ES2267583T3 - Biosensor. - Google Patents
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Abstract
Biosensor para medir un sustrato de una solución de muestra, que comprende: una placa base eléctricamente aislante, un sistema de electrodos que contiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto en dicha placa base, y un sistema reactivo que comprende por lo menos una óxidorreductasa, un polímero hidrófilo y un mediador electrónico, en el que dicho sistema reactivo comprende además una sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en dicho sistema reactivo que presenta la función de convertir un producto orgánico generado por la reacción directa del sustrato que debe medirse con dicha óxidorreductasa en otro compuesto, que es diferente del sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es soluble en dicha solución de muestra.
Description
Biosensor.
La presente invención se refiere a un biosensor
para facilitar la cuantificación rápida y exacta de un sustrato tal
como glucosa contenido en una muestra.
Con el propósito de efectuar una cuantificación
sencilla de los componentes de los fluidos corporales de las
personas normales, se han desarrollado recientemente diversos tipos
de biosensores que utilizan una acción catalítica específica de las
enzimas.
A continuación se explicará un procedimiento de
cuantificación de la glucosa como ejemplo del procedimiento de
cuantificación de un componente contenido en una solución de
muestra. Como procedimiento electroquímico de cuantificación de la
glucosa, es generalmente bien conocido un procedimiento que utiliza
una combinación de glucosa oxidasa (en lo sucesivo designada
abreviadamente como GOD) con un electrodo de oxígeno o un electrodo
de peróxido de hidrógeno.
La GOD oxida selectivamente
\beta-D-glucosa como sustrato a
D-glucono-\delta-lactona
utilizando oxígeno como mediador electrónico. En presencia de
oxígeno, el oxígeno se reduce a peróxido de hidrógeno durante el
proceso de reacción de oxidación mediante GOD. Se mide el volumen de
oxígeno reducido mediante el electrodo de oxígeno, o el volumen
aumentado de peróxido de hidrógeno mediante el electrodo de peróxido
de hidrógeno. El volumen de oxígeno reducido y el volumen de
peróxido de hidrógeno aumentado son proporcionales al contenido de
glucosa de la solución de muestra, de modo que es posible la
cuantificación de la glucosa basándose en el volumen de oxígeno
reducido o en el volumen de peróxido de hidrógeno aumentado.
Se han desarrollado sensores de glucosa de un
nuevo tipo que utilizan como mediador electrónico un compuesto
orgánico o un complejo metálico tal como ferricianuro potásico, un
derivado del ferroceno y un derivado de la quinona sin utilizar
oxígeno como mediador electrónico. Los sensores de esta clase oxidan
el agente reductor del mediador electrónico resultante de la
reacción enzimática que se produce en un electrodo, pudiendo
determinarse la concentración de la glucosa contenida en la
solución de muestra basándose en la cantidad de corriente de
oxidación. En caso de utilizar un compuesto orgánico o complejo
metálico como mediador electrónico en lugar de oxígeno, es posible
formar una capa de reactivo mientras el mediador electrónico es
transportado en una cantidad exacta y en estado estable junto con
GOD al electrodo. Además, también es posible integrar la capa
reactiva con un sistema de electrodos mientras se mantiene en un
estado casi seco. Los sensores de glucosa disponibles basados en
estas tecnologías han recibido recientemente mucha atención. Un
ejemplo característico de las mismas es un biosensor dado a conocer
en la publicación de patente japonesa nº 2517153. En un sensor
disponible de esta clase es posible medir fácilmente la
concentración de glucosa con un dispositivo de medición
sencillamente introduciendo la solución de muestra en el sensor
conectado de forma separable con el dispositivo de medición.
En el procedimiento de medición que utiliza el
sensor de glucosa anteriormente descrito, con una corriente de
respuesta del orden de 1 a 10 \muA/cm^{2}, la concentración de
glucosa de la muestra puede medirse en aproximadamente 30 segundos.
No obstante, en los últimos años existe el deseo en diversos ámbitos
de desarrollar sensores capaces de cuantificar la glucosa más
rápidamente con mayor sensibilidad y exactitud.
Además, en los sensores de glucosa
electroquímicos corrientes, mediante la adición de un polímero
hidrófilo tal como carboximetilcelulosa a la capa reactiva, se
evita que los resultados de medición sean afectados por la
vibración producida en el dispositivo de medición desde el exterior.
El polímero hidrófilo presenta otra ventaja consistente en la
posibilidad de funcionar como aglomerante para inmovilizar la enzima
en el electrodo de forma moderada. No obstante, la presencia del
polímero hidrófilo genera cambios en la actividad catalítica de la
GOD o en la termodinámica de la reacción hidrolítica de
D-glucono-\delta-lactona
a ácido glucónico, para producir la acumulación de
D-glucono-\delta-lactona,
que, en algunos caos, es un producto de reacción de la GOD. Como
resultado, tiene lugar la reacción inversa y disminuye la velocidad
de la reacción de oxidación de la glucosa, reduciéndose así la
cantidad de agente reductor del mediador electrónico generado en un
tiempo de reacción corto, de modo que la magnitud (sensibilidad) de
la corriente del sensor que fluye como respuesta a la glucosa
disminuye en algunos casos. Particularmente, intentar obtener una
sensibilidad suficiente para concentraciones elevadas de glucosa,
asegurando al mismo tiempo una buena exactitud, requiere un
incremento del tiempo de reacción para generar una cantidad
importante de agente reductor del mediador electrónico, de modo que
la medición tiende a necesitar un tiempo más largo.
El documento EP 0 368 474 A da a conocer un
sensor alcohólico en el cual una deshidrogenasa alcohólica funciona
como sustrato en la detección del alcohol etílico. En el sensor, la
deshidrogenasa alcohólica convierte el etanol en acetaldehído. El
sensor utiliza un compuesto de diamina en un revestimiento poroso,
es decir, no está incorporada a la mezcla del electrodo de trabajo.
La diamina reacciona con el acetaldehído producido, para evitar la
inhibición de la deshidrogenasa (el acetaldehído es un inhibidor de
la deshidrogenasa) aumentando la respuesta del sensor.
La presente invención se refiere a un biosensor
para medir un sustrato de una solución de muestra, que comprende
una placa base eléctricamente aislante, un sistema de electrodos que
comprende un electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto
en dicha placa base, y un sistema reactivo que comprende por lo
menos una óxidorreductasa, un polímero hidrófilo y un mediador
electrónico, en el que dicho sistema reactivo además comprende una
sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en dicho sistema
reactivo que presenta la función de convertir un producto orgánico
generado por la reacción directa del sustrato que debe medirse con
dicha óxidorreductasa en otro compuesto, que es diferente del
sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es soluble en dicha
solución de muestra.
La presente invención dispone un biosensor para
medir un sustrato de una solución de muestra, que comprende una
placa base eléctricamente aislante, un sistema de electrodos que
comprende un electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto en
dicha placa base, un elemento de cobertura dispuesto sobre dicha
placa base para formar una vía de suministro de solución de muestra
a dicho sistema de electrodos entre dicho elemento de cobertura y
dicha placa base, y un sistema reactivo que presenta una parte
expuesta a dicha vía de suministro de solución de muestra, en el
que dicho sistema reactivo comprende, por lo menos, una
óxidorreductasa, un polímero hidrófilo, un mediador electrónico y
una sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en dicho sistema
reactivo que presenta la función de convertir un producto orgánico
generado por reacción directa del sustrato que debe medirse con
dicha óxidorreductasa en otro compuesto, el cual es diferente del
sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es soluble en dicha
solución de muestra.
La figura 1 es una vista en perspectiva
despiezada de un sensor de glucosa según un ejemplo de la presente
invención, del cual se ha omitido el sistema reactivo.
La figura 2 es una vista en sección transversal
longitudinal de la parte vital del mismo sensor de glucosa.
Como se ha descrito anteriormente, un biosensor
para medir un sustrato en una solución de muestra según la presente
invención comprende un sistema de electrodos que comprende un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto en una placa
base eléctricamente aislante, y un sistema reactivo que comprende
por lo menos una óxidorreductasa, un polímero hidrófilo y un
mediador electrónico, en el que dicho sistema reactivo además
comprende una sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en dicho
sistema reactivo que presenta la función de convertir un producto
orgánico generado por la reacción directa del sustrato que debe
medirse con dicha óxidorreductasa en otro compuesto, que es
diferente del sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es
soluble en dicha solución de muestra.
El producto orgánico del sistema de reacción
enzimático es reducido o eliminado por la sustancia que presenta la
función de convertir el producto orgánico en otro compuesto; como
resultado, la reacción enzimática entre el sustrato que debe
medirse y la óxidorreductasa puede efectuarse suavemente. Esto
permite una medición rápida y exacta del sustrato. Evidentemente,
la sustancia que presenta la función de convertir el producto
orgánico en otro compuesto no debe ser una sustancia que vuelva a
convertir el producto orgánico en el sustrato original o que lo
convierta en un compuesto que pueda afectar negativamente a la
reacción enzimática. Además, la sustancia no debe ser una sustancia
que afecte ella misma negativamente a la reacción enzimática.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, el producto orgánico generado por reacción
directa del sustrato que debe medirse con la óxidorreductasa es un
producto de oxidación generado por la oxidación del sustrato por la
óxidorreductasa, y la concentración del sustrato se obtiene
basándose en la corriente que oxida el mediador electrónico que se
reduce en conjunción con la reacción enzimática.
En esta forma de realización, cuando el sustrato
que debe medirse es D-glucosa, se utilizan
respectivamente \beta-D-glucosa
oxidasa (EC 1.1.3.4) y
glucono-\delta-lactonasa (EC
3.1.1.17, en lo sucesivo denominada GLN) como óxidorreductasa y
como a sustancia que presenta la función de convertir el producto de
oxidación orgánico,
D-glucono-\delta-lactona,
en otro compuesto. Cuando la óxidorreductasa es glucosa
deshidrogenasa dependiente de pirroloquinolina quinona (en lo
sucesivo denominada PQQ) (EC 1.1.99.17), la GLN se utiliza como
sustancia que presenta la función de convertir el producto de
oxidación,
D-glucono-\delta-lactona,
en otro compuesto.
Cuando la óxidorreductasa es glucosa
deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (en
lo sucesivo denominada NAD) o nicotinamida adenina dinucleótido
ácido fosfórico (en lo sucesivo denominada NADP) (EC 1.1.1.47) (EC
1.1.1.118) (EC 1.1.1.119), la GLN se utiliza como sustancia que
presenta la función de convertir el producto de oxidación orgánico,
D-glucono-\delta-lactona,
en otro compuesto.
Cuando la óxidorreductasa es lactato oxidasa,
puede utilizarse piruvirato oxidasa como sustancia que presenta la
función de convertir el producto de oxidación, ácido pirúvico, en
otros compuestos, acetilfosfato y dióxido de carbono.
En los ejemplos siguientes, la GLN, que es una
enzima, se utilizó como sustancia que presenta la función de
convertir el producto en otro compuesto, pero no necesariamente se
utiliza un biorreactivo tal como una enzima. Por ejemplo, cuando el
sustrato que debe medirse es alcohol primario y la óxidorreductasa
es alcohol oxidasa o alcohol deshidrogenasa, es posible utilizar
hidracina o un compuesto orgánico que presente un residuo amino, el
cual enlaza rápidamente con el aldehído producto de la oxidación,
como sustancia que presenta la función de convertirlo en otro
compuesto.
En otra forma de realización de la presente
invención, el producto orgánico generado por la reacción directa
del sustrato que debe medirse con la óxidorreductasa es un producto
de reducción generado mediante la reducción del sustrato por la
óxidorreductasa y la concentración del sustrato se obtiene basándose
en la corriente de reducción del mediador electrónico que se oxida
en conjunción con la reacción enzimática. En esta forma de
realización, cuando el sustrato que debe medirse es glutationa
disulfuro y la óxidorreductasa es glutationa reductasa (EC
1.6.4.2), se utiliza una sustancia que reacciona
tiol-selectivamente, por ejemplo un compuesto de
maleimida, como sustancia que presenta la función de convertir el
producto orgánico glutationa en otro compuesto.
Como óxidorreductasa utilizada en la presente
invención, se selecciona una óxidorreductasa adecuada dependiendo
del sustrato contenido en la solución de muestra. Aparte de las
enzimas listadas anteriormente, es posible utilizar como
óxidorreductasa, por ejemplo, alcohol deshidrogenasa, lactato
oxidasa, colesterol oxidasa, xanteno oxidasa, aminoácido oxidasa,
ascorbato oxidasa, acil-CoA oxidasa, uricasa,
glutamato deshidrogenasa, o fructosa deshidrogenasa.
Para que la sustancia que presenta la función de
convertir el producto orgánico generado por la reacción de sustrato
con la óxidorreductasa a otro compuesto pueda funcionar de forma
efectiva, se añade preferiblemente un tampón pH al sistema
reactivo. En el caso de utilización del tampón pH, también es
necesario considerar el pH adecuado de la óxidorreductasa. Como
tampón pH es posible utilizar, por ejemplo, un tampón que contenga
una o más clases de fosfato, acetato, boato, citrato, ftalato y
glicina, aparte del tampón que comprende una combinación de
fosfatos utilizado en los ejemplos que se describirán
posteriormente. También es posible utilizar una o más clases de
sales ácidas de las sales anteriormente listadas, si existen.
Además, es posible utilizar un reactivo usado en los denominados
"tampones GOOD". Estos tampones de pH pueden estar comprendidos
en el sistema sensor en una forma variable según la estructura del
sensor, y la forma puede ser una materia sólida o una solución.
Además, el valor pH tamponado obtenido mediante el tampón se
selecciona básicamente para mejorar la eficacia de la sustancia que
presenta la función de convertir el producto orgánico generado por
la reacción del sustrato con la óxidorreductasa para formar otro
compuesto, pero la selección debe efectuarse considerando el
equilibrio entre esta mejora y la influencia del tampón pH en otras
reacciones del sensor.
Los ejemplos de mediador electrónico incluyen
ferricianuro potásico, complejos metálicos tales como
osmio-tris (bipiridinio) o derivados de ferroceno,
derivados de quinonas tales como p-benzoquinona,
derivados de fenazinio como el metosulfato de fenacina, derivados
del fenotiazinio como el azul de metileno, la nicotinamida adenina
nucleótido y la nicotinamida adenina dinucleótido ácido fosfórico.
Estos mediadores electrónicos pueden presentarse en forma de
aglomeración con el polímero principal o formando una parte del
mediador o todo él la cadena polimérica. Además, también cuando se
utiliza oxígeno como mediador electrónico puede obtenerse una
corriente de respuesta. Estos mediadores electrónicos se utilizan
por separado o en combinaciones de dos o más.
Como polímero hidrófilo es posible utilizar
derivados de celulosa solubles en agua, particularmente
etilcelulosa, hidroxietilcelulosa y carboximetilcelulosa,
polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico, gelatina, ácido
poliacrílico y sus sales, almidón y sus derivados, un polímero de
anhídrido maleico o sus sales, poliacrilamida, resina de
metacrilato,
poli-2-hidroxietilmetacrilato y
similares.
A continuación, se describirá la estructura de
un sensor según la presente invención haciendo referencia a la
figura 1 y la figura 2, pero la presente invención no se limita
solamente a la misma.
La figura 1 es una vista en perspectiva
despiezada de un sensor de glucosa según la presente invención, del
cual se ha eliminado el sistema reactivo. Se imprime una pasta de
plata en una placa base 1 de tereftalato de polietileno
eléctricamente aislante, mediante impresión por serigrafía, para
formar conductores 2 y 3 y la base de los electrodos descritos más
adelante. A continuación, se imprime en la placa base 1 una pasta
de carbono que contiene un aglutinante resínico, para formar el
electrodo de trabajo 4. Este electrodo de trabajo 4 se encuentra en
contacto con el conductor 2. Además, se imprime una pasta aislante
en la placa base 1 para formar una capa aislante 6. La capa
aislante 6 cubre la parte periférica exterior del electrodo de
trabajo 4, manteniendo constante el área de la parte expuesta del
electrodo de trabajo 4. A continuación, se imprime una pasta de
carbono conductora que contiene un aglutinante resínico sobre la
placa base 1, de modo que se encuentre en contacto con el conductor
3, formando un contraelectrodo anular 5.
Una vez que la placa base 1 eléctricamente
aislante anteriormente descrita ha sido dotada de un sistema
reactivo tal como se describe más adelante, se agrega a la misma un
espaciador 8 que presenta una ranura 10 y una tapa 9 con una
abertura de ventilación 11 en la relación posicional que muestra la
línea de trazos de la figura 1, con el fin de fabricar el
biosensor. Se forma una vía de suministro de la solución de muestra
en la parte de la ranura 10 del espaciador 8. El extremo abierto de
la ranura 10, que está situado en el extremo del sensor, sirve de
entrada de suministro de muestra para la vía de suministro de
solución de muestra.
La figura 2 es una vista en sección transversal
longitudinal del biosensor según la presente invención. Sobre la
placa base 1 en el que se encuentra el sistema de electodos, se
forma un sistema reactivo 7 que contiene una enzima y un mediador
electrónico. El sistema reactivo 7 está formado sobre el sistema de
electrodos, de modo que se encuentra en contacto con el electrodo
de trabajo 4 o con el contraelectrodo 5, incrementándose
sustancialmente la cantidad de mediador electrónico suministrado
para las reacciones electroquímicas en los electrodos, de modo que
es posible obtener una respuesta mayor. El sistema reactivo 7, en el
ejemplo mostrado en la figura, está compuesto por una capa de
polímero hidrófilo 7a y una capa 7b que está formada sobre la misma
y que contiene GOD, GLN y el mediador electrónico ferricianuro
potásico.
Al poner en contacto una solución de muestra con
el extremo abierto de la ranura 10 que forma la vía de suministro
de la solución de muestra del sensor con la estructura mostrada en
la figura 2, la solución de muestra se introduce en la vía de
suministro de solución de muestra gracias al fenómeno capilar,
disolviendo el sistema reactivo 7, para que se produzca la reacción
enzimática. De este modo, cuando se forma la vía de suministro de
la solución de muestra integrando el elemento de tapa compuesto del
espaciador 8 y la tapa 9 con la placa base 1, en la cual se ha
dispuesto el sistema de electrodos, la cantidad de la solución de
muestra que contiene el sustrato que debe medirse suministrada al
sensor puede ser constante, de modo que es posible aumentar la
exactitud de la medición.
En el sensor provisto de la vía de suministro de
solución de muestra descrito anteriormente, el sistema reactivo
puede formarse en una parte expuesta a la vía de suministro de
solución de muestra así como en el sistema de electrodos, de modo
que el sistema reactivo pueda disolverse en la solución de muestra
suministrada. Por ejemplo, el sistema reactivo puede formarse del
modo siguiente: el espaciador 8 y la tapa 9 están unidos entre sí,
es decir con la cara superior girada hacia abajo para formar una
superficie cóncava en la ranura 10, y se añade gota a gota una
solución para formar el sistema reactivo en la superficie cóncava y
se seca. Alternativamente, el sistema reactivo puede dividirse en
diversas capas, una en la placa base y otra en el elemento de
cubierta. En este caso, cada capa dividida no contendrá
necesariamente todos los reactivos. Por ejemplo, la óxidorreductasa,
el mediador electrónico y el tampón pH pueden estar contenidos en
capas diferentes.
El sensor también puede configurarse con sólo
la placa base 1, sin formar la vía de suministro de solución de
muestra como se ha descrito anteriormente. En este caso, el sistema
reactivo está formado sobre o cerca del sistema de electrodos
En los sensores de cualquiera de las
estructuras, es preferible formar una capa de polímero hidrófilo
sobre el sistema de electrodos para evitar la adsorción de proteína
en el sistema de electrodos o similar.
Una solución acuosa de sal sódica de
carboximetilcelulosa (en lo sucesivo denominada CMC) se vertió gota
a gota sobre el sistema de electrodos dispuesto sobre la placa base
1 y se secó para formar una capa de CMC 7a. Una solución acuosa de
GOD, GLN y ferricianuro potásico se añadió gota a gota sobre la capa
de CMC 7a y se secó para formar una capa 7b. La relación entre el
número de unidades de actividad de la GOD y de GLN, contenidas en
el sistema reactivo 7 así formado fue de GOD:GLN = 1:2. La cantidad
de GOD se situó en 1 unidad.
Se fabricó un sensor como el que muestra la
figura 2 combinando el espaciador 8 y la tapa 9 con la placa base
anteriormente descrita.
Se suministró una solución acuosa que contenía
una determinada cantidad de D-glucosa en
la abertura de la vía de suministro de solución de muestra del
sensor, es decir, en el extremo abierto de la ranura 10 del
espaciador. Después de un período de tiempo de reacción
predeterminado, se aplicó una corriente de 500 mV al electrodo de
trabajo 4 respecto al contraelectrodo 5, y se midió el valor del
flujo de corriente en este momento. Mientras que la
D-glucosa se oxidó formando
D-glucono-\delta-lactona
por la acción de la GOD, los iones de ferricianuro se redujeron a
iones de ferrocianuro. La concentración de iones de ferrocianuro
así generados es proporcional a la concentración de la glucosa. Por
lo tanto, puede medirse la concentración de la glucosa basándose en
la corriente de oxidación de la misma. La
D-glucono-\delta-lactona
generada en este momento se descompone por la acción de la GLN.
Se realizó un gráfico de la corriente de
respuesta obtenida en un tiempo de reacción de 5 segundos con la
concentración de D-glucosa de la solución utilizada;
como resultado, se observo una relación lineal favorable entre
ambas. Las respuestas obtenidas cuando las concentraciones de
glucosa eran de 602 mg/dl y 200 mg/dl se situaron aproximadamente
en 500 mV y 190 mV respectivamente. Además, como comparación, se
fabricó un sensor que no contenía GLN en la capa 7b y se midió la
respuesta del mismo modo que anteriormente: las respuestas
obtenidas cuando las concentraciones de glucosa eran de 602 mg/dl y
200 mg/dl se situaron aproximadamente en 425 mV y 165 mV
respectivamente, demostrando que las respuestas del sensor que
contenía GLN en el sistema reactivo eran significativamente mayores
que las del que no contenía GLN. Las tasas de incremento de las
respuestas fueron del 18% y del 15%, representando estos
porcentajes valores muy elevados. Se considera que la razón de ello
es que la adición de GLN al sistema reactivo descompone el producto
de reacción de la GOD,
D-glucono-\delta-lactona,
para evitar la acumulación del mismo en la solución, acelerando así
la reacción entre GOD y glucosa.
Además, merece una consideración especial el
hecho de que el coeficiente de variación de la respuesta (CV) en el
sensor al cual se añadió GLN fue del 75% o menos del del sensor sin
GLN. La adición de GLN mejoró la exactitud de la medición.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención permite incrementar la sensibilidad de la medición.
Además, resulta evidente que la concentración del sustrato que debe
medirse puede cuantificarse de forma exacta y rápida, en un
reducido tiempo de reacción, por ejemplo de 5 segundos.
Cuando la cantidad de GOD incluida en el sistema
reactivo fue tal que la actividad llegó a ser de entre 0,05 y 0,5
unidades por milímetro cuadrado de área de la superficie del sistema
sensor en contacto con la superficie del sistema sensor, se
obtuvieron resultados especialmente favorables.
Del mismo modo que en el ejemplo 1, se formaron
la capa 7a y la capa 7b que contenía GOD, GNL y ferricianuro
potásico sobre el sistema de electrodos en la placa base 1. En este
ejemplo no se utilizan el espaciador 8 y la tapa 9.
Sobre el sistema reactivo 7 del sensor se vertió
gota a gota una solución acuosa que contenía una cierta cantidad de
D-glucosa. La cantidad de solución acuosa de
D-glucosa vertida gotat a gota era una
cantidad predeterminada. Después de un intervalo de tiempo
predeterminado, se aplicó una tensión de 500 mV al electrodo de
trabajo 4, respecto al contraelectrodo 5, y se midió el valor del
flujo de corriente en este momento. Entre la corriente de respuesta
obtenida y la concentración de glucosa se apreció una relación
lineal favorable. Además, la corriente de respuesta obtenida fue
significativamente mayor que la corriente de respuesta obtenida del
sensor que no contenía GLN en el sistema reactivo 7. De este modo,
se encontró que, aunque el sensor no disponía del elemento de
cobertura, el efecto anteriormente descrito de la GLN permitía
incrementar la sensibilidad de medición.
En los ejemplos 1 y 2, el sistema reactivo 7
estaba formado para entrar en contacto con el sistema de electrodos,
pero aunque el sistema reactivo 7 se hubiera formado cerca de la
entrada de suministro de muestra en la placa base 1, de modo que no
entrara en contacto con el sistema de electrodos y se expusiera a la
vía de suministro de la solución de muestra, la adición de GLN
generaba el incremento de la sensibilidad de medición. Además,
podría apreciarse el mismo efecto cuando el sistema aunque el
sistema reactivo 7 estuviera formado en el lado de la tapa para
estar expuesto a la vía de suministro de la solución de muestra.
Además, en los ejemplos anteriores, para
descomponer con mayor eficacia la
D-glucono-\delta-lactona,
se incluyó GLN cerca de la GOD, es decir, en el sistema reactivo 7,
pero la GLN puede estar presente en una posición diferente del
sistema reactivo 7 en la vía de suministro de la solución de muestra
del sensor. Si se encuentra en una posición en contacto con la
muestra de medición, la adición de GLN incrementa la sensibilidad
de medición.
En este ejemplo, se fabricó un sensor del mismo
modo que en el ejemplo 1, excepto que se añadió un tampón pH
compuesto de una combinación de bifosfato dipotásico
(K_{2}HPO_{4}) y bifosfato potásico (KH_{2}PO_{4}) a la
capa 7b, de modo que el pH obtenido con la introducción de agua
fuera 7.
Se suministró una solución acuosa que contenía
una cierta cantidad de D-glucosa en la abertura de
la vía de suministro de la solución de muestra, y después de un
intervalo de tiempo predeterminado, se aplicó una tensión de 500 mV
al electrodo de trabajo 4 respecto al contraelectrodo 5, y se midió
el valor del flujo e corriente en este momento. La corriente de
respuesta obtenida fue superior a la del sensor del ejemplo 1 que no
contenía un tampón pH en el sistema reactivo 7. Este resultado se
obtuvo presumiblemente porque, debido a la adición del tampón pH,
el pH de la solución de muestra se mantuvo en un valor en el cual la
GLN descompone más efectivamente la
D-glucono-\delta-lactona.
Se consideró que la adición del tampón pH cambiaba tanto la
actividad de la GOD como la de la GLN. No obstante, al situarse los
pH adecuados para la GOD y la GLN aproximadamente en pH 5 y pH 7
respectivamente, el efecto de la GLN se consideró más favorecido en
el pH 7 de este ejemplo.
En este ejemplo, se fabricó un sensor del mismo
modo que en el ejemplo 1, excepto porque se utilizó deshidrogenasa
glucosa dependiente de PQQ (en lo sucesivo denominada
PQQ-GDH) en lugar de la enzima GOD de la capa 7b. La
relación entre el número de unidades de actividad de la GLN y el de
la PQQ-GDH fue GLN:PQQ-GDH = 2:1. La
cantidad de PQQ-GDH utilizada fue de 2
unidades.
Se suministró una solución acuosa que contenía
una determinada cantidad de D-glucosa en la abertura
de la vía de suministro de la solución de muestra del sensor, y
después de un intervalo de tiempo predeterminado, se aplicó una
tensión de 500 mV al electrodo de trabajo 4 respecto al
contraelectrodo 5, y se midió el valor del flujo de corriente en
este momento. La corriente de respuesta obtenida presentó una
relación lineal favorable respecto a la concentración de
D-glucosa. Además, con fines comparativos se fabricó
un sensor que no contenía GLN en el sistema reactivo 7 y se midió
el valor de la respuesta de mismo modo anterior. En cada
concentración de glucosa, la respuesta del sensor que contenía GLN
en el sistema reactivo fue significativamente mayor que la del
sensor sin GLN. Además, cuando se utilizó glucosa deshidrogenasa
dependiente de PQQ, la adición de GLN al sistema reactivo produjo
el efecto de incrementar la respuesta.
Además, del mismo modo que en el ejemplo 3, la
adición de un tampón pH al sistema reactivo incrementó
adicionalmente el valor de la respuesta.
Cuando la PQQ-GDH anteriormente
mencionada estaba en contacto con la superficie del sistema sensor,
de modo que la actividad de la misma llegó a entre 0,1 y 1,5
unidades por milímetro cuadrado de área de superficie del sistema
sensor, se obtuvieron resultados especialmente favorables.
En este ejemplo, se fabricó un sensor del mismo
modo que en el ejemplo 4, excepto que se utilizó glucosa
deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP (en lo sucesivo
denominadas NSD-GDH y NADP-GDH
respectivamente) en lugar de PQQ-GDH y que se
utilizó tionina en lugar de ferricianuro potásico. La proporción
entre el número de unidades de actividad de la GLN y el de la
NAD-GDH o la NADP-GDH se situó en
NAD (NADP) -GDH:GLN = 1:2.
Se midió el valor de la corriente de respuesta a
la concentración de D-glucosa, en condiciones
iguales a las del ejemplo 4; como resultado, la corriente de
respuesta obtenida fue casi proporcional a la concentración de
D-glucosa. La reacción entre la GDH y la
D-glucosa genera reductores de la NAD y la NADP,
donando electrones a la tionina, y transmitiendo la tionina así
convertida los electrones al electrodo; de este modo se genera una
corriente. Lo que debe apreciarse aquí es que los reductores de la
NAD y la NADP no son productos del sustrato (no generados por la
reacción entre el sustrato y la enzima). La respuesta obtenida fue
significativamente mayor a la del sensor similar que no contenía
GLN en el sistema reactivo 7. De este modo, también cuando se
utilizó glucosa deshidrogenasa dependiente de NAD y NADP, la
adición de GLN al sistema reactivo produjo el efecto de incrementar
la respuesta.
Los ejemplos 1 a 4 describen el caso en el cual
la proporción entre el número de unidades de actividad de la GLN y
el de la GOD, la PQQ-GDH y la
NAD(NADP)-GDH fue 2, pero también cuando la
proporción respecto a cada una de las óxidorreductasas era de 0,5 a
10 la GLN produjo el efecto de incrementar la corriente. Además,
cuando la proporción anteriormente mencionada fue entre 1 y 3, el
efecto fue particularmente importante y además se obtuvieron
resultados preferibles.
Además, del mismo modo que en el ejemplo 3, la
utilización del tampón pH incrementa adicionalmente la respuesta.
Además, el intervalo de pH en el cual la respuesta aumentó de forma
considerable fue entre el pH 4 y el pH 9, cuando la sustancia que
presenta la función de convertir el producto orgánico del sustrato
generado por la reacción de la óxidorreductasa en otro compuesto
era GLN. En dicho intervalo de pH, la actividad de la GLN se
considera elevada.
En los ejemplos, la tensión aplicada al sistema
de electrodos fue de 500 mV, pero no debe considerarse una
limitación. Puede aplicarse cualquier tensión a la cual el mediador
electrónico reducido pueda ser oxidado en el contraelectrodo. Para
reducir el mediador electrónico oxidado, puede aplicarse una tensión
adecuada para la reducción del mismo. Además, el procedimiento de
detección de la corriente se utilizó como procedimiento de
medición, pero cualquier variable que cambie cuando tiene lugar la
reacción electroquímica puede utilizarse sustancialmente como
sujeto que puede ser detectado. Por ejemplo, puede detectarse la
cantidad de carga eléctrica que pasa en un momento determinado. Al
ser la cantidad de carga eléctrica un valor integral de la corriente
respecto al tiempo, puede correlacionarse con la concentración de
la sustancia que debe medirse.
Respecto al tiempo de reacción, no existen
limitaciones específicas. Con un tiempo de reacción corto, el efecto
de incremento de la respuesta según la presente invención es
remarcable, pero el incremento de la respuesta se observa
sustancialmente en todos los tiempos de reacción.
Respecto al material de los electrodos, en los
ejemplos descritos es carbono, pero no debe considerarse como una
limitación. Como material para el electrodo de trabajo es posible
utilizar cualquier material eléctricamente conductor que no se
oxide ni reduzca él mismo durante la oxidación y reducción del
mediador electrónico, tal como platino, oro y paladio, además del
carbono. Además, como material del contraelectrodo, es posible
utilizar cualquier material eléctricamente conductor que se utilice
normalmente, como el oro, la plata y el platino, además del
carbono. En los ejemplos anteriores, el electrodo de trabajo y el
contraelectrodo se fabricaron por el procedimiento de impresión
serigráfica., pero el procedimiento de fabricación no está sujeto a
ninguna limitación. Por ejemplo, es posible utilizar un proceso tal
como la fotolitografía, el procedimiento de deposición de vapor, el
procedimiento de deposición de vapor químico o el procedimiento de
deposición electrónica. Además del electrodo de trabajo y del
contraelectrodo, puede disponerse un electrodo con un potencial
estable dentro del sistema sensor para utilizarlo como electrodo de
referencia. En este caso, la tensión se aplica entre el electrodo
de referencia y el electrodo de trabajo.
La forma, disposición y número del sistema de
electrodos no debe limitarse a los que muestran los ejemplos
anteriores. La forma, disposición y número de conductores y
terminales tampoco debe limitarse a los que muestran los ejemplos
anteriores.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención proporciona un biosensor capaz de medir un sustrato de
forma rápida y exacta.
Claims (17)
1. Biosensor para medir un sustrato de una
solución de muestra, que comprende:
una placa base eléctricamente aislante,
un sistema de electrodos que contiene un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto en dicha placa
base, y
un sistema reactivo que comprende por lo menos
una óxidorreductasa, un polímero hidrófilo y un mediador
electrónico,
en el que dicho sistema reactivo comprende
además una sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en dicho
sistema reactivo que presenta la función de convertir un producto
orgánico generado por la reacción directa del sustrato que debe
medirse con dicha óxidorreductasa en otro compuesto, que es
diferente del sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es
soluble en dicha solución de muestra.
2. Biosensor según la reivindicación 1, en el
que dicho sistema reactivo está previsto sobre o próximo a dicho
sistema de electrodos.
3. Biosensor para medir un sustrato de una
solución de muestra, que comprende:
una placa base eléctricamente aislante,
un sistema de electrodos que contiene un
electrodo de trabajo y un contraelectrodo dispuesto en dicha placa
base,
un elemento de cobertura dispuesto sobre dicha
placa base para formar una vía de suministro de solución de muestra
a dicho sistema de electrodos entre dicho elemento de cobertura y
dicha placa base, y
un sistema reactivo que presenta una parte
expuesta a dicha vía de suministro de solución de muestra,
en el que dicho sistema reactivo comprende, por
lo menos, una óxidorreductasa, un polímero hidrófilo, un mediador
electrónico y una sustancia mezclada con dicha óxidorreductasa en
dicho sistema reactivo que presenta la función de convertir un
producto orgánico generado por reacción directa del sustrato que
debe medirse con dicha óxidorreductasa en otro compuesto, el cual es
diferente del sustrato, y en el que dicho sistema reactivo es
soluble en dicha solución de muestra.
4. Biosensor según la reivindicación 3, en el
que dicho sistema reactivo se encuentra en contacto con dicho
sistema de electrodos.
5. Biosensor según la reivindicación 1 ó 3,
en el que dicho sistema reactivo comprende además un tampón de
pH.
6. Biosensor según la reivindicación 1 ó 3,
en el que dicha óxidorreductasa es
\beta-D-glucosa oxidasa (EC
1.1.3.4), dicho producto orgánico es
D-glucono-\delta-lactona
y dicha sustancia que presenta la función de convertir la
D-glucono-\delta-lactona
en otro compuesto es
glucono-\delta-lactonasa (EC
3.1.1.17).
7. Biosensor según la reivindicación 6, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa oxidasa es de 0,5 a
10.
8. Biosensor según la reivindicación 6, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa oxidasa es de 1 a
3.
9. Biosensor según las reivindicaciones 1 ó
3, en el que dicha óxidorreductasa es glucosa deshidrogenasa
pirroloquinolina quinona dependiente (EC 1.1.99.17), dicho producto
orgánico es
D-glucono-\delta-lactona,
y dicha sustancia que presenta la función de convertir
D-glucono-\delta-lactona
en otro compuesto es
glucono-\delta-lactonasa (EC
3.1.1.17).
10. Biosensor según la reivindicación 9, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa deshidrogenasa
dependiente de pirroloquinolina quinona es de 0,5 a 10.
11. Biosensor según la reivindicación 9, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa deshidrogenasa
dependiente de pirroloquinolina quinona es de 1 a 3.
12. Biosensor según la reivindicación 1 ó 3, en
el que dicha óxidorreductasa es nicotinamida adenina dinucleótido o
glucosa deshidrogenasa dependiente de nicotinamida adenina
dinucleótido o nicotinamida adenina nucleótido ácido fosfórico (EC
1.1.1.47) (EC 1.1.1.118) (EC 1.1.1.119), dicho producto orgánico es
D-glucono-\delta-lactona,
y dicha sustancia que presenta la función de convertir la
D-gluconato-\delta-lactona
en otro compuesto es
glucono-\delta-lactonasa (EC
3.1.1.17).
13. Biosensor según la reivindicación 12, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa deshidrogenasa
dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido o nicotinamida
adenina dinucleótido ácido fosfórico es de 0,5 a 10.
14. Biosensor según la reivindicación 12, en el
que la relación entre el número de unidades de actividad de dicha
glucono-\delta-lactonasa y el
número de unidades de actividad de dicha glucosa deshidrogenasa
dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido o nicotinamida
adenina dinucleótido ácido fosfórico es de 1 a 3.
15. Biosensor según la reivindicación 5, en el
que el pH alcanzado por dicho tampón pH es de 4 a 9.
16. Biosensor según la reivindicación 1 ó 3, en
el que dicha óxidorreductasa es alcohol oxidasa o alcohol
deshidrogenasa, dicho producto orgánico es aldehído, y dicha
sustancia que presenta la función de convertir aldehído en otro
compuesto es hidra-
cina.
cina.
17. Biosensor según la reivindicación 1 ó 3, en
el que dicha óxidorreductasa es alcohol oxidasa o alcohol
deshidrogenasa, dicho producto orgánico es aldehído, y dicha
sustancia que presenta la función de convertir aldehído en otro
compuesto es un compuesto orgánico que presenta un residuo
amino.
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