DE3784610T2

DE3784610T2 - Verfahren zur bestimmung von 1,5-anhydroglucitol und ausruestung dafuer.

Info

Publication number: DE3784610T2
Application number: DE8787113602T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Akanuma; Kazuo Kato; Minoru Masuda; Tsuneo Nakamura; Masahiko Yabuuchi
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1986-09-22
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2007-09-18
Also published as: CA1306172C; JP2983015B2; US4994377A; EP0261591A2; DE3784610D1; AU7869687A; JPH11155594A; AU599145B2; EP0261591A3; JPS63185397A; EP0261591B1

Description

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Reagenzausrüstung und ein Verfahren zur Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol (nachfolgend 1,5-AG abgekürzt), von der erwartet wird, daß sie als Marker für die Diagnose von Diabetes dient.

2. Hintergrund der Erfindung

1,5-AG ist in der menschlichen Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit und im Plasma enthalten, und es wurde darüber berichtet, daß sich dessen Menge im Plasma verringert bei bestimmten Erkrankungen, insbesondere bei Diabetes. 1,5-AG ist üblicherweise in der Hauptsache mittels Gaschromatographie bestimmt worden (Yoshioko et al., Tonyobyo, 25, 1115-1118 (1982)).
"J. Biochem." (1986) 99 (3), 607-613 offenbart ein aus Pseudomonas abgeleitetes Enzym, das die Oxidation von 1,5-AG katalysiert. In diesem Dokument wird auch vorgeschlagen, daß dieses Enzym klinische Anwendung bei der Bestimmung von 1,5-AG finden könnte.
Allerdings haben bekannte Methoden zur Bestimmung von 1,5-AG viele Nachteile vom klinischen Standpunkt her, da es vorher erforderlich ist, eine Probe zu behandeln und 1,5-AG zu markieren. Weiterhin erfordert die Verfügbarkeit analytischer Instrumente komplizierte Arbeitsweisen, die durch qualifiziertes Personal ausgeführt werden sollten, und die gaschromatische Analyse erfordert einen längeren Zeitraum, der es erschwert, viele Proben zu bestimmen.
Unter diesen Umständen ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zu entwickeln, durch das eine Vielzahl von Proben leicht bestimmt werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Pyranoseoxidase und L-Sorboseoxidase, die jeweils als Enzym zur Oxidation eines Zuckers in der Lage sind, auch 1,5-AG oxidieren, das ein Zuckeralkohol ist; und daß sie zur Bestimmung von 1,5-AG in einer Blutgruppe verwendet werden können, aus der Zucker selektiv entfernt worden sind.
Dementsprechend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Reagenzausrüstung zur Bestimmung von 1,5-AG, die aus einem Mittel zur Entfernung von Zuckern besteht, einem Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und Pyranoseoxidase und L-Sorboseoxidase zur Oxidation von 1,5-AG, sowie auf ein Verfahren zur Bestimmung von 1,5-AG, das selektiv die Entfernung von in einer Probe enthaltenen Zuckern umfaßt; das Zusammenwirken von Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase mit 1,5-AG, das in der so erhaltenen Probe enthalten ist; und die Bestimmung des 1,5-AG aus der Menge des so gebildeten Wasserstoffperoxids.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung macht es möglich, eine Vielzahl von Proben ohne das Erfordernis eines komplizierten Kennzeichnungsverfahrens wie der üblichen Gaschromatographie-Analyse zu bestimmen. Weiterhin ist es beim erfindungsgemäßen Verfahren nicht erforderlich, analytische Instrumente zu halten und zu bedienen. Bevorzugte Ausführungsformen der beanspruchten Reagenzausrüstung und des beanspruchten Verfahrens sind in den Unteransprüchen beschrieben.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine Eichkurve für die Bestimmung von 1,5-AG unter Verwendung von Pyranoseoxidase.
Fig. 2 zeigt eine Eichkurve für die Bestimmung von 1,5-AG unter Verwendung von L-Sorboseoxidase.
Fig. 3 zeigt eine Korrelation zwischen den 1,5-AG-Werten, bestimmt durch eine enzymatische Methode, und jenen, die durch eine gaschromatographische Methode bestimmt worden sind.

5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wird nachfolgend der erste Gegenstand der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Es können in der vorliegenden Erfindung beliebige Proben ohne Beschränkung verwendet werden, sofern es erforderlich ist, darin enthaltenes 1,5-AG zu bestimmen. Zu Beispielen dieser Proben gehören Hirn-Rückenmark-Flüssigkeit, Plasma, Serum und Urin. Diese Proben enthalten Zucker wie Glucose, das in der Lage ist, mit Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase zu reagieren. Diese Zucker sollten aus den Proben entfernt werden, um entsprechend vorbereitete Probeflüssigkeiten zu ergeben.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Pyranoseoxidase und L-Sorboseoxidase sind nicht streng beschränkt, sofern sie unter die Kategorien EC 1.3.10 und EC 1.1.3.11 fallen, wie durch das IUPAC=IUB-Nomenklaturkommitee bestimmt. Zum Beispiel kann Pyranoseoxidase, produziert durch Polyporus obtusus ATCC 26733 und L-Sorboseoxidase, produziert durch Trametes sanguinea IFO 4923 eingesetzt werden.
Diese Enzyme werden üblicherweise in Form einer Lösung in einem Puffer verwendet. Alternativ dazu können sie in der immobilisierten Form auf Trägern über übliche Techniken verwendet werden, wie durch kovalentes Binden oder Adsorption. Zu Beispielen von Trägern gehören solche vom Typ Membran, Gel, Teilchen, Mikrokapseln, Röhrchen oder Substanzbehälter. Die Menge an einzusetzendem Enzym verändert sich in Abhängigkeit von zum Beispiel der Menge einer Probe. Im allgemeinen können 0,5 Einheiten oder mehr, vorzugsweise 1,5 bis 5 Einheiten des Enzyms verwendet werden, um die enzymatische Reaktion innerhalb eines gewünschten Zeitraumes vollständig durchzuführen. Es ist nicht immer erforderlich, daß das Enzym die höchste Reinheit hat, obgleich selbstverständlich eine höhere spezifische Aktivität des Enzyms für die Reaktion wünschenswerter ist.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Pyranoseoxidase und L-Sorboseoxidase können nach den Verfahren erhalten werden, die in "Biochim. Biophys. Acta, 167, 493-500 (1968) und J. Biochem., 62 (2), 223-229 (1967) offenbart sind.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel in folgender Weise durchgeführt werden. Ein Elektronenakzeptor und 0,5 bis 10 Einheiten/ml, vorzugsweise 1 bis 5 Einheiten/ml Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase werden zu einer Probe hinzugegeben, und das erhaltene Gemisch wird bei 4 bis 50 ºC inkubiert, vorzugsweise bei 25 bis 40 ºC für 0,5 bis 3 Stunden, vorzugsweise 0,5 bis 1 Stunde. Das dabei gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend bestimmt, und die Menge an 1,5-AG kann daraus unter Verwendung einer Eichkurve bestimmt werden, die vorher angelegt wurde. Nun wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung im Detail beschrieben.
Für die Bestimmung des Wasserstoffperoxids im Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine beliebige Methode angewandt werden, solange sie genügend empfindlich ist. Unter einer Vielzahl möglicher Methoden ist die üblicherweise angewandte, verschiedene Substrate mit Wasserstoffperoxid zu oxidieren unter Verwendung von Meerrettichperoxidase (HRP) als katalytisches Enzym. Anschließend kann die gefärbte Substanz, die fluoreszierende Substanz oder die Chemilumineszenz, die durch die Oxidation entstanden ist, durch Messung der Absorption, durch Fluorometrie oder durch Fotometrie bestimmt werden. Beispiele für das Substrat von HRP, das in der Lage ist, eine gefärbte Substanz zu bilden, sind 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS), o-Phenylendiamin (OPD), 5-Aminosalicylsäure (5-AS) und 3,3',5,5'-Tetramethylenbenzidin (TMB). Beispiele für das Substrat von HRP, das in der Lage ist, eine fluoreszierende Substanz zu bilden, sind p-Hydroxyphenylessigsäure und 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure (HPPA). Beispiele für das Substrat für HRP, das in der Lage ist, Chemilumineszenz zu zeigen, sind Luminol und Isuluminol.
0,3 ml einer Natriumphosphat-Pufferlösung (1/15 M, pH 5,6), 0,5 ml einer färbenden Lösung enthaltend 4 mM 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure (ABTS) und 12 Einheiten/ml Meerrettichperoxidase, 0,1 ml einer 25 Einheiten/ml- Lösung von Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase und 0,1 ml einer Lösung von 1,5-AG wurden in einen Kessel eingebracht, und man ließ sie bei 37 ºC für 30 Minuten reagieren. Anschließend wurde die Reaktion durch Eiskühlung unterbrochen und die Absorption des Reaktionsgemisches bei 405 nm gemessen. Dann wurde die Konzentration des 1,5-AG aus der Absorption der Probe bestimmt unter Verwendung einer Eichkurve, die vorher angelegt wurde mit Hilfe von 1,5-AG-Lösungen bekannter Konzentrationen.
Es sind verschiedene Methoden zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid durch Chemilumineszenz bekannt ohne Verwendung von HRP, zum Beispiel durch Hervorrufen der Lumineszenz von Luminol mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit eines Ferricyanid-Ions; durch Hervorrufen der Lumineszenz von Lucigenin mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit eines Metallions; und durch Reaktion eines Aryloxalates, wie bis(2,4,6-Trichlorphenyl)oxalat mit Wasserstoffperoxid in Anwesenheit einer fluoreszierenden Substanz, um dadurch die fluoreszierende Substanz mit Hilfe der Zersetzungsenergie des Oxalates zu erregen, um dadurch Lumineszenz hervorzurufen. Alternativ dazu kann eine Wasserstoffperoxidelektrode verwendet werden, um direkt Wasserstoffperoxid zu bestimmen.
Nachfolgend wird die Entfernung von Zuckern aus einer Probe beschrieben.
Als Ergebnis unserer Untersuchungen bei der Entfernung von Zuckern wurde gefunden, daß Zucker selektiv derartig aus einer Probe entfernt werden können, daß 1,5-AG vollständig intakt bleibt, indem eine Probe mit einem stark basischen Anionaustauscherharz oder Borsäure behandelt wird, wodurch sich eine Probe ergibt, die 1,5-AG enthält.
Wenn ein stark basisches Anionenaustauscherharz verwendet wird, wird die Probe langsam durch das stark basische Anionenaustauscherharz vom OH-Typ geleitet, wodurch die Zucker adsorbiert und entfernt werden. Bevorzugte Beispiele des stark basischen Anionenaustauscherharzes sind solche, die eine quaternäre Ammoniumsalzgruppe enthalten, z. B. eine Trimethylaminogruppe (Typ I) oder Hydroxyethyldimethylaminogruppe (Typ II) als Ionenaustauschgruppe. Da dieses Verfahren von der Durchflußgeschwindigkeit der Probenlösung durch das Harz abhängt, ist es vorzuziehen, daß die Harzteilchen durch Siebe der Größe 200 Mesh bis 400 Mesh gegeben werden, um die Probe langsam passieren zu lassen. Die Probe kann weiterhin mit einem Kationenaustauscherharz behandelt werden, um sie dadurch zu neutralisieren.
Kationenaustauschharze sind verschiedene ionische Harze vom H-Typ. Zu den anionischen Harzen gehören solche beliebige Kationenaustauschharze im Bereich von stark sauer bis schwach sauer. Es ist zum Beispiel besonders vorzuziehen, daß ein stark saures Kationenaustauschharz vom H-Typ mit einer Sulfonatgruppe angewandt wird.
Wenn Borsäure verwendet wird, können die Proben mit Borsäure an sich behandelt werden. Allerdings ist vorzuziehen, daß ein Harz eingesetzt wird, an welches Borsäure gebunden ist.
Beispiele für das Harz, an das Borsäure gebunden ist, sind ein Harz mit kovalent gebundenem Borat und ein Anionenaustauschharz vom Borattyp.
Anionenaustauschharze vom Borattyp sind verschiedene kationische Harze vom Borattyp. Zu den kationischen Harzen gehören beliebige Anionenaustauschharze im Bereich von stark basisch bis schwach basisch. Es wird insbesondere vorgezogen, zum Beispiel ein stark basisches Anionenaustauschharz vom Borattyp zu verwenden, das eine Tri(C&sub1;-C&sub4;)-Alkylamino(d. h. Trimethylamino)-Gruppe (Typ I) enthält oder eine Hydroxy- (C&sub1;-C&sub4;)-alkyldi(C&sub1;-C&sub4;)-alkylamino (d. h. Hydroxyethyldimethylamin)-Gruppe (Typ II) und ein basisches Zwischen-Anionenaustauschharz vom Borattyp mit sowohl einer Di(C&sub1;-C&sub4;)-alkylamino(d. h.Dimethylamino)-Gruppe und eine Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)-alkyldi(C&sub1;-C&sub4;)-alkamino (d. h. Hydroxyethyldimethylamino)-Gruppe enthält, wie Bio-Rex 5 (Borattyp).
Wenn eine Probe verwendet wird, die mit Borsäure behandelt worden ist, so ist es vorzuziehen, daß die Probe weiterhin mit einem Anionenaustauschharz behandelt wird, gegebenenfalls zusammen mit einem Kationenaustauschharz, um restliche darin enthaltene Komplexe von Borsäure mit Zuckern zu entfernen.
Anionenaustauschharze sind verschiedene kationische Harze vom OH- oder schwach saurem Salz-Typ. Zu den kationischen Harzen gehören beliebige Anionenaustauschharze, die im Bereich von stark basischen bis schwach basischen liegen. Als schwache Säuren, die die schwach sauren Salze dieser kationischen Harze bilden, werden Kohlensäure und eine organische Säure wie Ameisensäure und Essigsäure vorgezogen. Besonders vorzuziehen ist, ein stark basisches Anionenaustauschharz zu verwenden, das eine Trimethylaminogruppe (Typ I) oder eine Hydroxyethyldimethylaminogruppe (Typ II) aufweist. Als das Kationenaustauschharz kann das oben beschriebene verwendet werden.
Die Borsäurebehandlung zur Entfernung der Zucker kann in folgender Weise durchgeführt werden. Für den Fall, wo Borsäure an sich angewendet wird, wird ein wäßrige Lösung von Borsäure zu einer Probe wie Plasma in einer solchen Menge hinzugegeben, daß ein Auslaugen der Borsäure in der nachfolgenden Behandlungsstufe mit Anionenaustauschharz verhindert wird. Im Anschluß daran wird gerührt, und das Gemisch wird durch eine Säule gegeben, die mit einem Anionenaustauschharz gepackt ist, gegebenenfalls zusammen mit einem Kationenaustauschharz.
Wenn ein Harz verwendet wird, an das Borsäure gebunden ist, wird dieses Harz in einer Säule zusammen mit einem Anionenaustauschharz und einem Kationenaustauschharz derart gepackt, daß sich das Borsäureharz an der Spitze der Säule befindet. Anschließend kann die Probe durch die oben genannte Säule gegeben werden.
Zusätzlich zu den obigen Verfahren können Zucker in einer Probe selektiv entfernt werden, indem ein 1,5-AG mit extremer chemischer Stabilität verwendet wird oder durch Modifizierung von Glucose, die die Hauptverunreinigung von 1,5-AG darstellt, mit Hilfe eines Enzyms als Katalysator. Die letztere Methode kann zum Beispiel durchgeführt werden durch Erhitzung einer Probe in Gegenwart von 6 N Salzsäure, um dadurch die Zucker, die nicht 1,5-AG sind zu zersetzen, und anschließend das in den Zersetzungsprodukten verbliebene 1,5-AG zurückzugewinnen; oder durch Behandlung einer Probe mit einem reduzierenden Mittel wie Natriumborhydrid, die im Gegensatz zu 1,5-AG Carbonyl- oder Formylgruppen aufweisen, zu reduzieren und dadurch modifizierte Verbindungen zu bilden, die nicht mit Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase reagieren können. Andererseits kann die letztere Methode zum Beispiel durchgeführt werden durch Umwandlung von Glucose in Gluconsäure mit Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) oder in Glucose-6-phosphat mit Hexokinase (EC 2.7.1.1.). Keine dieser mit einem Enzym modifizierten Verbindungen kann mit Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase reagieren. Somit kann 1,5-AG, das bei der enzymatischen Behandlung intakt bleibt, in der oben genannten Weise bestimmt werden.
In dem zweiten Gegenstand stellt die vorliegende Erfindung eine Reagenzausrüstung bereit, die aus einem Mittel zur Entfernung von Zuckern, einem Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und einem Enzym zur Oxidation von 1,5-AG besteht.
Wie oben beschrieben gehören zu Beispielen für das Mittel zur Entfernung von Zuckern Borsäure, ein Harz, an das Borsäure gebunden ist, ein stark basisches Anionenaustauschharz, Natriumborhydrid, Glucoseoxidase, Hexokinase, ein Anionenaustauschharz und ein Kationenaustauschharz. Unter diesen Mitteln sind vom Standpunkt der bequemen Verfahrensdurchführung bevorzugt ein Harz, an das Borsäure gebunden ist, ein Anionenaustauschharz kombiniert mit einem Kationenaustauschharz und ein Anionenaustauscher, kombiniert mit einem stark basischen Anionenaustauschharz und einem Kationenaustauschharz. Bei Einbeziehung in eine Reagenzausstattung, kann dieses Mittel üblicherweise in eine kleine Wegwerfsäule gepackt werden, und zwar in der Weise, daß das Harz, an das Borsäure gebunden ist oder das stark basische Anionenaustauschharz an deren Spitze plaziert ist.
Bei der Bestimmung von 1,5-AG kann ein beliebiges Enzym ohne Einschränkung angewandt werden, solange es direkt für die Bestimmung von 1,5-AG eingesetzt werden kann. Zum Beispiel kann Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase verwendet werden. Zu Beispielen für das Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid gehören Kombinationen von Peroxidase oder einer Peroxidase-ähnlichen aktiven Substanz mit einem färbenden Mittel oder einem Farbstoff und einem Kuppler; eine Peroxidase und ein fluoreszierendes Substrat; eine Peroxidase und ein lumineszierendes Substrat; und ein Ferricyanid-Ion und ein lumineszierendes Substrat. Besondere Beispiele für diese Reagentien sind bekannt aus den Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, wie oben beschrieben.
Das Enzym zur Oxidation von 1,5-AG und das Bestimmungsreagenz können miteinander vermischt werden, um ein einzelnes Reagenz zu ergeben. Alternativ dazu können diese Bestandteile entsprechend auseinandergehalten werden, wenn sie sich gegenseitig beeinflussen würden. Sie können in Lösung(en) oder Pulver(n) formuliert werden. Weiterhin können sie als entsprechendes Material wie Filterpapier oder als Folie vorliegen, um ein analytisches Papier oder eine Folie zu ergeben.
Zusätzlich zu den miteinander vereinigten Reagentien kann die Assay-Ausrüstung der vorliegenden Erfindung weiterhin ein Mittel zur Entfernung von Proteinen enthalten, wie Perchlorsäure sowie Standardreagentien, enthaltend eine gegebene Menge an 1,5-AG.
Die Menge des Mittels zur Entfernung von Substraten, die nicht 1,5-AG sind, kann wie folgt sein. Wenn ein stark basisches Anionenaustauschharz verwendet wird können 0,1 bis 1,0 ml des stark basischen Anionenaustauschharzes vom OH-Typ kombiniert werden mit 0,1 bis 0,5 ml eines Kationenaustauschharzes, und die Gesamtmenge der Harze kann entsprechend eingestellt sein auf 0,2 bis 1,5 ml. Wenn ein Harz verwendet wird, an das Borsäure gebunden ist, können 0,1 bis 0,5 ml des Harzes, an das Borsäure gebunden ist, zusammen verwendet werden mit 0,1 bis 1,0 ml eines Anionenaustauschharzes und 0,1 bis 0,5 ml eines Kationenaustauschharzes, und die Gesamtmenge der Harze kann entsprechend auf 0,5 bis 2 ml eingestellt sein.
Die Menge der Enzyme zur Bestimmung von 1,5-AG in der Ausrüstung variiert in Abhängigkeit von der Anzahl der zu untersuchenden Proben, z. B. 100 oder 300 Proben. Üblicherweise können 0,5 bis 10 Einheiten des Enzyms pro Probe verwendet werden. Wenn HRP und ABTS als Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid eingesetzt werden, sind 10 m Einheiten bis 100 Einheiten pro Probe an HRP und 0,5 bis 10 uM pro Probe an ABTS in der Ausrüstung enthalten. Zusätzlich dazu kann die Ausrüstung weiterhin 5 bis 20 ug Perchlorsäure bei einer Reinheit von 100 % enthalten zur Entfernung von Proteinen, und 200 bis 2000 ug 1,5-AG als Substanz zur Bildung einer Eichkurve.
Zur weiteren Erläuterung der vorliegenden Erfindung dienen die folgenden Beispiele.

Versuchsbeispiel 1: Eichkurve von 1,5-AG unter Verwendung von Pyranoseoxidase

ABTS und HRP wurden in 1/15 M Phosphat-Pufferlösung (pH 5,6) gelöst, um Konzentrationen von 4 mM und 12 Einheiten/ml entsprechend zu ergeben. Zu 0,5 ml der auf diese Weise erhaltenen färbenden Lösung wurden 0,1 ml einer Standard-1,5-AG- Lösung, 0,3 ml einer 1/15 M Phosphat-Pufferlösung und 0,1 ml einer 5mg/ml Lösung von Pyranoseoxidase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd; spezifische Aktivität zu Glucose: 5 Einheiten/mg) hinzugegeben werden. Das erhaltene Gemisch ließ man bei 37 ºC für eine Stunde miteinander reagieren. Fig. 1 zeigt eine Eichkurve, die durch Messen der Absorption des erhaltenen Reaktionsgemisches bei 405 nm gebildet wurde.

Versuchsbeispiel 2: Eichkurve von 1,5-AG unter Verwendung von L-Sorboseoxidase

Das Verfahren des Versuchsbeispiels 1 wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, daß die Pyranoseoxidaselösung ersetzt wurde durch eine 5 mg/ml-Lösung von L-Sorboseoxidase (spezifische Aktivität zu Glucose: 4,3 Einheiten/mg), um dadurch eine Eichkurve von 1,5-AG zu bilden. Fig. 2 zeigt das Ergebnis.

Beispiel 1: Bestimmung von 1,5-AG unter Verwendung von Pyranoseoxidase

Eine Probe, enthaltend 1 mg/ml Glucose und 0,1 mg/ml 1,5- AG wurde hergestellt. Die Probe wurde den folgenden Vorbehandlungen 1 bis 6 unterworfen, um daraus Glucose zu entfernen. Anschließend wurde das verbliebene 1,5-AG durch das gleiche Verfahren bestimmt, wie das im Versuchsbeispiel 1 beschriebene. Die Bestimmung von 1,5-AG erfolgte unter Einsatz einer Eichkurve, die gebildet worden war, indem jede Standard-1,5- AG-Lösung der gleichen Behandlung unterworfen wurde wie die für die obige Probe. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse.

(1) Entfernung von Substraten, die nicht 1,5-AG sind, als Komplexe mit Borsäure

0,02 ml einer 0,8 M wäßrigen Lösung von Borsäure wurde zu 0,2 ml einer Probe gegeben und gerührt. 0,1 ml des Überstehenden des erhaltenen Gemisches wurde durch eine Säule gegeben, die mit 0,5 ml eines Anionenaustauschharzes AG1-XS (OH-Typ; hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc.) gepackt war, und die Säule wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gewaschen, wodurch sich 1,5 ml eines Ablaufes ergaben.

(2) Entfernung von Substraten, die nicht 1,5-AG sind, durch Adsorption derselben mittels stark basischen Anionenaustauschharzes

0,2 ml einer Probe wurden durch eine Säule gegeben, die mit 0,5 ml eines Anionenaustauschharzes AG1-X8 (OH-Typ, 400 Mesh; hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc.) gepackt war, und die Säule wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gewaschen, wobei sich 1,5 ml eines Ablaufes ergaben.

(3) Entfernung von Substraten, die nicht 1,5-AG sind, durch Zersetzung mit Salzsäure

Zu 0,2 ml einer Probe wurden 0,25 ml einer 36 % Salzsäure gegeben, und das Gemisch wurde hermetisch abgeschlossen und für einen Tag auf 110 ºC erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockne eingeengt, um dadurch die Salzsäure zu entfernen, und der Rückstand wurde wieder in 0,2 ml destilliertem Wasser gelöst. 0,1 ml des Überstehenden wurde durch eine Säule gegeben, die mit 0,4 ml eines Anionenaustauschharzes AG1-X8 (Acetat-Typ) und 0,2 ml eines Kationenaustauschharzes (H-Typ) gepackt war, und die Säule wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gewaschen, um zu 1,5 ml eines Ablaufes zu gelangen.

(4) Reduzieren von Substraten, die nicht 1,5-AG sind, mit Natriumborhydrid

Zu 0,5 ml einer Probe wurden 0,05 ml einer 40 mg/ml wäßrigen Lösung von Natriumborhydrid hinzugegeben. Man ließ das Gemisch bei 37 ºC für 30 Minuten reagieren. Anschließend wurde der pH-Wert auf 5 bis 6 eingestellt durch Zugabe von 0,05 ml einer 60 % wäßrigen Lösung von Perchlorsäure, um dadurch das restliche Natriumborhydrid zu zersetzen. Zu 0,1 ml des Überstehenden des Reaktionsgemisches wurden 0,2 ml einer 1,8 % wäßrigen Lösung von Bariumhydroxid-Octahydrat gegeben sowie 0,2 ml einer 2 % Lösung von Zinksulfat-Heptahydrat, und das erhaltene Gemisch wurde bei 3000 U/Min für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Entfernung des Niederschlages wurde eine reduzierte Probe erhalten.

(5) Oxidieren von Glucose mit Glucoseoxidase

Zu 0,4 ml einer Probe wurden 0,2 ml einer 100 Einheiten/ml-Lösung von Glucoseoxidase (hergestellt durch Boehringer Mannheim) hinzugegeben. Man ließ das erhaltene Gemisch bei 37 ºC für eine Stunde reagieren. Dann wurden 0,2 ml einer 0,1 mg/ml Catalaselösung (hergestellt durch Sigma Co., Ltd.) dazugegeben. Man ließ das Gemisch bei 37 ºC für 5 Minuten reagieren, um dadurch vollständig das bei der Oxidation von Glucose entstandene Wasserstoffperoxid zu zersetzen.
Im Anschluß daran wurde das Gemisch in siedendem Wasser für 5 Minuten erhitzt, um die Glucoseoxidase und Catalase zu inaktivieren und zu entfernen. Nach dem Zentrifugieren des Gemisches bei 3000 U/Min für 10 Minuten erhielt man ein mit Glucoseoxidase behandeltes Überstehendes.

(6) Umwandlung von Glucose in Glucose-6-phosphat mit Hexokinase

Zu 0,1 ml einer Probe wurden 0,2 ml einer 1,8 % wäßrigen Lösung von Bariumhydroxid-Octahydrat und 0,2 ml einer 2 % wäßrigen Lösung von Zinksulfat-Heptahydrat gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde gerührt und bei 3000 U/Min für 10 Minuten zentrifugiert. Auf diese Weise erhielt man ein von Proteinen freies Überstehendes. Zu 0,2 ml des Überstehenden wurden hinzugegeben 0,64 ml einer 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0), 0,1 ml einer 0,2 M Lösung Magnesiumchlorid, 0,05 ml einer 0,2 M Adenosin-5'-triphosphat(ATP)-Lösung und 0,01 ml einer 1400 Einheiten/ml Lösung von Hexokinase (hergestellt durch Boehringer Mannheim). Man ließ das erhaltene Gemisch bei 37 ºC für 30 Minuten reagieren, um zu einer behandelten Probe zu gelangen.

Beispiel 2: Bestimmung von 1,5-AG unter Verwendung von L-Sorboseoxidase

Die gleiche Probe wie sie in Beispiel 1 erhalten worden war, wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, um dadurch Glucose daraus zu entfernen. Anschließend wurde das restliche 1,5-AG nach dem in Versuchsbeispiel 2 beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Tabelle 1 zeigt das Ergebnis. Tabelle 1 Bestimmung der Probe Verfahren zur Entfernung von Glucoose Enzym zur Bestimmung von 1,5-AG Pyranoseoxidase L-Sorboseoxidase Borsäurebehandlung stark basische Anionenaustausch-Behandlung Zersetzung mit Salzsäure Reduktion mit Natriumborhydrid Glucoseoxidase-Behandlung Hexokinase-Behandlung

Beispiel 3: Bestimmung von 1,5-AG in Serum unter Verwendung einer Vorbehandlungssäule

0,3 ml, 0,5 ml und 0,2 ml der Ionenaustauschharze AG50W-X8 (H-Typ), AG1-X8 (OH-Typ) und AG1-X8 (Borat-Typ) (jeweils hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc.) wurden in eine schmale Säule gepackt, vom Boden ausgehend in dieser Reihenfolge, um dadurch eine Vorbehandlungssäule zu ergeben.
15 ul einer 60 % wäßrigen Lösung von Perchlorsäure wurden zu 0,2 ml Humanserum gegeben, und das Gemisch wurde gründlich geschüttelt. Nach Zentrifugieren des Gemisches, um dadurch daraus die Proteine zu entfernen, wurden 0,05 ml des erhaltenen Überstehenden durch die oben genannte Vorbehandlungssäule gegeben, und die Säule wurde mit 3 ml destilliertem Wasser gewaschen, um dadurch 3 ml eines Ablaufes zu erhalten. Im Anschluß daran wurde der Ablauf bis zur Trockne eingedampft, und in 0,25 ml destilliertem Wasser wieder gelöst, um zu einer mit der Vorbehandlungssäule behandelten Probe zu gelangen. Die in der Probe verbliebene 1,5-AG wurde nach der im Versuchsbeispiel 1 beschriebenen Methode bestimmt. Die durch Verwendung von Standard-1,5-AG-Proben erhaltene Eichkurve wurde dazu eingesetzt. Die Korrelation zwischen den Serum-1,5-AG-Werten von normalen Personen und Diabetikern, die auf diese Weise erhalten wurden, und solchen der gleichen Proben, bestimmt durch Gaschromatografie, sind in Fig. 3 gezeigt. Fig. 3 zeigt offensichtlich, daß die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen Daten mit denen in übereinstimmen, die durch die Gaschromatografie bestimmt wurden.
Wenn man nach dem Verfahren dieses Beispiels arbeitet, mit Ausnahme dessen, daß das AG1-X8 (Borat-Typ) ersetzt wird durch ein Borsäuregel, werden ähnliche Resultate, wie oben beschrieben, erhalten.

Beispiel 4: Bestimmung von 1,5-AG in Urin durch Verwendung einer Vorbehandlungssäule

10 ml einer menschlichen Urinprobe, aus der die Proteine mit Hilfe einer zentrifugalen Ultrafiltrationsvorrichtung Centricon 10 (hergestellt durch Amicon) entfernt worden waren, wurden durch eine Säule gegeben, die mit 1 ml jeweils der Ionenaustauschharze AG50W-X8 (H-Typ) und AG1-X8 (Acetat-Typ) in dieser Reihenfolge gepackt war, und die Säule wurde mit 6 ml destilliertem Wasser gewaschen, um zu einer entsalzten Urinprobe zu gelangen. Die erhaltene Probe wurde bis zur Trockne eingedampft und in 0,5 ml destilliertem Wasser wieder gelöst. Anschließend wurde sie durch die gleiche Vorbehandlungssäule gegeben, wie sie in Beispiel 3 beschrieben wurde, und die Säule wurde mit 3 ml destilliertem Wasser gewaschen, um 3,5 ml eines Ablaufes aus der Vorbehandlungssäule zu erhalten. Dann wurde die vorbehandelte Flüssigkeit eingedampft und wiederum in 0,2 ml destilliertem Wasser gelöst, um zu einer Probe für die Bestimmung von 1,5-AG zu gelangen. Die Bestimmung von 1,5-AG erfolgte durch Einsatz von 0,1 ml der obigen Probe nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren. Zum Vergleich wurde 1,5-AG in der restlichen Probe durch Gaschromatografie bestimmt. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2 Bestimmung der Urinprobe
Bestimmungsmethode menschliche Urinprobe 1,5-AG konzentriert
enzymatisch (Pyranoseoxidase) 5,8 ug/ml
Gaschromatografie 5,7 ug/ml

Beispiel 5: Bestimmung von Serum-1,5-AG unter Verwendung der mit Boratharz gepackten Vorbehandlungssäule

Eine Säule wurde mit 0,3 ml, 0,5 ml und 0,2 ml der Ionenaustauschharze AG50W-X8 (H-Typ), AG1-X8 (OH-Typ) und AG1-X8 (Borat-Typ)(jeweils hergestellt durch Bio Rad Laboratories, Inc.) gepackt, die eine Teilchengröße von 400 Mesh hatten, und zwar vom Boden aus in der angegebenen Reihenfolge, um zu einer Vorbehandlungssäule zu gelangen.
Zu 0,2 ml des menschlichen Serums wurden 15 ul einer 60 % wäßrigen Lösung von Perchlorsäure hinzugegeben, und das Gemisch wurde geschüttelt und zentrifugiert, um dadurch daraus die Proteine zu entfernen. 0,1 ml des auf diese Weise erhaltenen Überstehenden wurde durch die oben genannte Vorbehandlungssäule gegeben, und die Säule wurde mit 3 ml destilliertem Wasser gewaschen, um 3,1 ml eines Ablaufes zu erhalten. Dieser Ablauf wurde anschließend bis zur Trockne eingeengt. 1,0 ml eines Reagenz zur Bestimmung von 1,5-AG wurde danach hinzugegeben. Man ließ das Gemisch bei 37 ºC für eine Stunde reagieren. Die Absorption dieses Reaktionsgemisches bei 405 nm wurde gemessen, und 1,5-AG wurde nach einer Eichkurve bestimmt, die vorher durch Behandlung von Standard-1,5-AG-Lösungen in gleicher Weise gebildet wurde, wie im Falle der menschlichen Serumproben. Das obige Reagenz zur Bestimmung von 1,5-AG war eine 1/15 M Phosphat-Pufferlösung (pM 5,6), enthaltend 2,5 Einheiten/ml PROD, 60 m Einheiten/ml HRP und 1 mM ABTS.
Die Serum-1,5-AG-Werte von normalen Personen und Diabetikern, die auf diese Weise bestimmt wurden, korrelieren eng mit denen der gleichen Proben, die mittels Gaschromatografie bestimmt wurden.

Beispiel 6: Bestimmung von Serum-1,5-AG unter Verwendung einer mit Boratharz gepackten Vorbehandlungssäule

Eine kleine Säule wurde mit 0,1 ml und 0,5 ml der Ionenaustauschharze AG50W-X8 (H-Typ) und Bio-Rex5 (Borat-Typ), jeweils hergestellt durch Bio-Rad Laboratories, Inc., gepackt, die eine Teilchengröße von 400 Mesh aufwiesen, und zwar vom Boden aus in dieser Reihenfolge, um zu einer Vorbehandlungssäule zu gelangen.
Das Verfahren von Beispiel 5 wurde wiederholt, mit Ausnahme dessen, daß die Vorbehandlungssäule mit dieser anderen ersetzt wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich, wie die von Beispiel 5.

Beispiel 7: Bestimmung von Serum-1,5-AG unter Verwendung einer mit stark basischem Anionenaustauschharz gepackten Vorbehandlungssäule

Eine kleine Säule wurde mit 0,1 ml und 0,4 ml der Ionenaustauschharze AG50W-X8 (H-Typ) und AG1-X8 (OH-Typ), jeweils hergestellt durch Bio-Rad Laboratories, Inc., gepackt, die eine Teilchengröße von 400 Mesh hatten, und zwar in dieser Reihenfolge von Boden aus, um zu einer Vorbehandlungssäule zu gelangen.
Zu 0,2 ml menschlichen Serums wurden 15 ul einer 60 % wäßrigen Lösung von Perchlorsäure hinzugegeben, und das Gemisch wurde unmittelbar geschüttelt und zentrifugiert, um dadurch daraus die Proteine zu entfernen. 0,1 ml des erhaltenen Überstehenden wurde durch die obige Vorbehandlungssäule gegeben, und die Säule wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gewaschen, um dadurch 1,6 ml eines Ablaufes zu erhalten. Der Ablauf wurde im Anschluß daran bis zur Trockne verdampft und dann in gleicher Weise wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt, um dadurch 1,5-AG zu bestimmen. Die auf diese Weise erhaltenen Ergebnisse waren ähnlich wie die von Beispiel 5.

Beispiel 8: Bestimmung von Serum-1,5-AG unter Verwendung einer Pyranoseoxidase-immobilisierten Membran

Die Pyranoseoxidase, wie sie in Beispiel 1 verwendet wurde, wurde auf einer Nitrocellulose-Folie (Porengröße 1 um) in üblicher Weise immobilisiert. Dazu wurden 5 mg Pyranoseoxidase (hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd; spezifische Aktivität zu Glucose: 5 Einheiten/mg) und 5 mg Rinderserumalbumin in 0,5 ml einer 1/15 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) gelöst, und 0,1 ml einer 1 % Glutaraldehyd-Lösung wurden dazugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf 5 Stücken Nitrocellulose-Folie gegossen (Porengröße 1 um; Durchmesser 2 cm) und für einen Tag und eine Nacht an der Luft getrocknet. Anschließend wurde jedes Stück mit 10 ml einer 1/15 M Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0) gewaschen, um zu einer Nitrocellulose-Folie zu gelangen, an der Pyranoseoxidase immobilisiert war. Diese Pyranoseoxidase-Folie wurde auf die Oberfläche einer Wasserstoffperoxidelektrode (hergestellt durch Ishikawa Seisakusho, Ltd.) aufgebracht, und 0,1 ml Anteile von Standard-1,5-AG- Lösungen von 1,5-AG-Konzentrationen von 1, 4, 16 und 32 ug/ml wurden dort hindurchgeleitet unter den folgenden Bedingungen: mobile Phase: 1/15 M Phosphat-Pufferlösung (pH 5,6);
Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase: 0,5 ml/Min; und
Temperatur: 25 ± 1 ºC.
Die auf diese Weise gebildeten Mengen an Wasserstoffperoxid wurden ebenso gemessen wie die Flächen des erhaltenen Peaks, und daraus wurde eine Eichkurve gebildet.
Anschließend wurde das trockene Produkt, das durch Verdampfen von 3 ml des Ablaufes aus der Vorbehandlungssäule in Beispiel 3 erhalten wurde, in 0,25 ml einer 1/15 M Phosphat- Pufferlösung (pH 5,6) gelöst. Die erhaltene Lösung wurde durch die oben genannte Elektrode geführt, die mit der Pyranoseoxidase-Folie ausgestattet war, in gleicher Weise wie im Falle der Standards. Die Fläche des auf diese Weise erhaltenen Peaks wurde gemessen, und daraus wurde entsprechend der obigen Eichkurve das 1,5-AG bestimmt.
Ähnlich wie im Falle von Beispiel 3 korrelierten die 1,5- AG-Werte von normalen Personen und Diabetikern eng mit denen der gleichen Probe, die mittels Gaschromatografie bestimmt worden war.

Beispiel 9: Reagenzausrüstung

(1) Herstellung der Ausrüstung

Reagenz A: 2,0 ml einer 60 % Lösung von Perchlorsäure wurde in ein Reagenzröhrchen gegeben. Reagenz B: 200 mg PAOD (5 Einheiten/mg; hergestellt durch Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,24 mg HRP (100 Einheiten/mg; hergestellt durch Wako Pure Chemicals Co., Ltd.) und 200 mg ABTS (hergestellt durch Boehringer Mannheim) wurden in 100 ml einer 0,27 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 5,6) in einer solchen Weise gelöst, daß das Gemisch in einem einzigen Reagenzröhrchen Aufnahme fand, und anschließend wurde dies in üblicher Weise lyophilisiert.
Vorbehandlungssäule: ein 1,5 ml Behälter (hergestellt durch Analytical International), ausgestattet mit einem gefritteten Filter wurde mit 0,1 ml AG50W-X8 (H-Typ) und 0,4 ml AG1-X8 (Oh-Typ), beide hergestellt von Bio-Rad Laboratories, Inc., in dieser Reihenfolge vom Boden gepackt. Anschließend wurde ein gefritteter Filter weiterhin auf den gepackten Harzen angeordnet, um dadurch die Harze zu fixieren. Über dem Auslaß wurde eine Kappe angeordnet, während der Einlaß hermetisch abgeschlossen wurde, um zu verhindern, daß die gepackten Harze austrocknen und um das Eindringen von in der Luft enthaltenen Kohlendioxidgas zu hemmen, das die Harze abbauen würde.
Standardlösung: 0,2 ml einer 1 mg/ml Lösung von 1,5-AG wurde in ein Reagenzröhrchen eingeführt und in üblicher Weise lyophilisiert.

(2) Verfahrensablauf

200 ul einer Serumprobe wurden in ein 1,5 ml Eppendorf- Röhrchen eingebracht, und 15 ul vom Reagenz A wurde dazugegeben, anschließend wurde gerührt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, und 100 ul des Überstehenden wurden auf einem Plastikröhrchen angeordnete Vorbehandlungssäule gegeben, von der die Kappe und die Abdichtung entfernt worden waren. Nachdem die Flüssigkeit vollständig das Harz passiert hatte, wurden 0,5 ml destilliertes Wasser für die Wäsche hinzugegeben. Nach dem Waschen mit zusätzlichen 0,5 ml Portionen destilliertem Wasser (2 Mal) wurden die 1,6 ml des Ablaufes aus der Vorbehandlungssäule gesammelt. Das Reagenz B wurde durch Zugabe von 100 ml destilliertem Wasser regeneriert. 0,5 ml des regenerierten Reagenz B wurden zu dem obigen Ablauf durch eine mit einem Filter ausgestatteten Düse gegeben, um suspendierte Bestandteile zu entfernen. Das erhaltene Gemisch wurde gerührt und bei 37 ºC für eine Stunde inkubiert. Die Absorption des Reaktionsgemisches bei 405 nm wurde mit einem üblichen Spektrometer gemessen.
Getrennt davon wurde eine Standard-1,5-AG-Probe (40 ug/ml) durch Zugabe von 5 ml destilliertes Wasser zu einer Standardlösung hergestellt. Anschließend wurde eine Eichkurve unter Verwendung der Standardprobe, einer weiteren durch zweifache Verdünnung derselben erhaltene Standardprobe und destilliertem Wasser gebildet. Auf diese Weise wurde 1,5-AG in der Serumprobe aus der Absorption entsprechend der Eichkurve bestimmt. Die Bestimmung nach der Eichkurve erfolgte in folgender Weise. Zu 100 ul des obigen Standards wurden 1,5 ml destilliertes Wasser und 0,5 ml des regenerierten Reagenz B hinzugegeben, und es wurde danach gerührt. Anschließend wurde sie in gleicher Weise behandelt wie im Falle des obigen Ablauf s aus einer Serumprobe, und die Absorption des Reaktionsgemisches wurde gemessen. Die gleiche Ergebnisse wie im Beispiel 5 wurden bei Einsatz dieser Ausrüstung erhalten.

Claims

1. Reagenzausrüstung zur Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol, die umfaßt

ein Mittel zur Entfernung von Zuckern,

ein Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid und

Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase zur Oxidation von 1,5- Anhydroglucitol.

2. Reagenzausrüstung nach Anspruch 1, worin das Reagenz zur Entfernung von Zuckern ein stark basisches Anionenaustauschharz (OH-Typ) oder ein Anionenaustauschharz vom Rorat-Typ ist.

3. Reagenzausrüstung nach Anspruch 2, worin ein Kationenaustauschharz zusammen mit dem stark basischen Anionenaustauschharz verwendet wird.

4. Reagenzausrüstung nach Anspruch 2 oder 3, worin das stark basische Anionenaustauschharz als Ionenaustauschgruppe eine Tri(C&sub1;-C&sub4;)alkylaminogruppe oder eine Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)alkyl-di- (C&sub1;-C&sub4;)alkylaminogruppe hat und eine solche Teilchengröße, daß es durch Siebe mit 0,074 bis 0,037 mm (200 bis 400 Mesh) hindurchgeht.

5. Reagenzausrüstung nach Anspruch 2, worin das Anionenaustauschharz vom Porat-Typ sowohl eine Di(C&sub1;-C&sub4;)alkyllaminogruppe als auch eine Hydroxy(C&sub1;-C&sub4;)alkyl-di(C&sub1;-C&sub4;)alkylaminogruppe als eine Ionenaustauschgruppe hat.

6. Reagenzausrüstung nach einem der Ansprache 1 bis 5, worin das Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid eine oxidase ist.

7. Reagenzausrüstung nach Anspruch 6, worin die Peroxidase Meerrettich-Peroxidase ist.

8. Reagenzausrüstung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid umfaßt:

(A) Meerrettichperoxidase; und

(B) ein Substrat für Meerrettichperoxidase, das entweder (1) eine gefärbte Substanz bildet; (2) eine fluoreszierende Substanz bildet; oder (3) Chemilumineszenz zeigt.

9. Reagenzausrüstung nach Anspruch 8, worin das Substrat für Meerrettich-Peroxidase, das eine gefärbte Substanz bildet, ausgewählt ist unter 2,2'-Acinobis(3-ethylbenzothiazolin-6- sulfonsäure), o-Phenylendiamin, 5-Aminosalicylsäure und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin;

das Substrat für Meerrettich-Peroxidase, das eine fluoreszierende Substanz bildet, ausgewählt ist unter p-Hydroxyphenylessigsäure und 3-(p-Hydroxyphenyl)propionsäure; und

das Substrat für Meerrettichoxidase, das Chemilumineszenz zeigt, ausgewählt ist unter Luminol und Isoluminol.

10. Reagenzausrüstung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, die umfaßt:

(1) eine Säule, gepackt mit 0,1 bis 1 ml eines stark basischen Anionenaustauschharzes (OH-Typ) und 0,01 bis 0,5 ml eines Kationenaustauschharzes;

(2) 10 m Einheiten bis 100 Einheiten pro Probe an Meerrettich- Peroxidase,

0,5 bis 10 uM pro Probe ABTS und

0,5 bis 10 Einheiten pro Probe an Pyranoseoxidase;

(3) 5 bis 20 ug pro Probe einer Perchlorsäurelösung mit einer Reinheit von 100 %; und

(4) 0,1 bis 1 mg 1,5-Anhydroglucitol.

11. Verfahren zur Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol, das umfaßt die selektive Entfernung von Zuckern aus einer 1,5-Anhydroglucitol enthaltenden Probe;

das Wirken von Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase gegen 1,5-Anhydroglucitol, das in der so erhaltenen Probe enthalten ist, in Gegenwart von Sauerstoff; und

Bestimmung von 1,5-Anhydroglucitol aus der so gebildeten Menge von Wasserstoffperoxid.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Pyranoseoxidase und die L-Sorboseoxidase in die Kategorien von EC Nr 1.1.3.10 und EC Nr 1.1.3.11 fallen.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Pyranoseoxidase durch einen Mikroorganismus produziert wird, der zum Genus Polyporus gehört, während die L-Sorboseoxidase durch einen Mikroorganismus produziert wird, der zum Genus Trametes gehört.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin 0,5 bis 10 Einheiten pro Probe an Pyranoseoxidase oder L-Sorboseoxidase gegenüber 1,5-Anhydroglucitol wirken, das in einer Probe enthalten ist, bei 4 bis 50 ºC für 0,5 bis 3 Stunden.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, worin in einer Probe enthaltene Zucker selektiv mit einem stark basischen Anionenaustauschharz entfernt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin eine Probe, aus der Zucker selektiv mit dem stark basischen Anionenaustauschharz entfernt wurden, mit einem Kationenaustauschharz neutralisiert wird.