DE2526558C2 - Verfahren zur enzymatischen Analyse - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Analyse

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatlschen Analyse, welches eine wesentliche Einsparung an Enzymen ermöglicht und sich Insbesondere für die Anwendung auf Analysenautomaten eignet.
In der Analyse von natürlichen Systemen wie biologischen Flüssigkelten, Insbesondere In der klinischen Chemie, hat man es mit einem Meßgut zu tun, das eine Vielzahl von Substraten enthalt, die einander zum Teil chemisch sehr ähnlich sind. Es hat sich erwiesen, daß In vielen Verfahren der Einsatz von Enzymen notwendig Ist, um die erforderliche SpeziTltat und damit Störungsfreiheit einer Substratbestimmung zu gewährleisten.
Μ Enzyme wirken als Katalysatoren, d. h. sie werden wahrend der Reaktion nicht verbraucht. Diese Tatsache führte zu Überlegungen, wie man diese /.. T. sehr teuren Enzyme nach abgeschlossener Reaktion erneut In einer anderen Analyse zum Einsatz bringen kann.
Als recht gut geeignetes Mittel hat sich dafür die Fixierung der Enzyme auf Inerte, unlösliche Trägermaterlallen erwiesen: entweder man entfernte dieses feste Material nach der Analyse wieder aus der Reaktionslösung
z. B. durch Filtration, oder man IaOt die Reaktionslösung durch einen Reaktor strömten, der dieses Material enthalt. Daraus geht auch hervor, daß der Einsatz tragergebundener Enzyme an Analysenautomaten und da wiederum an den kontinuierlich durchströmten, am einfachsten und wirkungsvollsten Ist.
Bei kontinuierlich von Reagens durchströmten Analysenautomaten Ist die sogenannte Verschleppung eines der Hauptprobleme. Durch Adsorption des Substrates oder seiner Folgeprodukte an den Winden des Flleßsystems kann es dazu kommen, daß Anteil aus einer Probe In den Lösungsbereich, In dem sich die nächstfol-■ gende Probe befindet, verschleppt werden. Dieser Effekt muß so klein wie möglich gehalten werden. Bei den
bisher üblichen, weit verbreiteten Verfahren konnte man das dadurch erreichen, daß als Material, das von den Lösungen durchflossen wird, zwischen Probengefaß und Analysator nur Glas oder spezielle Kunststoffschlauche verwendet werden.
Der Hauptnachlell des Einsatzes eines Enzymreaktors mit trägergebundenem Enzym vor der Meßeinrichtung besteht darin, daß das Verschleppungsproblcm hierdurch wesentlich verschärft wird und hluflg nur sehr schwer zu lösen Ist. Probenfrequenz und Analysendauer sind namllch bei Automaten weitgehend festgelegt. Eine Frequenz von 60/h ist bei den meisten Analysenautomaien die untere Grenze. Andererseits sollte, zumal bei Geräten, die mehrere parallel geschaltete Kanäle aufweisen, wie den sogenannten SMA-Geraten (Bestimmung von
so bis zu 12 verschiedenen Substraten), eine Reaktionszeit von 10 min nicht überschritten werden, da die bereits auf dem Gerat befindlichen Methoden unter dieser Reaktionszeit liegen und da die Resultate aller Kanäle gleichzeitig zur Anzeige gebracht werden müssen. Daher sind sehr hohe spezifische Aktivitäten bei tragergebundenen Enzymen nötig, damit der Reaktor klein und die Verschleppung gering gehalten werden können.
Es hat sich nun In der Praxis häufig als schwierig erwiesen, einerseits eine genügend hohe auf Trägern gebundene Enzymaktivität Im Reaktor zur Verfügung zu stellen und andererseits die geforderte hohe Probenfrequenz zu ermöglichen. Die enzymatlsche Aktivität steigt direkt proportional mit der Oberfläche des Materials, mit der die Reaktionslösung In Berührung kommt. Andererseits aber wird an einer großen Oberfläche, die man sich noch dazu bei enzymatisch aktivem Trägermaterial Im Mlkroberelch als porös und schwammartig vorstellen muß, mehr von dem Substrat und seinen Folgeprodukten absorbiert als von einer kleinen. Das heißt, die VerfBI-
«· schung des Wertes einer nachfolgenden Probe durch Verschleppung wird größer. Daraus folgt, daß man bei großen Oberflächen den Auswaschvorgang zwischen den Proben Intensivleren, d. h. verlängern muß, was nur auf Kosten der Probenfrequenz möglich Ist.
Ein weiterer Nachteil einer solchen Verfahrensweise, d. h. Einsatz des Enzymreaktors vor dem Analysator, Ist es, daß sich einige Enzyme zwar fixieren lassen, Ihre katalytisch^ Aktivität aber troizdem nicht oder fast nicht
*-s zur Wirkung kommt, da ein dlrekler Koniakt mit dem Substrat nicht hergestellt werden kann. Dies gilt für Substrate wie die Trlglycerlde, die sich In lipophllcn Mlkrophasen befinden, wahrend sich die zur Spaltung notwendigen Llpasen am Trager In einer hydrophilen Umgebung befinden. Ein Kontakt zwischen Enzym und Substrat wird auf diese Welse stark erschwert, wenn nicht unmöglich gemacht.
Der vorliegenden Erfindung Hegt die Aufgabe zugrunde, die obengenannten Schwierigkeiten zu beseitigen und den Enzymverbrauch bsi analytischen Verfahren, Insbesondere bei Verfahren auf Analysenautomaten, herabzusetzen unter Verwendung eines gelösten Enzyms für die Umsetzung der zu bestimmenden Substanz. Insbesondere 1st es ein Ziel der Erfindung, die benötigte Enzymmenge fur eine Reihe von wiederholten Analysen verwendbar zu machen, ohne daß diese Enzyme hierzu immobilisiert werden. s
Gelöst wird diese Aufgabe crfindungsgemflß durch ein Verfahren zur enzymutlschen Analyse durch enzymatlsche Umsetzung der zu bestimmenden Substanz und Messung der Zunahmt bzw. Abnahme eines Reaktionspartners der Haupt- oder einer nachgeschalteten Kllfsreaktion, wobei einer im Kreislauf geführten Lösung, welche das zur Umsetzung nötige Enzym und gegebenenfalls Hllfsenzyme sowie Hllfsstoffe gelöst enthält, eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probelösung zugesetzt und ein bestimmter Reaktionspanner gemessen "> wird, welches dadurch gekennzeichnet 1st. daß die Lösung nach der Messung durch einen mit einem Adsorbens beschickten Reaktor geleitet wird, welcher das gemessene Reaktionsprodukt vollständig aus der Lösung entfernt. Die Lösung kann dabei als Hllfsstoffe Puffer, Salze, Coenzyme, Farbbildner und dergleichen gelöst enthalten.
Beim Verfahren der Erfindung werden also die Enzyme, die direkt an den Reaktionen beteiligt sind, nicht immobilisiert, d. h. tragerflxiert, sondern man richtet einen Kreislauf ein. In dem die Reagenzien und die >s Enzyme gelöst sind und vor dem Vermischen mit einer neuen Probe wird nach zuvor erfolgter Messung das gemessene Reaktionsprodukt entfernt.
Das Verfahren wird vorzugsweise auf Analysenautomaten eingesetzt und macht es möglich, den dabei benötigten Reaktor an einer Stelle Im Verfal.rensgang einzusetzen, wo er die Probendifferenzierung nicht mehr ungünstig beeinflussen kann, was außerhalb des Weges zwischen Probeneingabe und Meßstelle (Analysator, Im allgemeinen eine Küvette) der Fall Ist. Weder die Form noch die Oberfläche des Reaktors können daher die || Probenfrequenz beeinflussen und Verschleppung wird vermieden.
;| Das Verfahren der Erfindung kann bei Anwendung auf Analysenautomaten sowohl auf solchen mit eingeil schalteter Dialyse als auch ohne solche eingesetzt werden.
\i Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird daher ein zu messendes Reaktionsprodukt zur
r'- Messung teilweise aus dem Lösungskreislauf abdlalyslert und der nicht abdlalyslerte Anteil dieses Produktes
wird entfernt.
ί Unter »Reaktor« wird Im Rahmen der Erfindung eine Im Reaktlonskrelslauf angeordnete Strecke bezeichnet,
■ In der die Entfernung des gemessenen Reaktionsprodukts erfolgt. Dies kann sowohl chemisch als auch physlka-
5/ lisch erfolgen. Physikalische Abtrennung kann erfolgen durch Adsorption an geeigneten Adsorbentlen, die
].' chemische Abtrennung durch chemische Bindung an geeigneten Materialien. Bei der Wahl des Reaktors Ist vor
' allem darauf zu achten, daß die Im Kreislauf strömenden Enzyme nicht In wesentlichem Ausmaß adsorbiert
:. werden sollen. Diese Adsorption läßt sich z. B. durch vorausgehende Sättigung des Reaktors mit gelösten
Eiweißstoffen wie Albumin verhindern. Eine anfängliche Adsorption während der Einlaufphase 1st jedoch zulässig, sofern sie nach einiger Zelt zum Stillstand kommt. Weiter 1st es wesentlich, daß die gemessenen Reaktlonsprodukte quantitativ entfernt werden. Zu diesem Zweck können im Reaktor einzelne Substanzen anorganischer oder organischer Natur oder Mischungen mehrerer solcher Materlallen verwendet werden. Das Im Reaktor verwendete Material soll ferner eine möglichst niedrige Löslichkeit aufweisen, um keine Verunreinigungen In den Kreislauf abzugeben. Ferner sollte das Adsorptionsmaterial im Reaktor so beschaffen sein, daß es während des Verfahrens seine Durchflußelgenschaften im wesentlichen beibehält. Materialien, die diesen Bedingungen *> genügen, lassen sich vom Fachmann ohne große Schwierigkeiten auswählen.
Im Reaktor können nicht nur die gemessenen Reaktionsprodukte entfernt, sondern auch andere für die Durchführung der Analyse notwendige Substanzen adsorbiert oder umgewandelt werden. Voraussetzung 1st jedoch, daß die Kreislauflösung unschwierig wieder mit diesen verbrauchten Reagenzien aufgefrischt werden kann.
Ins Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Reaklormalerlallen sind Adsorbentlen wie z. B. Aktivkohle, Kieselsäuregel, Bleicherde, Kieselgur, aktiviertes Aluminiumoxid und aktivierter Bauxit, Insbesondere für die Entfernung von Farbstoffen.
Eine andere Anwendungsmöglichkeit der Erfindung besteht t. B. bei solchen Reaktionen, die unter Beteiligung einer Oxldase und damit unter Bildung von H1O2 verlaufen. H2O2 wird meistens durch eine Farbreaktion nachgewiesen. Diese Farbreaktion kann Im Enzymkreislauf erfolgen, wobei die gebildete Farbe nach erfolgter Messung wieder entfernt wird, z. B. durch Adsorption des Farbstoffes in einem Holzkohlereaktor.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf handelsüblichen Analysenautomaten wie z. B. den AutoAnalyzer®-Geräten, aber auch anderen Fabrikaten durchführen, ohne daß die In diesen Geräten festgelegten Analysenparameter geändert werden müssen. Durchgeführte Versuche haben gezeigt, daß die Im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, gelösten Enzyme vielfach wieder verwendet werden können und damit die Menge an . benötigten gelösten Enzymen mindestens um den Faktor 10 gesenkt werden kann. Die Wiederverwendbarkeit
V der Enzyme Ist dabei nur begrenzt durch die allmähliche Anhäufung von Abbauprodukten und durch die
zunehmende Verdünnung der Lösung durch die zugegebenen Proben.
Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung welter.
Beispiel
Cholesterlnbestlmmung
Die Bestimmung wird auf einem handelsüblichen Analysenautomatcn mit durch Luftblasen segmentlerten Proben durchgeführt.
a) Übliche Menge Das Verfahren verlauft nach folgenden Reaktionsgleichungen:
Cholesterinester , cho|csterjn + FeUsäure Cholesterin + O2 cho|estenon + H?0;|
H2O2 + Phenol + 4-Aminoantipyrin
4-Aminoantipyrin
CH3
NU,
C„HS CH3 J, O
chinoider Farbstoff:
CH3
chinoider Farbstoff
Das Verfahren wird unter Verwendung einer Lösung mit nachstehenden Konzentrationen bzw. Aktivitäten durchgeführt:
0,4 M Kailumphosphatpuffer, pH = 7,2; 4% Methanol (v/); 0,4% Hydroxlpolyathoxldodecan; 0,6 mg 4-Amlnoantlpyrln/ml; >0,l U/ml Cholesierlnoxldasc; > 2,5 U/ml Peroxldase; 1,2 mg/ml Phenol.
Das Fließschema Ist aus Flg. 1 der beigefügten Abbildung zu ersehen.
b) erfindungsgemäßes Verfahren 40 Es werden folgende Reagentlen verwendet:
Reagens 1: 0,4 M Kaliumphosphatpuffer. pH = 7,2; 4% Methanol (v/v); 0.1 U/ml Cholesterlnoxldase; 0,1 U/ml
Cholesterinesterase; 2,5 U/ml Peroxldase.
Reagens 2: 1,2 g 4-Amlnoantlpyrln, 0,6 g Phenol. 5 ml Hydroxlpolyäthoxldodecan In 100 ml bldest. Wasser.
Gemäß dem In Flg. 2 der Zeichnung dargestellten Fließschema wird ein Lösungskreislauf eingerichtet, In dem ein mit 20 g Holzkohle beschickter Reaktor angeordnet Ist. Die Holzkohle wurde 2 Std. In einer 6%igen Albuminlösung Inkubiert und anschließend In eine senkrecht stehende SSuIe, die als Reaktor dient, gefüllt. Das Reagens, das den wahrend der Reaktion gebildeten chinolden Farbstoff enthalt, lauft Ober die Säule. Dort werden der Farbstoff sowie 4-Amlnoanilpyrln sowie teilweise Phenol und Hydroxipolyäthoxldodecan adsorbiert. Die Enzyme laufen ungehindert durch. Reagens 2 wird kontinuierlich zugesetzt, urn die notwendigen Konzentrationen an Phenol, 4-Amlnoantlpyrln und Detcrgcns aufrechtzuerhalten.
Mit dieser Arbeitsweise konnte unter Verwendung von 30 ml Reagens 1, die Im bekannten Verfahren für 30 min Laufzeit entsprechend 30 Bestimmungen ausreichen, das Verfahren 390 min lang durchgeführt werden, ohne daß ein Nachlassen der Enzymaktivität zu beobachten gewesen wire. Wahrend dieser Zelt wurden 130 wäßrige Cholesterlnstandards mit je 50 bis 400 mg Cholesterin/100 ml und 140 Serumproben mit unveränderter Richtigkeit analysiert. Die restliche Zelt wurde für die Beobachtung der Grundextinktion der Reagentlen (= BaslsUnle) verwendet. Hierbei konnte keine Veränderung festgestellt werden, woraus folgt, daß der chinolde Farbstoff quantitativ adsorbiert wurde.
Die Enzyme wurden bei diesem Versuch I3mal wiederverwendet und damit der Anteil der Enzymkosten, die an den Kosten dieses Tests etwa zwei Drittel ausmachen, um den Faktor 13 gesenkt.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
ψ 'iä.

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur enzyimtlschen Analyse durch enzymatlsche Umsetzung der zu bestimmenden Substanz und Messung der Zunahme bzw. Abnahme eines Rcakllonspartners der Haupt-' oder einer nachgeschalteten ' HÜfsreaktlon, wobei einer Im Kreislauf geführten Lösung, welche das zur Umsetzung notige Enzym und gegebenenfalls Hllfsenzyme sowie Hllfsstoffe gelost enthalt, eine die zu bestimmende Substanz enthaltende Probelösung zugesetzt und ein bestimmter Reaktionspartner gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung nach der Messung durch einen mit einem Adsorbens beschickten Reaktor geleitet wird, welcher das gemessene Reaktionsprodukt vollständig aus der Losung entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß In der Losung verbrauchte Bestandteile ergänzt werden, nachdem diese den Reaktor durchlaufen hat.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein zu messendes Reaktionsprodukt zur Messung teilweise aus dem Losungskreislauf abdlalyslert und der nicht abdlalyslerte Anteil dieses Produktes entfernt wird.
"
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Adsorbens
Aktivkohle verwendet wird.
S. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Konstanthaltung des Volumens der Krelslauilosung überschüssiges Lösungsmittel kontinuierlich oder Intermittierend abgetrennt wird, Insbesondere durch umgekehrte Osmose.
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