DE4118880C2 - Verfahren zur selektiven Bestimmung der Konzentration gelöster Substanzen in enzymatischen Reaktionen - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur selektiven Bestimmung der Konzentration gelöster Substanzen, die bei enzymatischen Reaktionen als Substrate verwendet werden und keine dauerhaften enzymatischen Hemmwirkungen aufweisen oder als Produkte gebildet werden, durch Messung der bei der enzymatischen Reaktion auftretenden Änderung des optischen Absorptionsverhaltens des Enzyms oder des am Enzym gebundenen Koenzyms oder des Enzym-Koenzym- Komplexes oder des Enzym-Substrat-Komplexes oder des Enzym-Produkt-Komplexes.

Eine nicht geringe Zahl von Stoffen, die in Lebewesen als Ausgangsstoffe (Substrate) von enzymatischen Reak­ tionen dienen, lassen sich grundsätzlich über diese enzymatischen Reaktionen nachweisen. Bei Enzymelektro­ den bzw. Enzymsensoren wird meist entweder das gebilde­ te Produkt oder ein weiterer Ausgangsstoff der enzyma­ tischen Reaktion mit Hilfe eines Wandlers (Transducers bzw. chemischen Sonsors) nachgewiesen.

Bei einem bekannten Glukosesensor (L. C. Clark und C. Lyons, Ann. New York Acad. Sci. 102 (1962) 29) wird mit Hilfe eines amperometrischen Wandlers die Sauerstoff­ konzentration in einer Lösung gemessen, die bei Anwe­ senheit von Glukose (Substrat) und Glucoseoxidase (En­ zym) abnimmt, da bei der enzymatischen Reaktion Sauer­ stoff als Cosubstrat verbraucht wird. Als Wandler (Transducer, Transduktoren) werden in erster Linie elektrochemische, d. h. potentiometrische oder ampero­ metrische Elektroden, ionenselektive Elektroden und ionenselektive Feldeffekttransistoren (ISFETS) verwen­ det.

Ferner sind Thermistorwandler vorgeschlagen worden, bei denen eine durch die bei der enzymatischen Reaktion freiwerdende oder verbrauchte Reaktionsenthalpie er­ zeugte Temperaturänderung zur Anzeige verwendet wird.

Weiterhin sind optoelektronische Sensoren entwickelt worden. Sie haben den Vorteil einer geringen Empfind­ lichkeit gegen elektromagnetische Störfelder. Die be­ kannten Sensoren messen entweder die Fluoreszenz oder die optische Absorption von Substrat oder Reaktions­ produkt oder von insbesondere pH- oder O₂-empfindlichen Indikatorstoffen:

Zum Beispiel wird zur Bestimmung der Konzentration von Nitrophenylphosphat diese Substanz mit Hilfe einer Phosphatase zu Nitrophenol umgesetzt. Dieses Reaktions­ produkt ist gelb gefärbt und kann deshalb durch Absorp­ tionsmessung gemessen werden.

Es gibt aber zahlreiche enzymatische Reaktionen, bei denen sowohl die Ausgangssubstanz als auch die Reakti­ onsprodukte im jeweils zugänglichen Spektralbereich und insbesondere im sichtbaren Spektralbereich keine Absor­ ption aufweisen. Eine optische Absorptionsmessung ist dann allenfalls über Indikatoren möglich. Wenn sich bei der enzymatischen Reaktion der pH-Wert ändert, kann man dies mit Hilfe eines zugesetzten pH-Indikators messen. Dies Vorgehensweise ist aber in stark gepufferten Lö­ sungen mit Schwierigkeiten verbunden. Vor allem aber erreichen die auf der Messung der optischen Absorption von Substrat oder Reaktionsprodukt beruhenden Sensoren im allgemeinen nicht Empfindlichkeiten bis unter 10 µmol/l. Andererseits ist bei Sensoren, die als Enzym eine Oxidase verwenden und nach dem oben erwähnten Prinzip (Glukoseoxidase-Sensor) als Wandler eine Sauer­ stoffelektrode verwenden, der Meßbereich bei höheren Konzentrationen begrenzt, da die Sauerstoffsättigung in Lösungen bei ca. 300 µmol/l liegt.

Der ideale Meßbereich für einen Glukosesensor liegt aber zwischen ca. 1 µmol/l und einigen 100 mmol/l (Glu­ kosekonzentration in einigen Nährmedien in Bioreakto­ ren).

Aus der US-Druckschrift US-4 411 989 ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen, nämlich sogenannten Enzym-Hemmstoffen, zu entnehmen, die im Wege einer Vergleichsmessung hin­ sichtlich der unterschiedlichen Absorptionsverhalten des freien Enzyms und des mit dem Enzym-Hemmstoff ver­ bundenen Enzyms, erhalten wird. Enzym- Hemmstoffreaktionen führen jedoch zu einem irreversiblen Enzym-Hemmstoffkomplex, der in einen stabilen Zustand übergeht, so daß das Enzym nach der Verbindung für weitere Reaktionen nicht mehr zur Ver­ fügung steht. Andere Reaktionsverhalten zeigen jedoch Enzyme, die als Katalysatoren dienen und am Ende einer enzymatischen Reaktion wieder in der ursprünglichen Form vorliegen.

Aus "Angew. Chem. 103 (1991) Heft 5, 519-541, insbes. S. 536 Abschn. 3.1.3." geht hervor, daß zur Substraterkennung die Untersuchung der Eigenfloureszenz von Enzymen und deren Kofaktoren während der Enzymreaktion herangezogen werden. Das gleiche ist auch aus "GIT Fachz. Lab. 11/89, S. 1102, Abschn. 6.4" zu entnehmen. Es wird ausgeführt, daß sich während einer Enzymreaktion die Fluoreszenzeigenschaften der beteiligten Cosubstrate ändern, so daß mittels ge­ eigneter Absorptionsuntersuchungen Aussagen über das Vorhandensein von Substraten möglich sind.

In einem Beitrag von H. Gutfreund et al., Biochem. J. (1968) 106, Seiten 683 bis 687 wird der Einfluß der Konzentration von Enzymen in wässrigen Lösungen auf ihr Fluoreszenzverhalten beschrieben, das spektroskopisch erfasst werden kann.

Ebenso geht aus Biological Abstracts, BA 66: 54 722; von T. Kunikata et al.; J. Biochem. (Tokyo) 83 (1978), Seiten 1435 bis 1442 ein Verfahren zur Untersu­ chung der Bindungsplätze von Substraten anhand der Absor­ ptionsänderungen hervor, das mit Hilfe spektroskopischer Titration durchgeführt wird. Dieses bekannte Verfahren wird zur Charakterisierung von Enzymen verwendet. So ist es auf diese Weise möglich, Enzymeigenschaften zu be­ stimmten, wie beispielsweise Zahl der Bindungsplätze oder Bestimmung der Bindungskonstanten. Das genannte Ver­ fahren ist jedoch nicht dazu geeignet, Konzentrationen von Substraten oder Produkten zu bestimmen.

Aus Biological Abstracts, BA 75: 64083; von M. Arrio- Dupont, D. Verge; Eur. J. Biochem. 125 (1982) Seiten 183 bis 188 ist eine theoretische Abhandlung über die Bestimmung der Dissozationskonstanten des Enzymsubstratkomplexes anhand von Differenzspektren bei verschiedenen Substratkonzentrationen zu entnehmen. So ist die Enzymsubstrat-Komplexbildung in vielfacher Weise von den Randbedingungen einer Reaktion abhängig. Die üblichen Nachweisreaktionen von Enzymen sind daher so ausgelegt, daß möglichst definierte Bedingungen ein­ gehalten werden können (Puffersubstanz zur Konstanthaltung des pH-Wertes, Substratkonzentration weit oberhalb des sogenannten K_m-Wertes, um selbst bei geringfügig variie­ renden Reaktionsbedingungen vollständige Substrat­ sättigung, d. h. maximale Enzymsubstrat-Komplexbildung, zu gewährleisten).

Ferner sind in folgenden Beiträgen,
Angew. Chem. 103 (1991) Heft 5, Seiten 519-541, insbes. S. 533 linke Spalte 2. Absatz, Seite 536 Abschnitt 3.1.3. sowie Seiten 538/539 Abschnitt 3.7,
GIT Fachz. Lab. 11/89, Seiten 1097-1103, insbes. Seite 1098, linke Spalte 2. Absatz sowie Seite 1102 Abschnitt 5.5, Seiten 1102/1103, Abschnitt 6.4 sowie
Chimia 42 (1988), Seiten 267-271, insbes. Seite 269 linke Spalte
Verfahren beschrieben, mit denen mittels optischer Spektroskopie die Konzentration von Ezymen ermittelt werden kann.

Den vorstehend genannten enzymatischen Reaktionen haftet jedoch der Nachteil an, daß sie sehr schnell ablaufen, wodurch der Nachweis sehr kleiner Konzentrationen von Substraten nicht möglich ist.

Auch die bekannten Verfahren erlauben nicht eine Konzentrationsbestimmung von Enzymen, die bereits in niedrigen Konzentrationen vorliegen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur selektiven Bestimmung der Konzentration von gelö­ sten Substanzen anzugeben, die bei enzymatischen Reak­ tionen als Substrate verwendet oder als Produkte gebil­ det werden, bei dem sowohl geringste Konzentrationen als auch vergleichsweise große Konzentrationen nachge­ wiesen werden können, ohne daß das Verfahren gegen äußere Einflüsse und insbesondere elektromagnetische Störfelder empflindlich wäre.

Eine erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 gekennzeichnet. Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung geht von dem bekannten Grundgedanken aus, daß sich bei einer Reihe von Enzymen die optische Ab­ sorption des Enzyms bei der enzymatischen Reaktion vorübergehend ändert. Es wird deshalb die Änderung des optischen Absorptionsverhaltens zur Bestimmung der Konzentration bestimmt, wobei weder die Änderung des optischen Absorptionsverhaltens der Ausgangssubstanz bzw. des Substrats noch des Produkts der enzymatischen Reaktion oder eines Indikatorstoffes herangezogen, sondern das Absorptionsverhalten des Enzyms selbst gemessen wird, das durch einen im allgemeinen kurzlebigen Zwischenzustand bestimmt wird.

Enzyme sind Biokatalysatoren, die gemäß der allgemeinen Definition für Katalysatoren eine (bio-)chemische Reak­ tion selektiv auslösen und steuern, ohne sich selbst dabei zu verändern. Tatsächlich durchlaufen aber Enzyme häufig kurzlebige Zwischenzustände, die im allgemeinen meßtechnisch nur schwer zu erfassen sind oder nur aus der Reaktionskinetik erschlossen werden können.

Trotz der bestehenden Schwierigkeiten wird der bei einer Enzymreaktion auftretende Zwischenzustand eines Enzyms optisch erfaßt. Dies gelingt erfindungsgemäß dadurch, daß die zur Messung erforderliche Meßempfindlichkeit durch Regelung der Konzentration bzw. der Zufuhr eines Elektronen- oder Protonendonators oder -akzeptors auf einen bestimmten Bereich eingeste­ llt wird. Auf diese Weise kann der Zwischenzustand bspw. künstlich verlängert werden, was zur Messung niedriger Konzentrationen erforderlich ist oder aber weiter verkürzt werden, was zur Messung von hohen Konzentrationen vorteilhaft ist. Hierdurch gelingt es, einen Enzymsensor zu schaffen, der Substratkon­ zentrationen zwischen ca. 0,1 µmol/l und ca. 100 mmol/l selektiv messen kann.

Insbesondere kann es sich bei den im Anspruch 2 angege­ benen Zwischenzuständen nicht nur um einen energeti­ schen Zwischenzustand, wie beispielsweise einen elek­ tronisch angeregten Zustand ohne sonstige Änderungen, sondern auch um einen chemisch veränderten Zustand oder um einen anderen Konformationszustand bzw. um eine Kom­ bination aus den vorgenannten Zwischenzuständen han­ deln.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungs­ beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnung exempla­ risch beschrieben, in der zeigen:

Fig. 1 eine Vorrichtung zur Durchführung des erfin­ dungsgemäßen Verfahrens, und

Fig. 2 das Gesamtsystem.

Die Erfindung wird im folgenden am Beispiel der Messung des Substrates Glucose mittels des Enzyms Glucoseoxida­ se beschrieben:

Bei der Umwandlung von Glucose in Glucono-δ-Lacton, das dann seinerseits zu Gluconsäure hydrolysiert, wird die Glucoseoxidase reduziert und in einer sehr raschen Folgereaktion durch den gelösten Sauerstoff wieder oxidiert. Die Änderung der chemischen Konstitution des Enzyms ist grundsätzlich mit Änderungen der optischen Eigenschaften verbunden. Infolge der raschen Rückoxidation, insbesondere bei kleinen Substrat­ konzentrationen (z. B. unter 1 mmol/l), ist dieser Ef­ fekt offensichtlich bislang nicht für den selektiven Nachweis niedriger Glucosekonzentrationen angewendet worden.

Bei dem im folgenden beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist unter Ausnutzung der vorstehend be­ schriebenen Vorgangs die Bestimmung selbst kleinster Substratkonzentrationen bis herab zu weniger als 1 µmol/l möglich.

Dabei wird bei dem folgenden Ausführungsbeispiel ohne Beschränkung des allgemeinen Erfindungsgedankens eine Meßanordnung verwendet, die ein Fließinjektionssystem (flow injection analysis, FIA) aufweist.

Fig. 1 zeigt eine Meßzelle 1, die einen Strömungskanal 2 für die zu messende Substratlösung aufweist. Der Strömungskanal 2 ist durch eine selektive, d. h. für das Substrat durchlässige, für das Enzym undurchlässige Membran 3 von der Enzymkammer 4 getrennt, in der sich die Enzymlösung befindet. Die Enzymkammer 4 kann über zwei Fenster 5 mit Licht durchstrahlt werden, so daß mit Hilfe einer in Fig. 1 nicht dargestellten Licht­ quelle/Filter/Photoempfänger-Anordnung die optische Absorption gemessen werden kann. Statt der kombinier­ ten Lichtquelle/Filter kann auch ein Laser oder eine Leuchtdiode verwendet werden. Selbstverständlich kann die Zelle 1 auch an Lichtleiter, z. B. Faserlichtleiter, angekoppelt werden.

In dem gewählten Beispiel wird Licht mit der Wellenlän­ ge 450 nm eingestrahlt. Es kann aber auch eine Absorp­ tionsänderung in einem anderen Spektralbereich herange­ zogen werden, z. B. im infraroten Spektralbereich zwi­ schen 1630 und 1670 cm^-1.

Fig. 2 zeigt, daß in den Strömungskanal über ein Fließ­ injektionssystem 8 wahlweise Pufferlösung 6 oder Sub­ stratlösung 7 (d. h. die zu messende Lösung) eingespeist werden kann. Das Fließinjektionssystem 8 besteht im wesentlichen aus zwei Pumpen 9 und jeweils einem Vor­ rats- oder Probenahmebehälter 10, sowie der photometri­ schen Vorrichtung 12, die die in Fig. 1 gezeigte Meß­ zelle 1 enthält.

Substrat- und Pufferlösung können durch einen Entgaser 11 (z. B. durch Durchleiten des Substratflusses durch einen sauerstoffpermeablen Schlauch - z. B. aus einem Polysiloxan oder Polyfluorkarbon - in einem Vakuumge­ fäß) weitgehend von Sauerstoff befreit werden.

Der Strömungskanal der Durchflußküvette wird zunächst von einer Pufferlösung durchflossen. Dabei wird für die optische Absorption ein Referenzwert (Nullinie) gemes­ sen. Bei Umschalten auf die Substratlösung diffundiert Substrat in die Enzymkammer. Dadurch nimmt die optische Absorption in der Enzymkammer ab, weil nun das Enzym reduziert wird. Die Abnahmerate ist zur Substratkonzen­ tration proportional. Auf diese Weise können sehr klei­ ne Substratkonzentrationen gemessen werden bis herab zu weniger als 1 µmol/l. Durch Integration der Abnahmekurve kann die Meßempfindlichkeit erhöht werden. Nach einiger Zeit (je nach Dimensionierung nach einigen Minuten oder einigen 10 Minuten) wird wieder auf Pufferlösung umge­ schaltet und der Rückgang des Signals auf die Nullinie kontrolliert. Das Signal nimmt wieder seinen ursprüng­ lichen Wert an, wenn das Substrat wieder aus der Enzym­ kammer herausdiffundiert und Sauerstoff nachdiffundiert ist.

Will man höhere Substratkonzentrationen messen, wird ein niedrigerer Grad der Entgasung kontrolliert einge­ stellt, so daß zusammen mit dem Substrat auch eine kontrollierte Menge an Sauerstoff eindiffundieren kann. Auf diese Weise können hohe Substratkonzentrationen gemessen werden, die wesentlich größer als 1 mol/l sind.

Durch geeignete Dimensionierung der Durchflußküvette und der Enzymkammer, durch Kontrolle von Fließgeschwin­ digkeit und Sauerstoffkonzentration können Meßempfind­ lichkeit und Ansprechgeschwindigkeit in weiten Grenzen variiert werden.

Die Messung eines durch Sauerstoffentzug künstlich verlängerten Zwischenzustandes des Enzyms hat den gro­ ßen Vorteil, daß man auf diese Weise wesentlich gerin­ gere Konzentrationen messen kann als durch die direkte Messung von Ausgangssubstanz oder Reaktionsprodukt, falls diese überhaupt geeignete Absorptionsbanden ha­ ben:

Wenn man das in einem genügend großen Volumen gelöste Substrat mit einer bestimmten Enzymmenge reagieren läßt, hängt die Nachweisgrenze nicht so sehr von der Substratkonzentration sondern von der eingesetzten Enzymmenge ab. Durch Verhinderung der Rückoxidation hat man einen integrierenden Effekt. Bei geringeren Sub­ stratkonzentrationen muß man nur entweder länger inte­ grieren oder eine größere Austauschfläche (Membran, Oberfläche des Immobilierungsgels) anbieten, um ein genügend hohes Signal zu bekommen. Auf diese Weise ist es möglich, auch Konzentration zu bestimmen, die klei­ ner als 1 µmol/l sind. Für höchste Nachweisempfindlich­ keiten ist es von besonderem Vorteil, wenn die Oxidase katalasefrei ist. Das Enzym Katalase ist oft als Verun­ reinigung in Präparaten der Oxidasen enthalten.

An einem Ausführungsbeispiel für Glucose (Enzym: Gluko­ seoxidase) wurden folgende Daten verwendet bzw. folgen­ de Werte gemessen;

Als Membran 3 diente eine 20 µm dicke Dialysemembran mit einer Ausschlußgrenze von 20.000 Dalton. Die Enzym­ kammer 4 hatte in Durchstrahlungsrichtung eine Dicke von wenigen Millimetern und war mit einer gesättigten Lösung von Glucoseoxidase gefüllt. Die Glucoseoxidase stammt aus Aspergillus niger und enthält ungefähr 11 bis 16% Kohlenhydrat-Reste. Als Pumpen 9 wurden stufen­ los regulierbare peristaltische Pumpen verwendet. Sie wurden so betrieben, daß der Gesamtfluß (Puffer- und Substratlösung) konstant war, der Anteil der Substrat­ lösung am Gesamtstrom aber nach Bedarf definiert ein­ gestellt werden konnte. Als Entgaser wurde ein übli­ cherweise in der Hochdruckflüssigchromatographie einge­ setztes Gerät verwendet.

Bei Umschaltung von Pufferlösung auf Substratlösung sinkt die optische Absorption ab, und aus der Steigung kann die Glucosekonzentration ermittelt werden. Die Empfindlichkeit kann durch Wahl von Gesamtfluß, Sub­ stratlösungsfluß und Entgasungsgrad in weiten Grenzen variiert werden. In einem Beispiel wurde für einen hohen Entgasungsgrad eine Empfindlichkeit von 4 . 10⁶ lmol^-1 min^-1 für die optische Absorption gemessen, für den Entgasungsgrad Null dagegen nur 4 . 10³ lmol^-1min^-1.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist grundsätzlich für alle Enzyme geeignet, die bei der Reaktion ihr opti­ sches Absorptionsspektrum ändern und eine Empfindlichkeits­ steigerung durch Regulierung der Zufuhr des Cosubstrats (in diesem Fall Sauerstoff) ermöglichen.

Bei den Oxidasen kommt neben der Regulierung der Sauer­ stoffkonzentration auch die Möglichkeit in Betracht, anstelle von (oder zusätzlich zu) Sauerstoff andere Elektronenakzeptoren bzw. Protonendonatoren zu verwen­ den, wie z. B. Tetracyanochinondimethan, 7-Dimethylami­ no-1,2-benzophenoxazin, 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-benzo­ chinon.

Grundsätzlich wird der Zwischenzustand des Enzyms durch Kontrolle der Konzentration des Elektronen-Protonen/- akzeptors/-donators bzw. des Wasserstoffdonators/- akzeptors in seiner Lebensdauer verlängert, wodurch er optisch sichtbar wird.

Für die Regelung der Lebensdauer des Zwischenzustandes des Enzyms bzw. der Rückreaktion des Enzyms aus dem Zwischenzustand kann anstelle von Überträgersubstanzen die Elektronenübertragung (Elektronentransfer) vom Enzym zu einer Elektrode oder umgekehrt verwendet wer­ den. Die Elektronenübertragung kann entweder durch direkten Kontakt zwischen Enzym und Elektrode ermög­ licht oder durch eine leitfähige Matrix direkt oder durch Mediatormoleküle vermittelt werden. Die leit­ fähige Matrix kann zum Beispiel durch ein leitfähiges Polymer gebildet werden. In einer besonderen Ausfüh­ rungsform sind die Enzymmoleküle in ein leitfähiges Gel eingebettet, das mit der Elektrode in Kontakt steht.

Besonders geeignet sind Flavoenzyme, die Flavinaden­ indinucleotid oder Flavinmononucleotid als prosthe­ tische Gruppe enthalten. Dazu gehören z. B. Oxidasen, Dehydrogenasen, Hydroxylasen, Metalloflavoenzyme.

Anwendungen für solche Sensoren gibt es in der Biotech­ nologie, Lebensmitteltechnik, im Umweltschutz und im klinischen Bereich.

Das Prinzip der Ausnützung der optischen Absorptions­ änderung des Enzyms bei der enzymatischen Reaktion kann im Fall des gewählten Beispiels genauer definiert wer­ den als eine Änderung des am Enzym gebundenen Koenzyms oder Kofaktors. Hierbei kann man im gewählten Beispiel als das eigentliche Enzym das Protein ansehen, das die aktive Stelle für die katalytische Funktion besitzt, und das als ans Enzym gebundene Koenzym (Kofaktor) das Flavinadenindinukleotid, wobei die Absorptionsänderung in der Flavingruppe, bzw. im Isolloxazin-Ringgerüst, ihren Ursprung hat.

Wesentlich ist jedoch, daß zur Messung eine Absorptionsän­ derung des Enzyms oder des Enzym-Koenzym(Kofaktor)- Komplexes (z. B. durch eine Charge-Transfer-Bande zwi­ schen Enzym und Koenzym) oder eine Absor­ ptionsänderung des (bzw. bei der Bildung oder Auflösung des) Enzym-Substrat-Komplexes oder des Enzym-Produkt- Komplexes auftreten muß.

Claims (12)

1. Verfahren zur selektiven Bestimmung der Konzentration gelöster Substanzen, die bei enzymatischen Reaktionen als Substrate verwendet werden oder als Produkte gebildet werden, durch Messung der bei der enzymatischen Reaktion auftretenden Änderung des optischen Absorptions­ verhaltens des Enzyms oder des am Enzym gebundenen Koenzyms oder des Enzym-Koenzym-Komplexes oder des Enzym- Substrat-Komplexes oder des Enzym-Produkt-Komplexes, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßempfindlichkeit durch Regelung der Konzentraton bzw. der Zufuhr eines Elektronen- oder Protonendonators oder -akzeptors auf einen bestimmten Bereich eingestellt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Änderung des Absorp­ tionsverhaltens gemessen wird, die sich durch einen reduzierten oder oxidierten bzw. protonierten oder deprotonierten Zwischenzustand des Enzyms oder des am Enzym gebundenen Koenzyms (Kofaktors) ergibt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßempfindlichkeit durch Elektronentransfer von einer Elektrode zum Enzym oder umgekehrt auf einen bestimmten Wert eingestellt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektronentransfer zwi­ schen Enzym und Elektrode durch ein leitfähiges Polymer und insbesondere durch ein leitfähiges Gel vermittelt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende Konzen­ tration des Substrats und/oder des Produkts zwischen 0,1 µmol/l und 100 mmol/l liegt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym ein Flavo-Enzym ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym eine Oxidase ist, und daß die Konzentration des gelösten Sauerstoffs gesteuert oder geregelt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidase eine Glukose­ oxidase ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Änderung des optischen Absorptionsverhaltens Absorptionsbanden im sichtbaren Spektralbereich gemessen werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Änderung des optischen Absorptionsverhaltens Absorptionsbanden im infraroten Spektralbereich gemessen werden.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Änderung des optischen Absorptionsverhaltens Absorptionsbanden im ultravioletten Spektralbereich gemessen werden.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine je nach Bedarf ein­ stellbare Mischung aus zu messender Lösung und defi­ nierter Pufferlösung an einem enzymhaltigen, optisch durchsichtigen Teil vorbeigeführt wird, in den die zu messende Substanz eindiffundieren kann.