DE69222272T2 - Biosensor und Verfahren zur quantitativen Analyse - Google Patents
Biosensor und Verfahren zur quantitativen AnalyseInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Biosensor und ein Verfahren zum Erkennen und quantitativen Analysieren eines spezifischen Materials, das in einer Flüssigkeitsprobe wie Blut, Serum, Urin, Speichel und dergleichen enthalten ist.
- Beispiele für das zu analysierende spezifische Material sind Glucose, Milchsäure, Cholesterin, Alkohol, Harnstoff und dergleichen. Beispiele für Zusammensetzungen, die spezifisch mit diesen Zusammensetzungen reagieren, sind Oxydoreduktasen. Andere elektrochemisch aktive Zusammensetzungen sind Ascorbinsäure, Harnsäure und dergleichen.
- Zwar gibt es, wie aus dem Vorhergehenden ersichtlich, zahlreiche verschiedene zu analysierende spezifische Materialien, jedoch wird als Beispiel ein herkömmliches Assay unter Bezugnahme auf die quantitative Analyse von Milchsäure und Ascorbinsäure beschrieben.
- Milchsäure reagiert mit Laktatoxidase unter Erzeugung eines elektrochemisch aktiven Materials. Durch Messen des bei dieser Reaktion erzeugten elektrischen Stroms kann die Konzentration der Milchsäure in der Flüssigkeitsprobe gemessen werden. Jedoch enthält die Flüssigkeitsprobe oftmals andere elektrochemisch aktive Zusammensetzungen, wie Ascorbinsäure, die eine genaue Messung der Konzentration der Milchsäure stören.
- Zur Lösung dieses Problems hat die Anmelderin ein Verfahren zur quantitativen Analyse vorgeschlagen, das einen Biosensor verwendet, der eine Arbeitselektrode und eme Gegenelektrode aufweist, und bei dem ein biologisch aktives Material, beispielsweise ein Enzym, an einer Stelle angeordnet wird, die von einer Elektrodenoberfläche entfernt gelegen ist, um so eine gewünschte Zusammensetzung und Ascorbinsäure (EP- A-0 513 904) separat zu analysieren. Bei diesem Biosensor wird, da das Enzym an einer von der Elektrode entfernt gelegenen Stelle angeordnet ist, in einem frühen Zeitraum von der Zufuhr der Probe an, ein elektrisches Signal, das ausschließlich von der Ascorbinsäure abhängt, erkannt und anschließend diffundiert ein Reaktionsprodukt einer enzymatischen Reaktion und erreicht die Elektrodenoberfläche, wodurch eine Summe aus dem von der Ascorbinsäure abhängigen elektrischen Signal und dem von dem Reaktionsprodukt abhängigen Signal ermittelt wird. Anschließend wird das vom Reaktionsprodukt abhängige elektrische Signal aus den erkannten Signalwerten berechnet.
- Bei dem genannten Biosensor beruht die Trennung der elektrischen Signale auf der Diffüsion des Reaktionsprodukts. Wenn Blut analysiert wird, beeinflussen Blutkörperchen in hohem Maße die Difiusionsrate, so daß ein Hämatokrit Einfluß auf die Empfindlichkeit des Assays haben kann. Wenn Blut, das eine große Menge von Partikeln, beispielsweise Erythrozyten, enthält, analysiert wird, ist es erforderlich, das Assay mit dem separierten Serum durchzufhhren, während kein Problem bei der Analyse von Urin oder Speichel besteht.
- US-A-4 431 507 offenbart eine Enzymelektrode, die eine erste Elektrode mit wenigstens einer darauf immobilisierten Art von Enzym zum elektrochemischen Erkennen einer in Verbindung mit einer Reaktion zu erzeugenden Substanz basierend auf dem Enzym und eine zweite Elektrode zum elektrochemischen Entfernen von Materialien aufweist, welche die Erkennung mittels der ersten Elektrode stören. Die zweite Elektrode ist auf der Seite einer Testlösung angeordnet, die ein Substrat des Enzyms der ersten Elektrode enthält.
- EP-A-0 359 831 offenbart einen Biosensor mit einer isolierenden Basisplatte auf der, nacheinander, Leitungen, ein hauptsächlich aus Kohlenstoff bestehendes Elektrodensystem, eine Isolierschicht und eine aus einem Enzym und einem Elektronenakzeptor bestehende Reaktionsschicht ausgebildet sind. Eine Kalium-Hexazyanoferrat(III)- Schicht ist auf jedem der Elektrodensysteme ausgebildet, an denen ein Abstandshalter und eine Abdeckung haftend angebracht sind.
- FR-A-2 643 150 offenbart eine Zelle für die Analyse der Konzentration einer flüssigen Zusammensetzung irn Durchfluß, bestehend aus zwei massiven Halbblöcken, die durch eine Dichtung voneinander getrennt sind. Ein dünner Schlitz ist in die Dichtung geschnitten und dieser Zwischenraum enthält eine poröse Membran entweder aus synthetischem Material, wie Polystyrol, oder aus natürlichem Material, beispielsweise Collagen, auf der ein Enzym angebracht ist, das der zu analysierenden flüssigen Zusammensetzung entspricht. Einlaß- und Auslaßöffnungen ermöglichen die Zirkulation eines Flüssigkeitsfilms durch die Membran. Ein Minimum von drei Elektroden wird zur Messung des erzeugten elektrischen Stroms verwendet.
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Biosensor zu schaffen, der eine spezifische Zusammensetzung in einer Flüssigkeitsprobe, die einen Partikelbestandteil enthalten kann, wie beispielsweise Blut, quantitativ analysieren kann.
- Die Aufgabe wird mit einem Biosensor nach Anspruch 1 gelöst.
- Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur quantitativen Analyse einer spezifischen Zusammensetzung in einer Flüssigkeitsprobe zu schaffen.
- Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur quantitativen Analyse einer zu analysierenden Zusammensetzung in einer Flüssigkeitsprobe mit den folgenden Schritten vorgesehen:
- Zuführen der Flüssigkeitsprobe auf einen erfindungsgemäßen Biosensor,
- Erfassen eines elektrischen Signals, das ausschließlich von einem elektrochemisch aktiven Material am ersten Elektrodenteil abhängt, mit dem die Flüssigkeitsprobe zuerst in Kontakt kommt, nach einer bestimmten Zeitspanne vom ersten Kontakt der Flüssigkeitsprobe mit dem ersten Elektrodenteil, wenn die Flüssigkeitsprobe den zweiten Elektrodenteil erreicht, Erfassen eines elektrischen Signals, das sowohl von dem elektrochemisch aktiven Material als auch von der zu analysierenden Zusammensetzung am zweiten Elektrodenteil abhängt, und
- Berechnen zweier elektrischer Signale zum separaten quantitativen Analysieren des elektrochemisch aktiven Materials und der zu analysierenden Zusammensetzung.
- Fig. 1 ist eine explodierte perspektivische Darstellung eines erfindungsgemäßen Biosensors mit zwei Elektrodenteilen,
- Fig. 2 ist eine Kalibrierungskurve des zuerst gemessenen elektrischen Stroms gegenüber Ascorbinsäure,
- Fig. 3 ist eine Kalibrierungskurve des zweiten gemessenen elektrischen Stroms gegenüber Milchsäure,
- Fig. 4 ist eine Kalibrierungskurve, die durch Korrigieren der Kalibrierungskurve von Fig. 3 durch die Kalibrierungskurve von Fig. 2 erhalten wird, und
- Fig. 5 ist eine Grafik zur Darstellung des Einflusses von Hämatokrit auf die Analyse von Milchsäure bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem herkömmlichen Verfahren.
- Detaillierte Erfindungsbeschreibung
- Eine der Charakteristiken des erfindungsgemäßen Biosensors ist, daß die Arbeitselektrode wenigstens zwei Elektrodenteile hat. Ein Enzym ist an wenigstens einem derselben vorgesehen, während an dem anderen keines vorgesehen ist. Der erfindungsgemaße Biosensor weist eine Rille auf, welche die mehreren Elektrodenteile miteinander verbindet, um das von den störenden Materialien, beispielsweise Ascorbinsäure, abhängende Signal zu erkennen, bevor die Flüssigkeitsprobe den Elektrodenteil erreicht, der das Enzym aufweist. Auf diese Weise gelangt die Flüssigkeitsprobe zunächst an die Elektrodenteile, die kein Enzym aufweisen, und fließt anschließend in einem bestimmten Zeitraum durch eine Rille zu dem zweiten Elektrodenteil, das mit einem Enzym versehen ist.
- Der Ausdruck "elektrochemisch aktives Material" umfaßt hierin nicht nur ein Material, das Elektronen mit der Arbeitselektrode austauschen kann, sondern auch ein Material, das in ein Material umgewandelt wird, das durch Reaktion mit einem in dem Biosensor angeordneten Beschleuniger einen Elektronenaustausch mit der Arbeitselektrode betreiben kann. Beispiele für den Beschleuniger sind Kalium-Hexazyanoferrat(III), Ferrocen, p-Benzochinon und dergleichen.
- Der erfindungsgemäße Biosensor wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben.
- Fig. 1 ist eine explodierte perspektivische Darstellung eines Beispiels für den erfindungsgemzßen Biosensor.
- Der Biosensor kann wie folgt hergestellt werden. Die folgende Erläuterung betrifft einen Biosensor für die quantitative Analyse von Milchsäure. Es ist möglich die Ausbildung des Biosensors entsprechend der zu analysierenden Zusammensetzung zu modifizieren.
- Auf einem Polyethylen-Terephthalat-Bahnsubstrat 3, werden Kohlenstoffelektroden 1, 1' mit Silber-Leitungsdrähten 2 beispielsweise durch Seidenrasterdruck gebildet. Auf dem Substrat 3 ist ein Polyethylen-Terephthalat-Abstandhalter 4 mit Zwischenräumen 8, 9, 10, die eine Rille zum Aufhehmen der Test-Flüssigkeitsprobe bilden, beispielsweise mit einem doppelseitigen Klebeband oder einem Kleber haftend angebracht. Um samtuche Zwischenräume 8, 9, 10 auszufüllen, wird eine wäßrige Lösung, die 30 mM Kalium-Hexazyanoferrat(III) und 1% Hydroxypropylzellulose (30µl) enthält, tropfenweise zugeführt und zur Bildung einer festen Phase von Kalium-Hexazyanoferrat (III) getrocknet. Ferner wurde auf einem Teil der Arbeitselektrode 1' in den Zwischenraum 10 eine wäßrige Lösung, die 320 mM Kalium-Hexazyanoferrat(III), 1% Hydroxypropylzellulose und 20 mg/dl Laktatoxidase (3 µl) enthielt, tropfenweise zugegeben und zur Bildung einer festen Phase, die das Enzym und Kalium-Hexazyanoferrat(III) aufwies, getrocknet. Schließlich wurde eine Polyethylen-Terephthalat-Abdeckplatte 5 mit einer Öffnung 6 zum Zuführen einer Flüssigkeitsprobe und einer Öffnung 7 zum Entfernen der Probe an dem Abstandhalter 4 haftend angebracht, beispielsweise unter Verwendung eines doppelseitigen Klebebandes oder eines Klebers, um einen Milchsäuresensor zu erhalten.
- Unter Verwendung des gemäß der vorhergehenden Beschreibung hergestellten Biosensors kann Milchsäure im Blut quantitativ analysiert werden. Die Konzentrationen der Milchsäure und der Ascorbinsäure wurden wie in den Fign. 2 und 3 dargestellt geändert.
- Eine Blutprobe wurde aus der ersten Öffnung 6 absorbiert und eine erste Spannung von +200 mV wurde unmittelbar zwischen den Elektroden 1 und 1' angelegt. Nach 5 Sekunden konnte ein elektrischer Strom gemessen werden. Der erste gemessene Strom ist in Fig. 2 dargestellt.
- Die Blutprobe, welche den Zwischenraum 8 nur während der Messung des ersten elektrischen Stroms ausfüllt, floss durch den Zwischenraum 9 und erreicht den Zwischenraum 10. Zu diesem Zeitpunkt reagierte das Enzym zum ersten Mal mit Milchsäure in der Blutprobe. 115 Sekunden nach dem Zuführen der Blutprobe in den Zwischenraum 8 wurde die zweite Spannung von +200 mV für 5 Sekunden angelegt. Anschließend wurde der zweite elektrische Strom gemessen. Der gemessene elektrische Strom ist in Fig. 3 dargestellt.
- Fig. 2 zeigt eine Kalibrierungskurve des ersten gemessenen elektrischen Stroms, der von der Konzentration der Milchsäure in bezug zur Konzentration der Ascorbinsäure abhängt. Trotz einer breiten Schwankung der Konzentration der Milchsäure zwischen 0 und 200 mg/dl liegen die elektrischen Strome im wesentlichen auf einer Linie. Dies bedeutet, daß die Konzentration der Ascorbinsäure ohne den Einfluß der Milchsäure gemessen wurde.
- Fig. 3 ist eine Kalibrierungskurve des zweiten gemessenen elektrischen Stroms, der von der Konzentration der Ascorbinsäure in bezug zur Konzentration der Milchsäure abhängt. Mit zunehmender Konzentration der Ascorbinsäure verschob sich die Linie in Abhängigkeit von dem Reaktionsstrom entsprechend der Konzentration der Ascorbinsäure nach oben. Dies bedeutet, daß die Ascorbinsäure einen positiven Einfluß auf die Messung der Konzentration der Milchsäure hat.
- Anschließend konnte die Kalibrierungskurve von Fig. 3 unter Verwendung der Kalibrierungskurve von Fig. 2 korrigiert werden. Die korrigierte Kalibrierungskurve ist in Fig. 4 dargestellt. Trotz breiter Schwankungen der Konzentration der Ascorbinsäure lagen die korrigierten elektrischen Ströme auf einer Linie. Dies bedeutet, daß die Konzentration der Milchsäure ohne Einfluß seitens der Ascorbinsäure gemessen wurde.
- Einer Blutprobe, die durch Vermischen von Serum und Blutkörperchen in einem bestimmten Verhältnis hergestellt wurde, wurde Milchsäure in einer Konzentration von 100 mg/dl gegeben, und die elektrischen Ströme wurden unter Verwendung des gleichen Biosensors wie bei den vorhergehenden Beispielen gemessen. Die korrigierten elektrischen Ströme sind in Fig. 5 dargestellt.
- Zum Vergleich wurde die gleiche Blutprobe wie zuvor mit einem Biosensor zur Analyse von Milchsäure gemäß EP-A-0 513 804 analysiert. Die korrigierten elektrischen Ströme sind in Fig. 5 dargestellt.
- Bei dem Vergleichstest, bei dem der Prozentsatz des Hämatokrits anstieg, verringerte sich die Empfindlichkeit ab einem Prozentsatz von Hämatokrit von 40% oder mehr. Bei dem erfindungsgemäßen Biosensor verringerte sich die Empfindlichkeit bis zu einem Prozentsatz von Hämatokrit von 50%. Daher kann der erfindungsgemäße Biosensor Milchsäure im nicht-separierten Blut ohne Einfluß des Hämatokrits quantitativ analysieren.
Claims (3)
1. Biosensor zum elektrochemischen Erkennen eines elektrochemisch aktiven
Materials, das durch eine Reaktion einer zu analysierenden Zusammensetzung in einer
Flüssigkeitsprobe und wenigstens einer Zusammensetzung gebildet ist, die spezifisch
mit der zu analysierenden Zusammensetzung reagiert,
dadurch gekennzeichnet, daß
der Biosensor zwei Elektroden (1, 1') aufweist,
ein erster Teil der Elektroden lediglich einen Beschleuniger aufweist,
ein zweiter Teil und optionale weitere Teile der Elektroden den Beschleuniger und
wenigstens eine Zusammensetzung aufweisen, die spezifisch mit der zu analysierenden
Zusammensetzung reagiert, und
der Biosensor eine Rille (8, 9, 10) aufweist, die die Flüssigkeitsprobe zum ersten Teil
der Elektroden (1, 1') und anschließend zum zweiten Teil der Elektroden (1, 1') leitet.
2. Biosensor nach Anspruch 1, bei dem ein Beschleuniger auf wenigstens einem der
Elektrodenteile vorgesehen ist.
3. Verfallren zur quantitativen Analyse einer zu analysierenden Zusammensetzung in
einer Flüssigkeitsprobe mit den folgenden Schritten:
Zuführen der Flüssigkeitsprobe auf einen Biosensor nach Anspruch 1,
Erfassen eines elektrischen Signals, das ausschließlich von einem elektrochemisch
aktiven Material am ersten Elektrodenteil abhängt, mit dem die Flüssigkeitsprobe
zuerst in Kontakt kommt,
nach einer bestimmten Zeitspanne vom ersten Kontakt der Flüssigkeitsprobe mit dem
ersten Elektrodenteil, wenn die Flüssigkeitsprobe den zweiten Elektrodenteil erreicht,
Erfassen eines elektrischen Signals, das sowohl von dem elektrochemisch aktiven
Material als auch von der zu analysierenden Zusammensetzung am zweiten
Elektrodenteil abhängt, und
Berechnen zweier elektrischer Signale zum separaten quantitativen Analysieren des
elektrochemisch aktiven Materials und der zu analysierenden Zusammensetzung.
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