DE60029127T2

DE60029127T2 - Biosensor

Info

Publication number: DE60029127T2
Application number: DE60029127T
Authority: DE
Inventors: Takahiro Kyoto-shi NAKAMINAMI; Motokazu Katano-shi WATANABE; Shin Katano-shi Ikeda; Shiro Hirakata-shi Nankai
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2020-11-17
Also published as: CN1355880A; EP1235069A4; EP1235069B1; WO2001036955A1; ES2267583T3; EP1235069A1; US6740215B1; CN1162699C; DE60029127D1; ATE331949T1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor zum Erleichtern einer schnellen und hochgradig genauen Quantifizierung eines Trägermaterials wie Glucose, das in einer Probe enthalten ist.
Verwandter Stand der Technik
Mit dem Ziel, eine einfache Quantifizierung von Komponenten der Körperflüssigkeit durch normale Menschen zu realisieren wurden in jüngster Zeit verschiedene Arten von Biosensoren entwickelt, welche eine spezifische katalytische Aktion von Enzymen ausnutzen.
Im Folgenden wird ein Verfahren zur Quantifizierung von Glucose als ein Beispiel des Verfahrens der Quantifizierung einer Komponente erklärt, die in einer Probenlösung enthalten ist. Als elektrochemisches Verfahren der Quantifizierung von Glucose ist ein Verfahren, das eine Kombination von Glucoseoxidase (hiernach als GOD abgekürzt) mit einer Sauerstoffelektrode oder einer Wasserstoffperoxidelektrode verwendet, im Allgemeinen gut bekannt.
GOD oxidiert selektiv β-D-Glucose als ein Trägermaterial zu D-Glucono-δ-lacton unter Verwendung von Sauerstoff als Elektronenvermittler. In der Anwesenheit von Sauerstoff wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid während des Oxidationsreaktions-Verfahrens von GOD reduziert. Die Abnahme des Volumens von Sauerstoff wird durch die Sauerstoffelektrode oder das angestiegene Volumen von Wasserstoffperoxid durch die Wasserstoffperoxidelektrode gemessen. Das verringerte Volumen von Sauerstoff und das angestiegene Volumen von Wasserstoffperoxid sind zu dem Gehalt an Glucose in der Probenlösung proportional, so dass die Quantifizierung von Glucose beruhend auf dem verringerten Volumen von Sauerstoff oder dem angestiegenen Volumen von Wasserstoffperoxid möglich ist.
Glucosesensoren des neuen Typs wurden entwickelt, welche als Elektronenvermittler eine organische Verbindung oder einen Metallkomplex wie Kaliumferricyanid, ein Ferrocenderivat und ein Chinonderivat ohne Verwendung von Sauerstoff als Elektronenvermittler verwenden. Die Sensoren dieses Typs oxidieren das Reagens des Elektronenvermittlers, der aus der Enzymreaktion auf einer Elektrode herrührt, wodurch die Konzentration von Glucose, die in der Probenlösung enthalten ist, beruhend auf der Menge des Oxidationsstroms bestimmt werden kann. In dem Fall der Verwendung einer solchen organischen Verbindung oder eines Metallkomplexes als Elektronenvermittler anstatt von Sauerstoff ist es möglich, eine Reagensschicht zu bilden, während der Elektronenvermittler in einem präzisen Betrag und in einem stabilen Zustand zusammen mit GOD auf der Elektrode getragen wird. Ferner ist es ebenso möglich, die Reagenssschicht mit einem Elektrodensystem zu integrieren, während sie in einem im Wesentlichen trockenen Zustand erhalten wird. Wegwerfbare Glucosesensoren, die auf diesen Technologien beruhend entwickelt wurden, wurden in jüngster Zeit mit viel Aufmerksamkeit bedacht. Ein typisches Beispiel hiervon ist ein Biosensor, der in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2517153 offenbart wurde. In einem solchen wegwerfbaren Glucosesensor ist es möglich, die Glucosekonzentration leicht mit einer Messvorrichtung durch einfaches Einführen der Probenlösung in den Sensor, der abnehmbar mit der Messvorrichtung verbunden ist, zu messen.
Bei dem Messverfahren, welches den vorstehend beschriebenen Glucosesensor verwendet, kann durch einen Antwortstrom von 1 bis 10 μA/cm² in der Größenordnung die Glucosekonzentration in der Probe in etwa 30 Sekunden gemessen werden. Es wurde jedoch in den zurückliegenden Jahren aus verschiedenen Bereichen erwünscht, Sensoren zu entwickeln, die dazu fähig sind, eine schnellere Glucosequantifizierung mit höherer Empfindlichkeit und Genauigkeit herzustellen.
Ebenso werden in herkömmlichen elektrochemischen Glucosesensoren durch die Zugabe eines hydrophilen Polymers wie Carboxymethylzellulose zu der Reagensschicht die Messergebnisse davor bewart, durch von außen auf die Messvorrichtung aufgegebene Vibrationen beeinträchtigt zu werden. Das hydrophile Polymer weist einen anderen Vorteil auf, dass es als ein Binder wirken kann, um die Enzyme auf der Elektrode moderat zu immobilisieren. Die Anwesenheit des hydrophilen Polymers erzeugt jedoch Veränderungen in der katalytischen Aktivität von GOD oder Thermodynamiken der hydrolytischen Reaktion von D-Glucono-δ-lacton zu Gluconsäure, wodurch in einigen Fällen eine Akkumulierung von D-Glucono-δ-lacton hervorgerufen wird, welches ein Produkt der GOD-Reaktion ist. Als Ergebnis schreitet die umgekehrte Reaktion fort und die Rate der Glucoseoxidationsreaktion nimmt ab, wodurch die Menge des Reduktionsmittels des Elektrodenvermittlers, der in einer kurzen Reaktionszeit erzeugt wurde, erniedrigt wird, so dass die Größenordnung (Empfindlichkeit) des Stroms des Sensors, der in Antwort auf die Glucose fließt, in einigen Fällen abnimmt. Insbesondere der Versuch, eine ausreichende Empfindlichkeit bei hohen Konzentrationen von Glucose zu erreichen, während eine gute Genauigkeit sichergestellt wird, benötigt einen Anstieg der Reaktionszeit, um eine große Menge des Reduktionsmittels des Elektronenvermittlers zu erzeugen, so dass die Messung dazu neigt, mehr Zeit zu benötigen.
Das Dokument EP 0 368 474 A offenbart einen Alkoholsensor, in welchem eine Alkoholdehydrogenase in der Detektion von Ethylalkohol als Trägermaterial wirkt. In dem Sensor wandelt die Alkoholdehydrogenase ein Ethanol zu Acetaldehyd um. Der Sensor wendet eine Diaminverbindung in einer porösen Überzugslage an, das heißt, er ist nicht in die gemischte Arbeitselektrode einbezogen. Das Diamin reagiert mit dem Acetaldehyd, das hergestellt wurde, um eine Inhibierung der Dehydrogenase zu verhindern (Acetaldehyd ist ein Inhibitor der Dehydrogenase), und dieses unterstützt die Antwort des Sensors.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor zur Messung eines Trägermaterials in einer Probenlösung, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auf der Grundplatte angeordnet sind, und ein Reagenssystem, das mindestens eine Oxidoreduktase, ein hydrophiles Polymer und einen Elektrodenvermittler enthält, umfasst, wobei das Reagenssystem ferner eine Substanz umfasst, welche mit der Oxidoreduktase in dem Reagenssystems mit einer Wirkung ein organisches Produkt umzuwandeln, das durch die Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung gemessen wird, gemischt wird, welches von dem Trägermaterial unterschiedlich ist, und wobei das Reagenssystem in der Probenlösung löslich ist.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Biosensor zum Messen eines Trägermaterials in einer Probenlösung zur Verfügung, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auf der Grundplatte angeordnet sind, ein Überzugselement das über der Grundplatte angeordnet ist, um einen Zufuhrweg für die Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen dem Bedeckungselement und der Grundplatte zu bilden, und ein Reagenssystem, welches mit einem Abschnitt versehen ist, der zum Zufuhrweg der Probenlösung hin frei liegt, enthält, wobei das Reagenssystem mindestens eine Oxidoreduktase, ein hydrophiles Polymer, einen Elektrodenvermittler und eine Substanz enthält, die mit der Oxidoreduktase in dem Reagenssystem gemischt ist, mit einer Funktion, ein organisches Produkt, das durch direkte Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wird, welche von dem Trägermaterial verschieden ist, und wobei das Reagenssystem in der Probenlösung löslich ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines Glucosesensors in Übereinstimmung mit einem Beispiel der vorliegenden Erfindung, wobei das Reagenssystem weggelassen wurde.
2 ist eine lämgslaufende Querschnittsansicht eines vitalen Anteils des gleichen Glucosesensors.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Wie vorstehend beschrieben umfasst ein Biosensor zum Messen eines Trägermaterials in einer Probenlösung in Übereinstimmung der vorliegenden Erfindung ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auf einer elektrisch isolierenden Grundplatte abgeschieden sind, sowie ein Reagenssystem das mindestens Oxidoreduktase, ein hydrophiles Polymer und einen Elektrodenvermittler umfasst, wobei das Reagenssystem ferner eine Substanz umfasst, die mit der Oxidoreduktase in dem Reagenssystem vermischt ist, mit einer Funktion, ein organisches Produkt, das durch direkte Reaktion der zu messenden Trägersubstanz mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wurde, welche von dem Trägermaterial verschieden ist, und wobei das Reagenssystem in der Probenlösung löslich ist.
Das organische Produkt in einem Enzymreaktionssystem wird durch die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des organischen Produkts zu einer anderen Verbindung reduziert oder entfernt. Als Ergebnis kann die Enzymreaktion zwischen dem zu messenden Trägermaterial und der Oxidoreduktase sanft voranbringen. Dies ermöglicht eine schnelle und hochgradig genaue Messung des Trägermaterials. Mit Sicherheit muss die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des organischen Produkts zu einer anderen Verbindung nicht eine sein, welche das organische Produkt zu dem ursprünglichen Trägermaterial zurück umgewandelt, oder es zu einer Verbindung umgewandelt, welche die Enzymreaktion gegenteilig beeinflussen würde. Ebenso darf das Trägermaterial keines sein, welches selbst die Enzymreaktion gegenteilig beeinflusst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das organische Produkt, das durch direkte Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase erzeugt wurde, ein Oxidationsprodukt, das durch Oxidation des Trägermaterials durch die Oxidoreduktase erzeugt wurde. Die Konzentration des Trägermaterials wird auf der Grundlage des Stroms erhalten, der den Elektrodenvermittler oxidiert, der in Verbindung mit der Enzymreaktion reduziert wurde.
In dieser Ausführungsform, wenn das zu messende Trägermaterial D-Glucose, β-D-Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) und Glucono-δ-lactonase (EC 3.1.1.17, hiernach als GLN bezeichnet) als Oxidoreduktase, und die Substanz mit einer Funktion, das organische Reaktionsprodukt, D-Glucono-β-lacton, jeweils zu einer anderen Verbindung umzuwandeln verwendet. Wenn die Oxidoreduktase von Pyrrolochinolinchinon (hiernach als PQQ bezeichnet) abhängige Glucosedehydrogenase (EC 1.1.99.17) ist, wird GLN als die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des Oxidationsprodukts, D-Glucono-δ-lacton, zu einer anderen Verbindung verwendet.
Wenn die Oxidoreduktase von Nikotinamidadenindinucleotid (hiernach als NAD bezeichnet) oder Nikotinamidadenindinucleotidphosphorsäure (hiernach als NADP bezeichnet) abhängige Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47) (EC 1.1.1.118) (EC 1.1.1.119) ist, wird GLN als Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des organischen Oxidationsprodukts, D-Glucono-δ-lacton, zu einer anderen Verbindung verwendet.
Wenn die Oxidoreduktase Lactatoxidase ist, kann Pyruvatoxidase als Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des Oxidationsprodukts, Pyrovinsäure, zu anderen Verbindungen, Acetylphosphat und Kohlendioxid, verwendet werden.
In den folgenden Beispielen wurde GLN, welches ein Enzym ist, als Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des Produkts zu einer anderen Verbindung verwendet, aber ein BioReagens wie ein Enzym muss nicht notwendiger Weise verwendet werden. Wenn das zu messende Trägermaterial ein primärer Alkohol ist und die Oxidoreduktase Alkoholoxidase oder Alkoholdehydrogenase ist, ist es möglich, Hydrazin oder eine organische Verbindung mit einem Aminorest zu verwenden, welche schnell an das Oxidationsprodukt Aldehyd binden, als Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des selben zu einer anderen Verbindung.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das organische Produkt, das durch die direkte Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase erzeugt wird, ein Reduktionsprodukt, das durch Reduktion des Trägermaterials durch die Oxidoreduktase erzeugt wird. Die Konzentration des Trägermaterials wird auf der Grundlage des Reduktionsstroms des Elektrodenvermittlers erhalten, der in Verbindung mit der Enzymreaktion oxidiert wird. In dieser Ausführungsform, wenn das zu messende Trägermaterial Glutathiondisulfit und die Oxidoreduktase Glutathionreduktase (EC 1.6.4.2) ist, wird eine Substanz, welche Thiol selektiv reagiert, zum Beispiel eine Maleimidverbindung, als Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln eines organischen Produkts, Glutathion, zu einer anderen Verbindung verwendet.
Als die Oxidoreduktase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird eine adäquate abhängig von dem in der Probenlösung enthaltenen Trägermaterial ausgewählt. Neben den vorstehend aufgeführten Enzymen ist es möglich, zum Beispiel Alkoholdehydrogenase, Lactatoxidase, Cholesteroloxidase, Xanthenoxidase, Aminosäureoxidase, Ascorbatoxidase, Acyl-CoA-Oxidase, Uricase, Glutamatdehydrogenase oder Fructosedehydrogenase als Oxidoreduktase verwenden.
Um zu bewirken, dass die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des organischen Produkts, das durch die Reaktion des Trägermaterials mit der Oxidoreduktase erzeugt wird, zu einer anderen Verbindung, effektiv wirken kann, wird bevorzugt ein pH-Puffer zu dem Reagenssystem zugegeben. In dem Fall der Verwendung eines pH-Puffers, muss ebenso ein geeigneter pH für die Oxidoreduktase berücksichtigt werden. Als pH-Puffer ist es möglich, zum Beispiel einen Puffer zu verwenden, der eine oder mehrere Arten von Phosphat, Acetat, Borat, Citrat, Phthalat und Glycin enthält, anders als der Puffer, der eine Kombination von Phosphaten umfasst, die in den Beispielen verwendet werden, die später beschrieben werden. Ebenso ist möglich, eine oder mehrere Arten von Wasserstoffsalzen der zuvor aufgeführten Salze zu verwenden, wenn diese vorhanden sind. Ebenso ist es möglich, ein Reagens zu verwenden, das in den sogenannten „GOODS-Puffern" Anwendung findet. Diese pH-Puffer können in dem Sensorsystem in der Form enthalten sein, dass sie gemäß der Struktur des Sensors variabel sind, und die Form kann als Feststoff oder Lösung vorliegen. Ferner wird der gepufferte pH-Wert durch den Puffer in grundlegender Weise zum Verbessern der Effizienz der Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln des organischen Produkts, das durch die Reaktion des Trägermaterials mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wird, zu verbessern, aber die Auswahl sollte in Anbetracht des Gleichgewichts dazwischen und dem Einfluss des pH-Puffers auf andere Sensorreaktion vorgenommen werden.
Beispiele des Elektronenvermittlers schließen Kaliumferricyanid, Metallkomplexe wie Osmiumtris(bipyridin) oder Ferrocenderivate, Chinonderivate wie p-Benzochinon, Phenazinderivate wie Phenazinmethosulfat, Phenothiazinderivate wie Methylenblau, Nikotinamidadenindinucleotid und Nikotinamidadenindinucleotidphosphorsäure ein. Diese Elektronenvermittler können in der Form von Bindungen an die Polymerhauptkette oder in der Form vorlegen, dass ein Teil oder das gesamte davon eine Polymerkette bildet. Auch wenn ferner Sauerstoff als Elektronenvermittler verwendet wird, kann eine Stromerwiderung erhalten werden. Diese Elektronenvermittler werden einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden.
Als hydrophiles Polymer ist es möglich, wasserlösliche Zellulosederivate insbesondere Ethylzellulose, Hydroxyethylzellulose und Carboxymethylzellulose, Polyvinylpolidon, Polyvinylalkohol, Gelatine, Polyacrylsäure und ihre Salze, Stärke und ihre Derivate, ein Polymer von Maleinsäureanhydrid oder seinen Salzen, Polyacrylamid, Methacrylatharz, Poly-2-hydroxyethylmethacrylat oder dergleichen zu verwenden.
Im Folgenden wird die Struktur eines Sensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung in Bezug auf die 1 und 2 beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf diese begrenzt.
1 ist eine perspektivische Explosionsansicht eines Glucosesensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, von welchem das Reagenssystem entfernt wurde. Eine Silberpaste wird auf eine elektrisch isolierende Grundplatte 1 aus Polyetyhlenterephthalat durch Siebdruck gedruckt, um die Leitungszuführungen 2 und 3 und die Grundlage der später beschriebenen Elektroden zu bilden. Als nächstes wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste, die einen Harzbinder enthält, auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine Arbeitselektrode 4 zu bilden. Diese Arbeitselektrode 4 steht in Kontakt mit der Leitungszuführung 2. Ferner wird eine isolierende Paste auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine isolierende Schicht 6 zu bilden. Die isolierende Schicht 6 bedeckt den äußeren Umfangsabschnitt der Arbeitselektrode 4, wodurch die Fläche des freiliegenden Anteils der Arbeitselektrode 4 konstant gehalten wird. Dann wird eine leitfähige Kohlenstoffpaste, welche einen Harzbinder enthält, auf die Grundplatte 1 gedruckt, so dass sie in Kontakt mit der Leitungszuführung 3 steht, welcher eine ringförmige Gegenelektrode 5 bildet.
Nachdem die zuvor beschriebene elektrisch isolierende Grundplatte 1 mit einem Reagenssystem in einer Art und Weise, wie später beschrieben, versehen wurde, werden ein Abstandhalter 8 mit einem Schlitz 10 und ein Überzug 9 mit einem Luftventil 11 darauf in einer positionellen Beziehung gebunden, wie sie durch die gestrichelten Linien in 1 gezeigt werden, wodurch ein Biosensor hergestellt wird. Ein Zufuhrweg für die Probenlösung wird in dem Abschnitt des Schlitzes 10 des Abstandhalters 8 gebildet. Das offene Ende des Schlitzes 10, welches am Ende des Sensors liegt, dient als Probenzufuhranschluss zu dem Zufuhrweg der Probenlösung.
2 ist eine längslaufende Querschnittsansicht des Biosensors in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung. Ein Reagenssystem 7, welches ein Enzym und einen Elektrodenvermittler enthält, wird auf der Grundplatte 1 gebildet, auf welcher das Elektrodensystem gebildet wurde. Das Reagenssystem 7 wird über dem Elektrodensystem gebildet, so dass es in Kontakt mit der Arbeitselektrode 4 oder der Gegenelektrode 5 kommt. Dies steigert im Wesentlichen den Betrag des Elektrodenvermittlers, welcher den elektrochemischen Reaktionen an den Elektroden zugeführt wird, so dass es möglich ist, eine größere Rückmeldung zu erhalten. Das Reagenssystem 7, in dem Beispiel wie in der Figur gezeigt, ist aus einer hydrophilen Polymerschicht 7a und einer Schicht 7b zusammengesetzt, die darauf gebildet ist und GOD, GLN und den Elektrodenvermittler Kalimferricyanid enthält.
Wenn eine Probenlösung in Kontakt mit dem offenen Ende des Schlitzes 10 gebracht wird, der den Zufuhrweg für die Probenlösung des Sensors mit der in 2 gezeigten Struktur zeigt, wird die Probenlösung in den Zufuhrweg für die Probenlösung aufgrund eines kapillaren Phänomens zugeführt, wodurch sie in dem Reagenssystem 7 gelöst wird, so dass die Enzymreaktion fortschreitet. Auf diesem Weg, wenn der Zufuhrweg der Probenlösung durch Integrieren eines Bedeckungselements gebildet wurde, das aus dem Abstandhalter 8 und der Bedeckung 9 auf der Grundplatte 1, auf welcher das Elektrodensystem bereitgestellt ist, gebildet wurde, kann die Menge der Probenlösung, welche das zu messende Trägermaterial enthält, und zu dem Sensor zugeführt wird, konstant gehalten werden, so dass es möglich ist, die Genauigkeit der Messung zu steigern.
In dem Sensor, der mit dem Zufuhrweg der Probenlösung wie vorstehend beschrieben versehen ist, kann das Reagenssystem auf einem Abschnitt gebildet werden, der zum Zufuhrweg der Probenlösung hin frei liegt, wie auch auf dem Elektrodensystem in der Form, dass das Reagenssystem die zugeführte Probenlösung lösen kann. Zum Beispiel kann das Reagenssystem wie folgt gebildet werden: der Abstandhalter 8 und die Bedeckung 9 werden aneinander gebunden, diese wird von oben nach unten umgedreht, um einen konkaven Abschnitt in dem Schlitz 10 zu bilden, und eine Lösung zum Bilden des Reagenssystems wird in den konkaven Abschnitt getropft und getrocknet. Alternativ kann das Reagenssystem in vielfache Schichten geteilt werden, eine auf der Grundlage und eine andere auf der Seite des Bedeckungselements. In diesem Fall muss jede geteilte Schicht nicht notwendiger Weise alle Reagens enthalten.
Zum Beispiel kann jedes der Oxidoreduktase, des Elektrodenvermittlers und des pH-Puffers in einer verschiedenen Schicht enthalten sein.
Der Sensor kann ebenso nur durch die Grundplatte 1 ohne Bilden des Zufuhrweges für die Probenlösung wie vorstehend beschrieben aufgebaut sein. In diesem Fall wird das Reagenssystem auf oder in der Nähe des Elektrodensystems gebildet.
In dem Sensor jeglicher der Strukturen ist es bevorzugt, eine hydrophile Polymerschicht auf dem Elektrodensystem zu bilden, um eine Adsorption von Protein an das Elektrodensystem oder dergleichen zu verhindern.
Beispiel 1
Eine wässrige Lösung eines Natriumsalzes von Carboxymethylcellulose (hiernach als CMC bezeichnet) wurde über das Elektrodensystem getropft, das auf der Grundplatte 1 angeordnet war, und getrocknet, um eine CMC-Schicht 7a zu bilden. Eine wässrige Lösung, welche GOD, DLN und Kaliumferricyanid löste, wurde über die CMC-Schicht 7a getropft und getrocknet, um eine Schicht 7b zu bilden. Das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl von GOD zu GLN, welches in dem auf diese Weise gebildeten Reagenssystem 7 enthalten war, wurde auf GOD : GLN = 1 : 2 eingestellt. Die Menge von GOD wurde als eine Einheit angenommen.
Ein Sensor, wie er in 2 gezeigt wird, wurde durch Kombinieren des Abstandshalters 8 und der Bedeckung 9 mit der zuvor beschriebenen Grundplatte hergestellt.
Eine wässrige Lösung, welche eine gewisse Menge D-Glucose enthielt, wurde der Öffnung des Zufuhrweges für die Probenlösung des Sensors zugeführt, das heißt, das offene Ende des Schlitzes des Abstandshalters. Nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit wurde eine Spannung von 500 mV and die Arbeitselektrode 4 in Bezug auf die Gegenelektrode 5 angelegt, und der Stromwert, der zu dieser Zeit floss, wurde gemessen. Während D-Glucose zu D-Glucono-δ-lacton durch die Wirkung von GOD oxidiert wird, werden Ferrocyanidionen zu Ferrocyanidionen reduziert. Die Konzentration der Ferrocyanidionen, die auf diese Weise erzeugt wurden, ist proportional zu der Konzentration von Glucose. Folglich kann auf der Grundlage des Oxidationsstroms hiervon die Konzentration von Glucose gemessen werden. D-Glucono-δ-lacton, das zu dieser Zeit erzeugt wurde, wird durch die Wirkung von GLN zersetzt.
Der Antwortstrom, der in der Reaktionszeit von 5 Sekunden erhalten wurde, wurde gegen die Konzentration von D-Glucose der verwendeten Lösung aufgetragen. Als Ergebnis wird eine hervorragende lineare Beziehung zwischen den beiden beobachtet. Die erhaltenen Antworten, wenn die Glucosekonzentrationen 602 mg/dl und 200 mg/dl waren, waren jeweils etwa 500 mV und 190 mV. Ebenso zum Vergleich wurde ein Sensor, der kein GLN in der Schicht 7b enthält, hergestellt und die Antworten in der gleichen Art und Weise wie vorstehend gemessen: die erhaltenen Antworten, wenn die Glucosekonzentrationen 602 mg/dl und 200 mg/dl waren, waren jeweils etwa 425 mV und 165 mV. Dies zeigte, dass die Antworten des Sensors, der GLN in dem Reagenssystem enthält, bemerkenswert größer waren als jene ohne GLN. Die Anstiegsraten in den Antworten waren 18 % und 15 %, welches sehr hohe Werte sind. Als Grund wird angenommen, dass die Zugabe von GLN zu dem Reagenssystem das Produkt von der GOD-Reaktion, D-Glucono-δ-lacton, zersetzte, um die Akkumulation davon in der Lösung zu verhindern, wodurch die Reaktion zwischen GOD und Glucose beschleunigt wurde. Ebenso ist dankenswerter Weise zu bemerken, dass der Koeffizient der Antwortvariation (CV) in dem Sensor, zu welchem GLN zugegeben wurde, von dem von dem Sensor ohne GLN 75 oder niedriger war. Die Zugabe von GLN verbessert die Genauigkeit der Messung.
Wie vorstehend beschrieben wurde, ermöglichte die vorliegende Erfindung die Realisierung des Anstiegs in der Empfindlichkeit der Messung. Ferner wurde klar, dass die Konzentration des zu messenden Trägermaterials genau und schnell quantifiziert werden konnte, zum Beispiel in einer kurzen Reaktionszeit von 5 Sekunden.
Wenn die Menge an GOD, das in dem Reagenssystem eingeschlossen war, so war, dass die Aktivität 0,05 bis 0,5 Einheiten pro einem Quadratmillimeter der Sensorsystemoberfläche in Kontakt mit dem Sensorsystem wurde, wurden speziell hervorragende Ergebnisse erhalten.
Beispiel 2
In der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 wurden die CNC-Schicht 7a und die Schicht 7b, die GOD, GLN und Kaliumferricyanid enthalten, über dem Elektrodensystem auf der Grundplatte 1 gebildet. Dieses Beispiel wendet keinen Abstandshalter 8 und keine Bedeckung 9 an.
Über dem Reagenssystem 7 des Sensors wurde eine wässrige Lösung getropft, die eine gewisse Menge an D-Glucose enthielt, die Menge der wässrigen Lösung von D-Glucose, die aufgetropft wurde, wurde zu einem vorbestimmten Betrag vorgenommen. Nach dem Verstreichen einer vorbestimmten Zeit wurde eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 in Bezug auf die Gegenelektrode 5 angelegt, und der Stromwert, der zu diesem Zeitpunkt floss, wurde gemessen. Zwischen dem Antwortstrom, der erhalten wurde, und der Konzentration der D-Glucose wurde eine hervorragende lineare Beziehung beobachtet. Ebenso war der Antwortstrom, der erhalten wurde, signifikant größer als der Antwortstrom, der aus dem Sensor erhalten wurde, der kein GLN in dem Reaktionssystem 7 enthielt. Auf diesem Wege wurde gefunden, dass selbst wenn der Sensor kein Bedeckungselement aufweist, der zuvor beschriebene Effekt des GLN die Realisierung eines Anstiegs der Empfindlichkeit der Messung realisieren konnte.
In den Beispielen 1 und 2 wurde das Reagenssystem 7 so gebildet, dass es in Kontakt mit dem Elektrodensystem kommt, aber selbst wenn es zu Reagenssystem 7 in der Nähe des Probenzufuhranschlusses auf der Grundplatte 1 in einer solchen Art und Weise gebildet wurde, dass es nicht in Kontakt mit dem Elektrodensystem kam, und in den Zufuhrweg für die Probenlösung freigesetzt wurde, wurde ein Anstieg der Empfindlichkeit der Messung durch die Zugabe von GLN realisiert. Ebenso konnte der gleiche Effekt beobachtet werden, auch wenn das Reagenssystem 7 auf der Bedeckungsseite gebildet wurde, so dass es gegen den Zufuhrweg der Probenlösung frei lag.
Ferner wurde in den vorstehenden Beispielen, um D-Glucono-δ-lacton effektiver zu zersetzen, GLN in die Umgebung von GOD eingeschlossen, das heißt in dem Reagenssystem 7, aber GLN kann an einer anderen Position von dem Reagenssystem 7 in dem Zufuhrweg für die Probenlösung des Sensors vorhanden sein. Wenn es an einer Position in Kontakt mit der Messprobe ist, steigert die Zugabe von GLN die Empfindlichkeit der Messung.
Beispiel 3
In diesem Beispiel wurde ein Sensor in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme hergestellt, dass ein pH-Puffer, der aus einer Kombination von Dikaliumhydrogenphosphat (K₂HPO₄) und Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) zusammengesetzt war, zu der Schicht 7b zugegeben wurde, so dass der realisierte pH-Wert durch die Einführung von Wasser 7 wurde.
Eine wässrige Lösung, die einen gewissen Betrag an D-Glucose enthielt, wurde der Öffnung des Zufuhrweges für die Probenlösung zugeführt. Nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit wurde eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 in Bezug auf die Gegenelektrode 5 angelegt, und der Stromwert, der zu dieser Zeit floss, wurde gemessen. Der erhaltene Antwortstrom war höher als der des Sensors aus Beispiel 1, der keinen pH-Puffer in dem Reagenssystem enthielt. Dieses Ergebnis wurde angenommener Weise dadurch erhalten, dass aufgrund der Zugabe des pH-Puffers der pH-Wert der Probenlösung auf einem Wert aufrecht erhalten wurde, bei welchem GLN effektiver das D-Glucono-δ-lacton zersetzt. Es wird angenommen, dass die Zugabe des pH-Puffers sowohl die Aktivität von GOD als auch die Aktivität von GLN verändert. Da jedoch geeignete pH-Werte für GOD und GLN jeweils etwa 5 und etwa 7 sind, wird für den Effekt von GLN angenommen, dass er durch einen pH-Wert von 7 in diesem Beispiel weiter gefördert wird.
Beispiel 4
In diesem Beispiel wurde ein Sensor in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme hergestellt, dass von PQQ abhängige Glucosedehydrogenase (hiernach als PQQ-GDH bezeichnet) anstatt des Enzyms GOD in der Schicht 7b verwendet wurde. Das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl von GLN zu PQQ-GDH war GLN : PQQ-GDH = 2 : 1. die Menge des verwendeten PQQ-GDH war zwei Einheiten.
Eine wässrige Lösung, welche einen gewissen Betrag an D-Glucose enthielt, wurde zu der Öffnung des Zufuhrweges für die Probenlösung des Sensors zugeführt, nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit wurde eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 in Bezug auf die Gegenelektrode 5 angelegt und der zu diesem Zeitpunkt fließende Stromwert gemessen. Der erhaltene Antwortstrom zeigte eine hervorragende lineare Beziehung in Bezug auf die Konzentration von D-Glucose. Ebenso wurde zum Vergleich ein Sensor hergestellt, der GLN in dem Reagenssystem nicht enthielt, und der Antwortwert wurde in der gleichen Art und Weise wie vorstehend gemessen. In jeder Glucosekonzentration war die Antwort des Sensors, welcher GLN in dem Reagenssystem enthielt, signifikant größer als der ohne GLN. Wenn ebenso von PQQ abhängige Glucosedehydrogenase verwendet wurde, erzeugte die Zugabe von GLN zu dem Reagenssystem den Effekt des Steigerns der Antwort.
Ferner steigerte in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 die Zugabe eines pH-Puffers zu dem Reagenssystem den Antwortwert weiter.
Wenn das zuvor genannte PQQ-GDH in Kontakt mit der Oberfläche des Sensorsystems war, so dass die Aktivität davon 0,1 bis 1,5 Einheiten pro 1 Quadratmillimeter der Sensoroberfläche wurde, wurden insbesondere hervorragende Ergebnisse erhalten.
Beispiel 5
In diesem Beispiel wurde ein Sensor in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 4 mit der Ausnahme hergestellt, dass von NAD oder NADP abhängige Glucosedehydrogenase (hiernach als NAD-GDH und NADP-GDH jeweils bezeichnet) anstatt von PQQ-GDH und dass Thionin anstatt von Kaliumferricyanid verwendet wurde. Das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl von GLN zu NAD-GDH oder NADP-GDH wurde auf NAD (NADP)-GDH : GLN = 1 : 2 eingestellt.
Unter den gleichen Bedingungen wie jene in Beispiel 4 wurde der Antwortstromwert zu der D-Glucose-Konzentration gemessen. Als Ergebnis war der erhaltene Antwortstrom im Wesentlichen proportional zu der D- Glucosekonzentration. Die Reaktion zwischen GDH und D-Glucose erzeugt Reduktionsmittel von NAD und NADP, welche Elektronen an Thionin abgeben, und das auf diese Weise umgewandelte Thionin überträgt Elektronen auf die Elektrode. Auf diesem Weg wird ein Strom erzeugt. Was hier zu bemerken ist, ist, dass die Reduktionsmittel von NAD und NADP keine Produkte des Trägermaterials sind (nicht durch die Reaktion zwischen dem Trägermaterial und dem Enzym erzeugt). Die erhaltene Antwort war signifikant größer als die des ähnlichen Sensors, welcher kein GLN in dem Reagenssystem 7 enthielt. Auf diesem Wege, auch wenn von NAD und NADP abhängige Glucosedehydrogenase verwendet wurde, erzeugte die Zugabe von GLN zu dem Reagenssystem den Effekt des Steigerns der Antwort.
Die Beispiele 1 bis 4 beschrieben den Fall, in dem das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl von GLN zu GOD, PQQ-GDH und NAD (NADP)-GDH 2 war, aber auch, wenn das Verhältnis zu jeder der Oxidoreduktasen 0,5 bis 10 war, erzeugte GLN den Effekt des Ansteigens des Stromes. Auch wenn das zuvor genannte Verhältnis 1 bis 3 war, war der Effekt insbesondere groß, in welchem weiter bevorzugte Ergebnisse erhalten wurden.
Ebenso steigert in der gleichen Art und Weise wie in Beispiel 3 die Verwendung des pH-Puffers die Antwort weiter. Ferner war der pH-Bereich, in welchem die Antwort bemerkenswert gesteigert wurde, pH 4 bis 9, wenn die Substanz mit einer Funktion, das organische Produkt des Trägermaterials umzuwandeln, das durch die Reaktion der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wurde, GLN war. In einem solchen pH-Bereich wird die Aktivität von GLN als hoch angenommen.
In den Beispielen war die an das Elektrodensystem angelegte Spannung 50 mV, aber das ist nicht als begrenzend anzusehen. Jede Spannung, bei der der reduzierte Elektronenvermittler an der Gegenelektrode oxidiert werden kann, kann angelegt werden. Zum Reduzieren des oxidierten Elektronenvermittlers kann eine für seine Reduktion geeignete Spannung angelegt werden. Ferner wurde das Verfahren des Detektierens des Stroms als Messverfahren angewendet, aber jeder Ausgang, der sich verändert, wenn die elektrochemische Reaktion fortschreitet, kann im Wesentlichen als das zu detektierende Subjekt verwendet werden. Zum Beispiel kann die Quantität der elektrischen Ladung, die in einer gewissen Zeit durchläuft, detektiert werden. Da die Quantität der elektrischen Ladung ein integraler Wert des Stromes in Bezug auf die Zeit ist, kann er mit der Konzentration des zu messenden Trägermaterials korreliert werden.
Was die Reaktionszeit betrifft, gibt es keine besonderen Begrenzungen. In einer kurzen Reaktionszeit ist der Effekt des Steigerns der Antwort gemäß der vorliegenden Erfindung bemerkenswert, aber der Anstieg der Antwort ist im Wesentlichen bei allen Reaktionszeiten zu beobachten.
Als Elektrodenmaterial beschrieben die Beispiele Kohlenstoff, aber dies ist nicht als begrenzend anzusehen. Als Material der Arbeitselektrode ist es möglich, jedes elektrisch leitfähige Material zu verwenden, welches nicht durch sich selbst während der Oxidation oder Reduktion des Elektrodenvermittlers oxidiert oder reduziert wird, wie Platin, Gold und Palladium zusätzlich zu Kohlenstoff. Ferner ist es als Material der Gegenelektrode möglich, jedes elektrisch leitfähige Material zu verwenden, welches herkömmlich angewendet wird, wie Gold, Silber und Platin zusätzlich zu Kohlenstoff. In den vorstehenden Beispielen wurde die Arbeitselektrode und die Gegenelektrode durch das Siebdruckverfahren hergestellt, aber das Herstellungsverfahren davon ist kein Gegenstand jeglicher Begrenzung. Es ist zum Beispiel möglich, ein Verfahren einschließlich Photolithographie, Gasphasenabscheidungsverfahren, chemisches Gasphasenabscheidungsverfahren oder Sputterverfahren als anderes Herstellungsverfahren für die Elektrode zu verwenden. Zusätzlich zu der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode kann eine Elektrode mit einem stabilen Potential in dem Sensorsystem bereitgestellt sein, um als Referenzelektrode verwendet zu werden. In diesem Fall wird die Spannung zwischen der Referenzelektrode und der Arbeitselektrode angelegt.
Die Form, die Anordnung und die Anzahl des Elektrodensystems sind nicht begrenzt zu jenen, die in den vorstehenden Beispielen gezeigt werden. Die Form, die Anordnung und die Anzahl der Anschlüsse und Leitungen ist ebenso nicht auf jene begrenzt, die in den vorstehenden Beispielen gezeigt werden.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Wie vorstehend beschrieben stellt die vorliegende Erfindung einen Biosensor zur Verfügung, der dazu fähig ist schnell und hochgradig genaue Messungen eines Trägermaterials durchzuführen.

Claims

Biosensor zur Messung eines Trägermaterials in einer Probenlösung, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auf der Grundplatte angeordnet sind, und ein Reagens-System, das mindestens eine Oxidoreduktase, ein hydrophiles Polymer und einen Elektroden-Vermittler aufweist, umfasst, wobei das Reagens-System ferner eine Substanz umfasst, die mit der Oxidoreduktase in dem Reagens-System gemischt ist, die eine Funktion aufweist, ein organisches Produkt umzuwandeln, das durch direkte Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wird, welche von dem Trägermaterial unterschiedlich ist, und wobei das Reduktionsmittelsystem in der Probenlösung löslich ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1, wobei das Reagens-System auf oder in der Nähe des Elektrodensystems bereitgestellt ist.
Biosensor zum Messen eines Trägermaterials in einer Probenlösung, welcher eine elektrisch isolierende Grundplatte, ein Elektrodensystem, das eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auf der Grundplatte angeordnet sind, ein Bedeckungselement, das über der Grundplatte angeordnet ist, um einen Zufuhrweg für die Probenlösung zu dem Elektrodensystem zwischen dem Abdeckelement und der Grundplatte zu bilden, und ein Reagens-System, das an einem Abschnitt bereitgestellt ist, der gegen den Zufuhrweg der Probenlösung offen liegt, aufweist, wobei das Reagens-System mindestens eine Oxidoreduktase, ein hydrophiles Polymer, einen Elektroden-Vermittler und eine Substanz umfasst, die mit der Oxidoreduktase in dem Reagens-System gemischt ist, die eine Funktion aufweist, ein organisches Produkt umzuwandeln, das durch direkte Reaktion des zu messenden Trägermaterials mit der Oxidoreduktase zu einer anderen Verbindung erzeugt wird, welche von dem Trägermaterial unterschiedlich ist, und wobei das Reagens-System in der Probenlösung löslich ist.
Der Biosensor nach Anspruch 3, wobei das Reagens-System in Kontakt mit dem Elektrodensystem steht.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Reagens-System ferner einen pH-Puffer umfasst.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Oxidoreduktase β-D-Glucoseoxidase (EC 1.1.3.4) ist, das organische Produkt D-Glucono-δ-lacton ist, und die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln von D-Glucono-δ-lacton zu einer anderen Verbindung Glucono-D-lactonase (EC 3.1.1.17) ist.
Der Biosensor nach Anspruch 6, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-δ-lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucoseoxidase 0,5 bis 10 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 6, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-D- lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucoseoxidase 1 bis 3 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Oxidoreduktase von Pyrrolochinolinchinon abhängige Glucosedehydrogenase (EC 1.1.99.17) ist, das organische Produkt D-Glucono-δ-lacton ist und die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln von D-Glucono-δ-lacton zu einer anderen Verbindung Glucono-δ-lactonase (EC 3.1.1.17) ist.
Der Biosensor nach Anspruch 9, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-δ-lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl der von Pyrrolochinolinchinon abhängigen Glucosedehydrogenase 0,5 bis 10 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 9, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-δ-lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl der von Pyrrolochinolinchinon abhängigen Glucosedehydrogenase 1 bis 3 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Oxidoreduktase von Nikotinamidadenindinucleotid oder von Nikotinamidadenindinucleotidphosphorsäure abhängige Glucosedehydrogenase (EC 1.1.1.47) (EC 1.1.1.118) (EC 1.1.1.119) ist, das organische Produkt D-Glucono-δ-lacton ist und die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln von D-Glucono-δ-lacton zu einer anderen Verbindung Glucono-δ-lactonase (EC 3.1.1.17) ist.
Der Biosensor nach Anspruch 12, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-δ-lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl des von Nikotinamidadenindinucleotid oder von Nikotinamidadenindinucleotidphosphorsäure abhängigen Glucosedehydrogenase 0,5 bis 10 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 12, wobei das Verhältnis der Aktivitäts-Einheitszahl der Glucono-δ-lactonase zu der Aktivitäts-Einheitszahl der von Nikotinamidadenindinucleotid oder von Nikotinamidadenindinucleotidphosphorsäure abhängigen Glucosedehydrogenase 1 bis 3 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 5, wobei der durch den pH-Puffer realisierte pH-Wert 4 bis 9 ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Oxidoreduktase Alkoholoxidase oder Alkoholdehydrogenase ist, das organische Produkt Aldehyd ist und die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln von Aldehyd zu einer anderen Verbindung Hydrazin ist.
Der Biosensor nach Anspruch 1 oder 3, wobei die Oxidoreduktase Alkoholoxidase oder Alkoholdehydrogenase ist, das organische Produkt Aldehyd ist und die Substanz mit einer Funktion zum Umwandeln von Aldehyd zu einer anderen Verbindung eine organische Verbindung mit einem Aminorest ist.