DE19605683A1

DE19605683A1 - Verfahren zur Trennung von Substanzen mittels einer geeigneten Membran

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Publication number: DE19605683A1
Application number: DE1996105683
Authority: DE
Inventors: Karsten Seelbach; Guido Giffels; Udo Dr Kragl; Christian Prof Wandrey
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1996-02-16
Filing date: 1996-02-16
Publication date: 1997-09-11
Also published as: WO1997029837A3; EP0880398A2; WO1997029837A2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung von Substanzen mittels einer geeigneten Membran gemäß Anspruch 1 bis 8.

Trennprozesse sind ein wesentlicher Bestandteil aller (bio)chemischen Synthesen. So ist die Trennung von Substanzen für die Gewinnung von Produkten, die während oder nach Synthesen gebildet werden bzw. worden sind, unerläßlich. Sie stellt für die Syntheseplanung bei Produktionen im großen Maßstab ein wichtiges Kriterium dar. Vielfach entscheidet gerade die Abtrennung von Zwischen- oder Endprodukten in einer geforderten Qualität über den möglichen Syntheseweg.

Bei katalytischen Reaktionen bzw. bei Reaktionen, die Synthesehilfsstoffe benötigen, kann zusätzlich die Abtrennung dieser Hilfsstoffe vom gebildeten Produkt wichtig werden. Denn Synthesehilfsstoffe, wie beispielsweise Katalysatoren bei chemischen Synthesen oder auch Cofaktoren bei enzymatischen Synthesen, sind in der Regel sehr kostspielig. Daher ist es das Ziel, die Synthesehilfsstoffe so effektiv wie möglich zu nutzen, um die Kosten von Synthesen weitestgehend zu vermindern. Dafür werden zum einen die für entsprechende Synthesen einzusetzenden Mengen an Hilfsstoffen möglichst gering gehalten. Zum anderen gibt es aber auch bereits verschiedene Ansätze, um eine verbesserte Ausnutzung von Synthesehilfsstoffen zu ermöglichen. Dazu zählen insbesondere Versuche, die während der Synthesen gebildeten Produkte vom Hilfsstoff zu trennen, um eine Wiederverwendung des Hilfsstoffes zu erreichen.

Die Trennung von Produkten vom Synthesehilfsstoff wurde bisher auf verschiedene Weise verwirklicht. So werden beispielsweise die Hilfsstoffe bzw. Katalysatoren auf Trägern immobilisiert, wobei aber häufig die Kontaktflächen zwischen Hilfsstoff und Träger stark vermindert sind, was man durch eine entsprechende Erhöhung der Porösität des Trägermaterials zu kompensieren versucht. Auch ist der Immobilisierungsvorgang in Bezug auf den Arbeitsaufwand und den Katalysatorverlust nicht unproblematisch. Desweiteren resultiert eine Immobilisierung häufig in einer veränderten Wirkweise des Hilfsstoffes.

Eine weitere Möglichkeit zur Trennung von Produkten vom Synthesehilfsstoff erfolgt durch Einsatz von Membranen. So werden beispielsweise die bei enzymatischen Umsetzungen eingesetzten Enzyme durch Membranen von der übrigen Reaktionslösung abgetrennt. Allerdings ist eine solche Abtrennung deshalb möglich, weil die Molmasseunterschiede zwischen Enzym bzw. Protein und den übrigen Reaktionsteilnehmern, wie Substrate, Produkte, Cokatalysator bzw. Cofaktor u.ä., in der Regel sehr groß sind: So liegt die Molmasse von Enzymen in einem Bereich von 40 000 g/mol, die der übrigen Reaktionsteilnehmern häufig unter 1000 g/mol. In Fig. 1 ist die Retentionsrate von käuflich zu erwerbenden Membranen (amicon) gegen die Molmasse aufgetragen. Wie aus dieser Figur hervorgeht, lassen sich Enzyme in dem genannten Molmassebereich leicht durch eine Membran, wie beispielsweise der YM10-Membran, von den übrigen Substanzen mit einer Molmasse unter 1000 g/mol abtrennen.

Betrachtet man die Graphik der Membranen mit geringerer Porengröße, z. B. für die Membran YC05 (nominelle Trenngrenze 500 g/mol), muß man feststellen, daß nicht mehr von einer Trenngrenze gesprochen werden sollte. Es entsteht vielmehr ein Massenbereich, bei dem eine mehr oder weniger gute Retention der Moleküle auftritt. Diese Tendenz ist bereits bei den Membranen YM1 (nominelle Trenngrenze 1000 g/mol) und YM3 (nominelle Trenngrenze 3000 g/mol) zu erkennen. Versucht man also eine Trennung von Substanzen, deren Molmassedifferenz bezogen auf die nominelle Trenngrenze relativ gering ist, so findet man bei hohen nominellen Trenngrenzen (wie z. B. bei YM10-, YM30-, YM100-Membranen) gute Retentionsunterschiede, während man bei geringen nominellen Trenngrenzen (wie z. B. bei YC05-, YM1-, YM3-Membranen) keine oder kaum Retentionsunterschiede findet.

Soll beispielsweise der bei enzymatischen Umsetzungen ebenfalls häufig einzusetzende Hilfsstoff bzw. Cofaktor NAD(P) oder NAD(P)H, dessen Molmasse bei etwa 700 g/mol liegt, von gebildeten Produkten mit einer Molmasse beispielsweise bei 150 g/mol getrennt werden, ist eine Separation mittels Membranen, wie in Fig. 1 dargestellt, nicht mehr möglich: Bei Verwendung einer YC05-Membran gemäß Fig. 1 wäre damit zu rechnen, daß etwa 75% des Produkts von der Membran zurückgehalten werden und damit keine effektive Trennung zwischen Cofaktor und Produkt stattfindet. Bei Verwendung einer YM1-Membran gemäß Fig. 1 würde zwar das Produkt nicht zurückgehalten; dafür würde aber auch ein relativ großer Anteil des Cofaktors die Membran passieren und damit ebenfalls keine effektive Abtrennung beider Substanzen erfolgen. Dieses, aus enzymkatalysierten Umsetzungen angeführte Beispiel ist selbstverständlich auch auf andere Umsetzungen übertragbar: So werden beispielsweise in der chemischen Katalyse wertvolle Hilfsstoffe, darunter auch Katalysatoren, eingesetzt, deren Wiederverwendung von großer Bedeutung ist. Aber auch in diesen Fällen ist der Molmasseunterschied zwischen Produkt und Katalysator bzw. Hilfsstoff häufig so gering, daß mit einer Trennung der Substanzen mittels Membranen nicht zu rechnen ist.

Um trotzdem eine Abtrennung durch Filtration zu ermöglichen, wurden abzutrennende Substanzen, wie z. B. Synthesehilfsstoffe, derart vergrößert, daß sie sich in ihrer molaren Masse und ihrem sterischen Anspruch um Größenordnungen von denen der weiteren Substanzen bzw. der gebildeten Produkte unterscheiden, um eine Rückhaltung mittels geeigneter Membranen zu erreichen. Die Hauptnachteile einer solchen Vorgehensweise sind aber auch hier - wie bereits oben für die Immobilisierung der Hilfsstoffe erwähnt - hohe Verluste des Hilfsstoffes, z. B. während der Polymeranbindung, sowie veränderte Eigenschaften: Beispielsweise wird durch chemische Modifizierung von Cofaktoren, die im übrigen bisher nur für eine geringe Anzahl von Cofaktoren durchgeführt werden konnte, häufig die Affinität des Enzyms zu den Cofaktoren herabgesetzt.

Es wurde nunmehr überraschenderweise gefunden, daß eine Trennung von Substanzen mittels Membranen mit niedriger Trenngrenze auch dann erfolgt, wenn die Molmasseunterschiede zwischen den Substanzen relativ gering sind. Dafür sollte die Molmasse einer Substanz S₁ 70 bis 1000 g/mol, die Molmasse einer weiteren Substanz S₂ 300 bis 2000 g/mol, die Molmassedifferenz S₂ minus S₁ 200 bis 1000 g/mol, der Quotient (S₂ minus S₁)/S₂ 0,5 bis 0,9 und die Retentionsrate von S₂ mindestens 75 bis 80% betragen. Für das Trennverfahren geeignete Membranen sind solche, die im Handel in der Regel als Nanofiltrations- oder Umkehrosmosemembranen bezeichnet werden. Eine für eine Trennung optimale Membran kann durch Versuche ermittelt werden, wobei Herstellerangaben über nominelle Trenngrenzen oder Salzretentionsraten nur als Anhaltspunkte dienen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren sind Substanzen mit den folgenden Molmassen sehr gut trennbar, wobei die Retentionsrate der Substanz S₂ 95 bis zu 100% beträgt:

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Trennung von in Gegenwart eines Synthesehilfsstoffes gebildeten Produkten vom Synthesehilfsstoff geeignet. Damit können aus enzymkatalysierten Umsetzungen erhaltene Produkte von Cofaktoren oder auch aus chemischer, vorzugsweise asymmetrischer chemischer Katalyse erhaltene Produkte vom Katalysator getrennt werden. Insbesondere bei enzymkatalysierten Umsetzungen erfolgt eine äußerst effektive Trennung von Produkten und Cofaktoren, wie NAD(P), FAD oder PQQ. Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist damit eine Rückhaltung von Hilfsstoffen bzw. Abtrennung von Produkten, insbesondere von Epoxiden, Aminosäuren, Alkoholen oder α-Hydroxysäuren, bei vergleichbaren Größenordnungen, aber leicht unterschiedlichen Retentionen möglich. Auch können Trennungen in allen Lösungsmitteln und unter allen membranverträglichen Bedingungen durchgeführt werden. Zudem sind die Hilfsstoffe ohne Veränderung einsetzbar und verlieren damit auch nicht ihre typischen Charakteristika.

Desweiteren kann das Verfahren aber auch zur Trennung einer Vielzahl weiterer Substanzen eingesetzt werden, z. B. solcher Substanzen, die in Tabelle 1 beispielhaft aufgeführt sind. Dabei handelt es sich bei Substanz 2 teilweise um nicht-komplexierte Liganden eines Synthesehilfsstoffes; für Substanz 1 gelten hinsichtlich der Molmassebereiche die erfindungsgemäßen Bedingungen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen sowie dreier Ausführungsbeispiele näher erläutert.

Es zeigen schematisch für die enzymatische Katalyse (Beispiel 1 und 2):

Fig. 2 eine Reaktion, wie sie in einem Membranreaktor durchgeführt wurde. Ein Substrat S wird in einer durch Enzym 1 katalysierten Reaktion zu einem Produkt P umgesetzt. Dazu wird ein Cofaktor, hier NADH, benötigt, der zu NAD⁺ abreagiert und in einer zweiten Reaktion, durch ein Enzym 2 katalysierten Reaktion (Oxidation von Ameisensäure, HCOOH, zu CO₂) regeneriert wird.

Fig. 3 Einsatz einer Nanofiltrations- (NF) bzw. Umkehrosmosemembran (RO) in einem Membranreaktor (1). Die Substrat, Cofaktor und HCOOH enthaltene Feedlösung wird dem Reaktor über eine Pumpe (3) zugeführt. Die NF-/RO-Membran (2) hält nun die Enzyme (4) und einen Teil der Cofaktoren zurück, während nicht abreagiertes Substrat und entstandenes Produkt sowie der geringe Anteil des Cofaktors die Membran passieren.

Die in Fig. 3 dargestellte Anordnung wurde zur Produktion von chiralen Alkoholen und Aminosäuren verwendet. Die Prozeßbedingungen sind in den beiden nachfolgenden Beispielen (Beispiel 1 und Beispiel 2) aufgeführt.

Tabelle 2 zeigt schließlich die Retentionen der in den Ausführungsbeispielen eingesetzten Substrate bzw. erhaltenen Produkte und der Katalysatoren bzw. Hilfsstoffe in Abhängigkeit der molaren Masse, Konzentration und Verweilzeit. Desweiteren sind auch die für einige weitere Substanzen gemessenen Retentionen angegeben.

Beispiel 1

In einem 10 ml-Enzymmembranreaktor (EMR) mit einer Umkehrosmosemembran (ROM 365, amafilter) wurden die Enzyme:

Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir: 0,5 U/mL
Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii: 0,5 U/mL

gegeben und als Feedlösung eine wäßrige Lösung von pH 7,0 mit

[Acetophenon] = 7 mM
[Magnesiumchlorid] = 1 mM
[NADP⁺] = 25 µM (entspricht 5% der im Reaktor beabsichtigten Konzentration)
[Natriumformiat] = 100 mM
[di-Kaliumhydrogenphosphat] = 50 mM

Bei einer Verweilzeit von 1h und einer Reaktionstemperatur von 25°C betrug der Umsatz bezüglich des Substrates Acetophenons 75%.

Zu Beginn der Reaktion wurde die Konzentration des Cofaktors im Reaktor durch eine einmalige Zugabe an Cofaktor auf 0,5 mM angehoben. Die dem Reaktor zugeführte Lösung enthielt nur 5% dieser Cofaktor Konzentration. D.h., daß das Rückhaltevermögen der Membran so hoch ist, daß der geringe Anteil des permeierenden Cofaktors durch diese 5% ersetzt werden kann. Auch die thermische Deaktivierung des Cofaktors wird durch diese geringe Menge aufgefangen.

Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 204 mol_P/mol_NAD (75%·7 mM/25 µM).

Ohne den Einsatz der RO-Membran ergäbe sich eine Wechselzahl von 10,5 mol_P/mol_NAD (75%·7 mM/500 µM).

Somit ergibt sich durch die durch Retention mögliche Rezyklierung des Cofaktors eine 20fach bessere Ausnutzung des teuren Cofaktors.

Trotz der Retention von Acetophenon bzw. Phenylethanol konnte keine Anreicherung dieser Substanzen im Reaktor festgestellt werden.

Beispiel 2

Aminosäuredehydrogenase aus Bacillus sp. 15 U/mL
Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii: 15 U/mL

gegeben und als Feedlösung eine mit NH₃ auf pH 8 gebrachte wäßrige Lösung mit

[Trimethylpyruvat] = 500 mM
[Ameisensäure] = 1,0 M
[NAD⁺] = 0,08 mM (entspricht 33% der im Reaktor beabsichtigten Konzentration)

Bei einer Verweilzeit von 4 h und einer Reaktionstemperatur von 30°C betrug der Umsatz bezüglich des Substrates Trimethylpyruvat 95%.

Zu Beginn der Reaktion wurde die Konzentration des Cofaktors im Reaktor durch eine einmalige Zugabe an Cofaktor auf 0,2 mM angehoben. Die dem Reaktor zugeführte Lösung enthielt nur 33% dieser Cofaktor Konzentration. Im Gegensatz zu Beispiel 1 sind die Reaktionsbedingungen für den Cofaktor sehr ungünstig, so daß aufgrund des pH-Werts und der Temperatur eine deutlich höhere Deaktivierung des Cofaktors NAD(H) auftritt, die durch eine entsprechend höhere Cofaktorkonzentration in der Substratlösung kompensiert werden muß. D.h., daß mit einem Großteil der zugeführten Cofaktormenge ausschließlich der deaktivierte Cofaktor ausgeglichen werden muß. Selbst für diesen Fall kann immer noch ein Drittel des Cofaktors durch Anwendung der RO-Membran eingespart werden.

Die Wechselzahl des Cofaktors betrug 7920 mol_P/ mol_NAD (95%·500 mM/0,08 mM).

Ohne den Einsatz der RO-Membran ergäbe sich eine Wechselzahl von 2375 mol_P/mol_NAD (95%·500 mM/0,2 mM).

Somit ergibt sich durch die durch Retention mögliche Rezyklierung des Cofaktors eine 3,3fach bessere Ausnutzung des teuren Cofaktors.

Demgegenüber lag die Retentionsrate des Substrats Trimethylpyruvat bzw. des gebildeten Produkts tert. Leucin bei nur 2%.

Beispiel 3

In einem 10 ml EMR (Versuchsaufbau entspricht dem von Fig. 2) wird eine Nanofiltrationsmembran (Celfa CMF-KX-060, bzw. Membrane Products:MPF 60) durch spülen mit 1.) Aceton und 2.) Dichlormethan konditioniert. Nun wird die in Dichlormethan gelöste, eingewogene Ligandmenge (Ligand des Jacobsen-Katalysators, siehe Fig. 4) eingespült. Die während des Einspülvorgangs austretende Lösung wird aufgefangen, und die Ligandkonzentration photometrisch bestimmt, um die im Reaktor verbliebene Ligandmenge ausrechnen zu können. Bei einer Flußrate von 20 ml/h (= Verweilzeit von 0,5 h) wird nun die austretende Lösung jeweils über einen Zeitraum von 1 Stunde aufgefangen und ebenfalls die Ligandkonzentration in diesem Permeat photometrisch bestimmt. Man erhält so die Möglichkeit die permeierte Menge Ligand pro Zeiteinheit auszurechnen und mit der im Reaktor verbleibenden Ligandmenge ins Verhältnis zu setzen.

Hieraus ergeben sich über einen Zeitraum von 7 Verweilzeiten bis zum Abbruch des Versuchs Retentionen von über 97%.

Nach demselben Verfahren wird die Retention von Styren, einem möglichen Substrat für die enantioselektive Epoxidierung, bestimmt. Als Analytik wurde hier eine gaschromatographische Methode gewählt.

Es ergeben sich für Styren Retentionen von unter 47%, wobei auch hier eine Anreicherung der Substanz im Reaktor nicht erfolgte.

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur Trennung von Substanzen mittels einer geeigneten Membran, bei dem die Molmasse einer Substanz S₁ 70 bis 1000 g/mol, die Molmasse einer weiteren Substanz S₂ 300 bis 2000 g/mol, die Molmassedifferenz S₂-S₁ 200 bis 1000 g/mol, der Quotient (S₂-S₁)/S₂ 0,5 bis 0,9 und die Retentionsrate von S₂ mindestens 75% beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1 zur Trennung von in Gegenwart eines Synthesehilfsstoffes (S₂) gebildeten Produkten (S₁) vom Synthesehilfsstoff (S₂).

3. Verfahren nach Anspruch 2 zur Trennung von aus enzym katalysierten Umsetzungen erhaltenen Produkten (S₁) von Cofaktoren (S₂).

4. Verfahren nach Anspruch 2 zur Trennung von aus chemischer Katalyse erhaltenen Produkten (S₁) vom Katalysator (S₂).

5. Verfahren nach Anspruch 4 zur Trennung von aus asymmetrischer chemischer Katalyse erhaltenen Produkten (S₁) vom Katalysator (S₂).

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt ein Epoxid, eine Aminosäure, ein Alkohol oder eine α-Hydroxysäure ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß für die Umsetzung und Trennung ein Membranreaktor verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung und Trennung kontinuierlich erfolgt.