DE69233537T2 - Biosensor und Verfahren zur Messung einer Konzentration eines Substrats in einer Probe - Google Patents
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Description
- Hintergrund der Erfindung
- 1. Gebiet der Erfindung:
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren zum Messen der Konzentration mindestens zweier Substrate (bestimmter Bestandteile) in einer Probe unter Verwendung des Biosensors.
- 2. Beschreibung des technischen Hintergrunds:
- Verschiedene Arten von Biosensoren, welche spezifische Enzym-Katalysen verwenden, wurden in der vergangenen Zeit entwickelt. Ein Saccharid-Biosensor wird als ein Beispiel solcher Biosensoren wie nachfolgend beschrieben:
Das optische Drehung-Verfahren, das Colorimetrieverfahren, das Reduktimetrieverfahren und andere Verfahren, welche verschiedene Arten der Chromatographie verwenden, wurden als Verfahren der quantitativen Analyse von Sacchariden entwickelt. Jedoch kann keines dieser Verfahren eine hohe Genauigkeit erzielen aufgrund der relativ geringen Spezifität gegenüber Sacchariden. Zusätzlich ist das optische Drehung-Verfahren leicht durchzuführen, jedoch wird es stark durch die Betriebstemperatur beeinflusst. Deshalb ist es für die gewöhnliche Verwendung zuhause oder ähnliches nicht geeignet. - Die Saccharide, welche in einer Frucht enthalten sind, werden allgemein als Saccharin- bzw. Zuckergehalts bewertet bzw. veranschlagt. Ein Refraktometer eines Lichtbrechungssystems (light refraction system) wird oft zum Quantifizieren des Saccharingehalts verwendet. Dieses Refraktometer funktioniert durch die Nutzung der Veränderung des Lichtbrechungsindex, welcher durch die Flüssigkeitskonzentration verursacht wird. Deshalb wird das Refraktometer des Lichtbrechungssystems durch all die Bestandteile beeinflusst, welche in der Probeflüssigkeit gelöst sind, zum Beispiel durch eine organische Säure wie eine Zitronensäure oder Maleinsäure, welche in Fruchtsaft in großen Mengen enthalten ist, wenn ein Saccharid in der Frucht quantifiziert wird. Demzufolge ist eine genaue Quantifizierung bzw. quantitative Bestimmung durch dieses Refraktometer unmöglich.
- Es wird nun ein Glukosesensor als ein Beispiel eines Biosensors beschrieben, welcher im klinischen Bereich verwendet wird.
- Es ist ein herkömmliches Verfahren zum Quantifizieren von Glukose, welche in Blut enthalten ist, Blut zu zentrifugieren, welches einem Patienten abgenommen wurde, und dann das so erhaltene Blutplasma zu messen. Dieses Verfahren erfordert eine Menge Zeit und Mühe. Deshalb wird ein Sensor gewünscht, welcher direkt die Glukose in dem Blut messen kann, welches von einem Patienten erhalten wurde.
- Ein Sensor ähnlich zu einem Testpapier bzw. Teststreifen für die Harnanalyse wurde als ein einfacher Glukosesensor entwickelt. Dieser Glukosesensor weist einen Träger in einer Stab- bzw. Stiftform auf, und einen Halter, welcher an den Träger befestigt ist. Der Halter umfasst ein Enzym, welches nur mit Glukose reagiert und einen Farbstoff bzw. ein Färbemittel, dessen Farbe durch Reaktion mit einem Produkt der Enzymreaktion verändert wird. Blut wird auf dem Träger des Glukosesensors getropft und die Veränderung der Farbe des Farbstoffs nach einem vorherbestimmten Zeitraum nach dem Auftropfen visuell beobachtet oder optisch gemessen, wodurch der Gehalt an Glukose in dem Blut gemessen werden kann. Jedoch weist das Quantifizierungsverfahren unter Verwendung dieses Glukosesensors eine geringe Genauigkeit aufgrund der gegenseitigen Beeinflussung bzw. Einwirkung durch die gefärbten Materialien in dem Blut auf.
- Die
EP 0 359 831 A1 offenbart den folgenden Glukosesensor mit einer hohen Genauigkeit als ein Verfahren zum Quantifizieren eines bestimmten Bestandteiles in einer Probeflüssigkeit aus einem lebenden Körper, wie Blut, ohne die Probeflüssigkeit zu verdünnen oder zu rühren bzw. schütteln:
Der Biosensor weist eine Grundfläche bzw. Basis42 auf, und einen Abstandshalter bzw. ein Abstandsstück3 und eine Abdeckung4 , welche integral auf der Grundfläche42 , wie in den13 und14 gezeigt, laminiert bzw. geschichtet sind. - Die Grundfläche
42 weist ein elektrisch isolierendes Substrat1 , ein Elektrodensystem43 , welches auf dem Substrat1 durch Siebdruck bzw. Serigraphie, etc. ausgebildet ist, und eine Reaktionsschicht44 , welche auf dem Elektrodensystem43 vorgesehen ist, auf. Das Elektrodensystem43 umfasst eine Arbeitselektrode45 und eine Gegenelektrode46 , welche elektrisch voneinander durch eine Isolationsschicht47 isoliert sind. Die Arbeitselektrode45 und die Gegenelektrode46 sind mit Leitungen12 bzw.13 verbunden, welche auf dem Substrat1 ausgebildet sind. - Die Reaktionsschicht
44 umfasst ein hydrophiles Polymer, eine Oxidoreduktase und Elektronenakzeptoren und bedeckt die Arbeitselektrode45 und die Gegenelektrode46 . - Wie in
13 gezeigt, weist das Abstandsstück3 U-Form auf und besitzt eine Rille17 . Wenn das Abstandsstück3 und die Abdeckung4 auf der Grundfläche bzw. Basis42 laminiert bzw. geschichtet sind, wird ein Durch gang18 zwischen der Basis42 und der Abdeckung4 , wie in14 gezeigt, ausgebildet, durch welchen eine Probeflüssigkeit hindurchtritt. Ein Ende des Durchgangs18 ist an einem Ende der Basis42 offen und die Öffnung dient als eine Probenzuführöffnung23 . Das andere Ende des Durchgangs18 ist auf der Abdeckung4 offen und die Öffnung dient als eine Luftöffnung24 . - Die Wirkungsweise bzw. die Arbeitsweise des Glukosesensors mit der oben ervähnten Struktur ist wie folgt: Eine Probeflüssigkeit, welche durch die Probenzuführöffnung
23 zugeführt wird, erreicht die Reaktionsschicht44 durch den Durchgang18 und die Oxidoreduktase und die Elektronenakzeptoren, welche in der Reaktionsschicht44 enthalten sind, werden in der Probeflüssigkeit gelöst. So werden die Elektronenakzeptoren reduziert, während die Enzymreaktion zwischen einem Substrat in der Probeflüssigkeit und der Oxidoreduktase fortschreitet. Nach dem Beenden der Enzymreaktion sind die reduzierten Elektronenakzeptoren elektrochemisch oxidiert. Ein Wert eines Oxidationsstroms, welcher zu diesem Punkt erhalten wird, liefert eine Konzentration des Substrats in der Probeflüssigkeit. - Jedoch weist der herkömmliche Biosensor die nachfolgenden Nachteile auf:
Die Probeflüssigkeit kann reduzierende Materialien enthalten, welche von dem zu messenden Substrat verschieden sind, welche die Elektronenakzeptoren reduzieren können. Des Weiteren schwankt bzw. verändert sich die Viskosität, etc. der zu messenden Probeflüssigkeit. - Entsprechend sind die Ansprechwerte des Sensors nicht konstant beim Messen einer Konzentration des Substrats in der Probeflüssigkeit, welche das Substrat und andere reduzierende Materialien enthält, welche die Elektronenakzeptoren reduzieren können, und deshalb sollte das reduzierende Material vor dem Messen entfernt bzw. weggelassen werden. Eine solche Vorbehandlung führt zu einer Erhöhung der Anzahl der Schritte beim Messen der Konzentration eines Substrats in einer Probeflüssigkeit.
- Des Weiteren hängt die Sensoransprache auch von der Meßzeit ab. Zum Beispiel kann eine genaue Konzentration nicht erhalten werden, wenn der Oxidationsstrom gemessen wird, bevor die Reaktion vollständig beendet bzw. abgelaufen ist.
- Des Weiteren hängt die Zeit, welche benötigt wird damit die Probeflüssigkeit die Reaktionsschicht erreicht und die Rate der Reaktion des Substrats mit dem Enzym von der Viskosität der Probeflüssigkeit ab. Deshalb führen ungleichmäßige bzw. nicht konstante Viskositäten zu nicht konstanten Sensoransprachen.
- Zuletzt sind in diesem bekannten Biosensor eine Vielzahl an Elektrodensystemen und eine Vielzahl an Reaktionsschichten auf ein und derselben Oberfläche des Substrates vorgesehen.
- Zusammenfassung der Erfindung
- Der Biosensor dieser Erfindung weist ein elektrisch isolierendes Substrat, welches ein Verbund aus zwei isolierenden Substraten ist und welches eine Vielzahl von Oberflächen hat, eine Vielzahl von Elektrodensystemen, welche auf mindestens zwei der Vielzahl von Oberflächen der Substrate ausgebildet sind, wobei jedes der Elektrodensysteme eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode aufweist, und eine Vielzahl von Reaktionsschichten, welche auf mindestens zwei der Vielzahl von Oberflächen der Substrate vorgesehen sind, wobei jede der Reaktionsschichten eine Oxidoreduktase enthält, auf, wobei die Vielzahl von Elektrodensystemen jeweils auf verschiedenen Oberflächen der Substrate vorgesehen sind, die Reaktionsschichten auf den Oberflächen, auf welchen die Vielzahl von Elektrodensystemen ausgebildet sind, vorgesehen sind, und die Arten von Oxireduktasen, welche in der Viel zahl von Reaktionsschichten enthalten sind, verschieden voneinander sind.
-
12 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei in den1 bis11 Beispiele offenbart werden, welche nicht der Erfindung entsprechen. - Kurze Beschreibung der Zeichnungen
-
1 ist eine Draufsicht auf eine Basis bzw. Grundfläche eines Glukosesensors gemäß einem ersten Beispiel. -
2 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosensors von1 , von welchem eine Reaktionsschicht entfernt wurde. -
3 ist eine Querschnittsansicht des Glukosesensors von1 . -
4 ist eine Draufsicht auf eine Grundfläche bzw. Basis eines Glukosesensors gemäß einem anderen Beispiel. -
5 ist eine Draufsicht auf eine Basis eines Glukosesensors gemäß einem weiteren anderen Beispiel. -
6 ist eine perspektivische Explosionsansicht, gesehen von einer Seite eines Glukosesensors gemäß einem weiteren anderen Beispiel. -
7 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors von6 , gesehen von der anderen Seite. -
8 ist eine Draufsicht auf eine Basis des Glukosesensors von6 . -
9 ist eine Querschnittsansicht des Glukosesensors von6 . -
10 ist eine Draufsicht auf eine Basis eines Glukosesensors gemäß einem weiteren anderen Beispiel. -
11 ist eine Querschnittsansicht eines Glukosesensors gemäß einem weiteren anderen Beispiel. -
12 ist eine Querschnittsansicht eines Saccharidsensors gemäß einem Beispiel der vorliegenden Erfindung. -
13 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines herkömmlichen Einwegglukosesensors, von welchem eine Reaktionsschicht entfernt wurde. -
14 ist eine Querschnittsansicht des Glukosesensors von13 . - Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
- Die Zeichnungen, welche in der nachfolgenden Beschreibung der Beispiele erwähnt werden, weisen durchgehend für das gleiche Element ein gemeinsames Bezugszeichen auf. Ein Teil der Beschreibung wird ausgelassen, wenn ein Anlass dazu besteht.
- Beispiel 1
- Es wird jetzt ein Glukosesensor beschrieben.
- Der Glukosesensor weist eine Grundfläche bzw. Basis
2 , und ein Abstandsstück bzw. einen Abstandshalter3 und eine Abdeckung4 auf, welche integral bzw. einstückig auf der Basis2 laminiert bzw. geschichtet sind, wie in den2 und3 gezeigt. - Die Basis
2 umfasst ein elektrisch isolierendes Substrat, welches aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist, ein Elektrodensystem ist auf dem Substrat1 durch Siebdruck bzw. Serigraphie (screen printing) und ähnliches ausgebildet. Das Elektrodensystem weist ein Hauptelektrodensystem19 und ein Unterelektrodensystem20 auf, welche auf dem Substrat1 mit einem Abstand dazwischen vorgesehen sind. Das Hauptelektrodensystem19 und das Unterelektrodensystem20 umfassen Arbeitselektroden6 bzw.8 und Gegenelektroden7 bzw.9 . Die Arbeitselektroden6 und8 und die Gegenelektroden7 und9 sind elektrisch voneinander durch eine Isolationsschicht10 isoliert. - Eine Leitung
12 , welche auf dem Substrat1 ausgebildet ist, wird elektrisch mit der Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 verbunden, eine Leitung13 mit der Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 , eine Leitung14 mit der Arbeitselektrode8 des Unterelektrodensystems20 und eine Leitung15 mit der Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 . Eine Reaktionsschicht5 bedeckt die Arbeitselektrode6 und die Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 . Die Reaktionsschicht5 umfasst Carboxymethylcellulose (hiernach als CMC bezeichnet) als ein hydrophiles Polymer, Glukoseoxidase (EC1.1.3.4; hiernach als GOD bezeichnet) als eine Oxidoreduktase, und Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren. - Wie in
2 gezeigt, ist das Abstandsstück3 in einer U-Form ausgebildet und weist eine Rille17 auf, welche an einem ihrer Enden offen ist. Wenn das Abstandsstück3 und die Abdeckung4 auf der Basis2 laminiert bzw. geschichtet sind, wird ein Durchgang bzw. Durchlass18 zwischen der Basis2 und der Abdeckung4 ausgebildet, durch welche eine Probeflüssigkeit hindurchtritt. Ein Ende des Durchgangs18 ist an einem Ende der Basis2 offen, und die Öffnung dient als eine Probenzuführöffnung23 . Das andere Ende des Durchlasses18 ist auf der Abdeckung4 offen, und die Öffnung dient als eine Luftöffnung. Entsprechend wird die Reaktionsschicht5 zwischen der Luftöffnung24 und der Probenzuführöffnung23 zur Verfügung gestellt, so dass sie dem Durchgang18 gegenüberliegt. - Der Glukosesensor wurde wie folgt hergestellt: Silberpaste bzw. -masse wurde auf das Substrat
1 durch Serigraphie bzw. Siebdruck gedruckt bzw. übertragen, um die Leitungen12 ,13 ,14 und15 auszubilden. Dann wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel umfasst, auf das Substrat1 gedruckt bzw. übertragen, um die Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 und die Arbeitselektrode8 und die Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 auszubilden. - Die Arbeitselektroden
6 und8 und die Gegenelektrode9 wurden elektrisch mit den Leitungen12 ,14 bzw.15 verbunden. - Als nächstes wurde eine isolierende Paste auf das Substrat
1 übertragen bzw. gedruckt, um die isolierende Schicht10 auszubilden. Die isolierende Schicht10 bedeckt den äußeren bzw. Umfangsbereich der Arbeitselektrode6 , so dass ein vorherbestimmter Bereich bzw. eine vorherbestimmte Fläche der Arbeitselektrode6 freiliegend ist. Des Weiteren bedeckt die isolierende Schicht10 einen Teil der Leitungen12 ,13 ,14 bzw.15 . Die Arbeitselektrode8 und die Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 wurden zum Teil durch die isolierende Schicht10 abgedeckt, so dass ein vorherbestimmter Bereich bzw. eine vorherbestimmte Fläche der Arbeitselektrode8 und der Gegenelektrode9 jeweils freiliegend waren. - Dann wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel umfasst, auf die isolierende Schicht
10 übertragen bzw. gedruckt, um so in Kontakt bzw. Verbindung mit der Leitung13 zu kommen, um die Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 auszubilden. Die Basis2 , welche in1 gezeigt ist, wurde auf diese Art hergestellt. - Als nächstes wurde eine wässrige Lösung, welche die GOD als die Oxidoreduktase, Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren und die 0,5 Gew.-% von CMC als das hydrophile Polymer enthält auf die Arbeitselektrode
6 und die Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 getropft, und in einem Warmlufttrockner bei einer Temperatur von 50°C während 10 min getrocknet, um die Reaktionsschicht5 auszubilden. Die Reaktionsschicht5 kann leicht auf diese Art ausgebildet werden. - Dann wurde eine gemischte wässrige Lösung, welche Kaliumferricyanid und die CMC enthielt, auf die Arbeitselektrode
8 und die Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 getropft und getrocknet, um eine Referenz- bzw. Bezugsschicht25 auszubilden. - Nach dem Ausbilden der Reaktionsschicht
5 und der Referenzschicht25 auf dem Substrat1 wurden die Abdeckung4 und das Abstandsstück3 laminiert bzw. geschichtet, um auf der Basis wie in2 mit gestrichelten Linien gezeigt, angeheftet bzw. befestigt zu werden. So wurde der Durchgang18 mit einem vergleichsweise geringen Querschnitt ausgebildet, welcher durch die Rille17 des Abstandsstücks3 , die Abdeckung4 und die Basis2 festgelegt bzw. definiert ist. - Dem so hergestellten Glukosesensor wurden durch die Probezuführöffnung
23 , 3 μl einer gemischten wässrigen Lösung als eine Probeflüssigkeit zugeführt, welche Glukose und Ascorbinsäure enthielt. Vor dem Zuführen der Probeflüssigkeit war der gesamte Biosensor, umfassend die Referenzschicht25 und die Reaktionsschicht5 in einem trockenen Zustand. Die Probeflüssigkeit, welche in Kontakt bzw. Berührung mit der Probezuführöffnung23 an der Spitze des Sensors kommt, wird in den Durchgang18 durch Kapillarwirkung eingeführt. Demzufolge wird die Probeflüssigkeit dem Unterelektrodensystem20 und der Reaktionsschicht5 durch einfaches in-Kontakt-bringen Probeflüssigkeit mit der Probezuführöffnung23 zugeführt. - Die Probeflüssigkeit erreichte die Luftöffnung
24 über das Unterelektrodensystem20 aufgrund der Kapillarwirkung, und die Referenzschicht25 auf dem Unterelektrodensystem20 und die Reaktionsschicht5 auf dem Hauptelektrodensystem19 wurden jeweils in der Probeflüssigkeit gelöst. Zu der gleichen Zeit wurde eine Impedanz zwischen der Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 und der Arbeitselektrode8 des Unterelektrodensystems20 verändert. Die Impedanzveränderung zeigte eine ausreichende Zufuhr der Probeflüssigkeit zu dem Sensor. Als nächstes wurde eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Spannung bei der Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 an die Arbeitselektrode8 angelegt. Ein Oxidations strom-(ein Anodenstrom)Wert I0 von 5 s nach dem Zuführen wurde gemessen. - Das Kaliumferricyanid auf dem Unterelektrodensystem
20 wurde durch Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit reduziert, um Kaliumferrocyanid zu erzeugen. Der Oxidationsstromwert I0, welcher durch das Anlegen der oben erwähnten vorherbestimmten Spannung erhalten wurde, wurde durch Oxidation des Kaliumferrocyanids verursacht. Deshalb war der Oxidationsstromwert I0 der Menge der Ascorbinsäure, welche in der Probeflüssigkeit enthalten war, proportional. - Eine Spannung von +0,5 V auf der Grundlage bzw. Basis der Spannung bei der Gegenelektrode
7 des Hauptelektrodensystems19 wurde an die Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 eine Minute nach Feststellen bzw. Detektieren der oben beschriebenen Impedanzveränderung angelegt. Ein Oxidationsstrom I1 wurde 5 s nach dem Anlegen gemessen. - Der Oxidationsstrom I1 ist ein Gesamtwert des Stroms, welcher durch Oxidation von Kaliumferrocyanid verursacht wurde, was durch die Reduktion durch Ascorbinsäure erzeugt wurde, und des Stroms, welcher durch die Oxidation von Kaliumferrocyanid verursacht wurde, was beim Oxidieren von Glukose durch die GOD erzeugt wurde.
- Nimmt man einen Koeffizienten zum korrigieren des Unterschieds im Ansprechen bei beiden Elektrodensystemen an, entspricht ein Stromwert, dargestellt als I1 – kI0 eng bzw. nahe der Glukosekonzentration in der Probeflüssigkeit.
- Als nächstes wurden Antworten bzw. Ansprechverhalten, welche bei den folgenden Betriebsarten (1) und (2) erhalten wurden, verglichen unter Verwendung von 30 Glukosesensoren.
- (1) Nach dem Zuführen der
Probeflüssigkeit
zu dem Sensor durch die Probenzuführöffnung wurde eine ausreichende
Zufuhr der Probeflüssigkeit zu
der Reaktionsschicht
5 detektiert bzw. festgestellt durch Detektieren der Veränderung der elektrischen Eigenschaften zwischen dem Hauptelektrodensystem und dem Unterelektrodensystem. Dann wurden die Sensoransprechverhalten bzw. -empfindlichkeiten in der oben beschriebenen Art erhalten. - (2) Anstatt des Detektierens der Veränderung der elektrischen Eigenschaften
wurde eine ausreichende Zufuhr der Probeflüssigkeit zu der Reaktionsschicht
5 durch visuelle Beobachtung bestätigt. Dann wurden die Sensoransprechverhalten bzw. -empfindlichkeiten durch Messen der Oxidationsstromwerte I0 und I1 auf die gleiche Art wie oben erhalten. - Als Ergebnis betrug des Variationskoeffizient (ein CV-Wert), welcher die Verteilung der Empfindlichkeiten bzw. Ansprechverhalten veranschaulicht, 2% bei Betriebsart (1) und 5% bei Betriebsart (2).
- Wie oben erwähnt, war der Variationskoeffizient bei Betriebsart (1) geringer als der bei Betriebsart (2). Dies scheint daher zu kommen, dass die nicht konstante Zeit vom Messen des Ansprech- bzw. Antwortstroms in dem Unterelektrodensystem zu dem in dem Hauptelektrodensystem bei Betriebsart (1) verringert wurde.
- Bei diesem Beispiel was die GOD in der Reaktionsschicht
5 nicht in dem Hauptelektrodensystem19 immobilisiert. Jedoch wurde die Viskosität der Probeflüssigkeit erhöht, wenn die Reaktionsschicht5 in der Probeflüssigkeit gelöst wurde, weil die Reaktionsschicht5 das hydrophile Polymer enthielt. Deshalb wurde die Dispersion von Materialien, welche in der Reaktionsschicht5 enthalten waren, verhindert, so dass die Materialien sich nicht in einem kurzen Zeitraum in Richtung auf das Unterelektrodensystem20 be wegten. Eine noch genauere Messung kann wirkungsvoll bzw. effektiv erhalten werden durch Immobilisieren des Enzyms, wie der GOD in dem Hauptelektrodensystem19 . - Beispiel 2
-
4 ist eine Draufsicht auf eine Basis2 eines Glukosesensors, welcher als ein anderes Beispiel des Biosensors hergestellt wurde. Dieser Glukosesensor wurde wie folgt hergestellt:
Silberpaste wurde durch Siebdruck bzw. Serigraphie, auf ein elektrisch isolierendes Substrat1 übertragen bzw. gedruckt, welches aus Polyethylenterephthalat hergestellt wurde, um Leitungen12 ,13 ,14 und15 auszubilden. Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel enthält, auf das Substrat1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode6 eines Hauptelektrodensystems19 und eine Arbeitselektrode8 eines Unterelektrodensystems20 auszubilden. - Die Arbeitselektroden
6 und8 wurden elektrisch mit den Leitungen12 bzw.14 verbunden. - Eine isolierende Paste wurde dann auf das Substrat
1 gedruckt, um eine isolierende Schicht10 auszubilden. Die isolierende Schicht10 deckte äußere bzw. Umfangsbereiche der Arbeitselektroden6 und8 ab, so dass ein vorherbestimmter Bereich bzw. eine vorherbestimmte Fläche der Arbeitselektroden6 und8 freiliegend war. Des Weiteren deckte die isolierende Schicht10 einen Teil der Leitungen12 ,13 ,14 bzw.15 ab. - Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel enthält, auf die isolierende Schicht
10 gedruckt, um so in Kontakt bzw. Berührung mit den Leitungen13 und15 zu kommen, um eine Gegenelektro de7 des Hauptelektrodensystems19 und eine Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 auszubilden. Auf diese Art wurde die in4 gezeigte Basis2 hergestellt. - Eine gemischte wässrige Lösung, welche das GOD, Kaliumferricyanid und das CMC enthält, wurde auf die Arbeitselektrode
6 und die Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 auf die gleiche Art, wie in Beispiel 1, getropft. Eine gemischte wässrige Lösung, welche Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, hiernach als BSA bezeichnet), Kaliumferricyanid und die CMC enthielt, wurde dann auf die Arbeitselektrode8 und die Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 getropft, und in einem Warmlufttrockner bei einer Temperatur von 50°C während 10 min getrocknet, um eine Reaktionsschicht und eine Referenzschicht (nicht gezeigt) auf dem Hauptelektrodensystem19 bzw. dem Unterelektrodensystem20 auszubilden. - Dann wurden ein Abstandsstück
3 und eine Abdeckung4 integral auf die Basis2 mit der Reaktionsschicht und der Referenzschicht in der gleichen Art wie in Beispiel 1 laminiert bzw. geschichtet, um den Glukosesensor auszubilden. - Weil die Referenzschicht, welche das BSA, Kaliumferricyanid und das CMC enthält, auf dem Unterelektrodensystem
20 ausgebildet wird, sind die Bedingungen zum Diffundieren bzw. Verteilen eines reduzierenden bzw. reduktiven Materials wie Ascorbinsäure auf dem Elektrodensystem20 und ähnliches, ähnlich zu denen auf dem Hauptelektrodensystem19 . - In dem Fall, dass Proteine, wie die GOD und das BSA auf den Elektrodensystemen vorkommen, kann die Wirksamkeit bzw. Aktivität der Elektroden teilweise verschlechtert werden durch Absorption von solchen Proteinen. Jedoch kann eine Schicht, welche Proteine enthält, welche auf beiden den Haupt- und Unterelektrodensystemen
19 und20 vorgesehen ist, wie oben beschrieben, Fehler bei den Oxidationsstromwerten minimieren, welche in jedem Elektrodensystem detektiert werden, aufgrund der Absorption der Proteine. Als Ergebnis kann die Korrektur zwischen den Oxidationsstromwerten in beiden, den Elektrodensystemen19 und20 , vereinfacht werden. - Ein solcher Vorteil ist insbesondere bemerkenswert bei einem Sensor, welcher Kohlenstoff als ein Hauptelektrodenmaterial verwendet.
- Beispiel 3
- Als nächstes wird ein Fruktosesensor als ein Beispiel eines Biosensors beschrieben.
-
5 ist eine Draufsicht auf eine Basis2 eines Fruktosesensors, welcher als ein weiteres anderes Beispiel des Biosensors hergestellt wurde. Der Fruktosesensor wurde wie folgt hergestellt:
Wie in5 gezeigt, wurde Silberpaste durch Siebdruck bzw. Serigraphie, auf ein elektrisches isolierendes Substrat1 gedruckt, welches aus Polyethylenterephthalat hergestellt ist, um Leitungen12 ,13 und14 auszubilden. Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel umfasst, auf das Substrat1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode6 eines Hauptelektrodensystems19 und eine Arbeitselektrode8 eines Unterelektrodensystems20 auszubilden. Eine isolierende Schicht10 wurde dann auf dem Substrat1 ausgebildet unter Verwendung der isolierenden Paste. Die isolierende Schicht10 deckte äußere bzw. Umfangsbereiche der Arbeitselektroden6 und8 ab, so dass ein vorherbestimmter Bereich bzw. eine vorherbestimmte Fläche der Arbeitselektroden6 bzw.8 freiliegend war. Des Weiteren bedeckte die isolierende Schicht10 einen Teil der Leitungen12 ,13 bzw.14 . - Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche ein Harzbindemittel enthält, auf die isolierende Schicht
10 gedruckt, um so in Kontakt bzw. Berührung mit der Leitung13 zu kommen, um eine Gegenelektrode7 auszubilden. So wurde die Basis2 hergestellt. - Als nächstes wurde eine gemischte wässrige Lösung aus Fruktosedehydrogenase (EC1.1.99.11; hiernach als FDH bezeichnet) als eine Oxidoreduktase, Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren und CMC als hydrophiles Polymer in einer Phosphatpufferlösung (pH = 5) auf die Arbeitselektrode
6 und die Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 getropft und in einem Warmlufttrockner bei einer Temperatur von 40°C während 10 min getrocknet, um eine Reaktionsschicht (nicht gezeigt) auszubilden. - Ein Abstandstück und eine Abdeckung wurden integral auf der so erhaltenen Basis
2 in der gleichen Art wie in Beispiel 1 laminiert bzw. geschichtet, um den Fruktosesensor herzustellen. - 3 μl einer gemischten wässrigen Lösung aus Fruktose und Ascorbinsäure wurden dem Fruktosesensor zugeführt. Eine Spannung von +1 V auf der Basis der Gegenelektrode
7 wurde an die Arbeitselektrode8 des Unterelektrodensystems20 angelegt und ein Oxidationsstromwert I0 wurde gemessen. Weil keine Oxidoreduktase und Elektronenakzeptoren auf der Arbeitselektrode8 des Unterelektrodensystems20 vorlagen, war der Stromwert I0 ein Oxidationsstromwert der Ascorbinsäure, welche in der Probeflüssigkeit enthalten war. Des Weiteren wurde ein genauer Stromwert I0 unmittelbar nach dem Zuführen der Probeflüssigkeit erhalten, weil kein hydrophiles Polymer und ähnliches zum Verhindern des Diffundierens bzw. der Verteilung der Materialien auf dem Unterelektrodensystem vorlag. Der Stromwert I0 stand im Verhältnis zu der Ascorbinsäurekonzentration. - Weiterhin wurde eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektro de
7 an die Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 eine Minute nach dem Zuführen der Probeflüssigkeit zu dem Sensor durch die Probezuführöffnung angelegt. Ein Stromwert I1 wurde 5 s nach dem Anlegen gemessen. Der Stromwert I1 ist ein Gesamtwert eines Oxidationsstroms des Kaliumferrocyanids, welches durch eine Reaktion mit Ascorbinsäure erzeugt wurde, und eines Stromes, welcher bei einer Reduktion der Fruktose durch das FDH erzeugt wurde. - Die Menge der Ascorbinsäure, welche in der Probeflüssigkeit enthalten war, wurde quantitativ bestimmt unter Verwendung des Stromwerts I0. Eine Fruktosekonzentration in der Probeflüssigkeit wurde aus der quantitativ bestimmten Menge der Ascorbinsäure und der Menge des mit dem Stromwert I1 quantitativ bestimmten Kaliumferrocyanids errechnet.
- Bei dem Fruktosesensor gemäß diesem Beispiel dient eine Gegenelektrode
7 als eine gemeinsame Gegenelektrode für die Haupt- und Unterelektrodensysteme19 und20 . Die Herstellung des Sensors kann vereinfacht werden durch gemeinsame Verwendung der Gegenelektrode auf diese Art. Des Weiteren können die Kosten zum Herstellen des Sensors verringert werden durch Verwendung einer Leitung weniger. Zusätzlich kann eine Unebenheit bzw. Ungleichheit der Oberflächen der Elektrodensysteme auf dem Substrat1 verringert werden, wodurch verhindert wird, dass sich die Reaktionsschicht von den Elektrodensystemen abblättert bzw. ablöst. Als Ergebnis kann ein Sensor mit hervorragenden Erhaltungs- und stabilen Eigenschaften hergestellt werden, und eine genaue Sensorempfindlichkeit bzw. Ansprechverhalten kann erhalten werden durch Erzeugen einer gleichmäßigeren bzw. feineren Bewegung der Probeflüssigkeiten auf den Elektrodensystemen. - Beispiel 4
- Ein Verfahren zum Messen der Glukosekonzentration in Vollblut unter Ver wendung des Glukosesensors, welcher in der gleichen Art wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, wird jetzt beschrieben.
- Das Vollblut wurde dem Glukosesensor durch die Probenzuführöffnung
23 zugeführt. Der gesamte Glukosesensor, einschließlich der Reaktionsschicht5 , war vor der Zufuhr der Probeflüssigkeit in einem trockenen Zustand. Die Probeflüssigkeit, d.h. das Vollblut, erreichte als erstes das Unterelektrodensystem20 , wodurch eine Impedanz zwischen der Arbeitselektrode8 und der Gegenelektrode9 in dem Unterelektrodensystem20 verringert wurde. Die Impedanzveränderung wurde durch die Leitungen14 und15 festgestellt bzw. detektiert. - Als nächstes erreichte das Vollblut das Hauptelektrodensystem
19 . Wenn die Reaktionsschicht5 auf dem Hauptelektrodensystem19 gelöst wurde bzw. war, wurde eine Impedanz zwischen der Arbeitselektrode6 und der Gegenelektrode7 des Hauptelektrodensystems19 verringert. Die Impedanzveränderung wurde durch die Leitungen12 und13 detektiert. - Wenn die Reaktionsschicht
5 im Vollblut gelöst wurde bzw. war, wurde die Glukose in dem Blut durch das GOD oxidiert, und zu der gleichen Zeit wurde das Kaliumferricyanid zu Kaliumferrocyanid reduziert. Eine Minute nach dem Zuführen des Vollbluts zu dem Glukosesensor wurde eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektrode7 an die Arbeitselektrode6 angelegt, und ein Oxidationsstrom wurde 5 s nach dem Anlegen gemessen. Der erhaltene Stromwert resultierte aus der Reduktion des Kaliumferrocyanids und war der Konzentration der Glukose, dem zu messenden Substrat, proportional. - Wenn die oben beschriebenen Oxidationsstromwerte unter Verwendung der Vollblutprobe mit einem Hämatokrit von 20% bis 60% gemessen wurde, verringerte ein höherer Hämatokritwert den Oxidationsstromwert. Des weite ren erhöhte sich, wenn die Zeitdifferenz, die zum Detektieren der Impedanzveränderung zwischen dem Hauptelektrodensystem und dem Unterelektrodensystem benötigt wird als t angenommen wird, t proportional zu dem Anstieg des Hämatokrit bei der Verwendung des Vollbluts mit einem Hämatokrit von 20% bis 60%.
- Wenn die Werte, welche durch Korrektur des Oxidationsstromwerts mit dem oben erwähnten Faktor t erhalten wurden, als Sensorempfindlichkeiten bzw. -ansprechverhalten genommen wurden, waren die Sensorempfindlichkeiten bzw. -ansprechverhalten konstant, unabhängig von dem Hämatokritwert in der Vollblutprobe und entsprachen der Glukosekonzentration in dem Vollblut.
- Bei diesem Beispiel kann die Probeflüssigkeit durch die Luftöffnung
24 zugeführt werden, und zwar unter Verwendung der Probezuführöffnung23 als eine Luftöffnung. In diesem Fall wird die Impedanzveränderung zuerst in dem Hauptelektrodensystem detektiert, und dann in dem Unterelektrodensystem. Die Zeitdifferenz t2, welche zum Detektieren der Impedanzveränderung zwischen dem Hauptelektrodensystem und dem Unterelektrodensystem erforderlich ist, entspricht nicht notwendig dem oben erwähnten t. Jedoch kann der gleiche Effekt wie bei diesem Beispiel durch vorheriges Untersuchen bzw. Studieren des Verhältnisses zwischen t2 und dem Hämatokrit erhalten werden. - Beispiel 5
- Ein Glukosesensor wird jetzt beschrieben.
-
6 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors, gesehen von einer Seite, von welchem eine Reaktionsschicht50 entfernt wurde.7 ist eine perspektivische Explosionsansicht des Glukosesensors, gesehen von der anderen Seite, von welchem eine Reaktionsschicht50 ent fernt wurde.8 ist eine Draufsicht auf eine Basis2 des Glukosesensors, welcher bei diesem Beispiel hergestellt wurde.9 ist eine Querschnittsansicht des Glukosesensors, welcher bei diesem Beispiel hergestellt wurde. - Ein Verfahren zur Herstellung des Glukosesensors wird jetzt beschrieben.
- Silberpaste wurde auf ein Substrat
1 , welches aus Polyethylenterephthalat hergestellt wurde, durch Siebdruck bzw. Serigraphie gedruckt bzw. übertragen, um Leitungen12 und13 auszubilden. Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste enthaltend bzw. umfassend ein Harzbindemittel auf das Substrat1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode6 eines Hauptelektrodensystems19 auszubilden. Die Arbeitselektrode6 wurde elektrisch mit der Leitung12 verbunden. Eine isolierende Paste wurde dann auf das Substrat1 gedruckt, um eine isolierende Schicht10 auszubilden. Die isolierende Schicht10 bedeckte die äußeren bzw. Umfangsbereiche der Arbeitselektrode6 , so dass ein vorherbestimmter Bereich der Arbeitselektrode6 freiliegend war. - Als nächstes wurde eine leitfähige Kohlenstoffpaste umfassend ein Harzbindemittel auf die isolierende Schicht
10 gedruckt, um so in Kontakt bzw. Berührung mit der Leitung13 zu kommen, um eine Gegenelektrode7 der Hauptelektrode9 auszubilden. - Auf der gegenüberliegenden bzw. rückseitigen Oberfläche des isolierenden Substrats
1 , auf welcher das oben erwähnte Elektrodenmuster gedruckt wurde, wurden Leitungen14 und15 , ein Unterelektrodensystem20 (umfassend eine Arbeitselektrode8 und eine Gegenelektrode9 ) und eine isolierende Schicht16 durch Drucken ausgebildet, wodurch die Basis2 , wie in den7 und8 gezeigt, hergestellt wurde. - Die Strukturen des Hauptelektrodensystems
19 und des Unterelektrodensystems20 waren die gleichen, und deshalb waren die Flächen bzw. Bereiche der Arbeitselektroden6 und8 auch die gleichen. - Eine gemischte wässrige Lösung, welche die GOD als Oxidoreduktase, Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren und CMC als hydrophiles Polymer enthielt, wurde auf das Hauptelektrodensystem
19 getropft und in einem Warmlufttrockner bei einer Temperatur von 50°C während 10 min getrocknet, um eine Reaktionsschicht50 auszubilden. - Als nächstes wurden Abstandsstücke
21 und29 und Abdeckungen22 und26 laminiert bzw. geschichtet, um auf der Basis2 mit der oben beschriebenen Reaktionsschicht50 , wie in9 gezeigt, anzuheften bzw. befestigt zu sein, um den Glukosesensor herzustellen. - Dem so erhaltenen Glukosesensor wurden 10 μl einer gemischten wässrigen Lösung aus Glukose und Ascorbinsäure als Probeflüssigkeit durch die Probezuführöffnungen
23 und27 zugeführt. Die zugeführte Probeflüssigkeit erreichte unmittelbar die Luftöffnungen24 und28 aufgrund einer Kapillarwirkung und die Reaktionsschicht50 auf dem Hauptelektrodensystem19 wurde aufgelöst. - Anschließend wurde eine Spannung von +1 V auf der Basis der Gegenelektrode
9 des Unterelektrodensystems20 an die Arbeitselektrode8 angelegt, und der Stromwert I0 gemessen. Weil keine Oxidoreduktase und Elektronenakzeptoren auf dem Unterelektrodensystem20 vorkamen, war der Stromwert I0 ein Wert eines Oxidationsstroms der Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit. Des Weiteren wurde der Stromwert I0 unmittelbar nach der Zufuhr der Probeflüssigkeit erhalten, weil kein hydrophiles Polymer zum Verhindern der Dispersion bzw. Verteilung der Materialien auf dem Unterelektrodensystem20 vorhanden war. Der Stromwert I0 stand im Verhältnis zu der Konzentration der Ascorbinsäure. - Eine Minute nach der Zufuhr der Probeflüssigkeit wurde eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektrode
7 des Hauptelektrodensystems19 an die Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 angelegt, und der Stromwert I1 wurde nach 5 s des Anlegens gemessen. Der Stromwert I1 war ein Gesamtwert eines Oxidationsstroms des Kaliumferrocyanids, welches durch eine Reaktion mit Ascorbinsäure erzeugt wurde, und eines Stroms, welcher bei einer Reduktion von Glukose durch die GOD erzeugt wurde. - Die Menge der Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit wurde quantitativ aus dem Stromwert I0 bestimmt. Eine Glukosekonzentration in der Probeflüssigkeit wurde aus der quantitativ bestimmten Menge der Ascorbinsäure und der Menge des Kaliumferrocyanids, welche aus dem Stromwert I1 erhalten wurde, errechnet.
- Bei diesem Beispiel waren das Hauptelektrodensystem
19 und das Unterelektrodensystem20 auf verschiedenen Seiten voneinander vorgesehen. Entsprechend bewegten sich die Materialien, welche in der Reaktionsschicht50 enthalten waren, wie die GOD, nicht auf dem Unterelektrodensystem20 . Als Ergebnis bestand kein Erfordernis, die GOD, das Kaliumferricyanid und ähnliches an dem Hauptelektrodensystem19 zu immobilisieren. - Unabhängig von dem oben erwähnten Verfahren kann die Basis
2 durch Laminieren von zwei isolierenden Substraten1 miteinander bzw. aneinander hergestellt werden, welche jeweils ein Elektrodenmuster auf einer ihrer Oberflächen tragen. Die Struktur des Unterelektrodensystems entspricht nicht notwendig der des Hauptelektrodensystems. Zum Beispiel kann die in10 gezeigte Struktur verwendet werden. - Beispiel 6
-
11 ist eine Querschnittsansicht eines Glukosesensors, welcher als ein anderes Beispiel hergestellt wurde. - Eine Basis
2 wurde in der gleichen Art wie in Beispiel 5 hergestellt. - Eine gemischte wässrige Lösung aus GOD, Kaliumferricyanid und CMC wurde auf ein Hauptelektrodensystem
19 (eine Arbeitselektrode6 und eine Gegenelektrode7 ) der Basis2 getropft und getrocknet, um eine Reaktionsschicht51 in der gleichen Art wie in Beispiel 5 auszubilden. Als nächstes wurde eine gemischte wässrige Lösung aus Kaliumferricyanid und CMC auf ein Unterelektrodensystem20 (eine Arbeitselektrode8 und eine Gegenelektrode9 ) getropft und getrocknet, um eine Referenz- bzw. Bezugsschicht25 auszubilden, welche aus Kaliumferricyanid und dem CMC hergestellt ist. - Ein Abstandsstück
3 und eine Abdeckung4 wurden integral bzw. einstückig laminiert bzw. geschichtet auf der Basis2 in der gleichen Art wie in Beispiel 5, um den Glukosesensor auszubilden. - Zu dem so erhaltenen Glukosesensor wurden 10 μl einer gemischten wässrigen Lösung aus Glukose und Ascorbinsäure als eine Probeflüssigkeit durch die Probenzuführöffnungen
23 und27 zugeführt. Die Probeflüssigkeit erreichte unmittelbar bzw. sofort die Luftöffnungen24 und28 aufgrund der Kapillarwirkung. - Die Referenzschicht
25 wurde in der Probeflüssigkeit auf dem Unterelektrodensystem20 gelöst. Kaliumferricyanid wurde durch die Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit reduziert. Eine Spannung von +0,5 V auf das Basis der Gegenelektrode9 des Unterelektrodensystems20 wurde an die Arbeitselektrode8 des Unterelektrodensystems20 10 Sek. nach dem Zuführen der Probeflüssigkeit angelegt. Ein Stromwert wurde 5 s nach dem Anlegen gemessen und war der Konzentration der Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit proportional. - Die Reaktionsschicht
51 wurde in der Probeflüssigkeit auf dem Hauptelektrodensystem19 gelöst. Kaliumferricyanid in der Reaktionsschicht51 wurde zu Kaliumferrocyanid durch zwei Reaktionen verändert: Reduktion durch Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit und Reduktion durch Oxidieren der Glukose in der Probe flüssigkeit durch die GOD. - Eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektrode
7 des Hauptelektrodensystems19 wurde an die Arbeitselektrode6 des Hauptelektrodensystems19 eine Minute nach der Zufuhr der Probeflüssigkeit zu dem Sensor angelegt. Der Stromwert I1 wurde 5 s nach dem Anlegen gemessen. - Der Stromwert I1 war ein Gesamtwert des Oxidationsstroms des Kaliumferrocyanids, welches durch eine Reaktion mit Ascorbinsäure erzeugt wurde, und eines Stroms, welcher durch eine Reduktion beim Oxidieren der Glukose durch die GOD erzeugt wurde.
- Eine Konzentration der Ascorbinsäure in der Probeflüssigkeit wurde quantitativ aus dem Ansprechverhalten des Unterelektrodensystems
20 bestimmt. Eine Glukosekonzentration in der Probeflüssigkeit wurde aus der quantitativ bestimmten Ascorbinsäurekonzentration und der Menge des Kaliumferrocyanids, welche aus dem Stromwert I1 erhalten wurde, berechnet. - Ein Ausgabe- bzw. Abgabestromwert in dem Unterelektrodensystem
20 kann nicht genau gemessen werden, wenn die GOD auf dem Unterelektrodensystem20 vorkommt. Das GOD kann vollständig daran gehindert werden, sich auf das Unterelektrodensystem20 zu bewegen durch Vorsehen des Hauptelektrodensystems19 und des Unterelektrodensystems20 auf voneinander verschiedenen Oberflächen des Substrats1 , wie in diesem Beispiel. Als Ergebnis kann eine noch genauere Messung erzielt werden. - Beispiel 7
- Ein Saccharidsensor wird als ein Beispiel des Biosensors gemäß der vorliegenden Erfindung beschrieben.
-
12 ist eine Querschnittsansicht des Saccharidsensors gemäß diesem Bei spiel. Ein Verfahren zur Herstellung des Saccharidsensors ist wie folgt:
Eine Basis2 , wie in12 gezeigt, wurde auf die gleiche Art wie in Beispiel 5 hergestellt. - Als nächstes wurde eine gemischte wässrige Lösung, umfassend bzw. enthalten die GOD als Oxidoreduktase, Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren und CMC als hydrophiles Polymer, auf das Hauptelektrodensystem
19 getropft und getrocknet, um eine erste Reaktionsschicht52 auszubilden. - Eine gemischte wässrige Lösung, enthaltend das FDH als die Oxidoreduktase, Kaliumferricyanid als Elektronenakzeptoren und CMC als hydrophile Polymer in einem Phosphatpuffer (pH = 4,5), wurde dann auf das Unterelektrodensystem
20 getropft und getrocknet, um eine zweite Reaktionsschicht53 auszubilden. Ein Abstandsstück und eine Abdeckung wurden auf die Basis2 laminiert bzw. geschichtet, wie in Beispiel 5, um den Saccharidsensor herzustellen. - Zu dem so erhaltenen Saccharidsensor wurden 10 μl Glukose und Fruktose als Probeflüssigkeit durch die Probezuführöffnungen
23 und27 zugeführt. Eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektrode7 und eine Spannung von +0,5 V auf der Basis der Gegenelektrode9 wurden an die Arbeitselektroden6 und8 angelegt, jeweils 2 Minute nach dem Zuführen der Probeflüssigkeit. Ein Stromwert bei jeder Elektrode wurde nach 5 s gemessen. Bei dem Hauptelektrodensystem19 mit der ersten Reaktionsschicht52 entsprach der Stromwert der Glukosekonzentration. Bei dem Unterelektrodensystem20 mit der zweiten Reaktionsschicht53 entsprach der Stromwert der Fruktosekonzentration. - Wenn die ersten und die zweiten Reaktionsschichten
52 und53 in der Probeflüssigkeit aufgelöst wurden, wurden die Substrate in der Probeflüssigkeit jeweils oxidiert mit der Oxidoreduktase, welche für jede Schicht spezifisch war. Kaliumferricyanid wurde zu Kaliumferrocyanid reduziert mit einem Elektronenübergang in jeder Schicht. Als nächstes wurde durch das Anlegen der oben vorherbestimmten Spannungen ein Oxidationsstromwert erhalten, welcher dem erzeugten Kaliumferrocyanid entspricht. Der Stromwert entsprach der Konzentration des Substrats in der Probeflüssigkeit. - Die Sensorempfindlichkeit bzw. das Sensoransprechverhalten des obigen Saccharidsensors, welchem Fruchtsaft als eine Probeflüssigkeit zugeführt wurde, wurde gemessen. Glukose und Fruktose in dem Fruchtsaft konnten quantitativ bestimmt werden.
- Die GOD, welche in der ersten Reaktionsschicht
52 verwendet wurde, und die FDH, welche in der zweiten Reaktionsschicht53 verwendet wurde, weisen voneinander verschiedene pH-Zustände zum Erzielen der höchsten Enzymreaktivität an. Im Allgemeinen hängt der am besten geeignete pH-Zustand oft von der Art des verwendeten Enzyms ab. Wenn die erste und die zweite Reaktionsschicht52 und53 auf der gleichen Oberfläche des Substrats1 vorgesehen wurden, bewegte sich ein Pufferbestandteil, welcher in der zweiten Reaktionsschicht53 enthalten war, in die erste Reaktionsschicht52 , welche die GOD enthält, durch die Dispersion der Probeflüssigkeit. Demzufolge kann der am besten geeignete pH-Zustand nicht erhalten werden. Weiterhin kann sich das Enzym auf eine Vielzahl von Elektroden durch Dispersion der Probeflüssigkeit bewegen. Deshalb ist es erforderlich, einen Zustand einzustellen bzw. festzusetzen, welcher es dem Enzym nicht erlaubt, sich durch Immobilisierung oder ähnliches zu bewegen. Als Ergebnis kann die Struktur des Sensors beschränkt bzw. begrenzt werden. - Wenn die Reaktionsschichten, welche verschiedene Enzyme enthalten, auf den verschiedenen Oberflächen des isolierenden Substrats
1 voneinander vorgesehen werden, wie bei diesem Beispiel, kann ein Bestandteil in jeder Reaktionsschicht daran gehindert werden, sich zu bewegen, wenn jede Reaktionsschicht in der Probeflüssigkeit gelöst wird. Auf diese Art kann der pH-Wert auf jedem Elektrodensystem leicht ausgeregelt bzw. festgelegt (settled) werden, damit er der am besten geeignete für das Enzym ist und das Enzym kann frei in der Probeflüssigkeit verteilt werden. - Bei den oben beschriebenen Beispielen ist es möglich, wenn die Abdeckung und das Abstandsstück aus einem transparenten Material hergestellt wurden, wie einem transparenten synthetischen Harz, den Zustand der Reaktionsschicht und den Einführungszustand der Probeflüssigkeit in den Durchgang von außen zu beobachten.
- Bei den vorangegangen Beispielen kann eine Lecithinschicht ausgebildet werden durch Entwickeln einer organischen Lösungsmittellösung aus Lecithin durch die Probenzuführöffnung in die Reaktionsschicht und Trocknen derselben, um die Probeflüssigkeit gleichmäßiger bzw. stetiger der Reaktionsschicht zuzuführen.
- Wenn die Lecithinschicht vorgesehen wurde, kann die Probeflüssigkeit zugeführt werden, selbst wenn der Durchgang, welcher durch die Basis die Abdeckung und das Abstandsstück festgelegt bzw. definiert ist, nicht schmal genug sind, um eine Kapillarwirkung zu erzielen.
- Weil die Menge der Probeflüssigkeit, welche zugeführt wird, von der Kapazität des Durchgangs abhängt, besteht keine Notwendigkeit, diese vorher quantitativ zu bestimmen. Zusätzlich kann das Verdampfen der Probeflüssigkeit während der Messung minimiert werden, wodurch eine noch genauere Messung erhalten werden kann.
- Die Probezuführöffnung ist nicht notwendig von der Luftöffnung unterscheidbar. Es ist möglich, die Probeflüssigkeit durch die Luftöffnung zuzuführen unter Verwendung der Probenzuführöffnung als eine Luftöffnung.
- Die Oxidoreduktase, wie die GOD in der Reaktionsschicht, wird nicht besonders immobilisiert für das Hauptelektrodensystem. Jedoch wird die Dispersion bzw. Verteilung des Materials verhindert aufgrund einer erhöhten Viskosität der Probeflüssigkeit, wenn die Reaktionsschicht in der Probeflüssigkeit gelöst wird, weil die Reaktionsschicht das hydrophile Polymer enthält. Deshalb bewegt sich das Mate rial, welches die Reaktionsschicht bildet, nicht auf das Unterelektrodensystem in einem kurzen Zeitraum. Das Enzym kann effektiv bzw. wirksam immobilisiert werden, um eine noch zuverlässigere Messung durchzuführen.
- Wenn die Probeflüssigkeit durch die Probezuführöffnung zugeführt wurde, ist es effektiv, das Unterelektrodensystem in der Umgebung bzw. Nähe der Probenzuführöffnung vorzusehen. Auf diese Art schreitet die Probeflüssigkeit voran in Richtung auf die Luftöffnung durch die Probenzuführöffnung. Deshalb kann eine Möglichkeit der Bewegung der Oxidoreduktase während der Reaktion in Richtung auf das Unterelektrodensystem, welches auf der stromabwertigen Seite des Flusses der Probeflüssigkeit vorgesehen ist, verringert werden. Jedoch verursacht dies kein Problem, wenn die Oxidoreduktase auf dem Hauptelektrodensystem immobilisiert ist.
- Bei den Beispielen
5 ,6 und7 hat das Unterelektrodensystem das gleiche Elektrodenmuster wie das Hauptelektrodensystem. Jedoch muss dies nicht das gleiche sein. Zum Beispiel kann das Muster, wie in10 gezeigt, verwendet werden. - Es besteht keine Notwendigkeit, alle Reaktionsschichten, die erste Reaktionsschicht, die zweite Reaktionsschicht und die Referenzschicht in Kontakt bzw. Berührung mit den Elektrodensystemen, wie in den vorangegangenen Beispielen, auszubilden. Wenn die Basis, das Abstandsstück und die Abdeckung integriert sind, kann die Reaktionsschicht auf einer rückseitigen Oberfläche der Abdeckung und ähnlichem ausgebildet werden, um so dem Durchgang gegenüberzuliegen.
- Des Weiteren ist bei den oben beschriebenen Beispielen ein Verfahren zum quantitativen Bestimmen von Glukose und Fruktose gezeigt. Jedoch kann die vorliegende Erfindung umfassend bei Systemen verwendet werden, welche eine Enzymreaktion verwenden, als ein Alkoholsensor, ein Milchsäuresensor, ein Cholesterinsensor und ein Aminosäuresensor.
- Des Weiteren wurden bei den vorangegangenen Beispielen GOD und FDH als die Oxidoreduktase verwendet. Jedoch kann auch eine Alkoholoxidase, eine Lactatoxidase, eine Lactatdehydrogenase, eine Cholesterinoxidase, eine Xanthinoxidase und eine Aminosäureoxidase und ähnliches verwendet werden.
- Das hydrophile Polymer ist nicht auf die bei den Beispielen verwendete CMC beschränkt. Andere Cellulosederivate, wie Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose und Carboxymethylethylcellulose können verwendet werden. Des Weiteren kann der gleiche Effekt erhalten werden unter Verwendung von Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine oder deren Derivaten, Acrylsäure oder deren Salzen, Methacrylsäure oder deren Salzen, Stärke oder deren Derivate und Maleinanhydrid oder dessen Salzen.
- Als Elektronenakzeptoren können neben Kaliumferricyanid, welches in den oben erwähnten Beispielen verwendet wurde, p-Benzochinon, Phenazinmethosulfat, Methylblau und Ferrocenderivate verwendet werden.
- Des Weiteren sind bei den vorangegangenen Beispielen die Oxidoreduktase und die Elektronenakzeptoren in der Probeflüssigkeit gelöst. Jedoch können diese immobilisiert werden, um in der Probeflüssigkeit unlöslich zu sein.
- Das oben beschriebene Elektrodensystem ist nicht auf ein Zwei-Elektrodensystem beschränkt mit nur einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode. Ein Drei-Elektrodensystem umfassend eine zusätzliche Referenzelektrode kann verwendet werden, so dass noch genauere Werte erhalten werden können.
- Flüssigkeit enthalten ist unter Verwendung eines Biosensors, wobei der Biosensor enthält: ein elektrisch isolierendes Substrat (
1 ), ein Hauptelektrodensystem (19 ), das auf dem Substrat (1 ) ausgebildet ist und eine Arbeitselektrode (6 ) und eine Gegenelektrode (7 ) aufweist, eine Reaktionsschicht (5 ;50 ;51 ;52 ), welche in Verbindung bzw. in Kontakt mit oder in der Umgebung bzw. Nähe des Hauptelektro densystems (19 ) ausgebildet ist und eine Oxidoreduktase enthält, und ein Unterelektrodensystem (20 ) als eine Bezugselektrode bzw. Referenzelektrode, welches auf dem Substrat (1 ) vorgesehen ist innerhalb eines Abstands von dem Hauptelektrodensystem (19 ) und eine Arbeitselektrode (8 ) und eine Gegenelektrode (9 ) aufweist, und das Verfahren weist die Schritte auf: Detektieren einer Veränderung der elektrischen Eigenschaften zwischen der Arbeitselektrode (6 ;8 ) und der Gegenelektrode (7 ;9 ) in dem Hauptelektrodensystem (19 ) bzw. dem Unterelektrodensystem (20 ) und Bestimmen der Natur der Probenflüssigkeit auf der Grundlage bzw. Basis des Zeit-Unterschieds, welcher zum Detektieren der elektrischen Eigenschaften in den Haupt- und Unterelektrodensystemen benötigt wird.
Claims (7)
- Biosensor umfassend: ein elektrisch isolierendes Substrat (
1 ), welches ein Verbund aus zwei isolierenden Substraten ist und eine Vielzahl von Oberflächen hat, eine Vielzahl von Elektrodensystemen (19 ,20 ), welche auf mindestens zwei der Vielzahl von Oberflächen des Substrats (1 ) ausgebildet sind, wobei jedes der Elektrodensysteme (19 ,20 ) eine Arbeitselektrode (6 ,8 ) und eine Gegenelektrode (7 ,9 ) hat, und eine Vielzahl von Reaktionsschichten (52 ,53 ), welche auf mindestens zwei der Vielzahl von Oberflächen des Substrats (1 ) gebildet sind, wobei jede der Reaktionsschichten (52 ,53 ) eine Oxidoreduktase enthält, wobei die Vielzahl von Elektrodensystemen (19 ,20 ) jeweils auf verschiedenen Oberflächen des Substrats (1 ) gebildet sind, die Reaktionsschichten (52 ,53 ) auf den Oberflächen gebildet sind, auf welchen die Vielzahl von Elektrodensystemen (19 ,20 ) ausgebildet sind, und die Arten von Oxidoreduktasen, die in der Vielzahl von Reaktionsschichten (52 ,53 ) enthalten sind, verschieden voneinander sind. - Biosensor nach Anspruch 1, wobei das Substrat plattenförmig ist und wobei eines (
19 ) der Vielzahl von Elektrodensystemen auf einer Oberfläche des Substrats (1 ) gebildet ist und ein anderes Elektrodensystem (20 ) auf der gegenüberliegenden Oberfläche des Substrats (1 ) gebildet ist. - Biosensor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Oxidoreduktase aus einer Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Fructose-Dehydrogenase, Glukose-Oxidase, Alkohol-Oxidase, Lactase-Oxidase, Lactase- Dehydrogenase, Cholesterol-Oxidase, Xanthin-Oxidase und Aminosäuren-Oxidase.
- Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede der Vielzahl von Reaktionsschichten (
52 ,53 ) weiter einen Elektronenakzeptor und ein hydrophiles Polymer enthält. - Biosensor nach Anspruch 4, wobei das hydrophile Polymer aus einer Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Carboxymethyl-Cellulose, Hydroxyethyl-Cellulose, Hydroxypropyl-Cellulose, Methyl-Cellulose, Ethyl-Cellulose, Ethylhydroxyethyl-Cellulose, Carboxymethylethyl-Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinyl-Alkohl, Gelatine oder deren Derivate, Acrylsäure oder deren Salze, Methacrylsäure oder deren Salze, Stärke oder deren Derivate, und Maleinanhydrid oder deren Salze.
- Biosensor nach Anspruch 4 oder 5, wobei der Elektronenakzeptor aus einer Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Kalium-Ferricyanid, p-Benzoquinon, Phenazinmethosulfat, Methylenblau und Ferrocen.
- Verfahren zum Messen eines Substrats enthalten in einer Probenflüssigkeit, wobei ein Biosensor nach einem der vorhergehenden Ansprüche verwendet wird, um mindestens zwei verschiedene Substrate zu messen.
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