DE4216980C2 - Immunosensorisches Nachweisverfahren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein immunosensorisches Verfahren zum Nach­ weis von blutgruppenspezifischen Antigenen der Erythrozytenober­ fläche mittels immobilisierter spezifischer Bindungspartner anhand von Stoffwechselreaktionen.

Immunologische Verfahren zur Bestimmung von Blutgruppen unter Verwendung immobilisierter Bindungspartner sind dem Prinzip nach bekannt. Beispielsweise beschreibt die US-P 4 943 522 Vorrich­ tungen und Verfahren zur Durchführung spezifischer Bindungspaar­ untersuchungen mit immobilisierten Antikörpern, wobei die be­ schriebenen Vorrichtungen zum einmaligen Gebrauch bestimmt sind und sich besonders für den qualitativen Nachweis durch visuelle Beobachtung eignen. Weiterhin werden halb quantitative Bestim­ mungen beschrieben, die auf dem Prinzip der Verdünnungsreihe beruhen. Ferner sind nach der US-P 4 943 522 quantitative Mes­ sungen der Farbe, Fluoreszenz oder Radioaktivität unter Einsatz zusätzlicher Meßgeräte möglich.

Die DE-PS 36 17 763 beschreibt optische Vorrichtungen zur Durch­ führung immunologischer Bestimmungen, die besonders zur Bestim­ mung der ABO-Blutgruppen geeignet sind und bei denen Antikörper auf optischen Leitern gebunden vorliegen. Die Vorrichtungen sind zur quantitativen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern ge­ eignet.

Verfahren und Vorrichtungen, die auf dem SPR-Prinzip (Surface Plasmon Resonance) basieren und demnach ebenfalls den optischen Verfahren zuzuordnen sind, werden in der WO 90/05303 und der WO 90/05305 beschrieben. Bei der SPR-Technik werden Änderungen des Brechungsindex in einer Schicht nahe eines dünnen Metallfilms durch die resultierenden Änderungen der Intensität eines reflek­ tierten Lichtstrahls gemessen. Die eigentliche Nachweisreaktion kann hierbei auf einer immunochemischen Reaktion beruhen.

Aus der EP-A-215 669 ist ein Verfahren zum Nachweis von bioche­ mischen Stoffen, Mikroben und Zellen bekannt, bei dem die nach­ zuweisenden Analyte von biochemischen oder organischen Verbin­ dungen auf der Oberfläche eines piezoelektrischen Kristallbio­ sensors adsorbiert werden und der Nachweis der Analyte sowie die Bestimmung der Konzentration derselben über die Messung der Veränderung der Resonanzfrequenz des piezoelektrischen Kristalls erfolgt. Als biochemische oder organische Verbindungen können Antikörper, Antigene und Lektine eingesetzt werden.

In der DE-OS 39 16 432 ist ein Verfahren zur Konzentrationsbestimmung eines Antikörper-Antigenpaares beschrieben, bei dem ein Partner des Paares an eine Elektrode einer elektrochemischen Meßkette in aktiver Form gebunden ist und die Bestimmung durch Ermittlung der Zellspannungsänderung der Meßkette erfolgt, die nach Zugabe des Reaktionspartners in die Meßlösung durch die immunologische Reaktion zwischen den Partnern hervorgerufen wird.

Ferner beschreibt die DE-OS 38 02 452 ein Verfahren zur Blut­ gruppenbestimmung mit Hilfe der Festphasen-Methode unter Ver­ wendung blutgruppenspezifischer Antikörper, welche sich an eine Trägeroberfläche binden lassen.

Nachteilig an den bekannten Verfahren ist, daß beispielsweise bei optischen Verfahren ihr Einsatz zur Untersuchung stark ge­ färbter Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, häufig mit Problemen be­ haftet ist; der Einsatz von Radioaktivität erfordert besondere Vorsichtsmaßnahmen, was eine allgemeine Anwendung erschwert.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren mit hoher Empfind­ lichkeit für die Serologie zu schaffen, das den sicheren Nach­ weis blutgruppenspezifischer Antigene anhand von Stoffwechselre­ aktionen gestattet.

Zur Lösung der Aufgabe wird erfindungsgemäß ein Verfahren gemäß Hauptanspruch vorgeschlagen, bei dem elektrochemische Transduk­ toren, beschichtet mit Lektinen und/oder Antikörpern, als Immu­ nosensoren verwendet werden und der Nachweis anhand von Stoff­ wechselreaktionen erfolgt. Bevorzugte Ausführungsformen des er­ findungsgemäßen Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 und 3 ange­ geben.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren beruht auf der Bindung der nachzuweisenden Antigene an eine Transduktoroberfläche und dem Nachweis der Bindung der Antigene an die Transduktoroberfläche durch elektrisch gemessene Größen am Transduktor, wie zum Bei­ spiel den vom Transduktor abfließenden Strom oder die am Trans­ duktor in Bezug auf eine Referenzelektrode meßbare Spannung.

Erfindungsgemäß wird derjenige Teil des Immunosensors Transduk­ tor genannt, der den Meßeffekt erfaßt, wobei der Transduktor des elektrochemischen Verfahren elektrisch leitende Materialien umfaßt.

Bei dem erfindungsgemäßen elektrochemischen Verfahren wird das Binden der nachzuweisenden Erythrozytenoberflächen-Antigene an die Transduktoroberfläche des Immunosensors durch die Bildung elektrodenaktiver Produkte nachgewiesen, die zu einer Strom- oder Spannungsänderung führen. Wie nachfolgend näher erläutert, werden die elektrodenaktiven Produkte durch Stoffwechselreak­ tionen der Erythrozyten selbst gebildet und durch amperometri­ sche oder potentiometrische Meßverfahren nachgewiesen.

Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen einen oder mehrere der beschriebenen Transduktoren in Form von Immunosensoren, auf deren Oberfläche ein Bindungspart­ ner, d. h. ein erythrozy­ tenbindendes Lektin und/oder Antikörper, direkt oder auf einer semipermeablen Membran angeordnet sind, welche sich unmittelbar vor der Transduktoroberfläche befindet. Die Vorrichtung kann ferner eine Meßkammer mit Probenzu- und -abführung sowie die Auswertungselektronik umfassen.

Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung von blutgruppenspezifi­ schen Antigenen und damit die Bestimmung der Blutgruppen auf die nachfolgend im einzelnen erläuterte Weise.

1. Blutgruppenbestimmung

Ein mit einer erythrozytenbindenden Lektin- oder Antikörper­ schicht überzogener Sensor wird mit der zu untersuchenden Blutprobe in Kontakt gebracht. Das verwendete Lektin bzw. der Antikörper bindet Erythrozyten abhängig von ihrer Blut­ gruppe. Nach einer Inkubationszeit von 1 bis 20 Minuten wird der Sensor aus der Blutprobe entfernt und abgespült. Bei der Blutgruppe 0 erfolgt keine Bindung von Erythrozyten.

Bei den erfindungsgemäßen elektrochemischen Verfahren wird der Sensor zum Nachweis der Blutgruppenantigene der gebundenen Erythrozyten anschließend mit blutgruppenspezifischen (monoklonalen) Antikörpern oder blutgruppenspezifischen Lektinen in Kontakt gebracht, welche ggfs. enzymmarkiert sein können. Beispiele für in Betracht kommende Lektine sind: Blutgruppe B: Lektin aus Eunymus europaeus, Blutgruppe A: Lektin aus Helix aspera oder H. Pomotia, Blutgruppe A₁: Lektin aus Dolichos biflo­ rus, Blutgruppe A₂: Lektin aus Ulex europaeus. Dabei reagie­ ren die ggfs. enzymmarkierten Antikörper oder Lektine mit dem komplementären Antigenen auf der Zelloberfläche der gebunde­ nen Erythrozyten (Abb. 1), indem sie den jeweils kom­ plementären Partner binden. Zur Vermeidung der unspezifi­ schen Adsorption wird der Sensor mit einer 2%igen Kälber­ serum-Lösung "geblockt".

Monoklonale Antikörper oder Lektine für die Blutgruppen A, B′ AB und die Untergruppen A₁, A₂, Lewis und D(R_H) sind käuf­ lich erhältlich. Die Markierung der Antikörper bzw. Lektine mit den Markerenzymen kann nach Standardverfahren der Proteinchemie erfolgen.

Nach einer Inkubationszeit von etwa 5 Minuten wird die Sen­ soroberfläche zur Entfernung nicht gebundener, ggfs. markierter Antikörper abgespült.

Die Markerenzyme werden so gewählt, daß bei Zugabe des En­ zymsubstrats ein elektrodenaktives Reaktionsprodukt gebildet wird bzw. so, daß ein Substrat für die Enzymelektrode in der Reaktion entsteht. Die elektrodenaktiven Reaktionsprodukte lassen sich durch amperometrische oder potentiometrische Meßverfahren nachweisen.

Werden die einzelnen Blutgruppen (A, B, AB) und Untergruppen (A₁, A₂) nacheinander überprüft, kann für alle eingesetzten Antikörper das gleiche Markerenzym verwendet werden.

Als Markerenzyme bieten sich alkalische Phosphatase, Oxida­ sen und Peroxidasen an. Bevorzugte Oxidasen sind Glucose­ oxidase und Lactatoxidase.

Geeignete Substrate sind im Fall der alkalischen Phospha­ tase para-Aminophenylphosphat und im Fall der Peroxidase Ferrocyanid. Als elektrodenaktive Produkte werden para-Ami­ nophenol (alkalische Phosphatase), Wasserstoffperoxid (Oxi­ dasen) bzw. Ferricyanid (Peroxidase) gebildet.

Vorteilhafterweise kann die Bestimmung aller Blutgruppen gleichzeitig erfolgen. Hierbei müssen die blutgruppenspezifischen Antikörper jedoch für jede Gruppe unterschiedliche Markeren­ zyme tragen, die elektrochemisch unterscheidbare Produkte liefern und deren Substrate nicht miteinander reagieren.

Für den gleichzeitigen Einsatz von drei Antikörperspezies bieten sich z. B. alkalische Phosphatase, Lactatoxidase und β-Galactosidase als Markerenzyme an. Die Anzeige des para- Aminophenols erfolgt bei +200 mV, die Anzeige von para-Ami­ nophenol und Wasserstoffperoxid bei +600 mV. Das Reak­ tionsprodukt der β-Galactosidase wird mit einer Glucoseoxi­ dase-Elektrode bei +600 mV angezeigt.

Für die elektrochemische Anzeige der Reaktionsprodukte wer­ den die üblichen amperometrischen und potentiometrischen Elektroden eingesetzt. Die Erythrozyten-bindende semiperme­ able Membran befindet sich unmittelbar vor der Elektroden­ oberfläche, um einen kurzen Diffusionsweg der elektroche­ misch aktiven Produkte zu gewährleisten.

Bei gleichzeitiger Anzeige der Produkte mehrerer Markerenzy­ me befindet sich für jedes Produkt jeweils eine elektrisch separate Indikatorelektrode unmittelbar hinter der Lektin­ membran.

Für das oben beschriebene Verfahren lassen sich Sensoren verwenden, an deren Oberfläche erythrozytenbindende Lektine und/oder Antikörper fixiert sind. Lektine und Antikörper werden entweder auf der Elektrodenoberfläche oder auf einer semipermeablen Membran, welche sich unmittelbar vor der Elektrode befindet, immobilisiert. Die Fixierung der Anti­ körper für die Gruppen A, B, AB, A₁, A₂, Lewis und D(R_H) erfolgt dabei vorzugsweise über den F_C-Teil mittels Protein A oder durch etablierte Immobilisierungsverfahren über den Kohlenhydratteil. Vorteil dieses Verfahren ist, daß die hierbei verwendeten Antikörper bereits mit dem Markerenzym markiert sein können. Auf diese Weise wird ein zusätzlicher Reaktionsschritt zur Markierung gebundener Erythrozyten überflüssig. Der Meßeffekt wird hierbei dadurch ausgelöst, daß die Aktivität der gebundenen Markerenzyme durch die Bindung der großen Antigene an die Antikörper erniedrigt wird ("Enzym-modifizierender Immuntest"). Bei Blutgruppe 0 tritt demnach weder bei Anti A noch bei Anti B ein Meßsignal auf. Dieser "Inhibitor-Effekt" ist auch in Gegenwart der Blutprobe auswertbar, d. h. es ist kein Spülschritt vor der Messung erforderlich. Der Meßeffekt tritt nur bei dem Sensor auf, der die entsprechenden für die Blutgruppe spezifischen Antikörper trägt. Bei Blutgruppe 0 wird demnach kein Meßsig­ nal an den Enzym-Immunosensoren beobachtet.

Erfolgt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch den Nachweis von Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen, kann auf Markerenzyme ganz verzichtet werden (Abb. 2). Das Vorhandensein gebundener Erythrozyten an den jeweiligen Antikörper wird hierbei z. B. durch folgende Reaktion nach­ gewiesen:

• - In Gegenwart von Glucose und Methylblau tritt ein star­ ker Sauerstoffverbrauch auf, der sich mittels Clark- Elektrode nachweisen läßt.
• - Erythrozyten enthalten Lactat-Dehydrogenase. Diese reduziert bei pH 9 in Gegenwart von Lactat und des Mediators Phenaziniummethosulfat, Ferricyanid zu Ferro­ cyanid, das bei +50 mV an einer Platinelektrode oxi­ diert werden kann.
• -Das Hämoglobin der Blutkörperchen besitzt peroxidanti­ sche Aktivität, die durch die Oxidation reduzierter Substrate quantifiziert werden kann. Bevorzugtes Sub­ strat ist Ferrocyanid, das sich bei -400 mV an einer Platinelektrode nachweisen läßt.

Nach der Anzeige der entsprechenden elektrochemischen Signa­ le, die durch die Bindung der Erythrozyten hervorgerufen werden, lassen sich die oben beschriebenen Sensoren durch Abspalten der gebundenen Blutkörperchen regenerieren. Dazu wird entweder der pH-Wert auf 2 erniedrigt oder die Ionen­ stärke des Mediums erhöht. Die immobilisierten und gegebe­ nenfalls enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper sind für die Messung von mindestens 100 Blutproben regene­ rierbar, danach muß der Sensor erneut mit Antikörpern be­ laden werden.

Das erfindungsgemäße immunosensorische Verfahren ermöglicht es, blutgruppenspezifische Antigene sicher aus einer Blutgruppe anhand von Stoffwechselreaktionen nachzuweisen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen und Figu­ ren erläutert.

Beispiel 1

An vier 2×2 cm große Stücke einer 20 µm dicken Zellulosemem­ bran werden nach der Aktivierung mit Cyanbromid in bekannter Weise monoklonale Antikörper gegen jeweils ein bestimmtes Blut­ gruppenantigen (A, A₁, A₂, B) fixiert. Jede dieser mit Antikör­ pern beladenen Membranen werden (wie bei Enzymelektroden üblich) mit einem Haltering über eine Stabelektrode gespannt. Unmittel­ bar hinter der Membran befindet sich die Platin-Indikatorelek­ trode und eine breitflächige Gegenelektrode aus Silber, die mit AgCl überzogen ist. Jede Stabelektrode mit Haltering wird in eine Mikrodurchflußzelle eingesetzt, anschließend werden die vier Durchflußzellen mit kurzen Schläuchen (Durchmesser etwa 1 mm) miteinander verbunden. Durch diese Meßzellenkombination wird 2%iges Kälberserum zum Blocken der Membranoberfläche und anschließend physiologische Kochsalzlösung (0,25 bis 0,5 ml/min) gepumpt und die Platinelektrode auf -600 mV gegen die AgCl/Ag- Elektrode mit einem Potentiostaten polarisiert. Nach einer Ein­ laufzeit von 20 Minuten hat sich der Strom der Elektrode stabi­ lisiert. Nun werden 200 µl unverdünntes Blut in die vier Meßkam­ mern gepumpt und der Fluß für 10 Minuten gestoppt, um die spezi­ fische Wechselwirkung der auf der Membran fixierten Antikörper mit den Erythrozyten zu ermöglichen. Danach wird das Blut aus den Meßzellen mit physiologischer Kochsalzlösung ausgespült. Nach 2 Minuten wird 5 mM Glucose in physiologischer Kochsalzlösung, die 1 mM Phenaziniummethosulfat enthält, durch die 4 Meß­ kammern gepumpt. Nur bei der Immunoelektrode, an die Erythrozy­ ten über die jeweiligen fixierten Antikörper gebunden sind, tritt innerhalb von 30 s eine Erniedrigung des Sauerstoff-Reduk­ tionsstromes auf. Dabei sinkt der Strom von einem Ausgangswert von 80 bis 150 nA auf 20 bis 40 nA ab.

Aus der Kombination der vier Meßwerte ergibt sich die Blutgruppe des untersuchten Bluts.

Blutgruppe A: nur Signal bei Elektrode mit Anti A
Blutgruppe B: nur Signal bei Elektrode mit Anti B
Blutgruppe 0: kein Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe AB: Signal bei Elektrode mit Anti A und Anti B
Blutgruppe A₁: Signal bei Elektrode mit Anti A₁

Nach der Messung erfolgt die Regenerierung der Immunomembran, indem die Mikromeßkammern mit Glycin-HCl-Puffer pH 2 für zwei Minuten gespült werden. Danach beginnt ein neuer Meßzyklus.

Beispiel 2

Auf die Oberfläche von Kohleelektroden (Querschnitt 1 mm) werden nach der bekannten Carbodiimid-Methode blutgruppenspezifische Antikörper gegen die Gruppen AB bzw. B fixiert. Diese Antikörper tragen als Markerenzym alkalische Phosphatase, die nach bekann­ ten Verfahren, z. B. mittels Glutaraldehyd, an das Antikörpermo­ lekül gebunden wurden.

Die beiden Immunoelektroden werden in eine Durchflußzelle mit einer antikörperfreien Vergleichs- und drei Gegenelektroden ein­ gebracht. Die Meßzelle wird von physiologischer Kochsalzlösung durchströmt, die 1 mM Aminophenylphosphat enthält und die Immu­ no- und die Vergleichselektrode werden auf +200 mV polarisiert. Nach etwa 10 Minuten erreicht der Strom einen stationären Wert von 50 bis 200 nA. Nun erfolgt-die Injektion der zu analysieren­ den Blutprobe, die ebenfalls 1 mM Aminophenylphosphat enthält. Durch die Bindung der Erythrozyten an die enzymmarkierten Anti­ körper erfolgt eine deutliche Erniedrigung des Elektrodenstromes bei der Elektrode, die die komplementären Antikörper auf den Erythrozyten besitzt.

Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.

Beispiel 3

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wird Lektin aus Sophora japonica an eine Zellulosemembran gebunden und diese Membran vor eine Stabelektrode in eine Durchflußkammer eingebracht. Nach Polari­ sierung der Meßelektrode auf 600 mV und Stabilisierung des Stro­ mes in physiologischer Kochsalzlösung, wird die zu untersuchende Blutprobe für 10 Minuten mit der Lektin-Membran in Wechselwir­ kung gebracht und dann mit physiologischer Kochsalzlösung ge­ spült. Anschließend werden nacheinander mit Lactatoxidasen mar­ kierte Antikörper, die spezifisch für die Blutgruppen A, B und A₁ sind, in die Meßkammer gepumpt. Nach 10minütiger Inkubation wird mit einer 2 mM Lactatlösung gespült. Die Bindung der en­ zymmarkierten Antikörper an die Erythrozyten vor der Meßelek­ trode ruft einen signifikanten Stromabfall durch den O₂-Verbrauch bei der Lactatumsetzung hervor.

Auswertung und Regenerierung erfolgen analog zu Beispiel 1.

Fig. 1 zeigt eine mit einer Lektinschicht überzogene Transduk­ toroberfläche. Das Lektin L bindet den Erythrozyten spezifisch über das Blutgruppenantigen B auf der Oberfläche des Erythrozy­ ten. Zum Nachweis der Blutgruppenantigene wird der Erythrozyt mit einem enzymmarkierten blutgruppenspezifischen Antikörper in Kontakt gebracht, der ebenfalls über ein Blutgruppenantigen B auf der Oberfläche des Erythrozyten gebunden wird. Das Markeren­ zym E katalysiert die Reaktion des Enzymsubstrats S zum trans­ duktoraktiven Produkt P, das durch Diffusion an die Transduktor­ oberfläche gelangt, wo es meßtechnisch erfaßt wird.

Fig. 2 zeigt die Bestimmung gebundener Erythrozyten durch Stoffwechselreaktionen der Blutkörperchen. Der Erythozyt wird durch das an die Transduktoroberfläche fixierte Lektin L spezi­ fisch über ein Blutgruppenantigen auf der Oberfläche des Ery­ throzyten gebunden. Stoffwechselreaktionen des gebundenen Ery­ throzyten führen zur Umsetzung eines Substrates S zu einem transduktoraktiven Produkt P.

Claims (3)

1. Immunosensorisches Verfahren zum Nachweis von blutgruppen­ spezifischen Antigenen der Erythrozytenoberfläche mittels immobilisierter, spezifischer Bindungspartner, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man

• (a) einen oder mehrere spezifische Bindungspartner auf der Oberfläche eines elektrochemischen Transduktors oder auf einer semipermeablen Membran, welche sich unmittel­ bar vor der Transduktoroberfläche befindet, immobili­ siert,
• b) die Transduktoroberfläche mit einem die Erythrozyten enthaltenden Medium unter Bedingungen in Kontakt bringt, welche die Bindung der Erythrozyten an die spezifischen Bindungspartner auf der Transduktorober­ fläche zulassen, und man
• (c) die Bindung der Erythrozyten an die Transduktoroberflä­ che anhand von Stoffwechselreaktionen nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten, spezifischen Bindungspartner blutgruppen­ spezifische Antikörper oder Lektine sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man der Untersuchungsprobe Glucose und Methylenblau zusetzt und die Bestimmung anhand des Sauerstoffverbrauchs der gebundenen Erythrozyten oder anhand der in Erythrozyten enthaltenen Lactatdehydrogenase oder durch die peroxidanti­ sche Aktivität der Erythrozyten durchführt.