DE19847562A1

DE19847562A1 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 5-Keto-psicose

Info

Publication number: DE19847562A1
Application number: DE1998147562
Authority: DE
Inventors: Friedrich Giffhorn; Alexander Huwig; Stefan Freimund; Lars Baldes
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2000-04-20

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 5-Keto-psicose (erythro-Hexo-2,5-diulose) aus L-Tagatose, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung von L-Tagatose mit den Enzymen Pyranose-2-Oxidase und Katalase behandelt und 5-Keto-psicose nach üblichen Methoden isoliert. DOLLAR F1

Description

1. Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 5-Keto-psicose (erythro-Hexo-2,5-diulose) aus L-Tagatose.

Der Ketozucker 5-Keto-psicose ist ein wertvoller Baustein, der in der Synthese von biologisch aktiven Stoffen verwendet werden kann. Bisher ist kein Verfahren bekannt, nach dem 5-Keto-psicose in hoher Reinheit und guter Ausbeute auf relativ einfache Weise hergestellt werden kann.

Eine wässrige Lösung von L-Tagatose wird praktisch vollständig durch eine enzymatische Oxidation mit Pyranose-2-Oxidase mikrobieller Herkunft, die gegebenenfalls immobilisiert vorliegt, zu 5-Keto-psicose umgesetzt (Abb. 1), während das gleichzeitig produzierte Wasserstoffperoxid mit dem Enzym Katalase entfernt wird. L-Tagatose wird aus dem Reaktionsansatz nach üblichen Methoden isoliert.

Beispiel 1

504 mg (2,8 mmol) L-Tagatose, nach bekanntem Verfahren hergestellt [Huwig et al. (1998) Carbohydrate Research 305, 337-339], werden in Gegenwart von 210 U immobilisierter Pyranose-2-Oxidase [Huwig et al. (1994) J. Biotechnol. 32, 309-315)] und 80 000 U Katalase in einem 500 ml Kolben in einem Gesamtvolumen von 200 ml deionisiertem Wasser gelöst und bei 25°C unter leichtem rühren umgesetzt. Dabei wird die Reaktionslösung mit 0,01 bis 0,05 L/min Druckluft begast und der pH- Wert der Lösung mit 0.01 N NaOH konstant bei 6,5 gehalten.

Die Reaktion wird durch Zugabe von 504 mg in 50 ml deionisiertem Wasser gelöste L-Tagatose gestartet. Sofort nach Durchmischen wird eine Probe von 0,5 ml entnommen (Nullwert) und weitere Proben nach 2,5 h, 14 h, 17 h und 37 h (Abb. 2). Die Probe wird bei 12 000 rpm zentrifugiert und über ein 0,45 µm Membranfilter filtriert. Im Filtrat werden die Konzentrationen an L-Tagatose und 5- Keto-psicose mittels "high-performance liquid chromatography" (HPLC) unter folgenden Trennbedingungen gemessen:
Stationäre Phase: Ca²⁺-beladene Kationenaustauschmatrix (Säule BC 100 Carbohydrate Ca²⁺ (300 × 7,8 mm) der Fa. Benson Polymeric Inc., Reno, USA). Injektionsvolumen 50 µl. Mobile Phase: Deionisiertes Wasser, 85°C. Die Elution erfolgt mit einer Flußrate 0,85 ml/min. Detektion: RI-Detektor auf 35°C temperiert. Für quantitative Bestimmungen werden Kalibrierungsgeraden in Konzentrations bereichen zwischen 0 und 100 mM aufgenommen.

Unter diesen Bedingungen wird z. B. das Edukt L-Tagatose mit einer Retentionszeit von 11,4 min eluiert und das Produkt 5-Keto-psicose bei 10,4 min. Die Zuordnung des Edukts geschieht in diesem Fall mittels hergestellter L-Tagatose [Huwig et al. (1998) Carbohydrate Research 305, 337-339], ist aber ebenso mit D-Tagatose möglich. Die Zuordnung des Produkts erfolgt mittels 5-Keto-psicose, die nach oben beschriebenen Verfahren hergestellt und chemisch charakterisiert wurde.

Das durch die enzymatische Umsetzung erhaltene Produkt ist rein, unter den angegebenen Trennbedingungen mittels HPLC ist keine L-Tagatose nachweisbar.

Reinigung

Nach Abfiltrierung immobilisierter Pyranose-2-Oxidase und Ultrafiltration des Filtrates zur Entfernung der Katalase wird 5-Keto-psicose mittels Ligandenaustauschchromatographie gereinigt [Huwig et al. (1994) J. Biotechnol. 32, 309-315)].

Chemische Charakterisierung

5-Keto-psicose wurde mit NMR-Spektroskopie charakterisiert. Die NMR-Spektren wurden auf einem Bruker AMX 500 Spectrometer bei 500.14 MHz für ¹H und 125.76 MHz für ¹³C und einer Temperatur von 300 K aufgenommen. Chemische Verschiebungen sind in ppm angegeben und sind kalibriert auf intern zugegebenes Aceton (d = 2.030 and 30.50 ppm) für D₂O und auf das restliche Protonensignal (d = 2.490 ppm) und Kohlenstoffsignal (d = 39.50 ppm) für Me₂SO-d₆. Die Probenkonzentration betrug 30 mg/0.5 ml deuteriertes Lösungsmittel. Die in der Tabelle zusammengefaßten Daten sind für die offenkettige Form (Abb. 3) angegeben.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 5-Keto-psicose, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Tagatose mit Oxidasen mikrobieller Herkunft, welche gegebenenfalls immobilisiert vorliegen zusammen mit Katalase behandelt und 5-Keto-Psicose nach üblichen Methoden isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Oxidasen verwendet, die aus den Pilzstämmen Auricularia polytrica, Clitocybula dusenii Coprinus micaceus, Coriolus versicolor, Daedaleopsis styracina, Gloeophillum sepiarium, Irpex lacteus, Lenzites betulinus, Oudemanstella mucida, Peniophora gigantea, Phanerochaete chrysosporium, Phlebiopsis gigantea, Pleurotus ostreatus, Polyporus obtusus, Trametes cinnabarinus, Trametes multicolor, Trametes versicolor sind.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Oxidasen verwendet, die aus Weißfäulepilzen sind.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Oxidasen aus Weißfäulepilzen und anderen Basidiomyceten verwendet, die Zucker in Gegenwart von molekularem Sauerstoff korrespondierenden Ketozuckern oxidieren.