DE69714322T2 - Cholesterinsensor - Google Patents

Cholesterinsensor

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DE69714322T2
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Junko Iwata
Shiro Nankai
Tomohiro Yamamoto
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft einen Cholesterinsensor, welcher die Durchführung der quantitativen Bestimmung von Cholesterin in einer Probe mit hoher Genauigkeit auf schnelle und vereinfachte Weise erlaubt.
  • Als System zum quantitativen Bestimmen einer spezifischen Komponente in einer Probe auf schnelle und vereinfachte Weise, ohne dass ein Verdünnen oder Rühren einer Probenlösung erforderlich ist, wurden verschiedene Typen von Biosensoren bisher vorgeschlagen.
  • Als erstes wird ein Glucosesensor als Beispiel für die Biosensoren beschrieben.
  • Als Verfahren zum quantitativen Bestimmen von Glucose unter Verwendung einer Enzymelektrode ist im allgemeinen ein System bekannt, umfassend eine Kombination von Glucoseoxidase und einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode. Die Glucoseoxidase oxidiert selektiv ein Substrat, beispielsweise -D-Glucose zu D-Glucono--Lacton durch Verwenden von Sauerstoff als Elektronenmediator. Bei dieser Reaktion wird Suaerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert. Die quantitative Bestimmung von Glucose wird durchgeführt durch Messen der Menge an durch bei dieser Reaktion an der Sauerstoffelektrode verbrauchtem Sauerstoff oder durch Messen der Menge an Wasserstoffperoxid, erzeugt in dieser Reaktion durch die Wasserstoffperoxidelektrode einer Platinelektrode oder ähnlichem.
  • Durch oben erwähntes Verfahren ist es jedoch unmöglich, die Glucosekonzentrationen unter einer sauerstofffreien Bedingung zu messen. Deshalb wurde ein Glucosesensor, der keinen Sauerstoff verwendet, sondern einen Metallkomplex, wie Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat, ein Chinonderivat oder ähnliches, oder eine weitere organische Verbindung als Elektronenmediator verwendet, entwickelt. Bei diesem Typ Glucosesensor wird ein durch die Enzymreaktion erzeugtes Reduktionsmittel des Elektronenmediators durch eine Elektrode oxidiert. Die Konzentration der Glucose wird durch Messen des für die Oxidation erforderlichen Stroms bestimmt. Dieser Messmodus wurde weitverbreitet zur quantitativen Bestimmung von Substraten, welche von Glucose verschieden sind, verwrendet.
  • Als ein Beispiel für diesen Biosensortyp ist ein nachfolgend beschriebener Glucosesensor bekannt (japanische Patentoffenlegungsschrift Hei 2-062952).
  • Das heißt, der offenbarte Glucosesensor umfasst ein Elektrodensystem aus einer Messelektrode, einer Gegenelektrode und einer Referenzelektrode, bereitgestellt auf einer isolierenden Basisplatte mittels Siebdruck oder ähnlichem, und eine Reaktionsschicht, einschließend ein Reaktions-Reagenssystem aus einem hydrophilen Polymer, einer Oxidoreductase und einem Elektronenmediator und, falls erforderlich, wird ein Puffermittel zugegeben.
  • Wenn eine ein Substrat enthaltende Probenlösung auf die Reaktionsschicht getropft wird, wird die Reaktionsschicht aufgelöst und auf einen pH eingestellt, bei welchem die höchste Enzymaktivität mittels einer Pufferwirkung des Puffermittels erhältlich ist, und man läßt das Enzym mit dem Substrat reagieren, und der Elektronenmediator wird reduziert. Nach Vervollständigung der Enzymreaktion wird der reduzierte Elektronenmediator elektrochemisch oxidiert, und die Substratkonzentration der Probenlösung wird von einem für die Oxidation erforderlichen Strom abgeleitet.
  • Messungen verschiedener Substanzen sind mit den Biosensoren von diesem Typ theoretisch möglich durch Verwendung eines besonderen Enzyms, welches eine Substratspezifizität zu der zu messenden Substanz besitzt.
  • Wenn Cholesterinoxidase als Oxidoreductase verwendet wird, ist es möglich, einen Biosensor zum Messen von Cholesterin im Serum zu konfigurieren. Der als Index für die Diagnose verwendete Serum-Cholesterinpegel ist jedoch eine Summe der Konzentrationen von Cholesterin und Cholesterinester im Serum. Da der Cholesterinester nicht als Substrat für die Oxidationsreaktion mittels der Cholesterinoxidase wirken kann, ist es erforderlich, einen Prozess zum Umwandeln des Cholesterinesters in Cholesterin zu kombinieren, um den Serum-Cholesterinpegel als Index für die Diagnose zu bestimmen. Der Grund hierfür ist, dass das zur Zeit verwendete Verfahren durchgeführt wird auf Basis des folgenden allgemeinen Reaktionsschemas: Cholesterinester + H&sub2;O → Cholesterin + Fettsäure Cholesterin + Elektronenmediator (oxidierte Form) → Cholestenon + Elektronenmediator (reduzierte Form) Elektronenmediator (reduzierte Form) → Elektronenmediator (oxidierte Form)
  • Falls jedoch eine von Sauerstoff verschiedene Verbindung als Elektronenmediator zur Verursachung der Oxidationsreaktion von Cholesterin durch Cholesterinoxidase, wie oben beschrieben, verwendet wird, wird die Rate der Sekundärreaktion zwischen dem Sauerstoff und dem Enzym schneller als die Rate der Sekundärreaktion zwischen dem Elektronenmediator und dem Enzym. Dies verursacht eine Tendenz, dass im Fall der Auflösung von Sauerstoff in der Probenlösung, der durch die Elektrode gemessene Oxidationsstromwert des Elektronenmediators niedriger wird, als der Wert, welcher durch die Oxidationsreaktion des in einer Probenlösung enthaltenen Substrats in vollständiger Konjugation mit der Reduktionsreaktion des Elektronenmediators, bestimmt wird. Das oben erwähnte Schema zeigt daher ein Problem der ungenauen Antworten des Sensors, besonders gegenüber Substraten mit niedrigen Konzentrationen in der Probenlösung. Ein weiteres Problem stellt die verlängerte Reaktionszeit dar, welche weitere Probleme mit sich bringt, dass eine Erhöhung der getragenen Cholesterinoxidasemenge auf dem Sensor, um eine Zeit verbrauchende Reaktion zu vermeiden, zu einer Erhöhung der Herstellungskosten führt, und dass eine Zunahme der getragenen Menge an Reagens auf dem Sensor bei der Herstellung des Sensors physikalisch interferiert.
  • Ein Cholesterinsensor, umfassend ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode und einer Gegenelektrode und einem Reaktionsreagenssystem, enthaltend wenigstens Cholesterindehydrogenase, Nicotinamidadenindinucleotid und einen Elektronenmediator, ist in ED-A-0636879 beschrieben.
  • KURZER INHALT DER ERFINDUNG
  • Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Cholesterinsensors, welcher fähig ist, eine schnelle quantitative Bestimmung von Cholesterin mit hoher Genauigkeit durchzuführen.
  • Die Erfindung stellt einen Cholesterinsensor bereit, umfassend ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, und ein Reaktionsreagenssystem, wobei das Reaktionsreagenssystem wenigstens Cholesterindehydrogenase, Nicotinamidadenindinucleotid und einen Elektronenmediator enthält.
  • Es ist bevorzugt, dass das oben erwähnte Reaktionsreagenssystem Cholesterinesterase und ein oberflächenaktives Mittel enthält.
  • Im Einklang mit der Erfindung ist es möglich, einen Biosensor zu erhalten, welcher ein schnelles Messen der Cholesterinkonzentration ohne irgendwelchen Einfluss durch Sauerstoff erlaubt.
  • Während die neuen Merkmale der Erfindung insbesondere in den beigefügten Ansprüchen dargelegt sind, wird die Erfindung, sowohl hinsichtlich Organisation als auch Inhalt, besser verstanden und gewürdigt, zusammen mit anderen Zielen und Merkmalen, aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den Zeichnungen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER UNTERSCHIEDLICHEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNG
  • Fig. 1 stellt eine schematische Ansicht dar und zeigt die Konfiguration eines Cholesterinsensors gemäß einer Ausführungsform der Erfindung.
  • Fig. 2 stellt ein Diagramm dar, welches ein Messergebnis zeigt, das durch den Cholesterinsensor der gezeigten Ausführungsform erhalten wurde.
  • Fig. 3 stellt ein Diagramm dar, das eine Beziehung zwischen der Cholesterinkonzentration und dem Stromwert in einem Beispiel des Messergebnisses zeigt, welches mit dem Cholesterinsensor der gezeigten Ausführungsform erhalten wurde.
  • Fig. 4 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht und zeigt den Aufbau eines wesentlichen Teils des Cholesterinsensors bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • Fig. 5 zeigt eine vergrößerte perspektivische Ansicht und zeigt den offenbarten Cholesterinsensor unter Weglassung der Reaktionsschicht.
  • Fig. 6 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht der Konfiguration eines wesentlichen Teils des Cholesterinsensors bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • Fig. 7 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht der Konfiguration eines wesentlichen Teils des Cholessterinsensors bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • Fig. 8 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht der Konfiguration eines wesentlichen Teils des Cholesoterinsensors bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung.
  • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Bei einem Modus der Erfindung umfasst der Cholesterinsensor eine Lösung, welche die oben erwähnten Reaktionsreagenzien und das in die Lösung eingetauchte Elektrodensystem enthält. Bei einem weiteren Modus der Erfindung sind die Reaktionsreagenzien in getrocknetem Zustand oder nahe des Elektrodensystems positioniert. Diese Konfiguration schafft einen Cholesterinsensor mit niedrigen Herstellungskosten zum Messen von Cholesterin auf einfache und schnelle Weise. Das heißt, der Hauptkörper des Cholesterinsensors ist aufgebaut mittels einer isolierenden Basisplatte, einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, welche auf der oben erwähnten isolierenden Platte bereitgestellt sind, und ein Abdeckglied mit einer Rinne, welche auf der oben erwähnten isolierenden Basisplatte zum Definieren eines Zuführkanals für die Probe angeordnet ist.
  • In Bezug auf den Cholesterinsensor mit der oben erwähnten Konfiguration werden verschiedene bevorzugte Ausführungsformen in Bezug auf die Positionierung der Reaktionsschicht in den folgenden Abschnitten beschrieben.
  • Bei einem ersten Konfigurationsmodus ist die Reaktionsschicht über dem Elektrodensystem auf der Basisplatte positioniert. Wenn die Reaktionsschicht ausgebildet wird, ist es bevorzugt, eine Schicht aus einem hydrophilen Polymer, wie Carboxymethylcellulose, über dem Elektrodensystem auszubilden, um zu verhindern, dass die Komponenten der Reaktionsschicht, das Enzym und der Elektrodenmediator direkt die Oberfläche des Elektrodensystems berühren. Dies hemmt wirksam eine nachteilige Änderung der Leistungsfähigkeit des Elektrodensystems, verursacht durch Adsorption von Protein auf die Oberfläche des Elektrodensystems und die chemische Wirkung einer Substanz mit einer oxidierenden Fähigkeit.
  • Bei einer zweiten Ausführungsform der Konfiguration ist die Reaktionsschicht in eine Vielzahl von Schichten unterteilt, um sie über dem Elektrodensystem auf der Basisplatte und dem Abdeckglied bereitzustellen. Im Fall, dass ein Reaktionsreagens als Elektronenmediator Kalium-1,2-naphtochinon-4- sulfonat einschließt, welches relativ unstabil bei hohem pH ist, und als Puffermittel Tris(hydroxymethyl)aminomethanchlorwasserstoffsäurepuffer (im Folgenden abgekürzt als Trishydrochlorid), ist es bevorzugt, den Elektronenmediator und das Puffermittel separat anzuordnen. Beispielsweise wird eine Schicht des Elektronenmediators, wie Kalium-1,2-naphthochinon-4-sulfonat, auf dem Teil des Abdeckglieds positioniert, welcher dem Zuführkanal für die Probe ausgesetzt ist, und die Reaktionsschicht, welche das Puffermittel, wie Trishydrochlorid, enthält, ist über dem Elektrodensystem auf der Basisplatte positioniert.
  • Bei einer dritten Ausführungsform der Konfiguration sind eine Schicht des Elektronenmediators, wie Kalium-1,2- naphthochinon-4-sulfonat, und eine weitere Schicht, enthaltend das Puffermittel, wie Trishydrochlorid, auf der gleichen Basisplatte getrennt positioniert. Beispielsweise wird die das oben erwähnte Puffermittel einschließende Reaktionsschicht über dem Elektrodensystem ausgebildet, und die im Elektronenmediator, wie Kalium-1,2-naphthochinon-4-sulfonat, einschließende Schicht ist auf einem Teil stromaufwärts zum Elektrodensystem bereitgestellt, das heißt auf einem Teil nächst zur Einlassöffnung des Zuführkanals für die Probe. Es ist bevorzugt, eine Schicht aus dem hydrophilen Polymer neben der letzteren Schicht auszubilden, oder das hydrophile Polymer mit den Komponenten dieser Schichten zu mischen.
  • Eine vierte Ausführungsform der Konfiguration besitzt eine hydrophile Polymerschicht über dem Elektrodensystem auf der Basisplatte, und eine Reaktionsschicht ist ausgebildet auf einem Teil des Abdeckglieds, welcher dem Zuführkanal für die Probe ausgesetzt ist.
  • Bei der zweiten und dritten Ausführungsform der Konfiguration ist es auch bevorzugt, das Elektrodensystem mit einer Schicht des hydrophilen Polymer zu beschichten. Heim Ausbilden einer den Elektronenmediator und ähnliches einschließenden Schicht auf dem Abdeckglied gemäß der zweiten und dritten Ausführungsform der Konfiguration, ist es auch bevorzugt, eine Schicht des hydrophilen Polymer neben der Elektronenmediatorschicht auszubilden, oder das hydrophile Polymer mit den Komponenten der Schicht zu mischen.
  • Es ist auch bevorzugt, eine Schicht aus Lecithin auf oder nahe der oben erwähnten Reaktionsschicht bereitzustellen, um die Probenlösung glatt in das Elektrodensystem einführen zu können.
  • In der Erfindung ist der Elektronenmediator wenigstens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1,2-Naphtochinon-4-sulfat, Dimethylbenzochinon, 1-Methoxy-5- methylphenaziniumsulfat, Thionin und Meldolas Blau.
  • Es ist auch bevorzugt, Diaphorase in dem Reaktionsreagenssystem zu enthalten. Die Diaphorase katalysiert die Reaktion des Elektronenmediators mit dem Reduktionsmittel von Nicotinamidadenindinucleotid und verkürzt die für die Messung erforderliche Zeitperiode. Im Fall der Verwendung von Kalium-1,2- naphthochinon-4-sulfonat als Elektronenmediator, welcher eine sehr schnelle Oxidations-Reduktionsreaktion mit dem Reduktionsmittel von Nicotinamidadenindinucleotid ohne Hilfe der katalytischen Wirkung von Diaphorase verursacht, ist die Diaphorase nicht besonders erforderlich.
  • In folgenden Abschnitten werden spezifische Beispiele der Erfindung beschrieben.
  • BEISPIEL 1 (nicht erfindungsgemäß)
  • Fig. 1 zeigt schematisch einen Cholesterinsensor im Einklang mit diesem Beispiel. Eine Glaszelle 1, welche ein Rührstück 2 enthält, ist auf einem Rührgerät 8 fixiert. Die Glaszelle 1 enthält auch eine Messelektrode 4, eine Gegenelektrode 5 und eine Referenzelektrode 6, welche durch eine Elektrodenfixiervorrichtung 3 in der Glaszelle befestigt sind. Die Messelektrode besteht aus einer glasartigen Kohlenstoffelektrode, und die Gegenelektrode 5 besteht aus einer Platinelektrode. Die Referenzelektrode 6 ist eine Silber/Silberchlorid-Elektrode und ist mit der Glaszelle über eine Salzbrücke aus Agarosegel, imprägniert mit Kaliumchlorid (KCl) Lösung, verbunden. Diese Elektroden sind entsprechend mit einer Aufzeichnungsvorrichtung 10 über eine Vorrichtung 9 mit konstantem Potential verbunden. Eine Messapparatur gemäß diesem spezifischen Beispiel ist mit den oben erwähnten Komponenten konfiguriert.
  • Die oben erwähnte Glaszelle 1 wird mit einer Reaktionslösung 7 gefüllt und mittels des Rührstücks 2 gerührt. Die Reaktionslösung 7 besteht aus einer wässrigen Pufferlösung aus Trishydrochlorid enthaltender Cholesterindehydrogenase (im Folgenden abgekürzt als "ChDH"), Nicotinamidadenindinucleotid (im Folgenden abgekürzt als "NAD"), Kaliumferricyanid als Elektronenmediator und Diaphorase. Die wünschenswerten Konzentrationen der entsprechenden Reaktionsreagenzien sind wie folgt: ChDH: 10 Einheiten/ml, NAD: 25 mM/l, Diaphorase: 20 Einheiten/ml, Kaliumferricyanid: 100 mM/l und Trishydrochlorid: 0,3 M/l.
  • Abgesehen von den oben beispielhaft genannten wünschenswerten Konzentrationen ist es möglich, eine geeignete Antwort durch Verwendung von teilweise falls erforderlich unterschiedlichen Konzentrationen gemäß einer unterschiedlichen Messbedingung zu erhalten. Es ist wünschenswert, den pH-Wert der Reaktionslösung auf 8,0 bis 9,0 einzustellen. Falls der pH- Wert niedriger als 8,0 ist, wird die für die Reaktion erforderliche Zeitperiode merklich erhöht, und falls der pH-Wert nicht weniger als 9,0 beträgt, wird der Stromwert pro Einheitskonzentration Cholesterin klein, und umgekehrt wird ein Reststromwert erhöht, vermutlich aufgrund einer von der Enzymreaktion verschiedenen chemischen Reaktion.
  • Ein Potential von 500 mV wird an die oben erwähnte Messelektrode 4 in Bezug auf die Referenzelektrode 6 angelegt. Wenn eine Cholesterin enthaltende Probenlösung auf die Reaktionslösung 7 über eine Öffnung 11 auf der Elektrodenfixiervorrichtung 3 zugetropft wird, wird das Cholesterin zu Cholestenon mittels ChDH oxidiert. Gepaart mit dieser Reaktion wird NAD zu NADH reduziert. Das erzeugte NADH gibt/empfängt Elektronen zu und von Ferricyanidionen und wird wiederum zu NAD oxidiert. Die Ferricyanidionen empfangen Elektronen von NADH und werden zu Ferricyanidionen reduziert.
  • Die Konzentration der auf oben erwähnte Weise hergestellten Ferrocyanidionen ist direkt zu der Cholesterinkonzentration in der Probenlösung proportional. Die Oxidations/Reduktionsreaktion wird mittels Diaphorase katalysiert. Obwohl die Reaktion spontan unter einer Bedingung ohne Diaphorase fortschreitet, ist es möglich, dass die Reaktion sehr schnell in Gegenwart von Diaphorase fortschreitet.
  • Wie zuvor beschrieben, da das Potential von 500 mV an die Messelektrode 4 in Bezug auf die Referenzelektrode 6 angelegt wurde, geben Ferricyanidionen Elektronen an die Messelektrode 4 ab und kehren zu Ferricyanidionen zurück. Da weiterhin die Messelektrode 4 eine glasige Kohlenstoffelektrode ist und das Potential der Lösung in der Nachbarschaft der Messelektrode 4500 mV in Bezug auf die Silber/Silberchloridelektrode beträgt, wird angenommen, dass die Menge an NADH, welches an der Messelektrode elektrochemisch oxidiert wird, sehr klein ist. Durch Beobachten der Übertragung von Elektronen, die von der Messelektrode 4 als elektrischer Strom angenommen werden, ist es möglich, quantitativ die Cholesterinkonzentration der Probenlösung zu bestimmen. Im Fall von Serum, bei welchem die Probenlösung Cholesterinester enthält, ist es möglich, eine Summe an Konzentrationen von Cholesterinester und Cholesterin zu messen, durch Zugeben von Cholesterinesterase und ein oberflächenaktives Mittel zur Förderung der katalytischen Eigenschaft von Cholesterinesterase zu der Reaktionslösung 7, zusätzlich zu den oben erwähnten Komponenten.
  • Fig. 2 und Fig. 3 zeigen die Ergebnisse der im Einklang mit diesem Beispiel durchgeführten Messungen.
  • Fig. 2 zeigt ein Diagramm, welches eine Änderung im Stromwert wiedergibt. Die entsprechenden Pfeile in der Figur repräsentieren die entsprechenden Cholesterinkonzentrationen in dar Reaktionslösung nach Zugabe von Tropfen der Substratlösung (30 ul) zu der Reaktionlösung. Fig. 3 zeigt ein Diagramm, welches eine Beziehung zu dem Stromwert und der Cholesterinkonzentration gemäß Fig. 2 wiedergibt. Wie durch diese Diagramme gezeigt, erhöht sich der Stromwert bei Zutropfen von Cholesterin und erreicht einen ständigen Wert in etwa einer Minute, und der Stromwert zeigt eine sehr bevorzugte lineare Beziehung mit der Cholesterinkonzentration.
  • BEISPIEL 2 (nicht erfindungsgemäß)
  • Fig. 4 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht des Cholesterinsensors im Einklang mit diesem Beispiel, und
  • Fig. 5 zeigt eine vergrößerte perspektivische Ansicht des Cholesterinsensors unter Weglassung der Reaktionsschicht.
  • In diesen Figuren ist eine isolierende Basisplatte 12 aus Polyethylenterephthalat hergestellt. Auf dieser isolierenden Basisplatte 12 sind Verbindungsleiter 13 und 14 aus Silberpaste mittels Siebdruck ausgebildet. Ein eine Messelektrode 15 und eine Gegenelektrode einschließendes Elektrodensystem ist durch Aufdrucken einer elektrisch leitenden Kohlenstoffpaste, enthaltend ein Harzbindemittel, und einer isolierenden Schicht 17 auf der isolierenden Basisplatte 12 durch Aufdrucken einer elektrisch isolierenden Paste, ausgebildet. Die isolierende Schicht 17 dient dazu, Flächen der ausgesetzten Teile der Messelektrode 15 und der Gegenelektrode 16 konstant zu definieren und um teilweise die Verbindungsleitungen 13 und 14 zu bedecken.
  • Nachdem der Teil der Elektroden auf diese Weise konfiguriert ist, wird eine wässrige Lösung aus einem hydrophilen Polymer, Natriumsalz von Carboxymethylcellulose (im Folgenden abgekürzt als "CMC") (0,5 Gew.-%) auf das Elektrodensystem aufgetropft und in einem Hitzetrockner bei 50ºC 10 Minuten getrocknet, um dabei eine CMC-Schicht 18 auszubilden.
  • Anschließend wird eine gemischte wässrige Lösung hergestellt, enthaltend ChDH, abgeleitet von Nocardia-Spezien mit 10 Einheiten/ml, NDA, welches ein Coenzym ist, mit 50 mM/l, Diaphorase, welches ein von Pseudomonas-Spezien abgeleitetes Enzym ist, mit 10 Einheiten/ml, Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenmediator ist, mit 50 mM/l, Cholesterinesterase (im Folgenden abgekürzt als "ChE"), abgeleitet von Pseudomonas- Spezien, mit 1 k Einheiten/ml, n-Octyl--D-thioglucosid, welches ein oberflächenaktives Mittel ist mit 0,5 Gew.-%, und Trishydrochlorid, welches ein Puffermittel ist, mit 0,3 M/l, und die Mischung wird auf pH 8,5 eingestellt.
  • Durch Auftropfen dieser gemischten wässrigen Lösung (5 ul) auf die CMC-Schicht 18 und Trocknen in einem Lufttrockner bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurde ein ChDH-ChE- Kaliumferricyanid-oberflächenaktives-Mittel-NAD-Diaplhorase- Puffermittelschicht 19 ausgebildet.
  • In dieser Schicht ist CMC teilweise mit ChDH, ChE, Kaliumferricyanid, n-Octyl--D-thioglucosid, NAD und einem Puffermittel gemischt, und das Ganze liegt in einem Zustand eines dünnen Films mit einer Dicke von verschiedenen Mikrometern vor. Das heißt, wenn die oben erwähnte gemischte wässrige Lösung auf die CMC-Schicht aufgetropft wird, wird die zuerst gebildete CMC-Schicht auf einmal aufgelöst, und im nachfolgenden Trocknungsprozess wird eine Schicht in einem Zustand der Mischung mit dem Enzym usw. gebildet. Da jedoch bei diesem Prozess nicht gerührt wird, wird ein komplett gemischter Zustand nicht erreicht, und ein Zustand wird aufrechterhalten, bei welchem die Oberfläche des Elektrodensystems nur mit CMC bedeckt ist. Bei diesem Prozess sind das Enzym, der Elektronenmediator und ähnliche nicht in Berührung mit der Oberfläche des Elektrodensystems, wodurch eine Änderung in den Charakteristiken des Elektrodensystems aufgrund der Adsorption von Protein auf die Oberfläche des Elektrodensystems oder eine chemische Wirkung durch die Substanz mit einer Oxidationsfähigkeit, wie Kaliumferricyanid, weniger auftritt. Als Ergebnis ist es möglich, einen Sensor mit einer Sensorantwort mit hoher Genauigkeit zu erhalten.
  • Auf die ChDH-ChE-Kaliumferricyanid-oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19 werden 5 ul einer 0,5 Gew.-%igen Toluollösung aus Phosphatidylcholin aufgetropft und getrocknet, wodurch eine Lecithinschicht 20 ausgebildet wird. Diese Lecithinschicht erleichtert die glatte Einführung der Probenlösung. Diese Lecithinschicht ist nicht für die Enzymreaktion unerlässlich.
  • Nach Ausbilden der Reaktionsschicht, umfassend die CMC-Schicht 18, die ChDH-ChE-Kaliumferricyanid- oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19, und die Lecithinschicht 20, ist der Cholesterinsensor vollständig durch Befestigen eines Abdeckglieds, zusammengesetzt aus einem Raumteiler 24 und einem Deckel 25 an der isolierenden Basisplatte 12 in einer positionellen Beziehung, wie dies durch die strichpunktierten Linien in Fig. 4 gezeigt ist. Bei dem auf diese Weise zusammengebauten Sensor wird ein Zuführkanal 28 für die Probe am Teil eines Schlitzes 26 des Räumteilers 24 ausgebildet.
  • Dieser Cholesterinsensor führt auf einfache Weise eine Probenlösung in einen Teil der Reaktionsschicht ein, und bringt auf einfache Weise die Probenlösung in Berührung mit einem Teil einer Einlassöffnung des Zuführkanals 28 für die Probe an der Spitze des Sensors. Da die Zufuhrmenge der Probenlösung vom Volumen des Zuführkanals 28 für die Probe abhängt, ist es nicht notwendig, die Menge zuvor zu quantifizieren. Es ist weiterhin möglich, das Verdampfen der Probenlösung während der Messung zu unterdrücken, wodurch eine Messung mit hoher Genauigkeit ermöglicht wird. In Fig. 4 bezeichnet das Bezugszeichen 27 ein Luftloch, welches auf dem Deckel 25 bereitgestellt ist. Wenn ein transparentes Polymer als Material für den Deckel 25 und den Raumteiler 24 verwendet wird, ist es leicht möglich, den Zustand der Reaktionsschicht und die Bedingung des Einführens der Probenlösung außerhalb des Sensors zu beobachten.
  • Drei Minuten nach Zugabe der Probenlösung auf 3 ul einer Cholesterinstandardlösung zu dem so konfigurierten Cholesterinsensor über die Einlassöffnung des Zuführkanals 28 für die Probe wird eine Pulsspannung von +0,5 V an die Messelektrode in anodischer Richtung angelegt, unter Verwendung der Gegenelektrode als Referenz, und der Stromwert wird nach 5 Sekunden gemessen.
  • Wenn die Probenlösung die Reaktionsschicht erreicht, löst die Lösung zunächst die Lecithinschicht 20 und nachfolgend löst sie die ChDH-ChE-Kaliumferricyanid-oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19. Der in der Probenlösung enthaltene Cholesterinester wird nochmals mittels n-Octyl- -D-thioglucosid dispergiert, welches in der ChDH-ChE- Kaliumferricyanid-oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase- Puffermittellösung 19 enthalten ist, und anschließend in Cholesterin mittels katalytischer Wirkung von ChE umgewandelt. Das erzeugte Cholesterin wird mittels ChDH oxidiert, und NAD wird reduziert in Konjugation mit der Oxidationsreaktion, wodurch NADH erzeugt wird. Das erzeugte NADH wird weiterhin nochmals durch katalytische Wirkung der Diaphorase oxidiert, um zu NAD zurückverwandelt zu werden. Gepaart mit der Oxidationsreaktion von NADH werden Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen reduziert.
  • Die Anwendung der oben erwähnten Pulsspannung erzeugt einen Oxidationsstrom sowohl für die erzeugten Ferricyanidionen und teilweise für NADH. Der Stromwert entspricht der Konzentration des Substratcholesterins.
  • Bei diesem Verfahren wird angenommen, dass, obwohl die Möglichkeit besteht, dass der beobachtete Stromwert den Oxidationsstrom für Teil-NADH einschließt, da ein Strom, welcher einer elektrochemischen Oxidation von NADH auf der Messelektrode zugesprochen wird, einen sehr kleinen Anteil des gesamten Messwerts besitzt, da die Zeitperiode, welche für die Messung erforderlich ist, durch Zugabe von Diaphorase zu dem Reaktionsreagenssystem verkürzt wird.
  • BEISPIEL 3
  • Fig. 6 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht des Cholesterinsensors dieses Beispiels. Die gleichen Bezugszeichen wie in Fig. 4 und Fig. 5 werden in der Figur verwendet, um gleiche oder ähnliche Komponenten zu bezeichnen, und diese Bezeichnungsweise wird auf die nachfolgende Beschreibung und die Zeichnungen angewandt.
  • Die CMC-Schicht 18 wird auf dem Elektrodensystem auf der Basisplatte auf ähnliche Weise, wie in Beispiel 2 ausgebildet. Auf einem ausgesparten Teil des Abdeckglieds, konfiguriert mit dem Raumteiler 24 und dem Deckel 25, entsprechend dem Schlitz 26 des Raumteilers 24, welcher dem Zuführkanal 28 für die Probe ausgesetzt ist, wird eine weitere CMC-Schicht 23 ausgebildet, durch Auftropfen einer 0,5 Gew.-%igen wässrigen Lösung aus CMC, und nachfolgendem Trocknen. Durch Auftropfen von 5 ul einer 50 mM Lösung aus Kalium-1,2-naphthochinon-4-sulfonat (im Folgenden abgekürzt als "NQS") zur Abdeckung der CMC- Schicht 23 und nachfolgendem Trocknen in Luft bei Raumtemperatur, wird eine NQS-Schicht 21 ausgebildet.
  • Falls eine obere Reaktionsschicht auf der Innenseite des Abdeckglieds, umfassend den Raumteiler 24 und den Deckel 25, ausgebildet ist, ist es bevorzugt, diese CMC-Schicht 23 bereitzustellen, da die Reaktionsschicht leicht abfällt, falls die CMC-Schicht 23 weggelassen wird. Anstelle der CMC-Schicht 23 und der NQS-Schicht 21 ist es möglich, eine Schicht zu schaffen, enthaltend sowohl CMC und NQS, durch Auftropfen einer wässrigen CMC-Lösung, welche NQS löst.
  • Da NQS relativ unstabil bei hohem pH ist, sollte es nicht in einer Lösung gelöst werden, welche ein Puffermittel, wie Trishydrochlorid, enthält, und lange nach dem Auflösen ruhig stehen gelassen werden. Falls jedoch NQS vom Puffermittel abgetrennt ist, wie offenbart, ist es möglich, NQS in einem Sensor als Elektronenmediator einzuverleiben.
  • Anschließend wird eine gemischte wässrige Lösung hergestellt, enthaltend ChDH, abgeleitet von Nocardia-Spezien mit 10 Einheiten/ml, NDA, welches ein Coenzym ist, mit 50 mN/l, ChE, abgeleitet von Pseudomonas-Spezien, mit 1 k Einheiten/ml, n-Octyl--D-thioglucosid, welches ein oberflächenaktives Mittel, mit 0,5 Gew. -%, und Trishydrochlorid, welches ein Puffermittel ist, mit 0,3 M/l, und die Mischung wird auf pH 8,5 eingestellt.
  • Durch Auftropfen dieser gemischten wässrigen Lösung (5 ul) über die CMC-Schicht 18 auf dem Elektrodensystem und Trocknen in trockener Luft bei Raumtemperatur für 30 Minuten, wird eine ChDH-ChE-oberflächenaktives-Mittel-NAD- Puffermittelschicht 22 ausgebildet.
  • Im Fall, dass NQS als Elektronenmediator verwendet wird, welches eine sehr schnelle Oxidations-Reduktionsreaktion mit NADH ohne Hilfe einer katalytischen Wirkung durch Diaphorase verursacht, kann die Diaphorase wie in diesem Beispiel weggelassen werden. Falls es notwendig ist, die Messzeit weiter zu verkürzen, kann die Diaphorase in das System dieses Beispiels eingeschlossen werden.
  • Über der ChDH-ChE-oberflächenaktives Mittel-NAD- Puffermittelschicht 22 wird eine Lecithinschicht 20 ausgebildet durch Auftropfen von 5 ul einer 0,5 Gew.-%igen Toluollösung aus Phosphatidylcholin und nachfolgendem Trocknen auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2. Auf oben erwähnte Weise wird eine Grundreaktionsschicht des Cholesterinsensors ausgebildet.
  • Durch Kombinieren des Abdeckglieds, umfassend den Raumteiler 24 und den Deckel 25, mit der oberen Reaktionsschicht und der isolierenden Basisplatte mit der Bodenreaktionsschicht, ist der Cholesterinsensor vervollständigt. Fig. 6 zeigt die Struktur des so erhaltenen Cholesterinsensors.
  • Die Antwort der mit diesem so ausgestalteten Cholesterinsensor erhaltenen Cholesterinstandardlösung zeigt eine akzeptierbare Linearität zur Cholesterinkonzentration.
  • BEISPIEL 4
  • Fig. 7 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht des Cholesterinsensors gemäß diesem Beispiel.
  • Die CMC-Schicht 18 ist auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 auf dem Elektrodensystem der Basisplatte ausgebildet. Auf einer Position des Zuführkanals für die Probe 28 zwischen der CMC-Schicht 18 und dem offenen Einlass an der Spitze der Basisplatte, welche nicht den Teil der Elektroden betrifft, ist eine weitere CMC-Schicht 29 so ausgebildet, dass sie nicht in Berührung mit der CMC-Schicht 18 steht, auf gleiche Weise, wie für die CMC-Schicht 18 angewandt. Die CMC-Schicht 29 ist nicht notwendigerweise die gleiche, wie die CMC-Schicht 18.
  • Anschließend wird eine gemischte wässrige Lösung hergestellt, enthaltend ChDH, abgeleitet von Nocardia-Spezien mit 10 Einheiten/ml, NDH, welches ein Coenzym ist, mit 50 mM/l, Diaphorase, das Enzym abgeleitet von Pseudomonas-Spezien, mit 10 Einheiten/ml, Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenmediator ist, mit 50 mM/l, ChE, abgeleitet von Pseudomonas-Spezien, mit 1 k Einheiten/ml, n-Octyl--D-thioglucosid, welches ein oberflächenaktives Mittel ist, mit 0,5 Gew.-% und Trishydrochlorid, welches ein Puffermittel ist, mit 0,3 M/l, und die Mischung wurde auf pH 8,5 eingestellt.
  • Durch Auftropfen dieser wässrigen Lösung (5 ul) auf die CMC-Schicht 18, so dass sie nicht die CMC-Schicht 29 berührt, und Trocknen in trockener Luft bei Raumtemperatur für 30 Minuten wird eine ChDH-ChE-Kaliumferricyanid- oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19 ausgebildet.
  • Durch Auftropfen von 5 ul einer 50 mM Lösung aus NQS in der Weise, dass die CMC-Schicht 29 bedeckt wird, und nachfolgendem Trocknen in Luft bei Raumtemperatur, wird eine NQS- Schicht 21 ausgebildet. Anstelle der CMC-Schicht 29 und der NQS-Schicht 21 ist es möglich, eine Schicht bereitzustellen, welche sowohl CMC und NQS enthält, durch Auftropfen einer NQS enthaltenden wässrigen CMC-Lösung. Da NQS relativ instabil bei hohem pH ist, sollte es nicht in einer Lösung aufgelöst werden, enthaltend ein Puffermittel wie Trishydrochlorid, und es sollte lange nach dem Auflösen still stehen gelassen werden. Wie offenbart ist, durch Abtrennen von NQS aus dem Puffermittel, ist es möglich das NQS in einen Sensor als Elektronenmediator einzuverleiben. Durch Auftropfen der oben erwähnten NQS-Lösung auf die CMC-Schicht 29 zur Ausbildung der NQS-Schicht 21 sollte dafür Sorge getragen werden, dass die NQS-Lösung nicht in Berührung mit der ChDH-ChE-Kaliumferricyanid-oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19 steht.
  • Auf sowohl die ChDH-ChE-Kaliumferricyanid- oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19 und die NQS-Schicht 21 wird eine Lecithinschicht 20 ausgebildet durch Auftropfen von 5 ul einer 5 Gew.-%igen Toluollösung aus Phosphatidylcholin und nachfolgendem Trocknen. Obwohl die Gegenwart dieser Lecithinschicht die glattere Einführung der Probenlösung erleichtert, ist diese Lecithinschicht nicht für die Enzymreaktion unerlässlich. Die Lecithinschicht 20 kann auch auf der Oberfläche einer Vertiefung oder Aussparung ausgebildet sein, definiert durch das Abdeckglied, umfassend den Raumteiler 24 und den Deckel 25, das heißt den Oberflächen, welche dem Zuführkanal für die Probe ausgesetzt sind.
  • Nach Ausbilden der Reaktionsschicht, umfassend die CMC-Schicht 18, die GMC-Schicht 29, die ChDH-ChE- Kaliumferricyanid-oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase- Puffermittelschicht 19, die NQS-Schicht 21 und die Lecithinschicht 20, wird der Cholesterinsensor vervollständigt durch Befestigen des Deckels 25 und eines Raumteilers 24 an der isolierenden Basisplatte 12 in einer positionellen Beziehung, wie diese durch die strichpunktierten Linien in Fig. 4 gezeigt sind.
  • BEISPIEL 5 (nicht erfindungsgemäß)
  • Fig. 8 zeigt eine longitudinale Querschnittsansicht des Cholesterinsensors gemäß diesem Beispiel.
  • Dia CMC-Schicht 18 ist auf dem Elektrodensystem auf der Basisplatte ausgebildet durch Auftropfen einer 0,5 Gew.- %igen wässrigen Lösung aus CMC auf ähnliche Weise, wie in Beispiel 2.
  • Nachfolgend wird eine weitere CMC-Schicht 23 auf einer Vertiefung, definiert durch das Abdeckglied, umfassend den Raumteiler 24 und den Deckel 25, ausgebildet durch Auftropfen einer 0,5 Gew.-%igen wässrigen Lösung aus CMC auf ähnliche Weise wie in Beispiel 3.
  • Anschließend wird eine gemischte wässrige Lösung hergestellt, enthaltend ChDH mit 10 Einheiten/ml, NDA mit 50 mM/l, Diaphorase mit 10 Einheiten/ml, Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenmediator ist, mit 50 mM/l, ChE, abgeleitet von Pseudomonas-Spezien, mit 1 k Einheiten/ml, n-Octyl--D- thioglucosid, welches ein oberflächenaktives Mittel ist, mit 0,5 Gew.-%, und Trishydrochlorid, welches ein Puffermittel ist, mit 0,3 M/l, und die Mischung wird auf pH 8,5 eingestellt.
  • Durch Auftropfen von 5 ul dieser gemischten wässrigen Lösung über die CMC-Schicht 23, so dass die CMC-Schicht 23 bedeckt ist, und Trocknen in getrockneter Luft bei Raumtemperatur für 30 Minuten wird eine ChDH-ChE-Kaliumferricyanid- oberflächenaktives Mittel-NAD-Diaphorase-Puffermittelschicht 19 ausgebildet.
  • Durch Befestigen des den Raumteiler 24 und den Deckel 25 umfassenden Abdeckglieds, ausgerüstet mit der Reaktionsschicht, auf oben erwähnte Weise an der Basisplatte 12 wird ein Cholesterinsensor vervollständigt. Diese Konfiguration des Trennens der Reaktionsschicht von dem Elektrodensystem und Ausbilden nur der CMC-Schicht auf der Oberfläche der Elektroden zeigt einen höheren Stromwert pro Einheitssubstratkonzentration, als eine Konfiguration, bei der eine Reaktionsschicht auf der Oberfläche der Elektroden bereitgestellt wird.
  • Die Mengen der entsprechenden Reagenzien, welche auf den in den vorhergehenden Beispielen gezeigten Reaktionsschichten getragen sind, sind nur beispielhaft, und daher ist die Erfindung nicht auf diese Mengen beschränkt.
  • Um das Einführen der Probenlösung in das Reaktionsreagenssystem zu erleichtern, kann der erfindungsgemäße Cholesterinsensor eine Schicht bereitstellen, enthaltend ein Lipid, wie eine Lecithinschicht 20 über der Oberfläche der Reaktionsschicht, wie dies in Beispiel 2 gezeigt ist. Zusätzlich können zu dem in den vorhergehenden Beispielen verwendeten Phosphatidylcholin ein amphiphatisches Lipid, wie Phsphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, oder ein anderes Phospholipid auch als Lipid für die Anwendung eingesetzt werden.
  • Zusätzlich zu der in den vorhergehenden Beispielen verwendeten Carboxymethylcellulose (CMC) können auch Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, ein weiteres wasserlösliches Cellulosederivat, wie Ethylcellulose und Hydroxypropylcellulose in besonderem, Gelatine, Polyacrylsäure und deren Salze, Stärke und deren Derivate, Maleinsäureanhydrid und deren Salze, Polyacrylamid, Methacrylatharz, Poly-2-hydroxyethylmethacrylat und ähnliche auch als hydrophiles Polymer zur Ausbildung der Reaktionsschicht verwendet werden.
  • In den vorhergehenden Beispielen wurde von Pseudomonas abgeleitetes ChE als ChE und n-Octyl--D-thioglucosid als oberflächenaktives Mittel verwendet, jedoch kann eine bevorzugte Antwort auch erhalten werden unter Verwendung von Lubrol PX (Handelsname), Natriumcholat, Dodecyl--D-maltosid oder DK- Ester (Handelsname), falls Pseudomonas-abgeleitetes ChE angenommen ist. Weiterhin kann von Säugetierpankreas abgeleitetes ChE ebenso als ChE verwendet werden. In solch einem Fall kann eine bevorzugtere Antwort erhalten werden, falls ein oberflächenaktives Mittel mit einem Gallensäuregerüst, wie Natriumcholat oder ähnlichem kombiniert wird.
  • In den vorhergehenden Beispielen 2 bis 5 kann eine genauere Messung erhalten werden durch Verwendung eines 3- Elektroden-Systems, welches weiterhin eine Referenzelektrode einschließt, obwohl die Beschreibung beschränkt ist auf ein 2- Elektroden-System, umfassend nur die Messelektrode und die Gegenelektrode.
  • Wie zuvor beschrieben, ist es gemäß der Erfindung möglich, einen Cholesterinsensor herzustellen, welcher fähig ist, die Cholesterinkonzentration in der Probenlösung in kurzer Periode ohne irgendwelchen Einfluss durch Sauerstoff zu messen.
  • Es wird verstanden, dass verschiedene andere Modifikationen offensichtlich und leicht durch den Fachmann durchführbar sind, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Demgemäß ist es nicht beabsichtigt, dass der Umfang der beigefügten Ansprüche auf die hier dargelegte Beschreibung beschränkt ist, sondern dass die Ansprüche so ausgestaltet sind, dass sie sämtliche Merkmale an patentierfähigem Neuem, welches in der Erfindung liegt, umfasst, einschließlich sämtlicher Merkmale, welche als Äquivalente durch den Fachmann behandelt werden, an welchen sich diese Erfindung richtet.
  • Obwohl die Erfindung in Bezug auf die gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist zu verstehen, dass solch eine Offenbarung nicht als beschränkend interpretiert werden kann. Verschiedene Änderungen und Modifikationen werden für den Fachmann, an den sich die Erfindung richtet, ersichtlich, nachdem er die obige Offenbarung gelesen hat.

Claims (7)

1. Cholesterin-Sensor, umfassend ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode (4) und einer Gegenelektrode (5) und ein Reaktionsreagenzsystem, worin das Reaktionsreagenzsystem wenigstens Cholesterindehydrogenase, Nikotinamidadenindinucleotid und einen Elektronenmediator enthält, wobei der Elektronenmediator wenigstens einer ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1,2-Naphthochinon-4- sulfat, Dimethylbenzochinon, 1-Methoxy-5-methylphenaziniumsulfat, Thionin und Meldola's Blau.
2. Cholesterin-Sensor nach Anspruch 1, worin das Reaktionsreagenzsystem Diaphorase enthält.
3. Cholesterin-Sensor nach Anspruch 1, worin das Reaktionsreagenzsystem Cholesterinesterase und ein oberflächenaktives Mittel enthält.
4. Cholesterin-Sensor, umfassend eine isolierende Basisplatte (12), ein Elektrodensystem mit einer Messelektrode (15) und einer Gegenelektrode (16), welche auf der isolierenden Basisplatte bereitgestellt sind, ein Abdeckglied (24, 25) mit einer Rinne, welche auf der isolierenden Basisplatte angeordnet ist, um einen Zuführkanal (28) für eine Probe zu definieren, welcher sich von einem Ende der Basisplatte zum Elektrodensystem erstreckt, und eine Reaktionsschicht, welche auf der Basisplatte oder dem Abdeckglied bereitgestellt ist, so dass sie dem Zuführkanal für die Probe ausgesetzt ist und ein Reaktionsreagenzsystem einschließt, worin das Reaktionssystem wenigstens Cholesterindehydrogenase, Nikotinamidadenindinucleotid und einen Elektronenmediator enthält, und worin der Elektronenmediator wenigstens einer ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 1,2-Naphthochinon-4-sulfat, Dimethylbenzochinon, 1-Methoxy-5-methylphenaziniumsulfat, Thionin und Meldola's Blau.
5. Cholesterin-Sensor nach Anspruch 4, worin die Reaktionsschicht so geteilt ist, dass sie auf sowohl dem Elektrodensystem als auch dem Abdeckglied bereitgestellt ist.
6. Cholesterin-Sensor nach Anspruch 4, worin die Reaktionsschicht eine Schicht enthält, welche ein hydrophiles Polymer in wenigstens einem Teil der Reaktionsschicht einschließt.
7. Cholesterin-Sensor nach Anspruch 4, worin die Reaktionsschicht eine Schicht enthält, welche ein hydrophiles Polymer und den Elektronenmediator in einem gemischten Zustand in wenigstens einem Teil der Reaktionsschicht einschließt.
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