末端”プライマーとして、アンチセンスコドンを使用し、かつN-末端MKVTVVGCT(配列番号4)をコードするプライマーと一緒にPCR中で使用する。PCRは、エンテロコッカスからのNADHオキシダーゼ(NOX)に対して59%の一致性を有する777bp長さの片を生じる。4種の異なる制限エンドヌクレアーゼ(EcoRI、PVu II、Sca I及びStu I)を用いるゲノムDNAの消化により、遺伝子ライブラリィが確立される。制限酵素の切断部位から誘導された特異的プライマー及び777bpフラグメントからの配列を用い、PCRを用いて、更なる配列フラグメントが得られ、この際、オーバーラップDNA配列及びストップコドンを用いて全配列を定義することができる。
【0068】
L.ブレビスからのNADHオキシダーゼ(NOX)の配列は、配列リスト(配列番号1)中に記載されている。
【0069】
5)補酵素再生のためのラクトバシルス ブレビスからのNADHオキシダーゼの使用
NADHオキシダーゼの典型的な用途は、NAD+の再生である。これは、例えば、一般に前記のように(反応式1)、NAD-依存性デヒドロゲナーゼが酸化のために使用される場合に必要である。このことは、次の反応式に従うエナンチオマー純粋なアルコールの製造の次の例で説明される:
(R,S)-アルコール+NAD+−−>S-アルコール+ケトン
+NADH + H+ (4)
NADH + H+ +1/2O2−−>NAD+ +H2O (5)
(反応(4)の触媒としてR-特異性アルコールデヒドロゲナーゼを、及び(5)のためにNADHオキシダーゼを使用)。
【0070】
この例で、R-特異性アルコールデヒドロゲナーゼとして、ラクトバシルス ブレビスからのR-アルコールデヒドロゲナーゼのNAD突然変異体(recADHG37D(NAD-当然変異体)DE10037101.9)をラクトバシルス ブレビスからの精製NADHオキシダーゼと組み合わせて用いた。アルコールとして(R,S)-フェニルエタノールを用い、この反応をバッチ反応として実施した。次の反応成分を用いた:50mM(R,S)-フェニルエタノール、2mM NADH、1mM MgCl2及び5mM DTTを有する50mM TEA緩衝液(pH7.0)、1U recADHG37D及び2U NADHオキシダーゼ。
【0071】
0、1、2、3、4、6、9及び24時間後に試料を取り、ガスクロマトグラフィ(カラム:CP-Chirasil-DEX CB、長さ:25m、直径:25μm(Fa. Chrompack)により分離した。温度プログラム:60℃で5分、次いで5℃/minで190℃まで;カラム流速1.3ml/min;ガス:ヘリウム。この際、アセトフェノンピーク(生成物;保留時間=16.9分)をもフェニルエタノールのエナンチオマー(出発物質;保留時間R-フェニルエタノール=20.8分及びS-フェニルエタノール=21.1分)をも検査した。図4は、R-アルコールが殆ど完全に酸化されている試料のGCスペクトルを示しており、これについて、酸化生成物アセトフェノンの相応する量を見ることができる。対照として、NADHオキシダーゼを添加しないだけで異なっている同じ実験を実施した。ガスクロマトグラフィ分析は、双方のアルコールにおいて著るしい変化を示しておらず、単に少量のアセトフェノンが検出でき、これは、おそらく空気中の酸素によるNADHの自然の酸化に帰因している。
【0072】
【配列表】
【0073】
【外7】
【0074】
【外8】
【0075】
【外9】
【0076】
【外10】
【0077】
【外11】
【0078】
【外12】
【0079】
【外13】
【図面の簡単な説明】
【図1】NADH酸化のpH依存性を示す図。
【図2】NADHオキシダーゼのpH安定性を示す図。
【図3】NADHオキシダーゼの活性と温度との関係を示す図。
【図4】試料のGCスペクトルクロマトグラフィ。
Claims (13)
- 配列番号1によるNADHオキシダーゼをコードする核酸又はそれに相補的な配列を有する核酸。
- 請求項1に記載の核酸によってコードされるNADHオキシダーゼ。
- 配列番号2によるNADHオキシダーゼ。
- 請求項1に記載の核酸1つ以上を有するプラスミド又はベクター。
- 請求項1に記載の核酸を製造するためのプライマー。
- キラルなエナンチオマー富化アルコール又はアミノ酸を製造するための、請求項2又は3に記載のNADHオキシダーゼ(NOX)の使用。
- 全細胞触媒の製法において、微生物に請求項4に記載のプラスミド又はベクターを移送する、全細胞触媒の製法。
- 請求項4に記載のプラスミド又はベクターを有する微生物。
- 請求項2又は3に記載のラクトバシルス ブレビス(Lactobacillus brevis)からのNADHオキシダーゼの製法において、請求項8に記載の微生物を好気的条件下に培養することを特徴とする、NADHオキシダーゼの製法。
- 微生物が、寄託番号DSM20054として寄託されているラクトバシラス ブレビス(Lactobacillus brevis)株である、請求項9に記載の方法。
- 請求項4に記載のプラスミド又はベクターと、デヒドロゲナーゼをコードするクローニングされた遺伝子とを有する、請求項8に記載の微生物。
- キラルなエナンチオマー富化アルコール又はアミノ酸の製法において、請求項8に記載の微生物を使用する、キラルなエナンチオマー富化アルコール又はアミノ酸の製法。
- キラルなエナンチオマー富化アルコール又はアミノ酸の製法において、請求項11に記載の微生物を使用する、キラルなエナンチオマー富化アルコール又はアミノ酸の製法。
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