JPS62232555A - 酵素センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、試料中のグルコースやアデノシン−５′−三
リン酸（ＡＴＰ）などの濃度測定に用いられる酵素セン
サに関するものである。

（従来の技術） 酵素センサは９分子やイオンなどの特定の化学種を選択
的に識別する酵素と、酵素反応によって消費あるいは生
成する物質の濃度変化又は熱量変化を測定するトランス
デユーサとからなり、目的成分を迅速かつ簡便に測定で
きるセンサとして。

さかんに開発がおこなわれている。トランスデユーサと
しては、ガス電極やイオン選択性電極などの電気化学デ
バイスを用いたものが、臨床化学検査分野や食品工業分
野などで適用されている。また、最近では酵素センサの
微小化や集積化が種々の分野で要望されるようになり、
トランスデユーサとして半導体デバイスを用いたもの、
とくにイオン感応性電界効果トランジスタ（ＩＳＦＥＴ
）を用いたものが注目されている。さらに、酵素反応に
伴う熱の出入を測定するため、熱測定デバイスとしてサ
ーミスタをトランスデユーサとした酵素センサも研究さ
れている（蛋白質　核酸　酵素。

Ｖｏｌ　３０．　Ｎ１４．　Ｐ２４５〜Ｐ２９Ｂ　（１
９８５））。

この中でもグルコースを測定するための酵素センサは最
も数多く研究されており、トランスデユーサとして電気
化学デバイス、半導体デバイス又は熱測定デバイスを用
いた酵素センサの研究もなされている。電気化学デバイ
スをトランスデユーサとして用いたグルコース測定用酵
素センサは。

酵素としてグルコースオキシダーゼを用いたものが開発
されており、グルコースがグルコースオキシダーゼの作
用により酸素を消費して過酸化水素とグルコノラクトン
を生成する反応を利用しているため９次の２種の酵素セ
ンサがある。１つは。

試料中のグルコース濃度と比例する酸素の消費量を酸素
電極で検出する酵素センサであり、さらに１つは、試料
中のグルコース濃度と比例する過酸化水素の生成量を過
酸化水素電極により検出する酵素センサである。また、
上記のようなグルコースオキシダーゼの作用により変化
する酸素あるいは過酸化水素の量を、半導体デバイスの
１つであるｌ５ＦＥＴを用いて測定する酵素センサも知
られている。さらには酵素としてヘキソキナーゼを用い
、ヘキソキナーゼの作用によりグルコースとＡＴＰが反
応し、グルコース−６−リン酸とアデノシン−５′−二
リン酸（ＡＤＰ）が生成するに伴い発生する熱量をサー
ミスタで測定する。いわゆる熱測定デバイスをトランス
デユーサとするグルコース測定用酵素センサも知られて
いる〔蛋白質　核酸　酵素、　Ｖｏｌ　３０．　Ｎａ４
．Ｐ２４５〜Ｐ２９Ｂ（１９８５））一方、ＡＴＰを測
定するための酵素センサは。

酵素としてグルコースオキシダーゼとへキソキナーゼを
用い、グルコースに対してグルコースオキシダーゼとへ
キソキナーゼとの競合反応の割合がＡＴＰの量によるこ
とを利用するＡＴＰ測定用酵素センサが提案されている
（特開昭６０−１７３４７号公報参照。）。

また、ＡＴＰ加水分解酵素（ＡＴＰａｇｅ）がＡＴＰを
加水分解し、水素イオンを生成することを利用し、その
ｐＨ変化をｌ５ＦＥＴで検出するＡＴＰ測是用酵素セン
サも知られている〔日本化学会第５０春季年会、講演予
稿集１　、　　Ｐ　６０４　（１９８５年）及び電気化
学協会５２回大会、講演予稿集Ｆ−４゜Ｐ７（１９８５
年）〕。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の技術で述べたグルコース測定用酵素センサあるい
はＡＴＰ測定用酵素センサは、グルコースオキシターゼ
、ヘキソキナーゼあるいはＡＴＰａｓｅを用いたもので
あるが、グルコースオキシダーゼを用いた酵素センサに
は、溶存酸素の不足により応答時間が長くなるという共
通の問題点がある。また、酸素電極で検出する酵素セン
サでは。

過酸化水素が分解して酸素に変換するために生ずる誤差
、過酸化水素電極により検出する酵素センサでは、試料
中に共存する還元物質による妨害などが大きな問題とな
っている。さらにヘキソキナーゼを用いた酵素センサに
は、ヘキソキナーゼがグルコース以外にもマンノースや
フルクトースにも作用するがため、グルコースだけの正
確な測定ができないという問題点がある。

とくに、これらの酵素センサは、いずれも長時間使用し
ていると応答が遅くなるとともに、検出率が徐々に低下
するという大きな問題点を有している。

また、ＡＴＰａｇｅを用いた酵素センサはＡＴＰａｓｅ
がすぐに失活したり、測定範囲が非常に狭いなどの問題
点を有している。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく鋭意研究
した結果、酵素としてグルコキナーゼを用いた酵素セン
サが長期間使用しても応答時間が遅くならないとともに
、検出率も低下しないということを見出し９本発明を完
成した。

すなわち９本発明は、基質に特異的に作用する固定化酵
素と、酵素反応によって消費あるいは生成する物質の濃
度変化又は熱量変化を電気信号に変えるトランスデユー
サとからなる酵素センサにおいて、酵素がグルコキナー
ゼであることを特徴とする酵素センサを要旨とするもの
である。

本発明に用いられるトランスデユーサとしては。

電気化学デバイス、半導体デバイスあるいは熱測定デバ
イスなどいずれも使用することができるが。

なかでも微小であり、集積化も容易な半導体デバイスの
１つであるｌ５ＦＥＴを使用するのが好ましい。

また、グルコキナーゼとしては、微生物由来のもの、動
物由来のものなど各種のものを使用することができるが
、なかでも最適生育温度が５０℃ないし８５℃である微
生物の産生ずるものが好ましい。そのような微生物とし
ては２例えばバチルス・ステアロサーモフィルス、バチ
ルス・サーモプロテオリテイクス、バチルス・アシドカ
ルダリウスなどのバチルス属、サーモアクチノマイセス
属、サーマス属、サーモミクロビウム属などの微生物が
あげられる。これらの中でもとくに好ましい微生物とし
ては、バチルス・ステアロサーモフィルスがあげられ、
その具体例としてはＡＴＣＣ？９３３．７９５４．１０
１９４　、１２９８０　、　ＮＣＡ　１５０３．ＵＫ５
６３株（微工研菌寄第７２７５号、ＦＥＲＭＰ−７２７
５、昭和５８年９月２９日寄託）などがある。

本発明におけるグルコキナーゼは、膜状１粒状。

繊維状、中空糸状、チューブ状などの水不溶性担体に固
定化した状態で使用する。このようにグルコキナーゼを
固定化した水不溶性担体で各種反応器、すなわち攪拌型
、充填型、流動型、前型などの反応器を形成し、それら
をフローシステムの中に組み入れ１反応器からの流出液
を電極感応面に導く方法を採用することもできるし、ま
た電極の感応面に、膜状の水不溶性担体に固定化したグ
ルコキナーゼを直接被覆する方法も採用することができ
る。とくに、後者の固定化グルコキナーゼを電極感応面
に直接被覆する方法が、酵素センサの微小化および集積
化の点で好ましい。

このときの被覆膜は薄いほど応答時間が速くなるため１
例えば１〜１００μ、好ましくはｌＯ〜５０μの厚さに
すればよい。

本発明でグルコキナーゼを水不溶性担体に固定化させる
には、たとえば８千畑一部署「固定化酵素」講談社（１
９７５）に記載されているような従来より公知の共有結
合法や吸着法を採用することができ）シ、また架橋化法
あるいは包括法などいずれの方法も採用することができ
る。

共有結合法としては、たとえばアガロースやデキストラ
ンなどを臭化シアンで活性化し、これにグルコキナーゼ
のアミノ基を結合させるペプチド法、芳香族アミノ基を
有する水不溶性担体を亜硝酸塩によりジアゾニウム塩と
し、これにグルコキナーゼのチロシン残基をカップリン
グさせるジアゾ法、アミノ基を有する水不溶性担体にグ
ルタルアルデヒドを結合させ、これにグルコキナーゼの
アミノ基を結合させるシッフ塩基形成法、水酸基を有す
る多孔性ガラス、シリカ、金属酸化物をγ−アミノプロ
ピルトリエトキシシランでアミノシラン化し、グルタル
アルデヒド処理し、これにグルコキナーゼのアミノ基を
結合させる方法などがあげられる。

吸着法としては、たとえばＤＥＡＥ−セルロースやフェ
ノキシアセチルセルロースなどの水不溶性担体に、グル
コキナーゼをイオン結合的あるいは物理的な力で固定化
する方法があげられる。

架橋化法としては、たとえばグルコキナーゼとアルブミ
ンのアミノ基をグルグルアルデヒドで架橋して固定化す
る方法があげられる。

包括法としては、たとえばアクリルアミドモノマーに架
橋剤であるＮ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、重
合開始剤であるリボフラビン、ベルオキソニ硫酸塩１重
合促進剤であるＮ、Ｎ、Ｎ’。

Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンなどをグルコキナ
ーゼ溶液に加えて窒素気流中で光照射して重合させてグ
ルコキナーゼを包括固定化する方法。

コラーゲンフィブリル懸濁液にグルコキナーゼを加えて
テフロン板上に薄く広げて風乾する方法。

コラーゲンとグルコキナーゼの懸濁液に２枚の白金電極
を挿入し２両極間に直流電圧を印加して陰極板上にグル
コキナーゼを含むコラーゲン膜を形成させて固定化する
方法などがあげられる。

本発明の酵素センサを用いてグルコースを測定するには
、たとえば固定化グルコキナーゼを充填した反応器に、
マグネシウムを含む塩とＡＴＰとを溶解した緩衝液を流
通し１反応器からの流出液をトランスデユーサで検出し
、試料としてのグルコース溶液の添加により生ずる検出
量の変化を測定してもよいし、あるいは固定化グルコキ
ナーゼをトランスデユーサ感応面に直接被覆したものを
。

マグネシウムを含む塩とＡＴＰとを溶解した緩衝液に浸
し、試料としてのグルコース溶液の添加により生ずるト
ランスデユーサでの検出量の変化を測定してもよい。す
なわち１次の反応 グルコース＋ＡＴＰ グルコキナーゼ 一一一一一一一−→グルコースー６−リン酸＋ＡＤＰ＋
Ｈ”　　＋（熱ｆｉ）により生ずる　Ｈ＋によるｐ　Ｈ
変化をｐＨ電極やｌ５ＦＥＴで測定するか、あるいは熱
量の変化をサーミスタで測定することができる。

測定用の溶液としては、たとえばＡＴＰ−ｔ−０，１〜
２０ｍＭ、好ましくは０．３〜５ｍＭ、マグネシウムを
含む塩を０．５〜５０ｍＭ、好ましくは２〜３０ｍＭと
なるように５〜１００ｍＭのトリス−塩酸、イミダゾー
ル酢酸などの緩衝液（ｐＨ４〜１０、好ましくは５．５
〜９．５）に溶解したものを用いればよい。

またＡＴＰを測定するには、グルコースを測定する場合
の測定用溶液のうちＡＴＰをグルコースに代えるだけで
よい。グルコースの使用濃度としては、　０．１〜３０
ｍＭ、好ましくは０．８〜１０ｍＭを用いればよい。

また、２Ｉｌ！ｌ定温度は、グルコースあるいはＡＴＰ
いずれの測定の場合も、５〜７５℃、好ましくは１５〜
５５℃が用いられる。

（作用） 本発明の酵素センサは１次の反応 グルコース＋ＡＴＰ により生ずる。ＨｏによるｐＨ変化をｐＨ電極またはＩ
　Ｓ　Ｆ　Ｅ、Ｔで検出するか、あるいは熱量の変化を
サーミスタで検出することにより構成され。

グルコース濃度の測定だけでなくＡＴＰｔ１度も測定す
ることができる。

（実施例） 次に２本発明を実施例によって具体的に説明する。、・ 実施例１．比較例１．２ バチルス・ステアロサーモフィルス由来のグルコキナー
ゼ２０μ１（２３ユニツト）と２５Ｗ／Ｖ−％の牛血清
アルブミン溶液２μＥを混合し、その混合液２μｌをｌ
５ＦＥＴのゲート上に滴下した。

ついで、２０分間室温で風乾したのち、ＩＷ／Ｖ−％の
グルタルアルデヒド溶液２μｌをゲート上に滴下し、４
℃で一昼夜反応させて固定化膜を形成させた。これを０
．１Ｍグリシン−力性ソーダ緩衝液。

ｐ　Ｈ８，５，に１５分間浸し最後に蒸留水で洗浄する
ことにより、グルコキナーゼを固定したｌ５ＦＥＴを調
製した。

ついで、２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，０，
２０ｍＭの塩化マグネシウムおよび°４ｍＭのＡＴＰか
ら成る反応溶液の２５ｍｊ！に、第１図に示すごとく、
グルコキナーゼ固定化ｌ５ＦＥＴＩおよび対象としてグ
ルコキナーゼを固定化していないｌ５ＦＥＴ（対照用ｌ
５ＦＥＴ）２を浸し。

さらに溶液の電位を一定に保つため、　　Ａｇ／＾ｇｃ
ｌ電極３を浸した。これらの各電極は第１図に示した測
定回路を形成し２両ｌ５ＦＥＴのソース・ドレイン間の
電圧は３．ＯＶに、またＡｇ／ＡｇＣｌ！電極への印加
電圧は６．５Ｖとした。これにグルコース溶液を添加す
ると、ｌ５ＦＥＴ界面で反応がおこり１局部的にｐＨが
変化するので、２本のｌ５ＦＥＴの差動出力値として測
定することができる。

なお、温度は３０℃一定とし、また反応液の攪拌は２０
Ｏｒｐｍ一定にて行った。

試料として用いたグルコース溶液の濃度を２゜５、　１
０．　３０．１００および２００　ｍｇ／ｊにて行い。

それぞれで得られた差動出力との関係を第２図に示した
。このようにグルコース濃度２〜２００　ｍｇ／〃の範
囲において良好な応答性を示し２本酵素センサによるグ
ルコース定量が可能であることが判明した。

次に本酵素センサの長期保存安定性をみるために、３７
℃にて１力月、３カ月および６力月放置した後に、いず
れも１０　ｍｇ／ａのグルコース溶液を用いて測定を行
なった。それぞれの応答時間とグルコース検出率は１表
１に示す通りであった。

また、比較のため、バチルス・ステアロサーモフィルス
由来のグルコキナーゼを酵母由来のへキソキナーゼに代
えた酵素センサを上記同様にして長期保存安定性を調べ
た。その結果も表１に示した（比較例１）。

さらに比較のため、グルコースオキシターゼを膜状にて
過酸化水素電極に固定化した市販の酵素センサを上記と
同様に長期保存安定性を調べた。この結果も表１に合せ
て示した（比較例２）。

表１ 表１から本発明の酵素センサが他の酵素センサに比べ驚
くほど安定であることが明らかである。

実施例２ 実施例１の反応溶液の１成分である４ｍＭのＡＴＰを１
２ｍＭのグルコースに代え、かつ測定対照のグルコース
をＡＴＰに代え、その濃度を５０．１００．２００．３
００及び５００■／ｄ！にて行った以外は実施例１と同
様に得られる差動出力との関係を求めた。

その結果を第３図に示した。Ａ　Ｔ　Ｐ　ｔｌＡ度５０
〜５００■／ｄ１の範囲において良好な応答性を示して
おり１本酵素センサによるＡＴＰ定量が可能であること
が判明した。

（発明の効果） 本発明の酵素センサは、試料中のグルコースの精密な測
定を可能にするだけでなく、同一センサでのＡＴＰの精
密な測定も可能にし、かつ長期間使用しても応答時間が
ほとんど変わらず、検出率の低下もごく僅かなものであ
るというすぐれた性能を有している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、グルコキナーゼ固定化ｌ５ＦＥＴＩ。 グルコキナーゼを固定していないｌ５ＦＥＴ２およびＡ
ｇ／Ａｇ　Ｃ１電極３から成る測定回路を示す図であり
、第２図はグルコース濃度と差動出力との関係を示す図
で、第３図はＡＴＰ濃度と差動出力との関係を示す図で
ある。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）基質に特異的に作用する固定化酵素と、酵素反応
   によって消費あるいは生成する物質の濃度変化又は熱量
   変化を電気信号に変えるトランスデューサとからなる酵
   素センサにおいて、酵素がグルコキナーゼであることを
   特徴とする酵素センサ。
2. （２）基質がグルコースである特許請求の範囲第１項記
   載の酵素センサ。
3. （３）基質がアデノシン−５′−三リン酸である特許請
   求の範囲第１項記載の酵素センサ。