DE2243962B2 - Enzymelektrode - Google Patents
EnzymelektrodeInfo
- Publication number
- DE2243962B2 DE2243962B2 DE19722243962 DE2243962A DE2243962B2 DE 2243962 B2 DE2243962 B2 DE 2243962B2 DE 19722243962 DE19722243962 DE 19722243962 DE 2243962 A DE2243962 A DE 2243962A DE 2243962 B2 DE2243962 B2 DE 2243962B2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- acceptor
- enzyme
- enzyme electrode
- membrane
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
- C12Q1/004—Enzyme electrodes mediator-assisted
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft eine Enzymelektrode zur Bestimmung der Konzentration von Substanzen, die im
intermediären Metabolismus auftreten, mit einem elektrochemischen Sensor, der zusammen mit einer
semipermeablen Membran einen Bereich begrenzt, in dem Enzym und ein Akzeptor enthalten sind.
Die Messung von im intermediären Metabolismus enthaltenen Substanzen geht im allgemeinen so vor sich,
daß eine Enzymelektrode in eine Lösung getaucht wird, aus der zu messendes Substrat durch die Membran
diffundiert, die die Enzymelektrode zur Lösung hin abschließt und im Bereich einer Enzymschicht zwischen
der Membran und einem elektrochemischen Sensor eine enzymatische Reaktion eingeht Mit dem elektrochemischen
Sensor wird die Konzentration eines elektrochemisch aktiven Reaktior.steilnehmers oder -produkts
gemessen. Die gemessene Konzentration steht in einer durch Eichung der Anordnung zu ermittelnden Beziehung
mit der Substanz-Konzentration in der zu untersuchenden Lösung.
Die Erfindung beschäftigt sich mit Enzymreaktionen, bei denen rieben der Substanz und dem Enzym ein
dritter, spezifischer Reaktionspartner beteiligt ist, insbesondere mit solchen Reaktionen, in denen durch
das Enzym die Oxydation einer organischen Verbindung katalisiert wird, z. B. die Oxydation von Glukose zu fts
Glukonsäure oder die Oxydation von Lactat zu Pyruvat. Im allgemeinen ist eine solche Oxydation mit der
Reduktion eines weiteren Stoffes gekoppelt, der P +An
■ed
Hierbei bedeutet
S die Substanz,
P das Produkt der Enzymreaktion,
Ami die oxydierte und die reduzierte Form des
Akzeptors und
E das Enzym.
E das Enzym.
Mit der Enzymelektrode wird nun die Konzentration der reduzierten und oxydierten Form des Akzeptors,
Ao, oder AnA elektrochemisch bestimmt und dadurch
auf indirektem Weg ein Maß für die Konzentration der Substanz in der zu untersuchenden Lösung gewonnen.
Bei der Glukosebestimmung mit Hilfe des Enzyms Glukose-Oxidase ist beispielsweise aus der US-PS
35 91 480 die Verwendung von Sauerstoff als Akzeptor bekannt Dabei wird gemäß dieser PS zur Vermeidung
der durch Schwankungen der Sauerstoffkonzentration bedingten Störungen nicht die Sauerstoffkonzentration
selbst sondern die Konzentration des Reaktionsproduktes Wasserstoffperoxyd gemessen, und zwar indirekt
über die parallel ablaufende Reduktion der bei der Reduktion des Wasserstoffperoxyds oxydierten jodionen.
Der Akzeptor, Sauerstoff, ist in der Lösung außerhalb der Enzymelektrode enthalten. Da die
semipermeable Membran für Glukosemoleküle durchlässig sein soll, ist sie auch für das an der Messung
beteiligte Jod durchlässig, so daß dieses in relativ kurzer Zeit aus der Enzymschicht herausdiffundieren wird und
sich an das Blut anlagen. Dies ist bei ln-vivo-Messungen aus physiologischen Gründen unerwünscht und kann zu
einer Verfälschung der Meßwerte führen. Allgemein sind mit Sauerstoff als Akzeptor arbeitende Enzymelektroden
experimentell aufwendig zu handhaben und weisen eine relativ kurze Einsatzdauer auf.
Aus der Zeitschrift »Analytical Chemistry«, Vo. 42, Nr. 1, Jan. 1970, ist eine Enzymelektrode der eingangs
beschriebenen Gattung bekanntgeworden. Bei dieser Elektrode werden andere, in die zu messende Lösung
eingebrachte Akzeptoren verwendet, z. B. Benzochinon oder Hexacyanoferrat Als Membran wird eine CeIIophan-Membran
verwendet, als elektrochemischer Sensor eine Platinelektrode. Die bekannte Enzymelektrode
erfordert daß die Testlösung, z. B. eine entnommene Blutprobe, vor der Messung mit einer bestimmten
Menge Akzeptor vermischt wird. Dies erfordert einen zusätzlichen Arbeitsaufwand und bedingt, daß sich diese
Elektrode für ln-vivo-Messungen prinzipiell nicht eignet.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Enzymelektrode zu schaffen, die auch für In-vivo-Messungen
geeignet ist.
Diese Aufgabe wird mit einer Enzymelektrode der eingangs beschriebene Gattung erfindungsgemäß dadurch
gelöst, daß der Akzeptor in dem Bereich zwischen semipermeabler Membran und elektrochemischem
Sensor teilweise in ungelöster Form vorliegt.
Damit wird erreicht, daß die Konzentration deü
gelösten Akzeptors in dem Bereich, in dem auch Enzym vorhanden ist, über längere Zeit auf einem für die
Enzymreaktion ausreichend hohen Wert bleibt. Wan:
kiin solcher Überschuß des Akzeptors in ungelöster
Form vorhanden, würde eine anfänglich in der Enzymelektrode vorhandene Menge gelösten Akzeptors innerhalb kurzer Zeit durch Diffusion durch die
Membran in die Testlösung verlorengehen, so daß die Enzymelektrode funktionsunfähig würde. Bei der
erfindungsgemäßen Enzymelektrode aber geht Akzeptor aus der ungelösten Form ständig in Lösung, so Gaß
die durch DiRasion aus der Membran verlorengehende Menge durch neu aufgelösten Akzeptor kompensiert
wird. Stationär stellt sich in der Enzymelektrode eine Akzeptorkonzentration ein, die im wesentlichen durch
die Löslichkeit des Akzeptors, seine Auflösungsgeschwindigkeit sowie die Permeabilität der Membran für
den Akzeptor gegeben ist ,
Als besonders vorteilhaft hat sich herausgestellt, die
drei letztgenannten Parameter derart zu -zählen, daß
optimale Bedingungen für eine bestimmte Enzymelektrode gewährleistet sind.
Die Akzeptorkonzentration im Bereich des Enzyms wird entsprechend der jeweiligen Enzymreaktion
gewählt. Eine zu hohe Konzentration kann eine Hemmung der Enzymreaktion zur Folge haben, eine zu
geringe Akzeptorkonzentration kann eine Sättigung der Elektrodenempfindlichkeit schon bei niederen
Substratkonzentrationen bewirken. Durch geeignete Wahl der Bedingungen wird dafür gesorgt, daß die
Akzeptorkonzentration im Bereich des Enzyms über einen möglichst langen Zeitraum konstant bleibt und
nur wenig Akzeptor aus der Elektrode in die Testlösung diffundiert. Dies ist insbesondere für Invivo-Messungen
wichtig, bei dener. die austretende Akzeptormenge unterhalb der Toxizitätsgrenze liegen muß.
Als Akzeptoren kommen vor allem ein Redoxfarbstoff, ein schwerlösliches Hexacyanoferrat(lll) oder ein
monosubstituiertes p-Benzochinon in Frage.
Insbesondere ist es im Falle der Glukose-Elektrode wichtig, daß die Reduktion des Akzeptors genügend
schnell abläuft gegenüber der Reduktion von Sauerstoff, die als Konkurrenzreaktion stattfinden kann. Nur dann
kann eine durch Sauerstoff bedingte Störung ausgeschaltet werden. Die reduzierte Form des Akzeptors
muß weiter stabil und quantitativ elektrolytisch reoxydierbar sein. Der Akzeptor muß weiter die
gewünschte Löslichkeit besitzen. Im Falle einer zu hohen Löslichkeit kann jedoch durch Verwendung von
Bindemitteln (z. B. Polyvinylalkohol oder Polystyrol) oder durch Mikroverkapselung eine Verringerung der
Auflösungsgeschwindigkeit und damit eine Erniedrigung der Akzeptorkonzentration in der Enzymschicht
erreicht werden.
Solche als Akzeptoren geeignete Substanzen sind beispielsweise für die Messung von Glukose, 2,6-Dichlorphenolindophenol-Natrium,
Methylenblau, Pyocyaninperchlorat oder p-Toluchinon.
Bei der Messung von L-Lactat haben sich Chrom(lII)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(IH),
Phenolblau oder Thionin bewährt.
Die Reoxydation des reduzierten Akzeptors wird amperometrisch bestimmt. Im Idealfall besteht eine
lineare Beziehung zwischen Strom und Konzentration.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Enzymelektrode weist die Oberflache des elektrochemischen
Sensors Vertiefungen auf, in denen der ungelöste Akzeptor enthalten ist. Als elektrochemischer Sensor fts
wird beispielsweise eine Festkörperelektrode aus Platin verwendet.
nip <pittinermeable Membran muß folgende Anforde
rungen erfüllen: Sie muß für das Enzym undurchlässig sein und für die zu messende Substanz nur in geringem
Maß durchlässig sein, damit eine lineare Beziehung zwischen dem gemessenen Strom und der Substanzkonzentration in der Testlösung erhalten wird. Durch die
Verwendung einer Membran mit niedriger Permeabilität läßt sich weiterhin erreichen, daß die Eichkurve bei
geringer Substanzkonzentration unabhängig von der Enzymkonzentration innerhalb der Elektrode ist.
Dadurch wird eine Drift der Eichkurve als Folge einer zeitlichen Abnahme der Enzymaktivität innerhalb
bestimmter Grenzen vermieden.
Um trotz einer vorgegebenen niedrigen Membranpenneabilität für die Substanz eine kurze Ansprechzeit
der Enzymelektrode auf Änderungen der Substanzkon zentration zu erhalten, ist erforderlich, daß die
Membrandicke und der Verteilungskoeffizient der Membran für die Substanz klein sind, der Diffusionskoeffizient
der Membran für die Substanz dagegen möglichst groß ist, wie sich aus theoretischen Überlegungen
ergibt.
Gute Erfahrungen wurden mit Membranen aus regenerierter Cellulose, Cellulosetriacetat (verschiedener
Hydrolysegrade) oder Polyvinylalkohol gemacht.
Weiter können die Membranen je nach den speziellen Anforderungen aus einem Träger und einer semipermeablen
Beschichtung bestehen.
Im folgenden wird anhand der Zeichnung eine
Enzymelektrodc zur Glucosebestimmung und die mit dieser durchführbare Messung als Ausführungsbeispiel
der Erfindung beschrieben.
Ein als Halter dienender 2y!indrischer Kunststoff-Dlock
1 weist an einer Stirnfläche eine zylindrische Vertiefung auf, die von einem ringförmigen Vorsprung
umgeben ist. In der Vertiefung ist ein Platinzylinder 2 als elektrochemischer Sensor angebracht. Vom Platinzylinder
führt eine Anschlußleitung 3 durch den Kunststoffblock
1 nach außen und dient zum Anschluß an ein übliches Strom-Meßgerät. Die Oberfläche des Platinzylinders
liegt ca. 0,2 mm unterhalb des Randes des Vorsprungs und weist Vertiefungen zur Aufnahme des
Akzeptors, im vorliegenden Fall 2,6-Dichloroindophenol-Natrium,
auf. In dem Raum zwischen der Oberfläche des Platinzylinders und der Membran befindet sich das
Enzym Glucoseoxidase in Puffer gelöst oder an einem Trägermaterial fixiert. Eine Membran 4 aus regenerierter
Cellulose wird durch einen Haltering 5 gegen den Rand des Vorsprungs und einen außerhalb des
Vorsprungs angeordneten Gummi-O-Ritig 7 gedrückt und das ganze durch Metallstifte 6 und eine aufschraubbare
Kappe 8 festgehalten.
Zur Messung wird diese Elektrode in die thermostatierte Lösung (z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Urin usw.)
getauscht. Der Platinzylinder in der Enzymelektrode ist über eine Spannungsquelle (Polarisationsspannung 300
bis 400 mV) und ein S'rommeßgerät mit einer Referenzelektrode (z. B. eine Silberchlorid-Elektrode)
verbunden. Nach einer Ansprechzeit von 5 bis 15 Minuten je nach Membran, erhält man 95% des
L.idausschlages eines der Glucosekonzentration proportionalen
Stromes, wobei bis zu Glucosekonzentrationen von ca. 600 mg/100 ml Proportionalität herrscht
(normaler Blutzuckergehalt 90 mg/100 ml).
Die zeitliche Stabilität dieser Elektrode beträgt für eine Glucosekonzentration von 500 mg/100 ml mehr als
60 Stunden. Eine Miniaturisierung dieser Elektroden für In-vivo-Messungen ist technisch leicht durchführbar. In
diesem Fall ist zusätzlich ein Thermistor zur Tempera-
turmessung eingebaut, um den Einfluß von Temperaturschwankungen auf den Meßwert kompensieren zu
können. Selbstverständlich können mit einer entsprechenden Enzymelektrode auch andere Substrate, wie
z. B. L-Lactat, bestimmt werden. Für eine L-Lactat-Bestimmung wurde z. B. als Enzym L-Lactatdehydrogenase
(Cytochrom b2) und ais Akzeptor Chrom(III)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(III)
verwendet. Man erhält nach einer Ansprechzeit von 1 bis 3 Minuten (je nacl
Membran) 95% des Endausschlages eines der L-Lactat konzentration proportionalen Stromes, wobei bis zi
L-Lactatkonzentrationen von 180 mg/100 ml Propor tionalität herrscht (normalei L-Lactatgehalt im Blut
7 mg/100 ml). Die zeitliche Stabilität dieser Elektrodi beträgt für eine L-Lactatkonzentration von 130 mg
100 ml mindestens 8 Stunden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
1. Enzyraelektrode zur Bestimmung der Konzentration
von Substanzen, die im intermediären s Metabolismus auftreten, mit einem elektrochemischen
Sensor, der zusammen mit einer semipermeablen
Membran einen Bereich begrenzt, in dem Enzym und ein Akzeptor enthalten sind, dadurch
gekennzeichnet, daß' der Akzeptor in dem Bereich zwischen der semipermeabler! Membran (4)
und dem elektrochemischen Sensor (2) teilweise in ungelöster Form vorliegt
2. Enzymelektrode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Akzeptor ein Red^xfarbstoff,
ein schwer lösliches Hexacyanofeirat(lU) oder
ein monosubstituiertes p-Benzochinon ist
3. Enzymelektrode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß der Akzeptor für die
Substanz Glukose, 2,6-Dichlor-phenolindophenol-Natrium,
Methylenblau, Pyocyaninperchlorat oder p-Toluchinon ist
4. Enzymelektrode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet daß der Akzeptor für die
Substanz L-Lactat Chrom(lll)-hexaantipyrin-hexacyanoferrat(lll),
Phenolblau oderThionin ist
5. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet daß die Oberfläche
des elektrochemischen Sensors (2) Vertiefungen aufweist, in denen der ungelöste Akzeptor enthalten
ist
6. Enzymelektrode nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (4)
aus einem Träger und einer semipermeablen Beschichtung besteht.
üblicherweise als Akzeptor bezeichnet wird Ein derartiger gekoppelter Prozeß läßt sich durch folgende
Bruttoreaktionsgleichung beschreiben:
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CH1321171A CH559912A5 (de) | 1971-09-09 | 1971-09-09 | |
CH1321171 | 1971-09-09 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2243962A1 DE2243962A1 (de) | 1973-03-15 |
DE2243962B2 true DE2243962B2 (de) | 1977-06-16 |
DE2243962C3 DE2243962C3 (de) | 1978-02-02 |
Family
ID=
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3534717A1 (de) * | 1985-09-28 | 1987-04-02 | Draegerwerk Ag | Elektrodenanordnung fuer eine elektrochemische messzelle |
EP0311377A2 (de) * | 1987-10-05 | 1989-04-12 | Arden Medical Systems, Inc. | Sensor zum Nachweis einer dehydrierbaren chemischen Substanz |
GR880100664A (el) * | 1988-10-05 | 1994-03-31 | Arden Medical Systems Inc | Σένσορας για την μέτρηση των αφυδρογονωσίμων με ένζυμα χημικών ειδών σε υδατικά διαλύματα. |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3534717A1 (de) * | 1985-09-28 | 1987-04-02 | Draegerwerk Ag | Elektrodenanordnung fuer eine elektrochemische messzelle |
EP0311377A2 (de) * | 1987-10-05 | 1989-04-12 | Arden Medical Systems, Inc. | Sensor zum Nachweis einer dehydrierbaren chemischen Substanz |
EP0311377A3 (de) * | 1987-10-05 | 1991-01-09 | Arden Medical Systems, Inc. | Sensor zum Nachweis einer dehydrierbaren chemischen Substanz |
GR880100664A (el) * | 1988-10-05 | 1994-03-31 | Arden Medical Systems Inc | Σένσορας για την μέτρηση των αφυδρογονωσίμων με ένζυμα χημικών ειδών σε υδατικά διαλύματα. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE376082B (de) | 1975-05-05 |
FR2152219A5 (de) | 1973-04-20 |
DD100556A5 (de) | 1973-09-20 |
JPS4837187A (de) | 1973-06-01 |
GB1329520A (en) | 1973-09-12 |
US3838033A (en) | 1974-09-24 |
CH559912A5 (de) | 1975-03-14 |
DE2243962A1 (de) | 1973-03-15 |
NL156242B (nl) | 1978-03-15 |
CA978457A (en) | 1975-11-25 |
NL7210734A (de) | 1973-03-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69822949T2 (de) | Verfahren zur quantitativen Messung eines Substrats | |
DE3779967T2 (de) | Verfahren und vorrichtung fuer elektrochemische messungen. | |
DE69917372T2 (de) | Vorrichtung zur Quantifizierung von Substraten | |
DE69233537T2 (de) | Biosensor und Verfahren zur Messung einer Konzentration eines Substrats in einer Probe | |
DE68928266T2 (de) | Verfahren und vorrichtung zur amperometrischen diagnostischen analyse | |
DE1932581C3 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen Bestimmung des Glukose-Gehaltes yon biologischen Flüssigkeiten | |
EP0354441B1 (de) | Verfahren zur kolorimetrischen Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer Oxidation | |
EP0431456B1 (de) | Verwendung eines schwer löslichen Salzes einer Heteropolysäure zur Bestimmung eines Analyts, entsprechendes Bestimmungsverfahren sowie hierfür geeignetes Mittel | |
DE69429640T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Biosensors | |
DE602004003288T2 (de) | Elektrochemischer Biosensor | |
DE60205702T2 (de) | Biosensor | |
DE69714322T2 (de) | Cholesterinsensor | |
DE3788239T2 (de) | Kontrollierte Farbton-Vorrichtung. | |
DE69019149T2 (de) | Verfahren zur analyse, reagenszusammensetzung sowie deren verwendung bei der glukosebestimmung. | |
DE4003194A1 (de) | Verfahren und sensorelektrodensystem zur elektrochemischen bestimmung eines analyts oder einer oxidoreduktase sowie verwendung hierfuer geeigneter verbindungen | |
DE69919224T2 (de) | Verfahren zur bestimmung eines substrates, und biosensor | |
EP1259800B1 (de) | Enzymatisch-elektrochemische messeinrichtung | |
DE1959410B2 (de) | Indikator zur bestimmung der reduzierten pyridincoenzyme | |
DE2237940C3 (de) | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Harnsäure | |
DE68918602T2 (de) | Elektroanalytisches Verfahren. | |
DE7917122U1 (de) | Messgeraet fuer polarographische oder voltametermessungen | |
DE2243962C3 (de) | Enzymelektrode | |
DE2243962B2 (de) | Enzymelektrode | |
DD283683A5 (de) | Verfahren und apparat fuer amperometrische diagnostische analysen | |
DE69709485T2 (de) | Reagenszusammensetzung, Teststück und Testkit |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |