BR112019000742B1

BR112019000742B1 - Método e kit para analisar uma amostra

Info

Publication number: BR112019000742B1
Application number: BR112019000742-3A
Authority: BR
Inventors: Richard C. Willson; Jinsu Kim; Binh V. Vu; Patricia Olga Vásquez Villegas; Federico Augusto Ruiz Ruiz; Marco Antonio Rito Palomares
Original assignee: University Of Houston System; Instituto Tecnológico Y De Estudios Superiores De Monterrey (Itesm)
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2017-07-27
Publication date: 2022-12-06
Also published as: US11307146B2; BR112019000742A2; WO2018022883A1; MX2019001134A; US20220221408A1; CN109312287A; US20180031484A1

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos, dispositivos e kit para analisar uma amostra contendo 1,5-anidroglucitol e um primeiro analito através de uma ou mais reações quimioluminescentes. Alguns exemplos de realização incluem a medição de uma primeira resposta luminosa resultante de uma primeira reação quimioluminescente e a medição de uma segunda resposta luminosa resultante de uma segunda reação quimioluminescente. Determinados exemplos de realização também incluem a comparação da primeira resposta luminosa em relação à segunda resposta luminosa para determinar uma relação entre 1,5- anidroglucitol e o primeiro analito.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório Norte Americano número 62/368.516, depositado em 29 de julho de 2016, cujo teor é integralmente incorporado ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] Exemplos de realização da presente divulgação referem-se a sistemas, métodos e kits para analisar uma amostra de fluido corporal. Exemplos de realização específicos referem-se a ensaios baseados em luminescência e detecção de fótons em locais de atendimentos remotos (ensaios POC, acrônimo do inglês point-of-care) para determinar analitos de baixos níveis em fluido corporal, como um método de triagem não invasivo. Em um formato de ensaio, um analito de interesse é tratado com reagentes em reações geradoras de luz para produzir fótons como sinal de saída. Os fótons emitidos são detectados usando o dispositivo detector POC que pode ser controlado e monitorado através de dispositivos com capacidade de computação e exibição, incluindo, por exemplo, dispositivos móveis como os smartphones.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O diagnóstico precoce do diabetes tipo 2 (DM2) é de suma importância para reduzir as complicações do diabetes. Para o monitoramento glicêmico no DM2, pode-se medir metabólitos, como o 1,5-anidroglucitol (1,5- AHG), HbAlc e glicose em amostras de sangue. Um relatório recente revelou uma forte associação do DM2 com 1,5-AHG na saliva como um marcador não invasivo, resultando em benefício aos pacientes que são adversos à coleta de sangue. O 1,5-AHG é um análogo da glicose não metabolizável que está presente no sangue humano devido predominantemente à ingestão dietética. Na fisiologia, o nível de 1,5-AHG é equilibrado por ser reabsorvido e excretado pelo rim e urina, respectivamente. A variação normal do nível de 1,5-AHG no corpo humano é de aproximadamente 6,8 - 32,3 μg/mL para pessoas nos EUA. A concentração de 1,5-AHG no sangue diminui durante os períodos de hiperglicemia, uma vez que a reabsorção é completamente inibida pela glicose no transportador ativo de frutose e manose; Portanto, monitorar 1,5-AHG na saliva é útil para alcançar o controle glicêmico.

[0004] Para determinar a concentração de 1,5-AHG, podem ser usados métodos convencionais, tais como cromatografia líquida, cromatografia gás- líquido e HPLC. Entretanto, esses métodos exigem uma grande quantidade de volume de amostra, uma série de preparações das amostras, complexos equipamentos laboratoriais e pessoal treinado. Uma alternativa aos métodos convencionais é usar sistemas enzimáticos. A piranose oxidase (PROD) tem sido utilizada para determinação de D-glicose e 1,5-AHG em análises clínicas. A PROD oxida o grupo hidroxila da segunda posição do 1,5-AHG e gera peróxido de hidrogênio que pode ser detectado usando uma variedade de métodos, incluindo a colorimetria, ensaio eletroquímico e quimioluminescente. Portanto, o 1,5-AHG é indiretamente determinado medindo o peróxido de hidrogênio gerado conforme mostrado na reação 2 da FIG. 1 seção (b). No entanto, a amostra de saliva contém D-glicose, que também é oxidada pela PROD e produz peróxido de hidrogênio, interferindo assim na medição do 1,5-AHG. Neste caso, é necessário o pré-tratamento da amostra para manter a D-glicose fora da reação com a PROD, conforme mostrado na reação 1 da Fig. 1 seção (a).

[0005] Desse modo, existe atualmente a necessidade de uma técnica melhorada para detectar analitos, tal como o 1,5-AHG, em amostras de fluidos corporais.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0006] Exemplos de realização da presente divulgação referem-se aos sistemas, métodos e kits para a medição de um analito, incluindo, por exemplo, 1,5-anidroglucitol, em uma amostra de fluido corporal.

[0007] Alguns exemplos de realização incluem um método para analisar uma amostra, em que o método compreende: a obtenção de uma amostra compreendendo 1,5-anidroglucitol e um primeiro analito; a adição de um primeiro reagente à amostra, em que o primeiro reagente provoca uma primeira reação quimioluminescente com a amostra; a medição de uma primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente; e a adição de um segundo reagente à amostra. Em exemplos de realização específicos, o segundo reagente é adicionado sequencialmente à amostra após o primeiro reagente ser adicionado à amostra; e o segundo reagente provoca uma segunda reação quimioluminescente com a amostra. Exemplos de realização específicos incluem a medição de uma segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente; e comparar a primeira resposta luminosa com a segunda resposta luminosa para determinar uma relação entre 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito.

[0008] Em exemplos de realização específicos, a amostra compreende saliva, urina, sangue e/ou fluido intersticial. Em alguns exemplos de realização, o primeiro analito é glicose, L-sorbose, D-xilose, D-galactose, glucono-S-lactona, ureia, creatinina ou creatina. Em exemplos de realização específicos, o primeiro reagente é glicose oxidase e o segundo reagente é piranose oxidase. Em exemplos de realização específicos, a medição da primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente e a segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente compreende a medição de fótons com um detector de luz.

[0009] Em determinados exemplos de realização, o detector de luz é selecionado a partir do grupo que consiste em um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam ou câmera de relógio inteligente. Em exemplos de realização específicos, o primeiro reagente e o segundo reagente são adicionados à amostra através de um dispositivo microfluídico. Em alguns exemplos de realização, comparar a primeira resposta luminosa à segunda resposta luminosa para determinar uma relação de 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito compreende transmitir os dados para um processador de computador. Exemplos de realização específicos compreendem ainda o acesso a uma tabela de pesquisa com o processador do computador. Em determinados exemplos de realização, a tabela de pesquisa compreende uma indicação de uma condição fisiológica. Em exemplos de realização específicos, a condição fisiológica está relacionada com um nível de insulina de uma pessoa a partir da qual a amostra foi obtida. Alguns exemplos de realização compreendem ainda a normalização da relação com base na medição de um marcador na amostra. Em exemplos de realização específicos, o marcador é ureia, creatinina, creatina, albumina de soro humano ou hemoglobina. Em determinados exemplos de realização, a amostra compreende urina, sangue ou saliva.

[0010] Algumas realizações exemplares incluem um kit compreendendo uma câmara configurada para adicionar sequencialmente um primeiro reagente e um segundo reagente a uma amostra, em que: a amostra compreende um primeiro analito e um segundo analito; o primeiro reagente provoca uma primeira reação quimioluminescente com a amostra; e o segundo reagente provoca uma segunda reação quimioluminescente com a amostra. Alguns exemplos de realização também incluem um dispositivo de detecção de luz, onde o dispositivo de detecção de luz está configurado para ser capaz de: mensurar o primeiro dado correlacionado com uma primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente; e mensurar o segundo dado correlacionado com uma segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente. Realizações exemplares incluem também um módulo de comunicação configurado para transmitir o primeiro e segundo dados do dispositivo de detecção de luz para um processador de computador, onde o processador de computador está configurado para calcular uma relação entre o primeiro analito e o segundo analito com base no primeiro dado e segundo dado.

[0011] Em determinados exemplos de realização, a câmara compreende um elemento capilar configurado para direcionar a amostra por capilaridade. Em exemplos de realização específicos, o primeiro reagente é absorvido em uma primeira porção do elemento capilar e o segundo reagente é absorvido em uma segunda porção do elemento capilar. Em alguns exemplos de realização específicos, o elemento capilar é configurado para distribuir a amostra à primeira porção do elemento capilar; e o elemento capilar é configurado para distribuir a amostra para a segunda porção do elemento capilar. Em exemplos de realização específicos, o elemento capilar é configurado para enviar a amostra à primeira porção antes de distribuir a amostra para a segunda porção. Em determinados exemplos de realização, o primeiro analito é glicose. Em exemplos de realização específicos, o segundo analito é 1,5-anidroglucitol. Em alguns exemplos de realização, o processador do computador está contido dentro de um dispositivo de comunicação sem fio. Em exemplos de realização específicos, o dispositivo de comunicação sem fio é um telefone celular. Em determinados exemplos de realização, o módulo de comunicação é configurado para transmitir dados sem fio do dispositivo de detecção de luz para o processador do computador. Em exemplos de realização específicos, o processador do computador é configurado para acessar uma tabela de pesquisa. Em alguns exemplos de realização, a tabela de pesquisa compreende uma indicação de uma condição fisiológica. Em exemplos de realização específicos, a condição fisiológica está relacionada com um nível de insulina de uma pessoa a partir da qual a amostra foi obtida.

[0012] Em determinados exemplos de realização, a amostra compreende saliva, urina, sangue e/ou fluido intersticial. Em exemplos de realização específicos, o primeiro analito é glicose, ureia, creatinina ou creatina. Em alguns exemplos de realização, o primeiro reagente é glicose oxidase. Em alguns exemplos de realização específicos, o segundo reagente é piranose oxidase. Em determinados exemplos de realização, o primeiro dado compreende uma primeira medição de fótons relacionada à primeira reação quimioluminescente; e o segundo dado compreende uma segunda medição de fótons relacionada à segunda reação quimioluminescente. Em exemplos de realização específicos, o dispositivo de detecção de luz é selecionado a partir do grupo que consiste em um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam ou câmera de relógio inteligente. Em alguns exemplos de realização, o processador do computador é configurado para normalizar a relação com base na medição de um marcador na amostra. Em exemplos de realização específicos, o marcador é ureia, creatinina, creatina, albumina de soro humano ou hemoglobina. Em determinados exemplos de realização, a amostra compreende urina, sangue ou saliva.

[0013] Exemplos de realizações da presente invenção incluem detectores de fótons baseados na quimioluminescência para a determinação de baixos níveis de 1,5-AHG em fluido corporal em um formato móvel, incluindo, por exemplo, um acessório para smartphones. Em um exemplo de realização do formato de ensaio, os inventores primeiro oxidaram 1,5-AHG em uma solução de amostra com PROD para produzir peróxido de hidrogênio, seguido pela adição de 5- amino-2,3-di-hidro-1,4-ftalaxinediona (luminol) e peroxidase de rábano (HRP). A luz emitida a partir da reação de luminol, conforme mostrado na FIG. 1(b) foi detectada usando sensores de fótons, incluindo as matrizes de fotodiodo de avalanche (APD) ou tubo fotomultiplicador (PMT).

[0014] Exemplos de realização específicos referem-se a um ensaio baseado em luminescência e detecção de fótons em locais de atendimentos remotos (ensaios point-of-care ou POC) para determinar analitos de baixo nível em fluido corporal, como um método de triagem não invasivo. Em um formato de ensaio, um analito de interesse é tratado com reagentes em reações geradoras de luz para produzir fótons como sinal de saída. Os fótons emitidos são detectados usando o dispositivo detector POC que pode ser controlado e monitorado através de dispositivos com capacidade de computação e exibição, incluindo, por exemplo, dispositivos móveis, como um smartphone.

[0015] Em um exemplo de realização, o analito de interesse é 1,5- anidroglucitol, glicose, creatina, creatinina, ureia, metabolitos, uma proteína, um peptídeo, um hormônio, um biomarcador, uma toxina ou uma proteína modificada (por exemplo, fosforilada ou acetilada).

[0016] Em um exemplo de realização, a amostra na qual o analito será detectado compreende um espécime de biopsia, sangue, soro, plasma, fezes, saliva, fluido de expectoração, LCR, líquido de lavagem, lavado nasal, urina, lisado celular, água potável, água natural, água do mar, água do solo, lixiviado do solo, tecido fresco, tecido congelado, tecido tratado em formalina neutra, bloco de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina, bloco de tecido fixado em etanol e emblocado em parafina.

[0017] De acordo com um exemplo de realização da presente invenção, um espécime é opcionalmente pré-tratado para concentração do analito, remoção de partículas, contaminantes, interferências ou inibidores da reação, redução da viscosidade, melhora das propriedades de manipulação ou para modificar o analito para uma melhor detecção.

[0018] Em um exemplo de realização adicional, os métodos para remover ou modificar seletivamente as interferências ou contaminantes incluem os usos de captura de anticorpos, captura de aptâmeros, reações enzimáticas, modificações químicas ou técnicas de cromatografia, como de troca-iônica, HIC, em quelato metálico, boronato ou por afinidade.

[0019] Em um exemplo de realização, o método de leitura, através do qual a substância a ser analisada é detectada, é o de emissão de luz por quimioluminescência, bioluminescência, ou qualquer método que possa ser utilizado para gerar o sinal de luz no método da presente invenção.

[0020] Em um exemplo de realização, o analito reage para produzir peróxido de hidrogênio pela reação acoplada enzimática. O peróxido de hidrogênio é detectado por reação quimioluminescente com substrato quimioluminescente para produzir sinal luminoso.

[0021] Em um exemplo de realização, os reagentes utilizados para gerar a produção de luz são substratos quimioluminescentes, tais como luminol, isoluminol, 1,2-dioxetanos, compostos peroxioxalato e corantes.

[0022] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é gerado pela reação de substrato quimioluminescente e peróxido de hidrogênio que é catalisado por enzima, tal como peroxidase de rábano-silvestre (HRP).

[0023] Em outro exemplo de realização, o sinal luminescente é gerado pela reação de substrato quimioluminescente e peróxido de hidrogênio com nanopartículas de metal, tal como nanopartículas de prata.

[0024] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é obtido sem enzima pela reação de luminol e peróxido de hidrogênio na presença de um íon ferricianeto.

[0025] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é obtido sem enzima pela reação de luminol e peróxido de hidrogênio na presença de nanopartículas de óxido de ferro.

[0026] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é obtido sem enzima pela reação de luminol e peróxido de hidrogênio na presença de catalisador de prata.

[0027] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é obtido sem enzima pela reação de lucigenina com peróxido de hidrogênio na presença de íon metálico.

[0028] Em um exemplo de realização, o sinal luminescente é obtido pela reação de um oxalato de arila, tal como bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato, com peróxido de hidrogênio, na presença de uma substância fluorescente.

[0029] Em um exemplo de realização, o ensaio é realizado em um dispositivo microfluídico que compreende múltiplos aspectos funcionais: separação ou remoção de interferências, reação para gerar sinal e áreas de leitura de sinal ótico. Em um exemplo de realização adicional, o dispositivo microfluídico contém múltiplas áreas de separação/remoção, reação e de leitura de sinal para multiplexação, onde mais de um analito pode ser avaliado.

[0030] Em um exemplo de realização, a área de separação no dispositivo microfluídico contém adsorvente ou absorvente para separar ou remover interferências a partir dos analitos.

[0031 ] Em outro exemplo de realização, a área de separação no dispositivo microfluídico contém enzima para converter interferências em não interferências.

[0032] Em outro exemplo de realização, as interferências são enzimaticamente convertidas por peróxido de hidrogênio que reage com o substrato quimioluminescente para gerar sinal de luz. Os interferentes e o peróxido de hidrogênio são consumidos no processo e seu sinal, que é lido pelo detector de luz, pode ser usado para calibração. As etapas subsequentes então convertem o analito em sinal luminoso e que é lido pelo detector de luz.

[0033] Em um exemplo de realização, a saída de sinal luminescente coletada por coleta óptica e subsequentemente detectada por detector de luz, tal como, mas não se limitando a, dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC) ou fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor de dispositivo de carga acoplada (CCD), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT). O detector de luz pode funcionar como um dispositivo de ponto de atendimento conectado e controlado via conexão com ou sem fio por computador pessoal, laptop, tablet, smartphone, relógio inteligente ou qualquer dispositivo semelhante com recursos de computação e exibição.

[0034] Os detalhes de uma ou mais exemplos de realização da invenção são apresentados nos desenhos anexos e na descrição abaixo.

[0035] Determinadas terminologias usadas na descrição a seguir são apenas por conveniência e não são limitativas. As palavras “direita”, “esquerda”, “inferior” e “superior” indicam a direção nos desenhos para os quais é feita referência. As palavras “interior”, “exterior” referem-se a ‘em direção’ e ‘afastado’, respectivamente, do centro geométrico do recurso ou dispositivo descrito. As palavras “distal” e “proximal” referem-se a orientações tomadas no contexto do item descrito e, com relação aos instrumentos aqui descritos, são tipicamente baseadas na perspectiva do cirurgião que usa tais instrumentos. As palavras “anterior”, “posterior”, “superior”, “inferior”, “medial”, “lateral” e palavras e/ou frases relacionadas designam posições e orientações preferidas no corpo humano para o qual a referência é feita. A terminologia inclui as palavras listadas acima, seus derivados e palavras de importância similar.

[0036] A seguir, o termo “acoplado” é definido como conectado, embora não necessariamente diretamente, e não necessariamente mecanicamente.

[0037] O uso da palavra “um” ou “uma” quando usado em conjunto com o termo “compreendendo” nas reivindicações e/ou no presente relatório descritivo pode significar “um”, mas também é consistente com a significação de “um ou mais” ou “pelo menos um”. Os termos “cerca de”, “aproximadamente” ou “substancialmente” significam, em geral, o valor declarado com mais ou menos 5%. O uso do termo “ou” nas reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para referir-se apenas às alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a descrição suporte uma definição que se refere apenas às alternativas e “e/ou”.

[0038] Os termos “compreende” (e qualquer forma de compreende, tal como “compreendendo”), “possuindo” (e qualquer forma de possuindo, tal como “possui” e “tem”), “incluindo” (e qualquer forma de incluindo, tal como “inclui” e” incluir”) ou “contendo” (e qualquer forma de contendo, tal como “contém” e “conter”) são verbos de ligação abertos. Sendo assim, um método ou dispositivo que “compreende”, “tem”, “inclui” ou “contém” uma ou mais etapas ou elementos, possui aquelas uma ou mais etapas ou elementos, mas não está limitado a possuir apenas tais elementos. Da mesma forma, uma etapa de um método ou um elemento de um dispositivo que “compreende”, “tem”, “inclui” ou “contém” um ou mais recursos, possui um ou mais recursos, mas não está limitado a possuir apenas estes um ou mais recursos. Além disso, um dispositivo ou estrutura que é configurado de certa forma é configurado pelo menos dessa maneira, mas também pode ser configurado de maneiras que não estão listadas.

[0039] Outros objetos, características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir. Entretanto, deve ser compreendido que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando exemplos de realização preferidos da invenção, são fornecidos apenas a título ilustrativo, uma vez que diversas alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção serão evidentes para os técnicos hábeis no assunto a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0040] Exemplos de realização exemplificativas da presente divulgação são fornecidos nas figuras anexas. As figuras são meramente exemplos para ilustrar a estrutura de dispositivos exemplares e determinadas características que podem ser usadas singularmente ou em combinação com outras características. A invenção não deve ser limitada aos exemplos mostrados.

[0041] A Figura 1 ilustra um esquema da reação para detecção de 1,5- AHG baseada em quimioluminescência.

[0042] A Figura 2 ilustra um fluxograma para um método de análise de amostra.

[0043] A Figura 3 ilustra um esquema de um kit compreendendo uma câmara configurada para adicionar sequencialmente um primeiro reagente e um segundo reagente a uma amostra.

[0044] A Figura 4 ilustra um esquema de um diagrama de circuito para ADC e controle do motor de passo.

[0045] A Figura 5 ilustra um esquema de um sistema de carregamento e medição de amostras.

[0046] A Figura 6 ilustra um esquema de uma interface gráfica de usuário (GUI) para aquisição de dados e operação de MPPC.

[0047] A Figura 7 ilustra um gráfico de detecção de HRP-Estreptavidina utilizando o leitor de microplacas MPPC e Tecan.

[0048] A Figura 8 ilustra um gráfico de detecção de baixo nível de H202 utilizando o leitor MPPC e Tecan.

[0049] A Figura 9 ilustra um gráfico de detecção de baixo nível de 1,5-AHG usando MPPC.

[0050] A Figura 10 ilustra um esquema de um suporte de amostra e sistema PMT geral.

[0051] A Figura 11 ilustra um esquema de um diagrama de circuito para um sistema de aquisição de dados sem fio.

[0052] A Figura 12 ilustra um visor ou display do aplicativo de software para a medição GUI de 1,5-AHG.

[0053] A Figura 13 ilustra gráficos de detecção de baixo nível de H202 usando PMT.

[0054] A Figura 14 ilustra um gráfico de detecção de baixo nível de 1,5- AHG usando PMT.

[0055] A Figura 15 ilustra um desenho esquemático de uma configuração óptica para melhorar um sistema PMT.

[0056] A Figura 16 ilustra um gráfico de detecção melhorada de baixo nível de 1,5-AHG usando PMT antes do alinhamento óptico.

[0057] A Figura 17 ilustra um gráfico de detecção melhorada de baixo nível de 1,5-AHG usando PMT após o alinhamento óptico.

[0058] A Figura 18 ilustra uma fotografia de um sistema PMT completo com resfriamento do sensor e ajuste do caminho óptico.

[0059] A Figura 19 ilustra um gráfico de SNR melhorada pela remoção de contagens escuras.

[0060] A Figura 20 ilustra um gráfico de SNR melhorada pela remoção de contagens escuras e aumentando o tempo de integração.

[0061] A Figura 21 ilustra um gráfico de uma curva de calibração para determinação de glicose com o uso de glicose oxidase.

[0062] A Figura 22 ilustra um gráfico de uma curva de calibração para determinação de 1,5-AHG com o uso de piranose oxidase.

[0063] A Figura 23 ilustra um desenho esquemático de uma depleção de glicose utilizando uma coluna de pré-tratamento.

[0064] A Figura 24 ilustra um gráfico de eficiência de separação usando uma minicoluna para depleção de glicose em mistura com 1,5-AHG.

[0065] A Figura 25 ilustra um gráfico da cinética quimioluminescente obtida com o uso de HRP e luminol.

[0066] A Figura 26 ilustra um gráfico da curva cinética de reação do ensaio de 1,5 AHG.

[0067] A Figura 27 ilustra um gráfico da curva padrão do ensaio de 1,5 AHG.

[0068] A Figura 28 ilustra um gráfico da viabilidade da dupla detecção de glicose e 1,5-anidroglucitol por reação enzimática em duas etapas.

[0069] A Figura 29 ilustra gráficos da dupla detecção de glicose e 1,5- anidroglucitol por reação enzimática de duas etapas.

[0070] A Figura 30 ilustra gráficos de contagem de fótons de nanopartículas de prata em uma reação quimioluminescente catalisada.

[0071] A Figura 31 ilustra um gráfico da detecção de glicose usando nanopartículas de prata como catalisador na reação quimioluminescente.

[0072] A Figura 32 ilustra um gráfico da detecção de creatinina com substrato quimioluminescente.

[0073] A Figura 33 ilustra um gráfico de uma curva padrão de um ensaio quimioluminescente de creatinina com um detector de fótons de uso no local de atendimento (point-of-care).

[0074] A Figura 34 ilustra um esquema de uma reação quimioluminescente envolvendo saliva e enzimas incluindo uricase e ascorbase.

[0075] A Figura 35 ilustra um esquema de uma reação química na qual o bis(2,4,6-triclorofenil)oxalato TCPO é dissolvido em acetato de etila.

[0076] A Figura 36 ilustra gráficos demonstrando a compatibilidade da química de peroxioxalato com saliva para detecção de peróxido de hidrogênio.

[0077] A Figura 37 ilustra um gráfico da detecção de peróxido de hidrogênio com titaniloxalato de amônio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0078] Uma visão geral dos exemplos de realização será apresentada inicialmente, seguida por uma discussão mais detalhada de características específicas dos exemplos de realizações. Referindo-se agora à Figura 2, é apresentado um fluxograma para um método de análise de amostras (100) que compreende múltiplas etapas. Em determinados exemplos de realizações, a amostra pode compreender um fluido corporal, incluindo, por exemplo, saliva ou urina.

[0079] Neste exemplo de realização, o método (100) inclui uma primeira etapa (105) que compreende a obtenção de uma amostra compreendendo 1,5- anidroglucitol e um primeiro analito. Em exemplos de realização específicos, o analito pode ser glicose, ureia, creatinina ou creatina. O método (100) também compreende uma etapa (110), que compreende a adição de um primeiro reagente com a amostra, em que o primeiro reagente causa uma primeira reação quimioluminescente com a amostra. Em exemplos de realização específicos, o primeiro reagente pode ser glicose oxidase.

[0080] Neste exemplo de realização, o método (100) também compreende uma etapa (115) de medição de uma primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente, e uma etapa (120) de adição de um segundo reagente à amostra. Em exemplos de realização específicos, o segundo reagente pode ser piranose oxidase e o primeiro reagente e o segundo reagente podem ser adicionados à amostra por um dispositivo microfluídico.

[0081] No exemplo de realização da Figura 2, o segundo reagente pode ser adicionado sequencialmente à amostra após o primeiro reagente ser adicionado à amostra; de modo que o segundo reagente provoque uma segunda reação quimioluminescente com a amostra.

[0082] O método (100) compreende ainda uma etapa (125) de medição de uma segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente. Em exemplos de realização específicos, a medição da primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente e a segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente compreende a medição de fótons com um detector de luz. Em exemplos de realização específicos, o detector de luz pode ser um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam ou câmera de relógio inteligente.

[0083] Além disso, o método (100) compreende uma etapa (130) de comparação da primeira resposta de luz com a segunda resposta de luz para determinar uma relação entre 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito. Em determinados exemplos de realização, comparar a primeira resposta luminosa à segunda resposta luminosa para determinar uma relação de 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito compreende transmitir os dados para um processador de computador. Em alguns exemplos de realização, a tabela de pesquisa pode compreender uma indicação de uma condição fisiológica, incluindo, por exemplo, uma condição fisiológica que está relacionada com um nível de insulina de uma pessoa a partir da qual a amostra foi obtida.

[0084] Entende-se que outros exemplos de realização da presente divulgação podem incluir etapas adicionais ou menos etapas do que as etapas mostradas na Figura 2 e descritas acima. Determinados exemplos de realizações podem compreender também kits configurados para realizar os métodos, tais como os aqui descritos.

[0085] Referindo-se à Figura 3, determinados exemplos de realização incluem um kit (200) compreendendo uma câmara (210) configurada para adicionar sequencialmente um primeiro reagente (211) e um segundo reagente (212) à uma amostra (220). No exemplo de realização mostrado, a amostra (220) é colocada em um cassete (225) que pode ser inserido na câmara (210). Em determinados exemplos de realização, a amostra (220) compreende um primeiro analito (221) e um segundo analito (212).

[0086] No exemplo de realização mostrado, o primeiro reagente (211) e o segundo reagente (212) podem causar, respectivamente, uma primeira reação quimioluminescente (que produz uma primeira resposta luminosa (231)) e uma segunda reação quimioluminescente (que produz uma segunda resposta luminosa (232)) com a amostra (220). O kit (200) pode compreender ainda um dispositivo de detecção de luz (230) que está configurado para medir um primeiro conjunto de dados correlacionados com a primeira resposta luminosa (231) resultante da primeira reação quimioluminescente. Adicionalmente, o dispositivo de detecção de luz (230) pode ser configurado para medir um segundo conjunto de dados correlacionados com a segunda resposta luminosa (232) resultante da segunda reação quimioluminescente.

[0087] O kit (200) pode compreender ainda um módulo de comunicação (250) configurado para transmitir os primeiros dados e os segundos dados do dispositivo de detecção de luz (230) para um processador de computador (260). Em exemplos de realização específicos, o processador de computador (260) pode ser configurado para calcular a relação do primeiro analito para o segundo analito com base nos primeiros dados e nos segundos dados.

[0088] Em certos exemplos de realização, a câmara (210) compreende um elemento capilar (215) configurado para direcionar a amostra por capilaridade (220) de modo que o primeiro reagente (211) seja absorvido em uma primeira porção (216) do elemento capilar (215) e o segundo reagente (212) seja absorvido em uma segunda porção (217) do elemento capilar (215). Em determinados exemplos de realização, o elemento capilar (215) é configurado para direcionar a amostra por capilaridade (220) da primeira porção (216) do elemento capilar (215) antes de direcionar a amostra por capilaridade (220) para a segunda porção (217). Em exemplos de realização específicos, o primeiro analito (221) pode ser 1,5-anidroglucitol e o segundo analito (222) pode ser glicose.

[0089] O processador de computador (260) pode estar contido dentro de um dispositivo de comunicação sem fio (265), incluindo, por exemplo, um telefone celular. Além disso, o módulo de comunicação (250) pode ser configurado para transmitir dados sem fios do dispositivo de detecção de luz (230) para o processador de computador (260).

[0090] Em exemplos de realização específicos, o processador (260) do computador pode ser configurado para aceder a uma tabela de pesquisa que compreende uma indicação de uma ou mais condições fisiológicas, incluindo, por exemplo, aquelas relacionadas com um nível de insulina de uma pessoa da qual foi obtida a amostra (220).

[0091] Em determinados exemplos de realização, a amostra (220) pode compreender um fluido corporal, incluindo, por exemplo, saliva ou urina. O primeiro analito (221) pode ser glicose, ureia, creatinina ou creatina e o primeiro reagente (211) pode ser glicose oxidase em exemplos de realização específicos. Além disso, o segundo reagente pode ser piranose oxidase em exemplos de realização específicos.

[0092] Durante a operação do kit (200), os dados correlacionados com a primeira resposta de luz (231) e a segunda resposta de luz (232) podem compreender uma medida de fótons relacionada à primeira e segunda reações quimioluminescentes, respectivamente. Em realizações exemplificativas, o dispositivo de detecção de luz (230) pode incluir um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam ou câmera de relógio inteligente.

[0093] Entende-se que outros exemplos de realização da presente invenção podem compreender características ou componentes diferentes dos mostrados e descritos na discussão das figuras.

CONTADOR DE FÓTONS DE MULTIPIXELS (MPPC)

[0094] Determinados exemplos de realização da presente invenção utilizam um dispositivo de detecção de luz configurado como um contador de fótons multipixels (MPPC), que é um detector baseado no estado sólido indicado como fotomultiplicador de silício (SiPM). O SiPM é um dispositivo que compreende múltiplos conjuntos de fotodíodos de avalanche (APD) em um substrato de silício. Normalmente, um APD é operado com a polarização reversa abaixo da tensão de ruptura para converter a luz em corrente elétrica por efeito fotoelétrico. No entanto, em um SiPM, o arranjo APD é operado acima da tensão de ruptura, no modo Geiger. Embora o tipo de saída digital funcione no modo de comutação/digital, o SiPM é, em geral, um dispositivo de saída analógico, pois todas as matrizes APD são lidas em paralelo, gerando um sinal analógico integrado. Os inventores usaram o MPPC (Hamamatsu, C12662-350, tipo de saída analógico), detectando luz em uma faixa dinâmica de 106 a 1010 fótons dentro de 3 mm2 de área na qual 3.600 APDs estão dispostos.

CONVERSOR ANALÓGICO-DIGITAL (ADC)

[0095] Para a leitura da saída analógica do MPPC, os inventores desenvolveram um conversor analógico-digital (ADC) barato e de alta resolução. O ADC é um digitalizador para converter sinais analógicos em valores digitalizados. Uma faixa de leitura típica do ADC é 0-5 V e 4-20 mA para tensão DC e corrente contínua, respectivamente. A resolução de bits do ADC varia dependendo dos produtos comerciais, e está geralmente na faixa de 8 a 18 bits. Os inventores também obtiveram um ADC (Microchip, MCP3421) que suporta a resolução de 12-18 bits e interface de circuito interintegrado (12C). Para enviar os valores digitalizados do ADC para computadores ou smartphones, é necessário um dispositivo mestre como um mediador. Os inventores usaram o microcontrolador Arduino (Arduino, Nano Atmega328) como dispositivo mestre para a comunicação I2C com o ADC. O diagrama do circuito para o ADC projetado é mostrado na Figura 4. Para programar e implementar o protocolo I2C, os inventores usaram <Wire.h> nas bibliotecas Arduino. CARREGAMENTO DE AMOSTRAS E SISTEMA DE MEDIÇÃO

[0096] Para desenvolver um sistema de carregamento e medição de amostras, peças de protótipo de plástico foram criadas usando um software de modelagem 3D (Autodesk, Inventor Professional 2015, edição estudantil) e impressora 3D (Flashforge, Creator Pro) como mostrado na Figura 5. Os inventores desenharam um cassete descartável no qual uma amostra líquida é adicionada. Para montar o cassete no módulo MPPC, o motor de passo (Nema 8, 8HS11-0204S) traz o controle deslizante para a porta do cassete e, em seguida, os usuários podem inserir o cassete no controle deslizante. O controle deslizante que leva o cassete se move para trás e para no local onde o detector está localizado. A luz gerada pela reação de quimioluminescência atravessa a janela de vidro do fundo do cassete e chega às matrizes do detector. A posição do motor é calibrada usando o sensor liga-desliga localizado no lado oposto da porta do cassete. Quando o controle deslizante atinge o sensor de posição, o sensor liga para definir a posição do motor como zero. O motor de passo é controlado usando um driver quádruplo haif-H (Texas instrument, SN754410N). O diagrama do circuito para o motor de passo é mostrado na Figura 4. Para programar e implementar o driver do motor, os inventores usaram <AccelStepper.h> nas bibliotecas do Arduino.

INTERFACE GRÁFICA DO USUÁRIO (GUI) LABVIEW

[0097] Para operar o sistema de medição MPPC e para visualizar os sinais adquiridos, uma interface gráfica do usuário (GUI) foi desenvolvida usando o LabView 8.6 (National Instrument), como mostrado na Figura 6. As funções da GUI são enviar e receber respostas do microcontrolador Arduino para operar o ADC e o motor de passo. Os inventores adotaram a interface serial para comunicação entre o computador e o microcontrolador Arduino, porque tanto o LabView quanto o Arduino suportam a biblioteca e a interface serial. Os comandos para a comunicação serial estão listados na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 PROTOCOLOS PARA COMUNICAÇÃO SERIAL

DETECÇÃO DE ESTREPTAVIDINA CONJUGADA COM PEROXIDASE DE RÁBANO (HRP- ESTREPTAVIDINA) USANDO MPPC

[0098] Para validar que o sistema MPPC pode detectar luz de baixo nível, os inventores primeiro determinaram concentrações de HRP-Estreptavidina (Thermo Fisher Scientific, # 21130) utilizando o ensaio de quimioluminescência. Os inventores misturaram 30 μL de solução luminol (Michigan Diagnostics, FEMTOGLOW) com 10 μL HRP-Estreptavidina a várias concentrações, a partir de 10 ng/mL até 100 μg/mL. As intensidades de cada amostra foram imediatamente mensuradas usando o MPPC. Na medição MPPC, a taxa de amostragem foi de 10 amostras/segundo e a resolução do ADC foi definida como 14 bits. Para comparar a sensibilidade do MPPC com um instrumento comercial disponível, os inventores também realizaram a medição de HRP-Estreptavidina com o leitor de microplacas Tecan (Tecan, Infinite 200 PRO). As intensidades lidas a partir do MPPC e do leitor Tecan foram proporcionais à concentração de HRP-Estreptavidina, conforme mostrado na Figura 7. Para o MPPC, os inventores detectaram intensidade de 2 mV para 1 ng/ml de HRP-Estreptavidina. Embora o ADC de 14 bits tenha uma resolução de 6,25 μV por bit, os inventores não conseguiram detectar 0,1 ng/ml de HRP-Estreptavidina, cujo sinal é esperado como sendo de 200 μV. Isso ocorre porque o sinal de fundo é maior que 600 μV. No entanto, foi detectado 0,1 ng/mL de HRP-Estreptavidina utilizando um leitor Tecan equipado com um tubo fotomultiplicador (PMT). Portanto, o MPPC tem uma sensibilidade de cerca de 10 vezes menor do que o leitor Tecan para a detecção de HRP- estreptavidina.

DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2) USANDO MPPC

[0099] Para determinar que o MPPC pode detectar baixos níveis de H2O2, os inventores mediram H2O2 em diversas concentrações (1,7 mM - 1,7 μM) utilizando ensaio quimioluminescente. 30 μL de solução de luminol (Michigan Diagnostics, FEMTOGLOW personalizado) foram misturados com 10 μL de H2O2 e 10 μL de HRP-Estreptavidina, seguido pela medição das intensidades utilizando MPPC e o leitor de microplacas Tecan. Note que a solução adaptada de luminol não contém H2O2.

[00100] Os inventores também detectaram H2O2 utilizando duas quantidades diferentes de HRP-Estreptavidina, tais como 10 e 1 μg/mL. Se a concentração de HRP-Estreptavidina for muito alta, o sinal decai rapidamente em poucos segundos. Neste caso, pode-se perder o sinal gerado no início da reação durante o carregamento da amostra no cassete ou na placa. Por outro lado, se a concentração de HRP-Estreptavidina for muito baixa, a reação pode não gerar luz suficientemente forte para ser medida. Os inventores determinaram 17 μM e 1,7 μM como um limite de detecção (LoD) de H2O2 para MPPC e para o leitor de placas Tecan, respectivamente.

DETECÇÃO DE 1,5-AHG USANDO MPPC

[00101] Para avaliar a sensibilidade do MPPC em detectar baixos níveis de 1,5-AHG, os inventores mediram 1,5-AHG em várias concentrações (50-1 mg/L) utilizando ensaio quimioluminescente. Os resultados são exibidos na Figura 9. 10 μL de 1,5-AHG foram misturados com 10 μL de PROD a 1 mg/mL por 5 minutos em temperatura ambiente. Após a reação de PROD e 1,5-AHG, 30 μL de solução luminol (Michigan Diagnostics, FEMTOGLOW personalizado) e 10 μL de HRP- Estreptavidina 1 μg/mL foram adicionados à solução de amostra 1,5-AHG, seguida por intensidades de medição usando o MPPC. Os inventores avaliaram 5 mg/L como LoD de 1,5-AHG para o sistema MPPC.

FOTOMULTIPLICADOR (PMT)

[00102] Um fotomultiplicador (PMT) é um tubo de vácuo (~10P4) que compreende uma janela de entrada, um fotocatodo, elétrodos de focagem, um multiplicador de elétrons (dinodos) e um ânodo (última dinodo). Em princípio, a luz passa pela janela de entrada do PMT e excita os elétrons no fotocatodo. Os elétrons excitados são acelerados e focalizados pelos eletrodos de focagem, chegando eficientemente ao primeiro dinodo. Ao atingir o dinodo, os elétrons são multiplicados pela emissão de elétrons secundários. Esta emissão secundária é repetida em cada um dos dinodos sucessivos. Os elétrons secundários multiplicados são finalmente coletados no ânodo, gerando o sinal legível. Os inventores obtiveram a cabeça de contagem de fótons (Hamamatsu, H7421-50), detectando luz em uma faixa dinâmica de 80 a 108 fótons. Para a medição da amostra, os inventores desenvolveram um suporte de amostra como mostrado na Figura 10.

CONTADOR DE PULSO

[00103] O PMT gera um sinal de pulso cuja largura é de 30 ns e a altura é de 3,6 V. Para contar o número de pulsos de saída, é necessário um contador de pulsos de 14 MHz devido à resolução de pulso-par de 70 ns. Entretanto, um contador de pulsos de 8MHz é bom o suficiente para luz de baixo nível, na verdade, a luz de baixo nível gera menos de -1000 pulsos por segundo. Os inventores usaram o Arduino como o contador de pulsos que possui uma velocidade de amostragem de 8MHz. Para programar e implementar o contador de pulsos, os inventores usaram <FreqCount.h> em bibliotecas do Arduino.

SISTEMA DE AQUISIÇÃO DE DADOS SEM FIO

[00104] Os inventores desenvolveram um sistema de aquisição de dados sem fio baseado em smartphones e rede Wi-Fi. Após o Arduino contar a saída de pulso PMT, o número contado é enviado para o smartphone por Wi-Fi. Para isso, a interface Wi-Fi é necessária para mediar entre o Arduino e o smartphone. O ESP8266 (Espressif) é um módulo WiFi programável equipado com porta serial e pinos de entrada/saída digitais. O ESP8266 fornece o modo de ponto de acesso (AP) e o serviço de servidor web (webserver para clientes. Ao contrário do WiFi direto e do Bluetooth, vários clientes podem acessar o servidor web ESP8266 a uma distância de até 1 km. Em princípio do nosso sistema de aquisição de dados sem fio, o ESP8266 recebe dados do Arduino através da porta serial e os salva na memória. Os clientes que se conectarem ao AP do ESP8266 podem solicitar o serviço web fornecido pelo ESP8266. Em seguida, o servidor da web responde ao protocolo de transferência de hipertexto (HTTP) contendo um documento escrito pela linguagem de marcação de hipertexto (html) através da qual os dados são transferidos. Para programar o servidor da web do ESP8266, os inventores usaram o ambiente de desenvolvimento integrado (IDE) do Arduino. O diagrama de circuito para a aquisição de dados sem fio é mostrado na Figura 11.

GUI DO ANDROID

[00105] Para visualizar os sinais adquiridos e os resultados do ensaio, a interface gráfica do usuário (GUI) foi necessária e desenvolvida usando o android studio, que é um dos IDEs de aplicativos Android como um software de código aberto. Em um exemplo de realização, uma aplicação Android compreende duas atividades, incluindo a atividade de medição e atividade de resultados, como mostrado na Figura 12. A atividade de medição realiza aquisição de dados, visualização de dados e gravação de dados. Após a medição, os dados são salvos como um arquivo .txt na pasta AHG_Data no dispositivo de armazenamento externo do smartphone. Os usuários podem transferir e salvar o arquivo de dados em computadores através de portas USB. A atividade do resultado mostra os resultados finais da medição e os dados do histórico salvos na pasta AHG_Data. Os inventores modificarão ainda mais a atividade de resultado para mostrar a análise de dados. A concentração de amostra desconhecida será determinada e calculada com base em uma curva padronizada. Os experimentos para a obtenção da curva padronizada serão realizados com amostras conhecidas, após o sistema PMT ser otimizado.

DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H2O2) USANDO PMT

[00106] Para determinar que o sistema PMT pode medir H2O2 em baixo nível, os inventores mediram H2O2 em diversas concentrações (1,7 mM - 170 nM) utilizando ensaio quimioluminescente. 30 μL de solução de luminol (Michigan Diagnostics, FEMTOGLOW personalizado) são misturados com 10 μL de H2O2 e 10 μL de HRP-Estreptavidina, seguido por intensidades de medição usando o PMT.

[00107] As intensidades lidas do PMT foram proporcionais à concentração de HRP-Estreptavidina como mostrado na Figura 13. Os inventores determinaram um LOD de 1,7 μM para H2O2, o que é três vezes maior do que o sinal de contagem escuro. O MPPC tem sensibilidade similar com o leitor de microplacas Tecan para LoD de H2O2.

DETECÇÃO DE 1,5-AHG UTILIZANDO PMT

[00108] Para avaliar a sensibilidade do PMT na detecção de 1,5-AHG em baixo nível, os inventores mediram 1,5-AHG em diversas concentrações (50-2 mg/L) utilizando ensaio quimioluminescente. 10 μL de 1,5-AHG foram misturados com 10 μL de PROD a 1 mg/mL durante 5 minutos em temperatura ambiente. Após a reação de PROD e 1,5-AHG, 30 μL de solução luminol (Michigan Diagnostics, FEMTOGLOW personalizado) e 1 μg/mL de HRP-estreptavidina foram adicionados à solução 1,5-AHG, seguido pela medição das intensidades usando PMT. Os inventores determinaram um LoD de 2 mg/L para 1,5-AHG, que é duas vezes superior ao sinal de contagem escuro no início da reação, como mostrado na Figura 12.

SISTEMA PMT MELHORADO PELA MODIFICAÇÃO DO CAMINHO ÓPTICO

[00109] Apenas uma pequena porcentagem da luz gerada na reação quimioluminescente chega ao sensor de fótons. Resultados iniciais de detecção de baixo nível de 1,5-AHG usando um PMT são mostrados na Figura 14. Para aumentar a intensidade da luz captada, os inventores desenvolveram uma configuração óptica, conforme mostrado na Figura 15, para colimar e focar a emissão quimioluminescente no sensor de fótons usando lentes plano-convexas. Os inventores esperavam que esta otimização da trajetória da luz aumentasse a sensibilidade em cerca de vinte vezes. Entretanto, os inventores observaram apenas uma melhoria de duas vezes na sensibilidade (LoD de 1 mg/L) conforme mostrado na Figura 16, em comparação com antes da configuração óptica (LoD de 2 mg/L). Os inventores assumiram que a melhora reduzida se baseou na falha do alinhamento óptico. Após o alinhamento óptico ter sido realizado experimentalmente, os inventores tiveram uma melhora de quatro vezes na sensibilidade (0,5 mg/L de LoD) como mostrado na Figura 15, em comparação com antes da configuração óptica (LoD de 2 mg/L). RELAÇÃO SINAL-RUÍDO MELHORADA - TEMPO DE REFRIGERAÇÃO E INTEGRAÇÃO

[00110] A melhora da relação sinal-ruído (SNR) aumenta a sensibilidade do detector e, portanto, diminui o LoD de 1,5-AHG. A Figura 17 mostra os sinais com grande flutuação, levando a uma decisão ambígua entre amostras de controle negativo e positivo próximas do LoD. Com um nível muito baixo de 1,5-AHG para gerar um sinal mais distinguível do que da amostra de controle negativo, é desejado uma melhora na SNR. A SNR pode ser determinada pela equação: SNR = (N_S Vt)/V(N_S + 2(N_b + N_d)) onde Ns é o número de fótons da reação de quimioluminescência, Nb e Nd são causados pela luz de fundo (ou ambiente) e contagem escura, respectivamente, e t é o tempo de integração. A partir da Equação (1), existem duas maneiras de aumentar a SNR. Primeira, os inventores removeram as contagens escuras, resfriando o sensor usando um chp Peltier, cuja temperatura será controlada a 0 °C usando o controlador PID. O controlador PID será programado usando <PID_vl.h> na biblioteca do Arduino. A Figura 18 mostra o sistema PMT completo com resfriamento do sensor e ajuste do caminho óptico. Antes do resfriamento, a temperatura do sensor era de 24 °C, na qual a contagem escura estava em torno de 510. Após o resfriamento, a contagem escura diminuiu em 40, o que proporciona uma melhora de duas vezes na SNR. A Figura 19 mostra o sinal de ruído reduzido com melhor SNR. No entanto, o LoD de 1,5-AHG ainda era 0,5 mg/L, que é o mesmo resultado de antes do resfriamento do detector.

[00111] Em segundo lugar, a SNR pode ser melhorada aumentando o tempo de integração. O número de fótons é contado e acumulado durante o tempo de integração. Os inventores integram os sinais na Figura 19 com 10 seg de tempo de integração, em vez de 1 seg. A Figura 20 mostra que um tempo de integração de 10 segundos fornece sinais muito mais limpos do que 1 segundo de tempo de integração.

[00112] A amostra em branco (água) mostrou sinais inesperados. Na ausência de H2O2, algo precipitou a reação quimioluminescente. O mesmo resultado foi também observado utilizando o leitor de placas Tecan no painel (b) da Figura 8. Os inventores ainda não identificaram as espécies que reagem com o luminol e o HRP e criam emissão de luz, mas os inventores suspeitam que possa ser oxigênio dissolvido na água.

[00113] O espécime a ser utilizado na presente invenção é um fluido corporal para avaliar o 1,5-AHG nele contido. Será realizada uma reação quimioluminescente enzimática de modo a emitir luz para detecção com o aparelho divulgado na presente invenção. Um aspecto da presente invenção compreende a remoção de todos os açúcares, tais como glicose, de tal espécime que possam reagir na reação quimioluminescente mencionada acima, para originar amostras apropriadas.

[00114] Isto pode ser realizado, por exemplo, utilizando a fosforilação da glicose ou coluna de depleção, de acordo com os métodos divulgados em Nowatzke W, et al. 2004. Clinica Chimica Acta. 350: 201-209 e Yabuuchi M, et al., 1989. Clin. Chem. 35/10, 2039-2043, respectivamente. Ou seja, a glicoquinase ou qualquer outra enzima de fosforilação da glicose adicionada na amostra de saliva e a mistura obtida é incubada em temperatura e tempo apropriados, preferencialmente temperatura ambiente (20-40 °C), e de 5-10 minutos. Isso pode ser feito de maneira isolada ou acoplado a um método de coluna de depleção em que a amostra tratada ou não tratada passa através de uma coluna empacotada com uma resina de troca aniônica forte para remover a glicose a partir da amostra.

[00115] Em seguida, um aceptor de elétrons, preferivelmente a piranose oxidase, é utilizado para gerar peróxido de hidrogênio, o qual é utilizado como substrato para qualquer número de métodos disponíveis que dê uma resposta quimioluminescente na presença de quaisquer outros substratos. O método mais comumente empregado utiliza a enzima catalítica peroxidase de rábano (HRP) e luminol para mostrar quimioluminescência.

[00116] Todos estes elementos serão colocados juntos em um único kit de reação compatível com a razão do aparelho da presente invenção, desde que não afetem um ao outro, e possam ser apresentados de maneira fácil de usar, por exemplo, em pó ou filmes ou transportado em um excipiente seco. Além disso, o kit completo deve fornecer uma referência padrão para calibrar o aparelho. Para ilustrar adicionalmente a presente invenção, são fornecidos os seguintes exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 DETECÇÃO DE 1,5-AHG COM PRÉ-TRATAMENTO ENZIMÁTICO

[00117] O diagnóstico precoce do diabetes tipo 2 (DM2) é de suma importância para reduzir as complicações do diabetes. Para o monitoramento glicêmico no DM2, pode-se medir analitos metabólitos, como o 1,5-anidroglucitol (1,5-AHG), HbAlc e glicose em amostras de sangue. Um relatório recente revelou uma forte associação do DM2 com 1,5-AHG na saliva como um marcador não invasivo, resultando em benefício aos pacientes que são adversos à coleta de sangue. O 1,5-AHG é um análogo da glicose não metabolizável que está presente no sangue humano devido predominantemente à ingestão dietética. Na fisiologia, o nível de 1,5-AHG é equilibrado por ser reabsorvido e excretado pelo rim e urina, respectivamente. A variação normal do nível de 1,5-AHG no corpo humano é de aproximadamente 6,8 - 32,3 μg/mL. A concentração de 1,5-AHG no sangue diminui durante os períodos de hiperglicemia, uma vez que a reabsorção é completamente inibida pela glicose no transportador ativo de frutose e manose. Portanto, monitorar 1,5-AHG na saliva é útil para alcançar o controle glicêmico.

[00118] Para determinar a concentração de 1,5-AHG, podem ser usados métodos convencionais, tais como cromatografia líquida, cromatografia gás- líquido, HPLC ou espectrometria de massa. Um método alternativo é usar o ensaio de reação enzimática. A piranose oxidase (PROD) tem sido utilizada para determinação de D-glicose e 1,5-AHG em análises clínicas. A PROD oxida o grupo hidroxila da segunda posição do 1,5-AHG e gera peróxido de hidrogênio que pode ser detectado usando uma variedade de métodos. Portanto, o 1,5-AHG é indiretamente determinado medindo o peróxido de hidrogênio gerado conforme mostrado na reação 2 da Figura 1 seção (b). No entanto, a amostra de saliva contém D-glicose, que também é oxidada pela PROD e produz peróxido de hidrogênio, interferindo assim na medição do 1,5-AHG. Neste caso, é necessário o pré-tratamento da amostra para manter a D-glicose fora da reação com a PROD, conforme mostrado na reação 1 da Figura 1 seção (a).

[00119] Neste exemplo, a amostra de saliva contendo 1,5-anidroglucitol é pré-tratada com glicoquinase para remover a glicose. A glicose é convertida em glicose-6-fosfato com o auxílio de um sistema de regeneração de trifosfato de adenosina (ATP) que consiste em piruvato quinase e fosfoenol piruvato. Após o pré-tratamento, a piranose oxidase é misturada com a amostra tratada para catalisar a oxidação de 1,5-anidroglucitol em peróxido de hidrogênio. Após a reação com piranose oxidase, o substrato quimioluminescente e a peroxidase de rábano são adicionados, seguido imediatamente pela medição da intensidade de luz usando um detector de luz de alta sensibilidade, tal como uma câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS ou smartphone com câmera de alta sensibilidade, usado para realizar a medição da intensidade de luz das linhas. A medição da intensidade é interpretada como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00120] Em outra modificação, após a reação da piranose oxidase e 1,5- anidroglucitol na amostra, 30 μL de solução de luminol e 1 μg/mL de lacase são adicionados à solução de 1,5-AHG, seguido pela medição das intensidades usando um detector de luz.

[00121] Em outra modificação deste exemplo, após a reação da piranose oxidase e 1,5-anidroglucitol na amostra, oxalato de arila como o oxalato de difenila e uma substância fluorescente são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com o oxalato de arila na presença de uma substância fluorescente para assim excitar a substância fluorescente, emitindo assim fótons.

EXEMPLO 2 DETECÇÃO DE 1,5-AHG COM COLUNA DE CROMATOGRAFIA

[00122] Em um exemplo, a amostra é executada através de uma coluna de cromatografia, tal como de troca iônica, HIC, quelato metálico, boronato ou de afinidade, para remover a glicose e outros interferentes. O eluente contendo 1,5- anidroglucitol é misturado com 10 μL de piranose oxidase durante 5 min. à temperatura ambiente. Após a reação de piranose oxidase e 1,5-anidroglucitol, 30 μL de solução de luminol e 1 μg/mL de peroxidase são adicionados à solução de 1,5-AHG, seguido pela medição da intensidade de luz usando o detector de fóton remoto que faz medições em locais de atendimento (detector de fóton point-of-care - POC).

EXEMPLO 3 PRÉ-TRATAMENTO DE AMOSTRA ADICIONAL PARA REMOVER INTERFERÊNCIAS

[00123] Dependendo das fontes da amostra, a presença de alguns monossacarídeos pode interferir com o teste de detecção de 1,5-AHG. Algumas das interferências conhecidas quando se utiliza a piranose oxidase como enzima de detecção de 1,5-AHG incluem: D-glicose, L-sorbose, D-xilose, D-galactose, glucono-S-lactona. A complexidade do pré-tratamento varia com o tipo de fluido corporal. Normalmente, com a amostra de sangue, a D-glicose é a principal interferência e os métodos de pré-tratamento foram descritos no exemplo 1 e 2. Para amostras de outros fluidos corporais, uma mistura de enzimas é usada ao invés de apenas glicose oxidase. Tal mistura enzimática contém enzimas que podem converter ou modificar as interferências em moléculas não interferentes. Um exemplo de composição da mistura de enzimas inclui glicose oxidase, L- sorbose oxidase, D-xilose oxidase, D-galactose oxidase, glucono-S-lactona oxidase.

EXEMPLO 4 DETECÇÃO DE 1,5-AHG COM DUPLA LEITURA (GLICOSE E 1,5-AHG)

[00124] Em um exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase, peroxidase e substrato quimioluminescente, seguida pela medição imediata da intensidade da luz utilizando o detector de fótons POC. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação completa, a piranose oxidase é adicionada e imediatamente seguida pela medição da intensidade da luz usando o detector de luz de alta sensibilidade. O sinal é interpretado como concentração de 1,5-anidroglucitol. A relação de 1,5-anidroglucitol para glicose pode ser usada para corrigir as variações no método de coleta de amostras.

EXEMPLO 5 DETECÇÃO DE 1,5-AHG COM NANOPARTÍCULAS METÁLICAS COMO CATALISADOR QUIMIOLUMINESCENTE

[00125] Em um exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase, nanopartículas como nanopartículas de prata, nanopartículas de ouro, nanopartículas de platina, nanopartículas de óxido de ferro, partículas de metal nanoporosas ou outros catalisadores metálicos e substrato quimioluminescentes, seguido pela medição imediata da intensidade da luz utilizando o detector de fótons POC. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação completa, adiciona-se piranose oxidase e, em seguida, é imediatamente feita a leitura das intensidades de luz usando o detector de fótons point-of-care (POC). O sinal é interpretado como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00126] Em outro exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com 10 μL da mistura de reação contendo glicose oxidase e substrato quimioluminescente em uma câmara de reação revestida com catalisador que pode catalisar o peróxido de hidrogênio, seguida imediatamente pela medição da intensidade da luz usando detector de fótons POC. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação completa, adiciona-se piranose oxidase e, em seguida, é imediatamente feita a leitura das intensidades de luz usando o detector de fótons point-of-care (POC). O sinal é interpretado como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00127] Em outro exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é dividida em duas frações de volume iguais. A primeira fração é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase, peroxidase e substrato quimioluminescente, seguida imediatamente pela medição da intensidade da luz usando o detector de fótons point-of-care (POC). O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. A segunda fração é misturada com piranose oxidase e substrato quimioluminescente, seguido pela medição da intensidade da luz usando o detector de fótons POC. O sinal é interpretado como a concentração total de glicose e 1,5-anidroglucitol. A concentração de 1,5-anidroglucitol é calculada a partir dos dois sinais ou pela tabela de pesquisa.

EXEMPLO 6 DETECÇÃO DE 1,5-AHG EM DISPOSITIVO MICROFLUÍDICO

[00128] Em um exemplo, a amostra é aplicada a um dispositivo microfluídico no qual interferentes, como a glicose, são removidos à medida que a amostra passa através da coluna cromatográfica. O efluente é então misturado com piranose oxidase. Após a reação da piranose oxidase, a amostra é misturada com reagente quimioluminescente e peroxidase de rábano, seguido pela medição da intensidade de luz através da janela óptica com detector de luz de alta sensibilidade, como câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS, ou câmera de alta sensibilidade de um smartphone.

[00129] Em outro exemplo, a amostra é aplicada a um dispositivo microfluídico então inserido em um leitor, no qual a amostra é dividida em duas frações pela junção Y no canal microfluídico. As frações são bombeadas para duas câmaras de reação separadas. Na primeira câmara de reação, uma solução contendo glicose oxidase é bombeada e misturada com a amostra para produzir peróxido de hidrogênio a partir da oxidação da glicose. Na segunda câmara, o tampão de reação contendo piranose oxidase é bombeado e misturado para produzir peróxido de hidrogênio a partir da oxidação de glicose e 1,5- anidroglucitol. Após um tempo específico que permite a conclusão das reações, o conteúdo da primeira câmara de reação é misturado com peroxidase de rábano e substrato quimioluminescente e seguido pela medição da intensidade da luz através da janela óptica com um detector de fótons (POC). O sinal da primeira câmara é interpretado como concentração de glicose. O conteúdo da segunda câmara de reação é misturado com peroxidase de rábano e substrato quimioluminescente e seguido pela medição da intensidade da luz através da janela óptica com um detector de fótons (POC). O sinal é interpretado como a concentração total de glicose e 1,5-anidroglucitol. A concentração de 1,5- anidroglucitol é calculada a partir dos dois sinais ou pela tabela de pesquisa usando os valores dos sinais.

[00130] Em outro exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é aplicada a um dispositivo microfluídico inserido em um leitor. A amostra é bombeada para a câmara de reação e misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase, peroxidase e substrato quimioluminescente, seguida pela medição da intensidade da luz através de uma janela óptica. A glicose oxidase converte glicose em peróxido de hidrogênio que, por sua vez, reage com o substrato quimioluminescente catalisado pela peroxidase de rábano para gerar um sinal luminoso. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação completa, quando toda a glicose é usada, a piranose oxidase é misturada imediatamente seguida pela medição da intensidade da luz através de uma janela óptica. A piranose oxidase converte 1,5-anidroglucitol em peróxido de hidrogênio que, por sua vez, reage com o substrato quimioluminescente catalisado pela peroxidase de rábano para gerar o sinal luminoso. O sinal é interpretado como concentração de 1,5-anidroglucitol.

EXEMPLO 7 DETECÇÃO DE 1,5-AHG NO FORMATO DE ENSAIO DE FLUXO LATERAL (LFA)

[00131] Em outro exemplo, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com peroxidase de rábano e substrato quimioluminescente. A mistura da amostra e reagente é então aplicada a uma tira de membrana usando tecnologia de ensaio de fluxo lateral (LFA). A tira de membrana é composta por nitrocelulose, membrana de fibra de vidro, como Fusion 5, membrana de celulose, ou qualquer material que tenha capacidade de absorção. A tira contém duas linhas de enzimas, sendo a glicose oxidase como a primeira linha e a piranose oxidase como a segunda linha cuja amostra irá encontrar à medida que se desloca ao longo da tira. À medida que a amostra se move sobre a linha da glicose oxidase (primeira linha), a glicose é oxidada pela glicose oxidase em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano como enzima para produzir o sinal de luz na primeira linha. A amostra de glicose depletada viaja então para a segunda linha onde a piranose oxidase converte 1,5-anidroglucitol em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano como enzima para produzir o sinal de luz na segunda linha. Um detector de luz de alta sensibilidade, como câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS ou câmera de smartphone de alta sensibilidade, pode ser usado para realizar medições de intensidade de luz das linhas. A medição da intensidade a partir da primeira linha é interpretada como concentração de glicose, e a medição da intensidade da segunda linha é interpretada como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00132] Em outra modificação, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é um substrato quimioluminescente misto. A mistura da amostra e substrato é então aplicada a uma tira de membrana usando a tecnologia de ensaio de fluxo lateral (LFA). A tira de membrana é composta por nitrocelulose, membrana de fibra de vidro, como Fusion 5, membrana de celulose, ou qualquer material que tenha capacidade de absorção (capilaridade). A tira contém quatro linhas de enzimas: a primeira linha é de glicose oxidase, a segunda linha é de peroxidase de rábano, a terceira linha é de piranose oxidase e a quarta linha é de peroxidase de rábano. A ordenação está na direção do fluxo da amostra que irá se encontrar enquanto ela percorre a tira. As larguras das primeira e segunda linhas são determinadas separadamente pelos tempos de reação enzimática de cada enzima. À medida que a amostra se move sobre a linha da glicose oxidase (primeira linha), a glicose é oxidada pela glicose oxidase em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano na segunda linha como a enzima para produzir o sinal de luz na segunda linha. A amostra de glicose depletada viaja então para a terceira linha onde a piranose oxidase converte 1,5-anidroglucitol em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano na quarta linha como a enzima para produzir o sinal de luz na quarta linha. Um detector de luz de alta sensibilidade, como câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS ou câmera de smartphone de alta sensibilidade, pode ser usado para realizar medições de intensidade de luz das linhas. A medição da intensidade a partir da segunda linha é interpretada como concentração de glicose, e a medição da intensidade da quarta linha é interpretada como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00133] Em outra modificação, a amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com um substrato quimioluminescente. A mistura da amostra e substrato é então aplicada a uma tira de membrana usando a tecnologia de ensaio de fluxo lateral (LFA). A tira de membrana é composta por nitrocelulose, membrana de fibra de vidro, como Fusion 5, membrana de celulose, ou qualquer material que tenha capacidade de absorção (capilaridade). A tira contém duas linhas de enzimas, com mistura de glicose oxidase e peroxidase de rábano como a primeira linha e mistura de piranose oxidase e peroxidase de rábano como a segunda linha, de modo que a amostra irá encontrá-las enquanto se desloca ao longo da tira. À medida que a amostra se move sobre a linha da glicose oxidase (primeira linha), a glicose é oxidada pela glicose oxidase em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano como enzima para produzir o sinal de luz na primeira linha. A amostra de glicose depletada viaja então para a segunda linha onde a piranose oxidase converte 1,5-anidroglucitol em peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reage com substrato quimioluminescente com a peroxidase de rábano como enzima para produzir o sinal de luz na segunda linha. Um detector de luz de alta sensibilidade, como câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS ou câmera de smartphone de alta sensibilidade, pode ser usado para realizar medições de intensidade de luz das linhas. A medição da intensidade a partir da primeira linha é interpretada como concentração de glicose, e a medição da intensidade da segunda linha é interpretada como concentração de 1,5-anidroglucitol.

[00134] Em outro exemplo, o 1,5-anidroglucitol pode ser detectado e medido em um ensaio de fluxo lateral quimioluminescente competitivo indireto. A tira de membrana é composta por nitrocelulose, membrana de fibra de vidro, como Fusion 5, membrana de celulose, ou qualquer material que tenha capacidade de absorção (capilaridade). A tira contém duas linhas: a linha de teste e a linha de controle. A de teste é uma área onde o anticorpo anti-1,5- anidroglucitol está imobilizado. A linha de controle é uma área onde o anticorpo anti-HRP está imobilizado. A amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com uma quantidade conhecida de conjugado de HRP-1,5-anidroglucitol. A mistura é aplicada na tira de membrana e migra ao longo da tira por ação capilar. Ao atingir a área da tira onde o anticorpo anti-1,5-anidroglucitol está imobilizado, o 1,5-anidroglucitol da amostra compete com o HRP-1,5-anidroglucitol pela ligação de uma quantidade fixa e limitada de anti-1,5-anidroglucitol imobilizado. Os reagentes não ligados continuam a migrar até atingirem a área da tira onde o excesso de conjugado de HRP-1,5-anidroglucitol foi capturado pelo anticorpo anti-HRP imobilizado. Na etapa de detecção, um substrato quimioluminescente para HRP é adicionado à tira e o sinal quimioluminescente resultante é fotografado usando o detector de luz de alta sensibilidade, como câmera CCD, PMT, diodo avalanche, câmera S-CMOS, câmera CMOS ou câmera de alta sensibilidade de um smartphone.

EXEMPLO 8 DETECÇÃO DE 1,5-AHG NO FORMATO DE ENSAIO IMUNOADSORVENTE ENZIMA- ASSOCIADO (ELISA)

[00135] Em outro exemplo, o 1,5-anidroglucitol pode ser detectado e medido em um ensaio imunoadsorvente de enzima-associado quimioluminescente. O poço da amostra no ensaio é revestido com anticorpo anti-1,5-anidroglucitol. A amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com uma quantidade conhecida de conjugado de HRP-1,5-anidroglucitol. A mistura é adicionada ao poço da amostra e incubada por 30 minutos. O 1,5-anidroglucitol na amostra compete com HRP-1,5-anidroglucitol pela ligação a uma quantidade fixa e limitada de anticorpo anti-1,5-anidroglucitol imobilizado. Após a incubação, os reagentes não ligados são lavados com um lavador de placas. Na etapa de detecção, um substrato quimioluminescente para HRP é adicionado ao poço e o sinal quimioluminescente resultante é lido usando o leitor de placas.

EXEMPLO 9 CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DE GLICOSE COM O USO DA GLICOSE OXIDASE

[00136] Tampão de fosfato (fosfato de sódio monobásico e dibásico) pH 6,5 a 0,2 M, Tampão TRIS-HCl, pH 8,5 a 50 mM, sal sódico do ácido 3-(N-etil-3- metilanilino)-2-hidroxi-propanossulfônico (TOOS) a 10 mg/mL, 4-aminoantipirina (4-APP) a 14 mg/mL, glicose oxidase a 18,3 U/mL e HRP a 0,57 mg/mL (194 U/mg). 40 μL de uma determinada diluição de padrão de glicose com concentração de 50 μg/mL são misturados com 60 μL de reagente contendo 1 mL de TOOS, 1 mL de 4-APP, 1 mL de HRP e 7 mL de TRIS-HCl e 60 μL e 80 μL de reagente contendo 50 mL de tampão fosfato pH 6,5 e 5 mg de glicose oxidase. Após 5 minutos, a absorbância da reação, realizada em microplacas transparentes de 96 poços, é lida em um comprimento de onda de 546 nm em um leitor Epoch (BioTek). A curva de calibração pode ser criada a partir dos resultados (mostrados na Figura 21).

EXEMPLO 10 CURVA DE CALIBRAÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DE 1,5-AHG COM O USO DE PIRANOSE OXIDASE

[00137] 160 μL de uma reação final contendo 32,14 mM de TRIS-HCl, pH 9, 10,71 mM de MgCl2, 2,14 mM de ATP, 6,25 U/mL de Glicoquinase, 6,56 mM de TRIS-HCl pH 8,5, 6,35 mM de TOOS, 129,16 mM de 4-APP, 1,07 U/mL de HRP e 2,18 U/mL de piranose oxidase, com as diluições correspondentes de 1,5-AHG a 50 mg/mL são tomados e a leitura da absorbância é feita a 546 nm. A curva de calibração pode ser criada a partir dos resultados (mostrados na Figura 22).

EXEMPLO 11 ENSAIO DE DEPLEÇÃO DE GLICOSE COM USO DE COLUNA DE PRÉ-TRATAMENTO

[00138] Uma a coluna é preenchida com 100 μL de SP Sepharose (trocador de cátions, para o equilíbrio do efluente), seguido por 400 μL de Q Sepharose (trocador de ânions) (mostrado na Figura 23). A coluna é lavada com 500 μL de água (3x). Em seguida, 100% de uma amostra de glicose ou 1,5-AHG são passadas pela coluna. 10 μL do efluente são analisados. Os resultados são exibidos na Figura 24.

EXEMPLO 12 CINÉTICAS DE LUZ OBTIDAS COM O USO DE HRP E LUMINOL

[00139] Os reagentes utilizados para este experimento são: solução de HRP (270 ng/mL), soluções de H2O2 (12,3-98 mM) e luminol (0,424 mg/l). Esses reagentes são misturados na próxima proporção em uma microplaca preta: 35 μL de HRP, 75 μL de luminol e 50 μL de H2O2. A placa de microtitulação foi colocada no luminômetro e as medições foram tomadas a cada minuto durante 20 minutos. Os resultados correspondentes são mostrados na Figura 25.

EXEMPLO 13 MÉTODO COMPLETO DE MEDIÇÕES DE 1,5-AHG COM SUBSTRATO QUIMIOLUMINESCENTE

[00140] O tampão de reação é preparado da seguinte forma: 0,4 mL de 56,13 mg/mL de MgCL, 0,6 mL de ATP a 66,13 mg/mL, 0,7 mL de água destilada são adicionados a 8,4 mL de TRIS-HCl a 75 mM pH 9. 80 μL deste tampão de reação são adicionados a 10 μL de 1,5-AHG e 25 μL de água. O tampão da reação com 1,5-AHG é misturado com 35 μL de HRP, 75μL de luminol e 60μL de piranose oxidase, e o sinal luminescente é lido por 20 min. A curva da cinética de luz correspondente e a curva de calibração são mostradas na Figura 26 e na Figura 27, respectivamente.

EXEMPLO 14 DETECÇÃO DE CREATINA

[00141] A creatina é produzida naturalmente no corpo humano, que é um reservatório de alta energia para a rápida regeneração do ATP para todas as células do corpo, mas principalmente para os músculos. A suplementação de creatina também tem sido usada como estimulante do desempenho esportivo. A creatina está sendo estudada como tratamento para insuficiência cardíaca congestiva crônica, distúrbios neuromusculares e neurometabólicos. A quantificação do nível de creatina em diversos fluidos corporais é importante e tem amplas aplicações.

[00142] Neste exemplo, o método enzimático envolve a conversão da creatina em sarcosina com o auxílio da creatinase e da sarcosina em glicina com a enzima sarcosina oxidase. A última reação libera peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio liberado reage com o luminol com o auxilio da peroxidase para gerar luz. Os fótons emitidos da reação quimioluminescente são detectados utilizando o dispositivo detector POC (mostrado na Figura 32). creatina + H2O + creatinase => sarcosina + ureia sarcosina + O2 + H2O + sarcosina oxidase => glicina + formaldeído + H2O2 H2O2 + luminol + peroxidase => H2O + luz

[00143] Em outra modificação, após a reação com a sarcosina oxidase para produzir peróxido de hidrogênio, 30 μL da solução de luminol e 1 μg/mL de lacase são adicionados à solução. Com a lacase como catalisadora, o peróxido de hidrogênio reage com o luminol e emite luz. A intensidade da luz é medida usando o detector de fótons de uso no local de atendimento (detector point-of-care ou POC) para quantificar o nível de creatina. Em outra modificação desta aplicação, após a reação com a sarcosina oxidase, 30 μL de solução de luminol e nanopartículas, tais como nanopartículas de prata, nanopartículas de ouro, nanopartículas de platina, nanopartículas de óxido de ferro, partículas de metal nanoporosas, ou outros catalisadores metálicos, são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com o luminol na presença de nanopartículas para, dessa forma, emitir luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of-care (POC).

[00144] Em outro exemplo desta aplicação, após a reação com a sarcosina oxidase, oxalato de arila tal como oxalato de difenila e uma substância fluorescente são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com oxalato de arila na presença de uma substância fluorescente para assim excitar a substância fluorescente, emitindo luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of-care (POC).

EXEMPLO 15 DETECÇÃO DUPLA DE GLICOSE E AHG

[00145] Na Figura 28, duas amostras idênticas contendo 50 μg/mL de 1,5- anidroglucitol e 50 μg/mL de glicose, e uma terceira amostra contendo apenas 50 μg/mL de glicose foram usadas para testar a viabilidade da detecção dupla de glicose e 1,5-anidroglucitol. Na primeira etapa, uma das duas amostras idênticas (amostra 1, (marcador triângulo vazio)) e a amostra somente de glicose (amostra 3, (marcador círculo vazio)) foram tratadas com glicose oxidase (GOD) enquanto a outra (amostra 2, (marcador diamante sólido)) foi tratada com piranose oxidase (PROD). A peroxidase de rábano e o substrato quimioluminescente contendo luminol foram adicionados em todas as amostras seguidos pela imediata medição de luz usando o detector de fótons. Uma vez que os sinais luminosos de todas as amostras atingiram o valor basal, a segunda enzima foi adicionada. Adicionou-se piranose oxidase à amostra 1 (marcador triângulo vazio) e amostra 3 (marcador circulo vazio) que foram primeiramente tratados com glicose oxidase. A glicose oxidase foi adicionada à amostra 2 (marcador diamante sólido) que foi primeiramente tratada com piranose oxidase. A segunda medição de luz foi feita para todas as amostras.

[00146] A Figura 29 ilustra uma diluição seriada de 2X das amostras começando com 50 μg/mL de 1,5-anidroglucitol e 50 μg/mL de glicose. Reações enzimáticas de duas etapas com dupla leitura de sinal de luz foram realizadas para todas as amostras. A mistura de glicose oxidase e substrato quimioluminescente contendo luminol foram primeiro adicionados nas amostras e, em seguida, a leitura de luz foi realizada (parte superior esquerda). Os resultados foram usados para criar a curva padrão de glicose (canto inferior esquerdo). Uma vez que os sinais luminosos de todas as amostras atingiram o valor basal, a piranose oxidase foi adicionada. A segunda medição de luz foi feita para todas as amostras (superior direito). Os resultados foram usados para criar a curva padrão de 1,5-anidroglucitol (canto inferior direito).

[00147] Na Figura 30 utilizaram-se nanopartículas de prata de 30, 10 e 60 nm como catalisador para a reação quimioluminescente. Substrato quimioluminescente contendo luminol e peróxido de hidrogênio em pH 11 foi adicionado à diluição seriada de 10X de nanopartículas de prata de 10 nm e 60 nm. Os gráficos superiores têm o eixo y em todo o intervalo. Os gráficos inferiores mostram a escala ampliada do eixo y para as amostras de baixo sinal.

[00148] Na Figura 31, nanopartículas de prata de 10 nm foram usadas em um ensaio para detectar glicose. Uma diluição em série de 2X da solução de glicose, a partir de 50 μg/mL, foi misturada com glicose oxidase, nanopartículas de prata e substrato quimioluminescente contendo luminol em pH 11. As amostras foram imediatamente medidas usando PMT por uma hora (esquerda). Os primeiros pontos de dados de cada diluição foram usados para criar a curva padrão (direita).

EXEMPLO 16 DETECÇÃO DE CREATININA

[00149] A creatinina é produzida a partir de creatina, fosfocreatina e ATP como resultado de processos metabólicos musculares. Ela é excretada principalmente por filtração glomerular durante a função renal normal. Assim, a creatinina é um importante indicador da saúde renal. Os ensaios de creatinina são conduzidos para fins de diagnóstico, para monitoramento terapêutico de doenças renais agudas e crônicas e para o monitoramento da diálise renal.

[00150] Inúmeros métodos foram descritos para determinar a creatinina. O método enzimático é baseado na determinação estabelecida de peróxido de hidrogênio após a conversão da creatinina com o auxílio de creatininase (creatinina amidohidrolase), creatinase e sarcosina oxidase. O peróxido de hidrogênio liberado reage com o luminol com o auxilio da peroxidase para gerar luz. Os fótons emitidos da reação quimioluminescente são detectados utilizando o dispositivo detector POC. creatinina + H2O creatininase => creatina creatina + H2O + creatinase => sarcosina + ureia sarcosina + O2 + H2O + sarcosina oxidase => glicina + formaldeído + H2O2 H2O2 + luminol + peroxidase => H2O + luz

[00151] Neste exemplo, a creatinina é primeiro convertida em creatina pela enzima creatininase. Em seguida, a creatina é enzimaticamente convertida de creatinina em sarcosina com o auxílio da creatinase e a partir de sarcosina em glicina com a enzima sarcosina oxidase. A última reação libera peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio liberado reage com o luminol com o auxilio da peroxidase para gerar luz. A Figura 32 ilustra a detecção de creatinina com substrato quimioluminescente. Os fótons emitidos da reação quimioluminescente são detectados utilizando o dispositivo detector POC (mostrado na Figura 33).

[00152] Em outra modificação, após a reação com a sarcosina oxidase para produzir peróxido de hidrogênio, 30 μL da solução de luminol e 1 μg/mL de lacase são adicionados à solução. Com a lacase como catalisadora, o peróxido de hidrogênio reage com o luminol e emite luz. A intensidade da luz é medida usando o detector de detector de fótons de uso no local de atendimento (detector point- of-care ou POC) para quantificar o nível de creatinina.

[00153] Em outra modificação desta aplicação, após reação com a sarcosina oxidase, 30 μL de solução de luminol e nanopartículas, tais como nanopartículas de prata, nanopartículas de ouro, nanopartículas de platina, nanopartículas de óxido de ferro, partículas de metal nanoporosas, ou outros catalisadores metálicos, são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com o luminol na presença de nanopartículas para dessa forma emitir luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of- care (POC).

[00154] Em outro exemplo desta aplicação, após a reação com a sarcosina oxidase, oxalato de arila tal como oxalato de difenila e uma substância fluorescente são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com oxalato de arila na presença de uma substância fluorescente para assim excitar a substância fluorescente, emitindo luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of-care (POC).

EXEMPLO 17 DETECÇÃO DE UREIA

[00155] A ureia desempenha um papel importante no sistema metabólico humano. Ela funciona como o transportador de resíduos de nitrogênio do metabolismo das proteínas para os rins e, em seguida, é excretada na urina. A ureia também desempenha um papel no sistema de troca dos néfrons para reabsorver água e íons críticos da urina excretada. A ureia é um excelente indicador da saúde renal. Portanto, a medição da ureia é um procedimento diagnóstico de rotina e existem numerosos métodos colorimétricos diferentes disponíveis.

[00156] Neste exemplo, é descrito um método quimioluminescente enzimático. Primeiro, a ureia é hidrolisada em amônia pela enzima urease. A amônia reage com glutamato e ATP na presença de glutamina sintetase e produz ADP. O ADP é medido em reações catalisadas sucessivamente por piruvato quinase e depois por piruvato oxidase em um sistema que gera peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio liberado reage com o luminol com o auxilio da peroxidase para gerar luz. Os fótons emitidos da reação quimioluminescente são detectados utilizando o dispositivo detector POC. Ureia + H2O + urease (EC 3.5.1.5) => CO2+2NH3 2NH4 + 2 L-glutamato + 2 ATP + glutamina sintetase (EC6.3.1.2) => 2ADP + 2 L-glutamina + 2 H2PO4- 2ADP + 2 fosfoenolpiruvato + piruvato quinase (EC 2.7.1.40) => 2 piruvato + 2ATP 2 piruvato + 2 H2PO4- + 2O2 + 2H2O + piruvato oxidase (EC 1.2.3.3) => 2 acetil fosfato + 2 CO2 + 2 H2O2 2 H2O2 + luminol + peroxidase => H2O + luz

[00157] Em outra modificação, após a reação com piruvato oxidase para produzir peróxido de hidrogênio, 30 μL da solução de luminol e 1 μg/mL de lacase são adicionados à solução. Com a lacase como catalisadora, o peróxido de hidrogênio reage com o luminol e emite luz. A intensidade da luz é medida usando o detector de detector de fótons de uso no local de atendimento (detector point- of-care ou POC) para quantificar o nível de ureia.

[00158] Em outra modificação desta aplicação, após a reação com piruvato oxidase, 30 μL de solução de luminol e nanopartículas, tais como nanopartículas de prata, nanopartículas de ouro, nanopartículas de platina, nanopartículas de óxido de ferro, partículas de metal nanoporosas, ou outros catalisadores metálicos, são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com o luminol na presença de nanopartículas para dessa forma emitir luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of- care (POC).

[00159] Em outro exemplo desta aplicação, após a reação com piruvato oxidase, oxalato de arila tal como oxalato de difenila e uma substância fluorescente são adicionados à amostra, o peróxido de hidrogênio da primeira reação reage com oxalato de arila na presença de uma substância fluorescente para assim excitar a substância fluorescente, emitindo luz. A intensidade de luz é medida usando o detector de fótons point-of-care (POC).

[00160] Os métodos aqui descritos são adicionalmente descritos pela amplificação de elementos individuais dos exemplos de realização dos métodos. A utilidade dos exemplos de realização da presente invenção inclui campos tais como Diagnóstico Clínico; Prognóstico, descoberta de patógenos; Biodefesa; Pesquisa; Detecção Adulterante; Detecção de Falsificação; Segurança Alimentar; Classificação Taxonômica; Ecologia Microbiana; Monitoramento Ambiental; Agronomia; e aplicação da lei.

[00161] Analtos: Em exemplos de realização, o analito de interesse pode incluir 1,5-anidroglucitol, glicose, creatina, creatinina, ureia, metabolitos, uma proteína, um peptídeo, um hormônio, um biomarcador, uma toxina ou uma proteína modificada (por exemplo, fosforilada ou acetilada).

[00162] Fontes de analtos: Em exemplos de realização, o espécime no qual o analito será detectado pode compreender um espécime de biopsia, sangue, soro, plasma, fezes, saliva, fluido de expectoração, LCR, líquido de lavagem, lavado nasal, urina, lisado celular, água potável, água natural, água do mar, água do solo, lixiviado do solo, tecido fresco, tecido congelado, tecido tratado em formalina neutra, bloco de tecido fixado em formalina e emblocado em parafina, bloco de tecido fixado em etanol e emblocado em parafina.

[00163] Pré-tratamento da amostra: Em exemplos de realização, um espécime é opcionalmente pré-tratado para concentração do analito, remoção de partículas, contaminantes, interferências ou inibidores da reação, redução da viscosidade, melhora das propriedades de manipulação ou para modificar o analito para uma detecção melhorada. Os métodos para remover ou modificar seletivamente as interferências ou contaminantes incluem os usos de captura de anticorpos, captura de aptâmeros, reações enzimáticas, modificações químicas ou técnicas de cromatografia, como de troca-iônica, HIC, em quelato metálico, boronato ou por afinidade.

[00164] Reagentes: Em exemplos de realização, o método de leitura, através do qual o analito é detectado pode ser a emissão de luz por quimioluminescência, bioluminescência, ou qualquer método que possa ser utilizado para gerar o sinal de luz no método da presente invenção. Reagentes para gerar luz são substratos quimioluminescentes, como luminol, isoluminol, 1,2-dioxetanos, compostos e corantes de peroxioxalato, ou substratos bioluminescentes, como a luciferina. A reação de geração de sinal pode ser gerada com ou sem enzima. Entre os métodos disponíveis, a oxidação de vários substratos quimioluminescentes com peróxido de hidrogênio catalisada pela peroxidase é a mais comum. Existem outros métodos conhecidos para a detecção do peróxido de hidrogênio por quimioluminescência sem o uso de peroxidase, por exemplo, a luminescência pode ser obtida com luminol e peróxido de hidrogênio na presença de lacase. A luminescência também pode ser obtida sem enzima pela reação de luminol e peróxido de hidrogênio na presença de um íon ferricianeto, pela reação de lucigenina com peróxido de hidrogênio na presença de um íon metálico, pela reação de um oxalato de arila como bis(2,4,6- triclorofenil)oxalato com peróxido de hidrogênio na presença de uma substância fluorescente, e pela reação de luminol e peróxido de hidrogênio na presença de nanopartículas de prata ou nanopartículas de óxido de ferro, ou catalisador de prata.

[00165] Aparelho de ensaio: Em exemplos de realização, o ensaio pode ser realizado em um dispositivo microfluídico que compreende múltiplos aspectos funcionais: separação ou remoção de interferências, reação para gerar sinal e áreas de leitura de sinal ótico. Em exemplos de realização adicionais, o dispositivo microfluídico pode conter múltiplas áreas de separação/remoção, reação e de leitura de sinal para multiplexação, onde mais de um analito pode ser avaliado. A área de separação no dispositivo microfluídico contém adsorvente ou absorvente para separar ou remover interferências a partir dos analitos. Em outro exemplo de realização, a área de separação no dispositivo microfluídico contém enzima para converter interferências em não interferências. O aparelho pode ser fabricado por impressora 3D, moldagem por injeção, moldagem por sopro, moldagem por extrusão, moldagem por vácuo, moldagem por compressão ou quaisquer outras técnicas de fabricação.

[00166] Dispositivos detectores: Em determinados exemplos de realização, o sinal luminescente pode ser detectado por um detector de luz tal como, mas não se limitando a, um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, MPPC (contador de fótons multipixels), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam, câmera de relógio inteligente ou qualquer detector de luz. O detector de luz pode funcionar como um dispositivo de ponto de atendimento conectado e controlado via conexão com ou sem fio por computador pessoal, laptop, tablet, smartphone, relógio inteligente ou qualquer dispositivo semelhante com recursos de computação e exibição. A conexão sem fio inclui, mas não está limitada a, Bluetooth, Wi-Fi e Comunicação por Campo de Proximidade (NFC do inglês Near Field Communication).

[00167] O ensaio pode ser feito em formato de placa e os sinais são lidos por um leitor de placas equipado com tubos fotomultiplicadores (PMT), diodo avalanche, (contador de fótons de múltiplos pixels) MPPC ou fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor de dispositivo de carga acoplada (CCD), sensor complementar de metal-óxido semicondutor (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS).

EXEMPLO 18 ELIMINAÇÃO DE INIBIDORES PARA ENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES

[00168] Os antioxidantes são essenciais para o sistema de defesa do corpo. Eles neutralizam os radicais livres, como as espécies reativas de oxigênio (ROS), que danificam as células. Os principais antioxidantes na saliva incluem ácido úrico, ácido ascórbico, albumina, glutationa e enzimas antioxidantes. Suas atividades antioxidantes também podem interferir com uma reação quimioluminescente, que é um processo de oxidação. A presença de antioxidantes em uma reação quimioluminescente pode diminuir ou retardar a saída do sinal luminoso. De fato, o atraso de tempo do sinal luminoso é por vezes utilizado para quantificar a quantidade de antioxidantes nas amostras. A remoção desses antioxidantes é necessária para algumas reações quimioluminescentes, como aquelas que utilizam reagentes baseados em luminol. A Figura 34 ilustra um esquema de uma reação quimioluminescente envolvendo saliva e enzimas incluindo uricase e ascorbase.

[00169] Em um exemplo, antes da reação quimioluminescente, 500 μL de saliva são tratados com 0,05 U de uricase, 0,05 U de ascorbase, polifenol oxidase, glutationa oxidase e outras enzimas que então são incubadas por 10 minutos a 37°C para remover pequenos antioxidantes que inibem a reação quimioluminescente. A catalase é adicionada para remover o peróxido de hidrogênio produzido a partir da oxidação desses antioxidantes. A amostra é então filtrada com um filtro com intervalo de corte de peso molecular de 3kD (MWCO) para remover as moléculas antioxidantes maiores, como superóxido dismutases (SODs), bem como catalase, etc. Uma vez que os antioxidantes são removidos, os metabólitos da amostra podem ser analisados com leitura da reação quimioluminescente.

[00170] Especificamente, podemos medir glicose, galactose e 1,5- anidroglucitol (AHG) em uma amostra limpa com antioxidante. A amostra na qual os antioxidantes foram removidos contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase, peroxidase e substrato quimioluminescente, seguida pela medição imediata da intensidade da luz utilizando o detector de fótons. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação estar completa, a galactose oxidase é adicionada e imediatamente seguida pela medição da intensidade da luz usando o detector de luz de alta sensibilidade. O sinal é interpretado como concentração de galactose. Finalmente, a piranose oxidase é adicionada, seguida imediatamente pela medição da intensidade da luz usando o detector de fótons. O sinal é interpretado como concentração de AHG. A relação de 1,5-anidroglucitol para glicose ou galactose pode ser usada para corrigir as variações na coleta de amostras.

[00171] Em uma modificação, após 10 minutos de incubação a 37°C com enzimas para remover antioxidantes, a amostra é aquecida a 95°C por 10 minutos para inativar todas as enzimas e outras macromoléculas antioxidantes como as superóxidos dismutases (SODs), catalase, etc. Uma vez que os antioxidantes são removidos, os metabólitos da amostra podem ser analisados com leitura da reação quimioluminescente.

[00172] Em outra modificação, antes da reação quimioluminescente, 500 μL de saliva são tratados com 0,05 U de uricase, 0,05 U de ascorbase, glicose oxidase, galactose oxidase, polifenol oxidase, glutationa oxidase e outras enzimas para remover pequenos antioxidantes que inibem a reação quimioluminescente e remover interferentes na reação AHG. A catalase também é adicionada para remover o peróxido de hidrogênio produzido a partir da oxidação desses antioxidantes. A amostra é incubada a 37°C durante 1 a 90 minutos, tipicamente 10 minutos. A amostra é então filtrada ou aquecida para remover ou inativar as moléculas antioxidantes maiores, como as superóxidos dismutases (SODs), catalase, etc. Uma vez que os antioxidantes e interferentes são removidos, o AHG na amostra pode ser analisado com leitura da reação quimioluminescente. A amostra na qual os antioxidantes e interferentes foram removidos contendo 1,5- anidroglucitol é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo piranose oxidase, peroxidase e substrato quimioluminescente, seguida pela medição imediata da intensidade da luz utilizando o detector de fótons. O sinal de luz é interpretado como concentração de AHG.

[00173] Em outro exemplo, antes da reação quimioluminescente, 500 μL de amostra de saliva é filtrada ou aquecida para remover ou inativar as moléculas antioxidantes maiores, como as superóxidos dismutases (SODs), enzimas semelhantes à catalase, etc. A saliva é então tratada com 0,05U de uricase, 0,05 U de ascorbase e outras enzimas e incubadas por 10 minutos a 37°C para converter pequenos antioxidantes que inibem a reação quimioluminescente ao peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio produzido a partir da oxidação desses antioxidantes é quantificado por reação quimioluminescente com HRP e substrato de luminol. O sinal pode ser usado para normalizar outras medições para diluição pela produção de saliva. Uma vez limpo de antioxidantes, a amostra pode ser testada pela leitura da reação quimioluminescente convencional.

[00174] Em uma modificação, a amostra tratada é a urina. Sabe-se que a urina contém alto nível de ácido úrico. A remoção de ácido úrico e outros antioxidantes é necessária em ensaios utilizando substrato quimioluminescente à base de luminol. Em outra modificação, a amostra tratada com a mistura de enzimas é sangue, que contém catalase e outros antioxidantes. Em outra modificação, a peroxidase é derivada de batata doce ou, em uma modificação preferida, a peroxidase é derivada de soja.

ALTERNATIVAS PARA O QUÍMICO LUMINOL

[00175] A presença de antioxidantes nos fluidos corporais faz com que o ensaio quimioluminescente baseado em luminol não seja confiável sem nenhum pré-tratamento. A presença de antioxidantes em uma reação quimioluminescente pode diminuir ou retardar a saída do sinal luminoso. Dentre os métodos quimioluminescentes para detectar o peróxido de hidrogênio, a química do peroxioxalato e a química de éster de acridínio são impermeáveis à interferência do antioxidante.

[00176] Um exemplo de substrato químico do peroxioxalato é o bis(2,4,6- triclorofenil)oxalato (TCPO) que é usado em bastões luminosos (ou gOwstickS). Outras variações da molécula TCPO foram sintetizadas para compatibilidade com solventes e também podem ser usadas. Em relação à Figura 35, é exibido um esquema de uma reação química em que TCPO é dissolvido em acetato de etila a 600 mg/L. Os gráficos demonstrando a compatibilidade da química de peroxioxalato com saliva para detecção de peróxido de hidrogênio são mostrados na Figura 36. O gráfico à esquerda ilustra a resposta do peróxido de hidrogênio em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e o gráfico à direita ilustra a resposta do peróxido de hidrogênio na saliva.

[00177] Um agente fluorescente tal como perileno é adicionado a uma concentração de 50 mg/L. O agente fluorescente pode ser escolhido para combinar espectralmente com a sensibilidade espectral de um detector eletrônico a ser utilizado. Uma pequena quantidade de catalisador básico, trimetilamina (50 μl/L) é adicionada para fazer o substrato quimioluminescente. Esse substrato TCPO pode ser usado para detectar metabólitos ou outros compostos em amostras como saliva, urina, sangue, alimentos, bebidas ou águas naturais ou de processo. Por exemplo, uma amostra contendo 1,5-anidroglucitol é misturada com 10 μL de mistura enzimática contendo glicose oxidase e substrato quimioluminescente TCPO, seguida pela medição imediata da intensidade da luz utilizando o detector de fótons POC. O sinal de luz é interpretado como concentração de glicose. Após a primeira reação completa, a galactose oxidase é adicionada e imediatamente seguida pela medição da intensidade da luz para o sinal de galactose. Finalmente, a piranose oxidase é adicionada, seguida imediatamente pela medição da intensidade da luz usando o detector de luz de alta sensibilidade. O sinal é interpretado como concentração de 1,5- anidroglucitol. A relação de 1,5-anidroglucitol para glicose pode ser usada para corrigir as variações no método de coleta de amostras.

CÉLULA CAPILAR DE GUIA DE ONDA LÍQUIDA

[00178] Na espectroscopia, a sensibilidade da maioria dos métodos é diretamente proporcional ao comprimento do caminho óptico do porta-amostras. Aumentar o comprimento do caminho usando uma cuveta de amostra convencional requer um volume de amostra maior, o que nem sempre é possível. Além disso, o espaço adicional para acomodar o suporte da amostra é uma restrição. Uma célula capilar de guia de onda líquida resolve este problema fazendo com que a amostra se torne o conduto de luz flexível, a célula capilar de guia de onda é baseada na reflexão interna total, conceito similar àquele que permite que as fibras ópticas transmitam luz ao longo de seu comprimento flexível. Em uma fibra óptica, um núcleo com alto índice de refração é cercado por um menor índice de refração. Um raio de luz que entra na fibra com um ângulo maior que o ângulo crítico ao normal será refletido internamente e transmitido ao longo do comprimento das fibras. Em uma célula capilar de guia de onda líquida o líquido serve como núcleo de alto índice de refração e a parede do tubo serve como o revestimento de baixo índice de refração. Para aplicações aquosas, a água tem um índice de refração muito baixo (1,33), de modo que a disponibilidade de materiais de revestimento adequados é muito limitada, e aqueles materiais que demonstram tal capacidade são muito caros. O Teflon AF 1600 e o Teflon AF 2400 da DuPont têm índices de refração de 1,31 e 1,29, respectivamente, e são usados atualmente para material de revestimento em células capilares de guia de onda líquida.

[00179] Materiais com índice de refração moderadamente baixo são menos caros, tal como o propileno etileno fluorado (FEP). O FEP é amplamente utilizado como tubo transparente com índice de refração de 1.341-1.347, que é superior ao da água. O uso de FEP como material de revestimento para células capilares de guia de onda líquidas aquosas não é possível devido ao seu alto índice de refração em relação à água. Em uma modificação, resolvemos esse problema modificando o núcleo líquido aquoso com substâncias de alto índice de refração para tornar o índice de refração mais alto do que o da tubulação mais barata.

MODIFICAÇÃO DO ÍNDICE DE REFRAÇÃO CENTRAL

[00180] A refração do líquido central (núcleo) pode ser aumentada pela adição de sais como cloreto de cálcio, açúcares como sacarose, ou substâncias com alto índice de refração (incremento) tal como glicerol.

[00181] Em um exemplo, o líquido aquoso a ser analisado é misturado com glicerol (10% a 90%, tipicamente 20%) para dar uma solução com um índice de refração maior do que o da tubulação de FEP. A solução é então injetada na tubulação com o comprimento do caminho pré-selecionado. O método de injeção é projetado para ser livre ou quase livre de bolhas de ar. A pressão elevada pode ser aplicada ao líquido do núcleo para forçar as bolhas de ar a encolher e dissolver no líquido. Uma vez livre de bolhas, o núcleo líquido tem a capacidade de guiar a luz e a medição ou leitura pode ser realizada.

[00182] Em outro exemplo, o líquido aquoso a ser analisado é misturado com sacarose (10% a 90%, tipicamente 20%) para formar o índice de refração maior do que o da tubulação de FEP. A solução é então injetada na tubulação com o comprimento do caminho pré-selecionado. O método de injeção é projetado para não ter ou ter poucas bolhas de ar. A alta pressão pode ser aplicada ao líquido do núcleo para forçar as bolhas de ar a encolher e dissolver no líquido. Uma vez livre de bolhas, o núcleo líquido tem a capacidade de guiar a luz e a medição ou leitura pode ser realizada.

[00183] Em outro exemplo, o cloreto de cálcio (CaCL) é adicionado ao líquido aquoso a ser analisado para aumentar o índice de refração da solução. A solução é então injetada na tubulação de FEP com o comprimento do caminho de 70 cm. O núcleo líquido tem a capacidade de guiar a luz e a medição ou leitura pode ser realizada.

DIFERENTES FORMATOS DE CÉLULAS CAPILARES DE GUIA DE ONDA LÍQUIDAS

[00184] Em um exemplo, a célula capilar de guia de onda líquida é composta por tubos FEP com diâmetro interno de 0,1 mm a 1 mm. O tubo FEP é disposto em uma bobina com diâmetro maior que o raio mínimo de curvatura para manter a operação de direcionamento de onda adequada e a estabilidade mecânica. O comprimento da tubulação determina o comprimento do caminho óptico e, portanto, sua sensibilidade. As extremidades da tubulação são terminadas por adaptadores em T que permitem que a luz entre e saia ao longo da direção axial da tubulação e que o líquido flua para dentro e para fora a partir da direção lateral. Os adaptadores em T podem ser conectados a fibras ópticas que podem ser conectadas à fonte de luz e ao detector.

[00185] Em outro exemplo, a célula capilar de guia de onda líquida é composta por um cartucho de fluido fabricado com plástico FEP por moldagem por injeção, gravação quente, impressão 3D ou outros processos de fabricação plástica. A célula capilar de guia de onda líquida fabricada pode ser linear, curva, ou em rolos, dependendo do comprimento do percurso, as limitações de espaço e de um raio mínimo de curvatura. As extremidades da célula capilar de guia de onda líquida são terminadas por formatos em T que permitem que a luz entre e saia ao longo da direção axial da tubulação e que o líquido flua para dentro e para fora a partir da direção lateral. Uma extremidade pode ser conectada com a fonte de luz e a outra extremidade ao detector.

MEDIÇÃO DE ABSORBÂNCIA COM CÉLULA CAPILAR DE GUIA DE ONDA LÍQUIDA

[00186] Em medições típicas de colorimetria, o comprimento padrão do caminho óptico é de 1 cm. De acordo com a lei de Beer-Lambert, a sensibilidade da medição é diretamente proporcional ao comprimento do caminho, mas um caminho mais longo exigiria um grande volume de amostra que nem sempre está disponível. Além disso, o comprimento do caminho óptico precisa ser perfeitamente reto e, portanto, um caminho mais longo exigiria um processo de fabricação de precisão e seria volumoso. Em contraste, a célula capilar de guia de onda líquida pode ter um comprimento de percurso muito longo e requer um volume de amostra muito baixo. Para o mesmo volume, o comprimento do caminho óptico da célula capilar de guia de onda líquida pode ser 100 vezes mais longo que uma cuveta convencional. A célula capilar de guia de onda líquida pode ser curvada ou enrolada para economizar espaço.

[00187] Em um exemplo, o nível de AHG na saliva pode ser detectado por colorimetria usando uma célula capilar de guia de onda líquida. Após a remoção de todos os interferentes, a piranose oxidase é adicionada à amostra para converter o AHG em peróxido de hidrogênio. Substrato TMB e a peroxidase de rábano são então adicionados à amostra e incubados por 30 min. A reação é então interrompida com 0,16 M de ácido sulfúrico seguido pela adição de um modificador do índice de refração, como cloreto de cálcio, glicerol ou outros, para aumentar o índice de refração de modo a ser maior do que o da tubulação. A amostra é então injetada na tubulação FEP com o comprimento do caminho óptico pré-selecionado. Uma medição de absorbância pode ser realizada transmitindo a luz de um terminal e analisando no outro terminal.

[00188] Em outra modificação, o peróxido de hidrogênio pode ser detectado pela adição de titaniloxalato de amônio à amostra seguido pela adição de um modificador do índice de refração, tal como cloreto de cálcio, glicerol ou outros para aumentar o índice de refração para um índice de refração maior do que o da tubulação. A amostra é então injetada na tubulação FEP com o comprimento do caminho óptico de 50 cm para a medição da absorbância.

[00189] Os resultados da detecção de peróxido de hidrogênio com titaniloxalato de amônio descritos acima são mostrados na Figura 37.

[00190] A concentração de bilirrubina total (a soma de bilirrubina não conjugada e conjugada) no plasma, hemoglobina total, saturação de oxigênio, fração de oxihemoglobina, carboxiemoglobina, desoxiemoglobina, metemoglobina e hemoglobina fetal pode ser medida pelo uso de células de guia de onda líquida. Por exemplo, a amostra de sangue total é hemolisada e diluída com plasma e misturada com o modificador de índice de refração, como glicerol, CaCl2 e outros, para aumentar o índice de refração para maior que o da tubulação. A mistura é transportada para a célula de guia de onda líquida. O método de injeção é projetado para não ter ou ter poucas bolhas de ar. Uma alta pressão pode ser aplicada ao líquido do núcleo para forçar as bolhas de ar a encolher e dissolver no líquido. A temperatura da célula de guia de onda líquida é regulada para 37°C. A luz é enviada para uma extremidade da célula de guia de onda líquida. A luz transmitida através da célula de guia de onda líquida é guiada para o espectrômetro. O espectro de absorção da amostra é usado para calcular os valores dos parâmetros de oximetria. A partir desses dados espectrais, a bilirrubina foi calculada juntamente com os valores da oximetria (hemoglobina, hemoglobina fetal, saturação de oxigênio e outros) e é ajustada quanto à presença de hemoglobina, hemoglobina fetal e outros componentes da matriz.

MEDIÇÃO DE QUIMIOLUMINESCENTE COM CÉLULA CAPILAR DE GUIA DE ONDA LÍQUIDA

[00191] A sensibilidade da detecção quimioluminescente depende da capacidade de coletar o sinal luminoso do volume de reação. A coleta óptica precisa estar a mais próxima possível da amostra emissora de luz, devido à relação com o inverso do quadrado entre a intensidade e a distância. A coleta de luz emitida a partir de um grande volume de amostra é difícil e não é eficiente. A célula capilar de guia de onda líquida pode coletar efetivamente a luz ao longo de seu comprimento e transmitir à luz para o detector sem ou com muito poucos elementos ópticos.

[00192] Em um exemplo, o nível de AHG na saliva pode ser detectado com um método quimioluminescente usando uma célula capilar de guia de onda líquida. Após a remoção dos interferentes, a piranose oxidase é adicionada à amostra para converter o AHG em peróxido de hidrogênio. O substrato quimioluminescente e a peroxidase de rábano são então adicionados à amostra seguido por adição de um modificador do índice de refração, tal como cloreto de cálcio, glicerol ou outros para aumentar o índice de refração para um índice de refração maior do que o da tubulação. A amostra é então injetada no tubo FEP. O método de injeção é projetado para estar livre de bolhas de ar. A luz é detectada em uma ou ambas as extremidades da tubulação.

MEDIÇÃO DE FLUORESCÊNCIA COM CÉLULA CAPILAR DE GUIA DE ONDA LÍQUIDA

[00193] Outra aplicação para a célula capilar de guia de onda líquida é a medição de fluorescência. O analito fluorescente na amostra pode ser excitado por uma fonte de luz introduzida ao longo do comprimento axial da célula capilar de guia de onda líquida, utilizando, por exemplo, um espelho semiprateado, ou lateralmente através da parede. Uma fração da luz emissora é coletada e transmitida ao longo da célula capilar de guia de onda líquida até as extremidades. O sinal luminoso pode ser filtrado e medido com um detector de luz.

[00194] Em um exemplo, o nível de AHG na saliva pode ser detectado com um método de medição por fluorescência usando uma célula capilar de guia de onda líquida. Após a remoção de todos os interferentes, um modificador do índice de refração, como cloreto de cálcio, glicerol e outros, para aumentar o índice de refração para um valor maior que o índice de refração da tubulação, é adicionado à amostra. A piranose oxidase é então adicionada à amostra para converter AHG em peróxido de hidrogênio. O substrato vermelho Amplex e peroxidase de rábano são adicionados à amostra e a amostra é então injetada no tubo FEP e incubada a 37°C durante 10 min. O vermelho Amplex é oxidado em resorufina, um composto altamente colorido e fluorescente. O tubo é exposto à luz no comprimento de onda de excitação, 538 nm. A luz é filtrada e detectada em uma ou ambas as extremidades da tubulação a 587 nm para medição de AHG.

ESPECTROSCOPIA RAMAN COM CÉLULA CAPILAR DE GUIA DE ONDA LÍQUIDA

[00195] A espectroscopia Raman pode ser usada para identificar e quantificar moléculas alvo em uma amostra, observando os modos vibracional, rotacional e outros de baixa frequência. Uma luz monocromática, geralmente a partir de um laser, interage com vibrações moleculares, ou outras excitações no sistema, fazendo com que a energia da luz do laser seja deslocada para cima e para baixo. O deslocamento no comprimento de onda e a intensidade da luz emissora fornecem informações sobre a identidade e a quantidade dos analitos- alvo. A intensidade do sinal Raman é muito fraca e, portanto, requer um comprimento de caminho óptico de excitação muito longo. A célula capilar de guia de onda líquida pode ser usada para melhorar o sinal Raman. A amostra pode ser excitada ao longo do tubo pela injeção de luz monocromática de uma extremidade do tubo e o sinal pode ser filtrado e analisado na outra extremidade. A superfície do guia de onda pode ser modificada para melhorar os sinais Raman. Os sinais podem ser interpretados usando algoritmos de aprendizagem profunda ou de rede neural.

IMUNOENSAIO EM CÉLULA CAPILAR SE GUIA SE ONDA LÍQUIDA

[00196] O imunoensaio tal como o ensaio imunoadsorvente enzima- associado (ELISA) pode ser realizado em células capilares de guia de onda líquida para detectar e quantificar substâncias como peptídeos, proteínas, anticorpos, hormônios, metabolitos ou toxinas. A superfície interna das células capilares de guia de onda líquida pode ser funcionalizada com um elemento de reconhecimento molecular, tal como um anticorpo, aptâmero, ácido nucleico, análogo de anticorpo, lectina, receptor, hormônio, toxina ou fármaco ou fármaco análogo. A funcionalização pode ser feita com adsorção passiva ou modificação química covalente. O elemento de reconhecimento molecular imobilizado é usado para capturar as moléculas alvo. Para moléculas alvo grandes, como proteína, o formato de ensaio sanduíche pode ser usado usando o elemento de reconhecimento molecular ligado à enzima para detecção (método direto) ou usando um elemento de reconhecimento molecular primário para se ligar ao alvo seguido por um reconhecimento molecular secundário ligado à enzima que reconhece o elemento de reconhecimento primário para detecção (método indireto). Após a lavagem seguida da adição de substrato, a enzima conjugada ligada irá converter o substrato em produto mensurável. Para moléculas alvo pequenas como metabolitos, o ensaio competitivo pode ser realizado utilizando um antígeno marcado. O antígeno não marcado das amostras e o antígeno marcado competem pela ligação ao elemento de reconhecimento da molecular de captura. Uma diminuição no sinal do antígeno marcado indica a presença do antígeno nas amostras quando comparado com os poços do ensaio apenas com o antígeno marcado.

[00197] Em um exemplo, o 1,5-anidroglucitol (AHG) na saliva pode ser analisado com o método de imunoensaio em células capilares de guia de onda líquida. Este ensaio emprega a técnica competitiva de imunoensaio enzimático. Um anticorpo monoclonal específico para AHG foi pré-revestido na superfície interna da célula capilar de guia de onda FEP de 50 cm de comprimento. Uma reação competitiva é realizada entre o AHG marcado com biotina e o AHG não marcado presente nas amostras com o anticorpo pré-revestido específico para AHG. Após a incubação, o conjugado não ligado é lavado. Em seguida, a avidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) é adicionada à célula capilar de guia de onda líquida e incubada. Após determinado número de fluxos até o tampão de lavagem, o substrato, como o TMB e o modificador de índice de refração, é bombeado na célula capilar de guia de onda líquida. A quantidade de conjugado HRP ligado é inversamente proporcional à concentração de AHG na amostra. A intensidade da cor desenvolvida é inversamente proporcional à concentração de AHG na amostra. Uma medição de absorbância pode ser realizada transmitindo a luz de um terminal e analisando no outro terminal. O valor de absorbância pode ser comparado com o padrão para determinar a concentração de AHG na amostra.

[00198] Em uma modificação, após a adição de avidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP), é utilizado substrato Amplex vermelho como substrato em vez de TMB. O vermelho Amplex é oxidado em resorufina, um composto altamente colorido e fluorescente. O tubo é exposto à luz no comprimento de onda de excitação, 538 nm. A luz é filtrada e detectada em uma ou ambas as extremidades da tubulação a 587 nm para medição de AHG.

[00199] Aplicações não aquosas: Muitos líquidos não aquosos têm índice de refração maior que o índice de refração do tubo FEP. Isto permite a aplicação de células capilares de guia de onda líquida para medir quantitativa e qualitativamente estas substâncias ou substâncias nelas sem qualquer modificação na amostra.

[00200] Em um exemplo, a célula capilar de guia de onda líquida é usada para verificar a autenticidade, a pureza e a adulteração de azeite de oliva. Uma amostra de óleo é injetada na célula capilar de guia de onda líquida. Como o núcleo líquido possui índice de refração mais alto que o tubo, ele tem a capacidade de guiar a luz. A medição de absorbância pode ser realizada transmitindo a luz de uma extremidade e analisando na outra extremidade, ou usando um espelho em uma extremidade e um acoplador em formato T semiprateado e fonte de luz e detector na outra. O resultado espectral é comparado com o padrão para determinar sua autenticidade, pureza e adulteração.

[00201 ] As reações enzimáticas em meios não aquosos podem ser utilizadas para bioanálise em células capilares de guia de onda líquida, por exemplo, no modo de análise por injeção em fluxo (vide, Anal. Chem., 1992, 64 (2), págs. 129-133). Em um exemplo, a primeira metade do comprimento de uma célula de guia de onda líquida é empacotada com vidro de poro controlado com colesterol oxidase imobilizada e peroxidase de soja. Amostras de tolueno contendo colesterol e misturadas com substrato de p-anisidina fluem através do capilar, e a concentração de colesterol é inferida a partir das medições de absorbância realizadas ao longo da segunda metade do capilar.

PREPARAÇÃO DE AMOSTRA E PRÉ-CONCENTRAÇÃO

[00202] Quando a molécula alvo é um monossacarídeo de baixo peso molecular, ela pode ser processada de acordo com as técnicas tradicionais de concentração de carboidratos, incluindo tratamentos térmicos.

[00203] Como uma primeira modificação, uma amostra de saliva coletada pode ser concentrada usando concentração por congelamento, ou por um procedimento de liofilização semelhante ao relatado por Daughters et al. Primeiro, uma amostra fresca é centrifugada a 4°C e a 1600 x g por 15 min. O sobrenadante é transferido para um novo tubo de 2 mL e o sedimento é descartado. O sobrenadante limpo e fresco é então congelado por um período de 24 horas a -80°C. Considerando que o solvente da amostra é principalmente água, a etapa de concentração reside em uma etapa de liofilização a ser realizada durante a noite (de 12-16 h aproximadamente considerando a natureza e o volume da amostra). Após a liofilização, as amostras devem ser armazenadas a -20°C. Foi determinado que as amostras de saliva liofilizadas nestas condições são estáveis para estudos moleculares em até duas semanas. Após esses procedimentos, as amostras poderiam ser submetidas à análise de conteúdo de AHG.

[00204] Um segundo protocolo para concentração da amostra pode incluir a concentração evaporativa. Após a coleta de uma amostra de saliva, a amostra poderia ser centrifugada a 15.000 x g por 30 min. a 24°C. O sobrenadante seria então transferido para um novo tubo de 2 mL e depois submetido à concentração com um GeneVac EZ-2 pus a 30°C por 2 h. Uma redução de 10-15 vezes no volume é alcançada. Finalmente, amostras concentradas são submetidas à análise do conteúdo de AHG. Um instrumento alternativo que poderia ser usado nesta abordagem é o Savant DNA 120 SpeedVac Concentrator (Thermo Electron Corporation).

[00205] Em uma terceira modificação, uma amostra de saliva ou urina, etc., é depurada de sólidos por centrifugação, depois tratada com a adição de um volume igual de acetona ou clorofórmio frio e mantida a 4°C durante a noite Ipse (12-16 h). Então, uma etapa de centrifugação a 15.000 x g por 30 min. a 4°C é realizada, e o sobrenadante é removido e tratado com um Savant DNA 120 SpeedVac Concentrator. A amostra final é então analisada.

[00206] Um quarto método de pré-concentração da amostra é a precipitação. Saliva depurada por centrifugação é misturada com 1 volume de uma solução de sulfato de amônio a 50% de saturação. Após um período de incubação de 10 minutos em temperatura ambiente, a amostra é centrifugada a 15.000 x g durante 30 min. à temperatura ambiente. O sobrenadante é descartado. Após outro ciclo de sulfato de amônio + etapa de centrifugação e descarte do segundo sobrenadante, o sedimento final é resuspenso e submetido à análise.

[00207] Um quinto método de pré-concentração é a troca aniônica, afinidade por metal quelato ou interação hidrofóbica ou adsorção de fase-reversa, opcionalmente utilizando uma fase reversa de superfície interna ou outro adsorvente de acesso controlado. Para a adsorção de açúcares por troca aniônica, a operação em pH alto (> 9) é preferida.

REFERÊNCIAS

[00208] As referências a seguir, na medida em que proporcionam detalhes procedimentais ou outros exemplos suplementares aos aqui apresentados, são especificamente incorporadas ao presente pedido como referência. - Publicação Internacional N° W02008072702A1. - K. Daughters, A.S.R. Manstead, K. Hubble, A. Rees, A. Thapar, S.H.M. van Goozen. Salivary oxytocin concentrations in males folowing intrasanal administration of ocytoxin: A doubleblind, cross-over study. PLOS ONE (2015). - RJ. Linhardt, H.G. Bazin, Separation and Purification of Carbohydrates, Em: Glycosci. Chem. Chem. Biol., 2002: págs. 63-74. - R.A. Young, The Precipitation of Carbohydrates by Neutral Salts, J. Physiol. 22 (1898) 401- 422.

Claims

1. MÉTODO PARA ANALISAR UMA AMOSTRA, caracterizado pelo fato de que compreende: a obtenção de uma amostra compreendendo 1,5-anidroglucitol e um primeiro analito; a adição de um primeiro reagente à amostra, em que o primeiro reagente provoca uma primeira reação quimioluminescente com a amostra; a medição de uma primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente; e a adição de um segundo reagente à amostra, em que: o segundo reagente é adicionado sequencialmente à amostra após o primeiro reagente ser adicionado à amostra; e o segundo reagente provoca uma segunda reação quimioluminescente com a amostra; uma segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente é mensurada; e a comparação da primeira resposta luminosa em relação à segunda resposta luminosa para determinar uma relação de 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito; em que o primeiro reagente ser glicose oxidase e pelo segundo reagente ser piranose oxidase, sendo que primeiro reagente e segundo reagente serem adicionados à amostra através de um dispositivo microfluídico; e a medição da primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente e da segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente compreender a medição de fótons com um detector de luz, sendo que o detector de luz é selecionado a partir do grupo que consiste em um dispositivo de carga acoplada (CCD), diodo avalanche, contador de fótons multipixels (MPPC), fotomultiplicador de silício (SiPMT), sensor semicondutor de metal-óxido complementar (CMOS), sensor CMOS científico (sCMOS), tubo fotomultiplicador (PMT), fotodiodo, câmera, câmera de telefone celular, webcam ou câmera de relógio inteligente.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende saliva, urina ou fluido intersticial.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro analito é glicose, L-sorbose, D-xilose, D-galactose, glucono-S- lactona, ureia, creatinina ou creatina.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a comparação da primeira resposta luminosa em relação à segunda resposta luminosa para determinar uma relação de 1,5-anidroglucitol e o primeiro analito compreende a transmissão dos dados para um processador de computador, no qual uma tabela de pesquisa é acessada, e possui uma indicação de uma condição fisiológica que está relacionada com o nível de insulina de uma pessoa a parir da qual a amostra foi obtida.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a normalização da relação com base na medição de um marcador na amostra ureia, onde o dito marcador é ureia, creatinina, creatina, albumina de soro humano ou hemoglobina.

6. KIT PARA ANALISAR UMA AMOSTRA, caracterizado pelo fato de que compreende: uma câmara configurada para adicionar sequencialmente um primeiro reagente e um segundo reagente a uma amostra, em que: a amostra compreende um primeiro analito e um segundo analito; o primeiro reagente provoca uma primeira reação quimioluminescente com a amostra; e o segundo reagente provoca uma segunda reação quimioluminescente com a amostra; e um dispositivo de detecção de luz, em que o dispositivo de detecção de luz é configurado para ser capaz de: medir o primeiro dado correlacionado com uma primeira resposta luminosa resultante da primeira reação quimioluminescente; e medir o segundo dado correlacionado com uma segunda resposta luminosa resultante da segunda reação quimioluminescente; e um módulo de comunicação configurado para transmitir o primeiro dado e o segundo dado do dispositivo de detecção de luz para um processador de computador, em que o processador de computador está configurado para calcular uma relação entre o primeiro analito e o segundo analito com base no primeiro e segundo dados; em que o primeiro analito é glicose, ureia, creatinina ou creatina, e pelo segundo analito ser 1,5-anidroglucitol, sendo que o primeiro reagente se glicose oxidase, e o segundo reagente ser piranose oxidase; e o primeiro dado possui uma primeira medição de fótons relacionada à primeira reação quimioluminescente; e o segundo dado possui uma segunda medição de fótons relacionada à segunda reação quimioluminescente.

7. KIT, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a câmara compreende um elemento capilar configurado para direcionar a amostra por capilaridade, sendo que o primeiro reagente é absorvido em uma primeira porção do elemento capilar e o segundo reagente é absorvido em uma segunda porção do elemento capilar, sendo que o dito elemento capilar é configurado para enviar a amostra por capilaridade para a primeira porção do elemento capilar, e ainda, é configurado para enviar a amostra por capilaridade para a segunda porção do elemento capilar, sendo configurado para enviar a amostra à primeira porção antes de enviar a amostra para a segunda porção.

8. KIT, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o processador de computador está contido em um dispositivo de comunicação sem fios, onde o dito dispositivo de comunicação sem fios é um telefone celular, e também, pelo módulo de comunicação ser configurado para transmitir dados sem fio do dispositivo de detecção de luz para o processador do computador, sendo que o dito processador de computador é configurado para: acessar uma tabela de pesquisa dotada de uma indicação de uma condição fisiológica que está relacionada com um nível de insulina de uma pessoa a partir da qual a amostra foi obtida, sendo que a amostra pode ser saliva, urina, sangue ou fluido intersticial; e normalizar a relação com base na medição de um marcador na amostra, sendo que o dito marcador pode ser ureia, creatinina, creatina, albumina de soro humano ou hemoglobina.