DE10313972A1 - Gekoppeltes cofaktorabhängiges enzymatisches Reaktionssystem - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Anmeldung richtet sich auf ein Reaktionssystem, bei dem unter Zuhilfenahme eines gekoppelten enzymatisch arbeitenden Transformationsprozesses chemisch wertvolle Verbindungen in hohen Enantiomereneinheiten gewonnen werden können. DOLLAR A Das gekoppelte enzymatisch arbeitende Reaktionssystem besteht dabei aus einer enzymatischen Transformationsreaktion, die unter Verbrauch eines Cofaktors abläuft und einer enzymatisch ablaufenden Recyclierung des verbrauchten Cofaktors, wobei in einem homogenen wässrigen Lösungsmittelsystem, aufweisend einen organischen Kohlenwasserstoff mit mindestens zwei Hydroxyl- oder Ethergruppen, arbeitet.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein gekoppeltes enzymatisch arbeitendes Reaktionssystem, welches sich dadurch auszeichnet, dass es in einem homogenen Lösungsmittelgemisch durchgeführt wird. Insbesondere richtet sich die Erfindung auf ein Reaktionssystem umfassend eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer organischen Verbindung, wobei der Cofaktor im selben System enzymatisch regeneriert wird.
- Die Gewinnung optisch aktiver organischer Verbindungen, z.B. Alkohole und Aminosäure, auf biokatalytischem Wege gewinnt zunehmend an Bedeutung. Als ein Weg zur großtechnischen Synthese dieser Verbindungen hat sich der gekoppelte Einsatz zweier Dehydrogenasen unter Cofaktorregenerierung gezeigt (
DE 19753350 ). - Schema 1:
- In situ Regeneration von NADH mit der NAD-abhängigen Formiatdehydrogenase bei der reduktiven Aminierung von Trimethylpyruvat zu L-tert-Leucin (Bommarius et al. Tetrahedron Asymmetry 1995, 6, 2851–2888).
- Die im wäßrigen Medium effizient eingesetzten Biokatalysatoren weisen neben ihrer katalytischen Eigenschaft und Effizienz zudem den Vorteil auf, dass im Gegensatz zu einer Vielzahl an synthetischen metallhaltigen Katalysatoren auf den Einsatz metallhaltiger, insbesondere schwermetallhaltiger und somit toxischer Einsatzstoffe verzichtet werden kann. Auch kann auf den Einsatz von teuren und zudem gefährlichen Reduktionsmittel wie beispielsweise Boran bei der asymmetrischen Reduktion verzichtet werden.
- Allerdings treten Schwierigkeiten bei der Umsetzung von Substraten auf, die schlecht wasserlöslich sind. Ähnliche Schwierigkeiten liegen bei schlecht wasserlöslichen Produkten vor. Eine prinzipiell denkbare Lösung wäre die Durchführung der biokatalytischen Reduktion in einem polaren organischen Solvens bzw. einer wäßrigen Lösung daraus. Hierbei sollten sowohl Enzyme als auch Substrat und ggf. Produkt löslich sein. Ein genereller Nachteil einer direkten Gegenwart eines organischen Solvens stellt allerdings die im Allgemeinen auftretende erhebliche Verminderung der Enzymaktivität unter diesen Bedingungen dar (siehe z.B. Anderson et al., Biotechnol. Bioeng. 1998, 57, 79–86). Insbesondere die FDH als einzige bislang im technischen Maßstab eingesetzte und in kommerziellen Mengen zugängliche Formiatdehydrogenase weist bedauerlicherweise eine hohe Empfindlichkeit gegenüber organischen Solventien auf. Dieses zeigt sich auch in dem Vergleichsbeispiel 1 unter Verwendung von DMSO, Sulfolan, MTBE, Aceton, Isopropanol und Ethanol als organischer Solvenskomponente bei Zusatzmengen von je 10% (siehe
1 ). - Zur Lösung dieses Problems einer Stabilisierung der Formiatdehydrogenase aus Candida boidini in Gegenwart organischer Solventien sind verschiedene Ansätze bekannt, z.B. die Durchführung von Reaktionen durch zusätzlichen Einsatz von Tensiden als oberflächenaktive Stoffe. Nachteilig zeigt sich dabei aber die etwa um den Faktor 40 (!) verminderte Reaktionsgeschwindigkeit sowie die aufgetretene Inhibierung der Formiatdehydrogenase (B. Orlich et al., Biotechnol. Bioeng. 1999, 65, 357–362.). Die Autoren bemerken zudem, dass aufgrund der niedrigen Stabilität der eingesetzten Alkoholdehydrogenase ein Reduktionsprozeß unter diesen Bedingungen einer Mikroemulsion nicht ökonomisch ist.
- Eine weitere prinzipielle Möglichkeit der Durchführung von biokatalytischen Reaktionen besteht in der Anwendung immobilisierter Enzyme im organischen Solvens oder die Verwendung von Enzymen in einer homogenen Lösung, bestehend aus Wasser und einem wassermischbaren organischen Solvens. Allerdings sind diese Techniken bei der es zu einem direkten Kontakt von organischen Solvens und Enzym kommt auf wenige Enzymklassen, insbesondere Hydrolasen begrenzt. So wird in
DE 4436149 bemerkt, dass die „direkte Gegenwart von organischen Lösungsmitteln (wassermischbar oder nicht wassermischbar) nur von wenigen Enzymen vertragen wird, die zur Klasse der Hydrolasen gehören." Wenige weitere Beispiele aus anderen Enzymklassen sind zwar in der Zwischenzeit bekannt (so u.a. Oxynitrilasen), die inDE 4436149 gemachte Feststellung besitzt aber für die Mehrzahl der Enzyme nach wie vor Gültigkeit. So ist eine effiziente Immobilisierung der FDH aus Candida boidini nicht bekannt. Zudem ist die Immobilisierung selbst mit zusätzlichen Kosten durch den Immobilisierungsschritt sowie die Immobilisierungsmaterialien verbunden. - Technisch wurden deshalb Verfahren entwickelt, die die Gegenwart organischer Lösungsmittel aufgrund der Gefahr der Deaktivierung bzw. Denaturierung der Enzyme vermeiden. So beschreibt
DE 4436149 ein Verfahren, bei dem das Produkt aus der Reaktionslösung durch eine produktdurchlässige, insbesondere hydrophobe Membran in ein organisches Lösungsmittel extrahiert wird. Verglichen mit einem Standardverfahren in einem Rührkesselreaktor ist dieses Verfahren allerdings technisch deutlich aufwendiger, zudem sind auch die benötigten organischen Membranen ein zusätzlicher Kostenfaktor. Darüber hinaus ist diese Methode nur für kontinuierliche Prozesse geeignet. - Zusammenfassend läßt sich festhalten, dass somit kein Verfahren bekannt ist, welches die oben aufgeführten Nachteile umgehen hilft.
- Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es deshalb, eine Möglichkeit anzugeben, wie insbesondere schlecht wasserlösliche organische Verbindungen einer gekoppelten cofaktorabhängigen enzymatischen Umsetzung in derart ausreichendem Maße zugänglich gemacht werden können, dass eine Anwendung der Möglichkeit im technischen Maßstab unter insbesondere ökonomisch und ökologisch vorteilhaften Voraussetzungen erfolgen kann.
- Diese Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst. Ansprüche 1 bis 8 richten sich auf ein erfindungsgemäß operierendes Reaktionssystem. Anspruch 9 schützt eine Vorrichtung. Anspruch 10 betrifft ein erfindungsgemäß arbeitendes Verfahren, wohingegen die Ansprüche 11 und 12 auf bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen Reaktionssystems gerichtet sind.
- Dadurch, dass man ein gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer organischen Verbindung und eine enzymatische Regeneration des Cofaktors zur Verfügung stellt, wobei das Reaktionssystem in einem homogenen wässrigen Lösungsmittelsystem aufweisend einen organischen Kohlenwasserstoff mit mindestens zwei Hydroxyl- oder Ethergruppen arbeitet, gelangt man insbesondere überraschend, keinesfalls vorhersehbar und erfindungsgemäß besonders vorteilhaft zur Lösung der gestellten Aufgabe. Entgegen der aus dem Stand der Technik ableitbaren Meinung ist es überraschenderweise möglich, trotz Anwesenheit eines bestimmten wasserlöslichen organischen Kohlenwasserstoffs das gekoppelte enzymatische Reaktionssystem ohne lösungsmittelbedingten Aktivitätsverlust eines der Enzyme arbeiten zu lassen.
- Als bevorzugt einzusetzende organische Kohlenwasserstoffe haben sich Verbindungen der allgemeinen Formel (I)wobei
n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist,
m 0 oder 1 ist,
R1 bis R8 unabhängig voneinander H, (C1-C8)-Alkyl,
(C2-C8)-Alkoxyalkyl, (C6-C18)-Aryl, (C7-C1 9)-Aralkyl,
(C1-C8)-Alkyl-(C6-C18)-Aryl, (C3-C8)-Cycloalkyl,
(C1-C8)-Alkyl-(C3-C8)-Cycloalkyl, (C3-C8)-Cycloalkyl-(C1-C8)-Alkyl, bedeuten, erwiesen. - Ganz besonders bevorzugt ist der Einsatz von Ethylenglykol, DME oder Glycerin in diesem Zusammenhang.
- Dem Fachmann ist freigestellt, in welcher Menge er das organische Cosolvents zur Reaktionsmischung hinzugibt. Die optimale Menge lässt sich mithin durch Routineexperimente ermitteln. Bevorzugt ist die Zugabe in einer Menge von 1 – 80, mehr bevorzugt von 5 – 60 und ganz besonders bevorzugt von 10–45 Vol.-% in Bezug auf die vorhandene wässrige Phase.
- Als Cofaktoren werden vorzugsweise die am gebräuchlichsten und unter den Reaktionsbedingungen am ökonomischten arbeitenden Cofaktoren herangezogen. Insbesondere sind dies die Cofaktor NADH oder NADPH.
- Als Enzym für die Transformation der organischen Verbindung wird vorzugsweise eine Dehydrogenase eingesetzt. Prinzipiell kann das Reaktionssystem jedoch auch mit jedweder anderen cofaktorabhängigen Oxidoreductase betrieben werden, wobei der Cofaktor durch die Oxidoreduktase verbraucht wird und durch ein zweites enzymatischen System regeniert werden kann, es sich also um ein gekoppeltes enzymatisches System handelt. Weitere geeignete Enzyme dieser Art können der Literatur entnommen werden (Enzyme Catalysis in Organic Synthesis; Ed.: K. Drauz, H. Waldmann, Vol. I und II, VCH, 1995).
- Als bevorzugt einzusetzendes Enzym hat sich eine Alkoholdehydrogenase oder Aminosäuredehydrogenase erwiesen.
- Die Art der Regeneration des Cofaktors richtet sich primär nach dem eingesetzten Cofaktor selbst. Aus oben angegebener Literatur sind verschiedene Methoden der Cofaktorregenerierung zu entnehmen. Der Fachmann ist unter den gegebenen Randbedingungen von Lösungsmittel, Enzymen, Raumzeitausbeute frei in der Wahl des Regenerationsmediums. Im Allgemeinen eignet sich im Hinblick auf NAD+ als Cofaktor (bei Oxidationsreaktionen) eine NADH-Oxidase aus z.B. Lactobacillus brevis oder L. kefir (
DE 10140088 ). Weiterhin hat sich bei Reduktionsreaktionen auch die Regeneration des Cofaktors NADH durch eine Formiatdehydrogenase als sehr erfolgreich erwiesen. - Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine Vorrichtung zur Transformation von organischen Verbindungen aufweisend ein erfindungsgemäßes Reaktionssystem. Hierbei kann es sich z.B. um ein enzymatisches Kit handeln.
- Vorteilhaft einzusetzende Vorrichtungen sind beispielsweise der Rührkessel oder Rührkesselkaskaden, oder Membranreaktoren, die sowohl im batch-Betrieb als auch kontinuierlich betrieben werden können.
- Im Rahmen der Erfindung wird unter Membranreaktor jedwedes Reaktionsgefäß verstanden, bei dem der Katalysator in einem Reaktor eingeschlossen wird, während niedermolekulare Stoffe dem Reaktor zugeführt werden oder ihn verlassen können. Dabei kann die Membran direkt in den Reaktionsraum integriert werden oder außerhalb in einem separaten Filtrationsmodul eingebaut sein, bei der die Reaktionslösung kontinuierlich oder intermittierend durch das Filtrationsmoduul strömt und das Retentat in den Reaktor zurückgeführt wird. Geeignete Ausführungsformen sind u.a. in der WO 98/22415 und in Wandrey et al. in Jahrbuch 1998, Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen, VDI S. 151ff.; Wandrey et al. in Applied Homogeneous Catalysis with Organometallic Compounds, Vol. 2, VCH 1996, 5.832 ff.; Kragl et al., Angew. Chem. 1996, 6, 684f. beschrieben.
- Die in dieser Apparatur neben dem batch- und semikontinuierlichen Betrieb mögliche kontinuierliche Fahrweise kann dabei wie gewünscht im Cross-Flow-Filtrationsmodus (
3 ) oder als Dead-End-Filtration (2 ) durchgeführt werden. Beide Verfahrensvarianten sind prinzipiell im Stand der Technik beschrieben (Engineering Processes for Bioseparations, Ed.: L.R. Weatherley, Heinemann, 1994, 135–165; Wandrey et al., Tetrahedron Asymmetry 1999, 10, 923–928). - Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ebenfalls ein Verfahren zur enzymatischen Transformation einer organischen Verbindung unter Anwendung des erfindungsgemäßen Reaktionssystem. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um die Herstellung einer enantiomer angereicherten organischen Verbindungen, vorzugsweise einer α-Aminosäure oder einem chiralen Alkohol.
- Die Ausgestaltung des Verfahrens kann anhand des beschriebenen Reaktionssystems und den nachfolgend dargelegten Beispielen nach dem Belieben des Fachmanns ausgeführt werden. Es werden unter den gegebenen Randbedingungen die sonst für die enzymatische Umsetzung bekannten Bedingungen entsprechend eingestellt.
- Ebenfalls ein Aspekt der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Reaktionssystems zur enzymatischen Transformation organischer Verbindungen oder zur Diagnose bzw. Analyse bestimmter organischer substanzen.
- Vorzugsweise erfolgt die enzymatische Transformation einer organischen Verbindung dabei unter Ausbildung von enantiomer angereicherten Produkten.
- Unter gekoppeltem enzymatischen System wird erfindungsgemäß verstanden, dass eine enzymatische Transformation einer organischen Verbindung unter Verbrauch eines Cofaktors abläuft und der Cofaktor in situ durch ein zweites enzymatisches System regeniert wird. Im Ergebnis führt dies zu einer Verminderung des Einsatzes teurer Cofaktoren.
- Es ist dabei besonders überraschend, dass trotz der gängigen Lehrmeinung die beiden eingesetzten Enzyme nicht durch die Anwesenheit des organischen Mediums beeinträchtigt werden und es so gelingt, in sehr guten Raumzeitausbeuten die gewünschten Produkte herzustellen.
- Wie sich gezeigt hat, können für sowohl DME als auch Ethylenglykol im Gegensatz zu den meisten organischen Solventien (siehe Vergleichsbeispiele), die zu einer schnellen Desaktivierung der eingesetzten FDH führen, hervorragende Stabilitätseigenschaften der Formiatdehydrogenase auch nach mehreren Tagen noch beobachtet werden. Während beispielsweise in Gegenwart von Aceton bzw. DMSO die Enzymaktivität innerhalb von 24 Stunden um 35 bzw. 66% abnimmt, sind in Gegenwart von 10% DME noch 80% Enzymaktivität selbst nach 5 Tagen zu verzeichnen. Die Ergebnisse mit DME und Ethylenglykol finden sich in
1 graphisch dargestellt und Tabelle 3 wieder. Die Vergleichsbeispiele mit anderen organischen Solventien sind ebenfalls in1 aufgeführt. - Das Verfahren gelingt sowohl mit dem Wildtyp der Formiatdehydrogenase aus Candida Boidini aber auch mit einer gentechnisch veränderten Form dieses Enzyms (
DE 19753350 ). Als Cofaktor kommt wie gesagt vorzugsweise NADH zum Einsatz. Für die experimentellen Versuche kann beispielsweise eine ADH aus Rhodococcus, vorzugsweise Rhodococcus erythropolis, in nativer oder rekombinanter Form, als ADH-Komponente zum Einsatz kommen. Die eingesetzten Enzyme können in beliebig aufgereinigter nativer oder rekombinat hergestellter Form zur Reaktion eingesetzt werden. Ebenfalls denkbar ist deren Einsatz in Form der intakten ganzen Zellen des Wirtsorganismus. Dabei ist ebenfalls die Ausgestaltung vorteilhaft, bei der beide Enzymsysteme in einem an die optimale Reaktion angepassten Zustand im Ganzzellkatalysator vorliegen (DE 10218689 ). - Interessant ist zudem, dass in Gegenwart von organischen Kohlenwasserstoffen der Formel (2) auch die Alkoholdehydrogenase eine hohe Stabilität zeigt. Das erfindungsgemäße Solventsystem eignet sich somit für die Durchführung asymmetrischer biokatalytischer Reduktionen. Dies wurde anhand der asymmetrischen Synthese von 1-p-Chlorphenylethan-1-ol bzw. 1-n-Butylphenylethan-1-ol ausgehend von p-Chloracetophenon bzw. p-(n-Butyl)acetophenon experimentell untersucht.
- Nach einer Reaktionszeit von 110 Stunden wurde das Produktmit einer Bildungsrate von 59% bzw. 70% für p-Chloracetophenon bzw. p-(n-Butyl)acetophenon als Substrat gebildet.
- Ein Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht in der Einfachheit des Prozesses. So sind keine aufwendigen Verfahrensschritte enthalten, und das Verfahren kann sowohl in Batchreaktoren als auch kontinuierlich durchgeführt werden. Ebenso werden im Gegensatz zu früheren Verfahren keine speziellen Membranen, die das wäßrige Medium vom organischen Medium trennen, benötigt. Auch die in einigen bisherigen Prozessen benötigten Tensid-Zusätze entfallen bei diesem Verfahren. Dies war so aus dem Stand der Technik nicht zu entnehmen und macht dennoch das gegenständliche Verfahren überaus vorteilhaft.
- Als linear oder verzweigte (C1-C8)-Alkyl sind anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl samt aller ihrer Bindungsisomeren. Als (C2-C8)-Alkoxyalkyl sind Reste gemeint, bei denen die Alkylkette durch mindestens eine Sauerstoffunktion unterbrochen ist, wobei nicht zwei Sauerstoffatome miteinander verbunden sein können. Die Anzahl der Kohlenstoffatome gibt die Gesamtzahl der im Rest enthaltenen Kohlenstoffatome an. Es sind alle Bindungsisomere mitumfaßt.
- Unter (C3-C8)-Cycloalkylrest versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw. Cycloheptylreste etc. Mit Hetreoatomen substituierte Cyckloalkylrest sind vorzugsweise z. B. 1-, 2-, 3-, 4-Piperidyl, 1-, 2-, 3-Pyrrolidinyl, 2-, 3-Tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-Morpholinyl.
- Ein (C3-C8)-Cycloalkyl- (C1-C8)-Alkylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten Cycloalkylrest, welcher über einen wie oben angegebenen Alkylrest an das Molekül gebunden ist.
- Unter einem (C6-C1 8)-Arylrest wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl-, Biphenylreste.
- Ein (C7-C19)-Aralkylrest ist ein über einen (C1-C8)-Alkylrest an das Molekül gebundener (C6-C18)-Arylrest.
- Enantiomerenangereichert bezeichnet die Tatsache, daß eine optische Antipode im Gemisch mit ihrer anderen zu > 50% vorhanden ist.
- Die dargestellten Strukturen beziehen sich auf alle möglichen Diastereomere und bezüglich eines Diastereomers auf die darunter fallenden möglichen zwei Enantiomere der in Frage stehenden Verbindung.
- Unter homogenen wässrigen Lösungsmittelsystem wird erfindungsgemäß verstanden, dass der eingesetzte Kohlenwasserstoff mit der wässrigen Phase eine homogene Lösung bilden, mithin also nur eine flüssige Phase vorliegt.
- Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachfolgend beschriebenen Beispiel verdeutlicht.
- Beschreibungen der Zeichnungen:
-
1 zeigt einen Membranreaktor mit Dead-End-Filtration. Das Substrat1 wird über eine Pumpe2 in den Reaktorraum3 überführt, der eine Membran5 aufweist. Im rührerbetriebenen Reaktorraum befinden sich neben dem Lösungsmittel der Katalysator4 , das Produkt6 und nicht umgesetztes Substrat1 . Über die Membran5 wird hauptsächlich niedermolekulares6 abfiltriert. -
2 zeigt einen Membranreaktor mit Cross-Flow-Filtration. Das Substrat7 wird hier über die Pumpe8 in den gerührten Reaktorraum überführt, in dem sich auch Lösungsmittel, Katalysator9 und Produkt14 befindet. Über die Pumpe16 wird ein Lösungsmittelfluß eingestellt, der über einen ggf. vorhandenen Wärmetauscher12 in die Cross-Flow-Filtrationszelle15 führt. Hier wird das niedermolekulare Produkt14 über die Membran13 abgetrennt. Hochmolekularer Katalysator9 wird anschließend mit dem Lösungsmittelfluß ggf. wieder über einen Wärmetauscher12 ggf. über das Ventil11 zurück in den Reaktor10 geleitet. - Experimenteller Teil:
- Beispiel 1 (Vergleichsbeispiele der FDH-Aktivitäten)
- Es werden 2,72 g (0,8 mol/L) Natriumformiat und 1,14 g (0,1 mol/L) Di-Kalium-Hydrogen-Phosphat-Tri-Hydrat eingewogen und in 40 mL VE-H2O gelöst. Mit Ammoniak-Lösung (25%) und Ameisensäure (100%), bzw. entsprechenden Verdünnungen, wird der pH-Wert der Lösung auf 8,2 gestellt. Dann wird die Lösung in einen 50 mL-Meßkolben überführt und mit VE-H2O aufgefüllt. Separat dazu werden 71,7 mg (4 mmol/L) NAD+-Tri-Hydrat abgewogen und in ca. 20 mL VE-H2O gelöst. Mit Ammoniak-Lösung (25%) und Ameisensäure (100%), bzw. entsprechenden Verdünnungen, wird der pH-Wert der Lösung auf 8,2 gestellt. Dann, wird die Lösung in einen 25 mL-Meßkolben überführt und mit VE-H2O aufgefüllt. Anschließend werden jeweils 500 μL der Substratlösung sowie der NADH-Lösung in der zur Messung verwendeten 1 cm-Küvette gemischt. Nach Zugabe von 10 μL der Enzymlösung, wobei als Lösungsmittel eine 10%-ige Lösung eines organischen Solvens (siehe Tabelle) in Wasser zum Einsatz kommt, wird kurz geschüttelt, die Küvette ins Photometer gestellt und die Datenaufnahme gestartet. Die Enzymlösung wird erst direkt vor Meßbeginn zugegeben. Die Aktivitäten der Enzyme werden nach bestimmten Zeitabschnitten durch den photometrischen Nachweis der Reaktion NAD+ zu NADH bestimmt. Die photometrische Messung erfolgte bei einer Temperatur von 30° C, einer Wellenlänge von 340 nm und mit einer Meßzeit von 15 min. Die Ergebnisse sind anbei in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt.
- Tab. 1. Enzymaktivität der FDH in U/mL in Abhängigkeit von Solvens und Zeit
- Tab. 2. Enzymaktivität der FDH in U/mL in Abhängigkeit von Solvens und Zeit
- Beispiel 2 (Messung der FDH-Aktivitäten)
- Die Bestimmung der Aktivität erfolgte gemäß der Vorschrift in Beispiel 1, wobei als organische Solvenskomponente DME bzw. Ethylenglykol verwendet wurde. Die Ergebnisse sind anbei in Tabelle 3 dargestellt.
- Tab. 3. Enzymaktivität der FDH in U/mL in Abhängigkeit von Solvens und Zeit
-
- Beispiel 3:
- Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 25mM p-Chloracetophenon, sowie 0.1mM NAD+, 75mM Natriumformiat bei Enzymkonzentrationen von 0.1U/ml S-ADH und 0.2U/ml FDH (DM), läßt man bei einer Reaktionstemperatur von 30°C über einen Zeitraum von 110 Stunden in einem Solvenssystem, bestehend aus 90 Vol.-% 100mM Phosphat-Puffer mit einem pH von 7.5 und 10 Vol.-% DME, rühren. Anschließend werden die organischen Komponenten mit Methylenchlorid extrahiert, die wäßrige Phase verworfen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Das nach Filtration resultierende Filtrat wird im Vakuum von den leichtflüchtigen Bestandteilen befreit, und das resultierende Öl analytisch via 1H-Kernresonanzspektroskopie hinsichtlich der Bildungsrate untersucht. Es wurde eine Bildungsrate von 59% ermittelt.
- Beispiel 4:
- Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 25mM p-(n-Butyl)acetophenon, sowie 0.1mM NAD+, 75mM Natriumformiat bei Enzymkonzentrationen von 0.2U/ml S-ADH und 0.4U/ml FDH (DM), läßt man bei einer Reaktionstemperatur von 30°C über einen Zeitraum von 110 Stunden in einem Solvenssystem, bestehend aus 90 Vol.-% 100mM Phosphat-Puffer mit einem pH von 7.5 und 10 Vol.-% DME, rühren. Anschließend werden die organischen Komponenten mit Methylenchlorid extrahiert, die wäßrige Phase verworfen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Das nach Filtration resultierende Filtrat wird im Vakuum von den leichtflüchtigen Bestandteilen befreit, und das resultierende Öl analytisch via 1H-Kernresonanzspektroskopie hinsichtlich der Bildungsrate untersucht. Es wurde eine Bildungsrate von 70% ermittelt.
- Beispiel 5: Umsetzung mit 20%(v/v)-Ethylenglykolanteil
- Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 1.3 mmol p-Chloracetophenon (208.3mg; 13 mM), sowie 0.24 mmol NADH (169.4 mg; 2.4 mM), 6.2 mmol Natriumformiat (62 mM; 421.7 mg; 4.8 Äquivalente bezogen auf das Keton) bei Enzymmengen von 24 U einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 24 U einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (Doppelmutante: C23S, C262A; expr. in E. coli), läßt man bei einer Reaktionstemperatur von 30°C über einen Zeitraum von 21 Stunden in einem Solvenssystem, bestehend aus 80 Vol.-% 50mM Phosphat-Puffer mit einem pH von 7.0 und 20 Vol.-% Ethylenglykol, rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via PLC ermittelt. Nach 21 Stunden wurde eine vollständige Umsetzung des Ketons festgestellt. Anschließend werden die organischen Komponenten mit 4 Λ 100 mL Methyl-tertbutylether extrahiert, die wäßrige Phase verworfen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Das nach Filtration resultierende Filtrat wird im Vakuum von den leichtflüchtigen Bestandteilen befreit, und der resultierende Rückstand nach weiterem Versetzen mit MTBE und Trennung der entstehenden zwei Phasen analytisch via 1H-Kernresonanzspektroskopie hinsichtlich der Bildungsrate untersucht. Es wurde eine Bildungsrate von > 99% ermittelt.
- Beispiel 6: Umsetzung mit 40%(v/v)-Ethylenglykolanteil
- Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 2.63 mmol p-Chloracetophenon (407.3mg; 26.3 mM), sowie 0.52 mmol NADH (372.1 mg; 5.2 mM), 14.4 mmol Natriumformiat (144 mM; 979.3 mg; 5 Äquivalente bezogen auf das Keton) bei Enzymmengen von 52.4 U einer (S)-ADH aus R. erythropolis (expr. in E. coli) und 52.4 U einer Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (Doppelmutante: C23S, C262A; expr. in E. coli), läßt man bei einer Reaktionstemperatur von 30°C über einen Zeitraum von 21 Stunden in einem Solvenssystem, bestehend aus 60 Vol.-% 50mM Phosphat-Puffer mit einem pH von 7.0 und 40 Vol.-% Ethylenglykol, rühren. Es werden in diesem Zeitraum Proben genommen und der jeweilige Umsatz via PLC ermittelt. Nach 21 Stunden wurde eine vollständige Umsetzung des Ketons festgestellt. Anschließend werden die organischen Komponenten mit 2 × 100 mL Methyl-tertbutylether extrahiert, die wäßrige Phase verworfen und die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet. Das nach Filtration resultierende Filtrat wird im Vakuum von den leichtflüchtigen Bestandteilen befreit, und der resultierende Rückstand nach weiterem Versetzen mit MTBE und Trennung der entstehenden zwei Phasen analytisch via 1H-Kernresonanzspektroskopie hinsichtlich der Bildungsrate untersucht. Es wurde eine Bildungsrate von > 99% ermittelt.
Claims (12)
- Gekoppeltes enzymatisches Reaktionssystem aufweisend eine cofaktorabhängige enzymatische Transformation einer organischen Verbindung und eine enzymatische Regeneration des Cofaktors, wobei das Reaktionssystem in einem homogenen wässrigen Lösungsmittelsystem aufweisend einen organischen Kohlenwasserstoff mit mindestens zwei Hydroxyl- oder Ethergruppen arbeitet.
- Reaktionssystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der eingesetzte organische Kohlenwasserstoff nach der allgemeinen Formel (I)wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 10 ist, m 0 oder 1 ist R1 bis R8 unabhängig voneinander H, (C1-C8)-Alkyl, (C2-C8)-Alkoxyalkyl, (C6-C18)-Aryl, (C7-C19)-Aralkyl, (C1-C8)-Alkyl-(C6-C18)-Aryl, (C3-C8)-Cycloalkyl, (C1-C8)-Alkyl-(C3-C8)-Cycloalkyl, (C3-C8)-Cycloalkyl-(C1-C8)-Alkyl, bedeuten, ausgebildet ist.
- Reaktionssystem nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als organischer Kohlenwasserstoff Ethylenglykol, DME oder Glycerin verwendet werden.
- Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der organische Kohlenwasserstoff in einer Menge von 1-80, mehr bevorzugt von 5 – 60 und ganz besonders bevorzugt von 10–45 Vol.-% in Bezug auf die wässrige Phase vorhanden ist.
- Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Cofaktor NADH oder NADPH eingesetzt wird.
- Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Enzym für die Transformation der organischen Verbindung eine Dehydrogenase eingesetzt wird.
- Reaktionssystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Alkoholdehydrogenase oder eine Aminosäuredehydrogenase einsetzt.
- Reaktionssystem nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Regeneration des Cofaktors durch eine Formiatdehydrogenase erfolgt.
- Vorrichtung zur Transformation von organischen Verbindungen aufweisend ein Reaktionssystem nach Anspruch 1.
- Verfahren zur enzymatischen Transformation organischer Verbindungen unter Anwendung des Reaktionssystems nach Anspruch 1.
- Verwendung des Reaktionssystems nach Anspruch 1 zur enzymatischen Transformation organischer Verbindungen oder zur Diagnose bzw. Analyse.
- Verwendung nach Anspruch 11 in einem Verfahren zur Herstellung enantiomer angereicherter organischer Verbindungen.
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