DE3010119A1 - Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren - Google Patents

Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren

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DE3010119A1
DE3010119A1 DE19803010119 DE3010119A DE3010119A1 DE 3010119 A1 DE3010119 A1 DE 3010119A1 DE 19803010119 DE19803010119 DE 19803010119 DE 3010119 A DE3010119 A DE 3010119A DE 3010119 A1 DE3010119 A1 DE 3010119A1
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Michael Dipl Chem Dr Jaenchen
Dorothea Dipl Biol Pfeiffer
Klaus Dipl Biol Dr Riedel
Frieder Dipl Chem Dr Scheller
Oda Scheller
Ingrid Seyer
Martina Siepe
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Akademie der Wissenschaften der DDR
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
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    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
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Description

Enzymelektrode zur Bestimmung von Kofaktoren Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Enzymelektroden zur Bestimmung der Konzentration von Kofaktoren insbesondere ATP oder NAD(P). Mit solchen Elektroden kann auf der Basis der ATP- oder der ITAD(P)-Messung die enzymatische Aktivität von ATPasen und von Kinasen oder Dehydrogenasen sowie die Konzentration deren Substrate z.B. Glyzerol, Kreatinin, laktat, Alkohol und die Keimzahl in physiologischen und Fermentationslösungen besLimmt werden. Sie sind besonders für den Einsatz im klinischen Labor, der Mikrobiologie, der Nahrungsgüterwirtschaft sowie der Arzneimittelforschung geeignet.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Eine bekannte Methode zur ATP-Bestimmung beruht auf der ATP-abhängigen Lumineszenz von Luciferin in Gegenwart von Luciferase. Der Nachteil dieser Methodik liegt in dem großen apparativen Aufwand (Flurometer) sowie dem hohen Preis von Luciferin und Luciferase.
Eine andere Methode koppelt die Reaktionen von Hexokinase und Glukose-6-Phosphatdehydrogenase, wobei das in der ersten Reaktion entstehende G-6-E unter Bildung von NADPH oxidiert wird. Die Messung der ATP-Konzentration erfolgt über die spektralphotometrisch gemessene NADPH-Menge. Der Nachteil dieser
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Methode liegt in der Notwendigkeit eines Spektralphotometers sowie des Verbrauchs von NADP in jeder Messung (Handbook of Enzymatic Methods of Analysis, G. Quilbault, M. Dekkerlnc, New York 1976).
Die verbreitete Methode zur Bestimmung der NAD(P)-Konzentration ist der optische Test. Er beruht auf der Messung der UV-Absorption des Reduktionsproduktes NAD(P)H bei 340 nm. Diese Methode wird auch zur Konzentrationsmessung der Substrate NAD(P)H-abhängiger Dehydrogenasen angewandt.
Die elektrochemische Messung der NAD(P)-Konzentration ist nur in sauerstoffreier Lösung möglich, da sich die H2O2- und die 1. NAD(P)-Reduktionsstufe überlagern. Dabei führt das Entlüften zur Denaturierung der Proteinmoleküle.
Die bekannten Enzymelektroden sind nicht zur Bestimmung von ATP oder NAD(P) geeignet. Bisher wurden nur solche Enzymreaktionen in Bi-Enzymelektroden kombiniert, bei denen Glukose aus Oligo- oder Polysacchariden gebildet wird. Dabei befinden sich beide Enzyme homogen in einer Enzymschicht verteilt.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es, eine Enzymelektrode zur Messung der Konzentration von Kofaktoren, der Aktivität kofaktorabhängiger Enzyme und der Konzentration deren Substrate zu entwickeln. Dabei sollen billige Enzyme umgesetzt und kurze Meßzeiten erreicht werden.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch,Kombination von Enzymen in einer Enzymelektrode, ein ''Signal zu erhalten, das von der Konzentration eines Köfaktors abhängt.
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Die Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode dadurch gelöst, daß neben Glukoseoxidase (GOD) für die ATP-Mesaung Hexokinase (HK) und für die NAD(P)-Bestimmung Glukosedehydrogenaae (GDH) gemeinsam in einer Schicht vor einer üblichen Sauerstoffelektrode angeordnet sind und der Meßlösung eine definierte Menge Glukose zugesetzt wird. In Abwesenheit von ATP oder HAD(P) tritt durch die Glukoseoxidation ein Op-Verbrauch auf, der der zugesetzten Glukosemenge proportional is* (Prinzip der Glukoseelektrode, F. Scheller et al., Z. med. Lab. Diagn. 18, 312 (1977)). Bei Zugabe von ATP oder NAD(P) zu dieser Lösung wird ein Teil der Glukose durch HK oder GDH verbraucht, so daß eine Verkleinerung des Signals für Glukose auftritt, die von der ATP- oder NAD(P)-Menge abhängt:
Glukose + Op + HpO ■ ■ Glukonsäure
GOD
(Indikatorreaktion)
HK
Glukose ■»- ATP ► G-6-P +· ADP
GDH
Glukose -ι- NAD(P) ·> Glukonsäure -H NAD(P)H
+ H2O
Die erfindungsgemäße Enzymelektrode erlaubt sowohl die kontinuierliche als auch die punktweise Bestimmung der ATP- oder NAD(P)-Konzentration mit einfachen Geräten (pOp-Meter). Damit ist auch die Bestimmung des Verbrauchs an ATP oder .NAHP) möglich. Die ATP-Messung erfordert nicht den Zusatz eines weiteren Kofaktors, wie bei den bekannten Verfahren.
Die Bestimmung von Substraten von Kinasen oder Dehydro genasen kann über die Messung des in der Lösung gebildeten oder verbrauchten ATP bzw. NAD(P) erfolgen, wobei die für das jeweilige Substrat spezifische Ki-
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. 5-
aase oder Dehydrogenase und der Kofaktor (NAD(P) oder NAD(P)H bzw. ATP oder ADP) der Meßlösung zugesetzt sind. Zur Bestimmung der Substratkonzentrationen ist es zweckmäßig, daß die Enzymschicht zur GOD und HK oder GDH zusätzlich mit der für das jeweilige Substrat spezifischen Kinase (z.B. Glyzerol- oder Kreatininkinase) oder Dehydrogenase (z.B. Laktat- oder Alkoholdehydrogenase) versehen ist.
Die Kofaktorbestimmung mit der erfindungsgemäßen Enzymelektrode ist auf Grund der einfachen Durchführbarkeit für den Souiinebetrieb mit einer hohen Analysenfrequenz geeignet.
Ausführung^ eis pi el e
Die Erfindung soll nachstehend an 5 Ausführungsbeispielen erläutert werden.
1. Beispiel
2000 U GOD und 300 U HK werden in 0,3 ml Lösung von 5 mg Anrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von
8 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und photopolymerisiert. Ein 3 σ 3 ■ großes Filmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelbar vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert. Über die Enzymschicht wird ein Dialyseschlauch mit einem 0-Ring über den Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6 mit 10 mM MgCl2 und ist an ein pOp-Meter mit Schreiber angeschlossen.
Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hat, wird eine Menge an Glukose zugegeben, so daß die Konzentration in der Meßlösung 0,5 mM beträgt. Nach 2 Minuten ist der stationäre Stromwert erreicht und es erfolgt 8 mal die Zugabe von jeweils 0,25 mM ATP (Aufnahme
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der Eichkurve)· Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung dea Glukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach ATP-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt. Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete.
Zur Messung der ATP-ase-Aktivität wird eine lösung, die 0,5 mM Glukose und 2 mM ATP enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitzt, wird die ATP-ase-Probe zugegeben. Durch die Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die ATP-Konzentration verkleinert wird. Aus der Eichkurve kann damit die ATP-ase-Aktivität errechnet werden.
Der Zusatz von ATP-ase-Hemmern, z.B. Ouabain, ruft eine Verkleinerung des Anstiegs hervor. Durch Variation der Inhibitorkonzentration wird die notwendige Konzentration zur 50%igen Hemmung der ATP-ase ermittelt. Diese Größe ist ein Maß der Herzwirksamkeit von Medikamenten.
2. Beispiel
Eine photopolymerisierte Enzymschicht, die nur GOD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die Op-Elektrode aufgebracht. Anschliessend wird eine zweite PoIyacrylamidschicht von 100/U Dicke, die 30 U HK und 20 U Glyzerokinase je cm enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyseschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenmantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die 0,5 mM Glukose, 1 mM ATP und 1 mM MgCl2 in 0,1 M Phosphatpuffer pH 6 enthält. Nachdem sich der Strom stabilisiert hat,werden 100 ml der Glyzerol-haltigen Meß probe zugegeben. In der Enzymreaktion wird eine zur
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.11.
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Ausgangskonzentratxon an Glyzerol proportionale ATP-Menge verbraucht, die aus der Änderung des Stromes über die Eichkurve bestimmt wird. Die Messung dauert 2 Minuten.
3. Beispiel
Über den Elektrodenmantel wird ein Dialyseschlauch gespannt, auf dem eine Snzymschicht mit GOD und HK (wie in Beispiel 1) an einem zweiten Dialyseschlauch fixiert wird. Die Pt-Elektrode wird auf +600 mV gegenüber der Bezugselektrode polarisiert, so daß die H_02-Oxidation erfaßt wird. Die Elektrode ist an einen Analogdifferenzierer angeschlossen, der den maximalen Anstieg der Strom-Zeit-Kurve anzeigt.
Der Grundstrom stellt sich in 2 ml einer Pufferlösung von pH 6 mit 0,5 mM Glukose, 1 mM MgClp ein. Danach erfolgt die Zugabe von 50/ul des Filtrates der mit Trichloressigsäure behandelten Fermentationslösung. Die Geschwindigkeit d£s Stromabfalls ist der ATP-Konzentration proportional, so daß die Keimzahl über die ermittelte ATP-Konzentration erhalten wird. Bei glukosehaltigen Meßproben wird vor der ATP-Hessung mit einer nur GOD-enthaltenden Enzymelektrode die Glukosekonzentration ermittelt und bei der Auswertung berücksichtigt.
4. Beispiel
200 U GOD und 50 U GDH mit 3 U Mutarotase werden in 0,3 ml Lösung von 5 mg Acrylamid aufgelöst und auf einer Fläche von 2 cm zwischen 2 Glasplatten ausgestrichen und photopolymerisiert. Ein 3 x 3 mm großes Filmstück wird auf der Polyäthylenfolie der Clark-Elektrode unmittelber vor der Indikatorelektrode (Pt) plaziert. Über die Enzymschicht wird ein Dialyse-
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ORIGINAL JNSPECTEO
- T-
schlauch mit einem O-Ring über den"Elektrodenmantel gespannt. Die so präparierte Enzymelektrode taucht in die gerührte Meßlösung von 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6, und ist an ein pOp-Meter mit Schreiber angeschlossen.
Nachdem sich der Grundstrom eingestellt hat wird eine Menge an Glukose zugegeben, so daß die Konzentration in der Meßlbsung 0,5 mM beträgt. Nach 2 Minuten ist der stationäre Stromwert erreicht und es erfolgt 8 mal die Zugabe von jeweils 0,25 mM NAD (Aufnahme der Eichkurve). Dabei tritt jeweils eine Verkleinerung des G^ukosesignals ein, wobei nach dem steilen Abfall unmittelbar nach NAD-Zugabe der Übergang zu einem konstanten Gebiet erfolgt. Der Meßwert ergibt sich als Schnittpunkt der linearen Extrapolation beider Gebiete..
Zur Messung der LDH-Aktivität wird eine Lösung, die 0,5 mM Glukose und 1 mM NAD sowie 0,1 M Laktat enthält in die Meßzelle eingefüllt. Nachdem der Strom einen konstanten Wert besitzt, werden 20/ul der LDH-haltigen Serumprobe zugegeben. Durch die Enzymreaktion erfolgt ein Anstieg der Strom-Zeit-Kurve, da die NAD-Konzentration verkleinert wird. Aus der Eichkurve kann damit die LDH-Aktivität errechnet werden.
5. Beispiel
Eine photopolymerisierte ünzymschicht, die nur GOD enthält, wird wie in Beispiel 1 auf die Op-Elektrode aufgebracht. Anschliessend wird eine zweite Polyacrylamid schicht von 20/U Dicke, die 30 U GDH und 20 U
Alkoholdehydrogenase je cm enthält, über die GOD-Schicht gelegt und mit einem Dialyseschlauch auf der Stirnfläche des Elektrodenmantels fixiert. Diese Elektrode taucht in 5 ml temperierte Grundlösung, die
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ORIGINAL JNSPFrm=n
-Λ:
0,05 mM Glukose, 1 mli NAD in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,6 enthält. Nachdem sich der Strom stabilisiert hat, werden 100/Ul der Äthanol-haltigen Meßprobe zugegeben. In der Enzymreaktion wird eine zur Konzentration an Äthanol äquimolare NAD-Menge verbraucht und deshalb der Strom erhöht. Diese Erhöhung ergibt die Äthanolkonzentration aus der Eichkurve, die unter identischen Bedingungen aufgenommen wurde.
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Claims (5)

Erfindungsanspruch
1. Enzymelektrode zur Bestimmung von Kofaktoren insbesondere ATP oder NAD(P) mittels einer CU- oder HpOp-anzeigenden Elektrode dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrode mit einer Enzymschicht, in der Glukoseoxidase und ein kofaktorabhängiges glukoseumsetzendes Enzym sowie gegebenenfalls ein weiteres kofaktorumsetzendes Enzym homogen oder in getrennten Schichten aufgebracht und durch einen Dialyseschlauch abgedeckt ist, wobei die Meßlösung eine definierte Menge Glukose enthält.
2. Enzymelektrode zur Bestimmung von ATP nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht neben Glukoseoxidase auch Hexokinase enthält.
3. Enzymelektrode zur Bestimmung von NAD(P) nach Punkt 1 dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht neben Glukoseoxidase auch Glukosedehydrogenase enthält.
4. Enzymelektrode nach Punkt 1 und 2 zur Bestimmung von Substraten ATP-abhängiger Enzyme dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht neben Glukoseoxidase und Hexokinase zusätzlich Glyzerol- oder Kreatininkinase enthält.
5. Enzymelektrode nach Punkt 1 und 3 zur Bestimmung von Substraten NAD(P)-abhängiger Enzyme dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht neben Glukoseoxidase und Glukosedehydrogenase zusätzlich Laktatoder Alkoholdehydrogenase enthält.
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DE19803010119 1979-04-25 1980-03-15 Enzymelektrode zur bestimmung von kofaktoren Withdrawn DE3010119A1 (de)

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CA1223638A (en) * 1983-05-05 1987-06-30 Graham Davis Assay systems utilising more than one enzyme
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