JP2517153B2 - バイオセンサおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、種々の微量の生体試料中の特定成分につい
て、試料液を希釈することなく迅速かつ簡便に定量する
ことのできるバイオセンサに関する。

従来の技術 従来、血液などの生体試料中の特定成分について、試
料液の希釈や攪拌などを行なう事なく簡易に定量しうる
方式として、第７図に示すようなバイオセンサを提案し
た。このバイオセンサは、絶縁性の基板１上にスクリー
ン印刷等の方法でカーボンなどからなる電極系2,3を形
成し、前記電極上に親水性高分子層６と酸化還元酵素層
９と電子受容体層10からなる酵素反応層を形成したもの
である。試料液を酵素反応層へ滴下すると、酸化還元酵
素と電子受容体が試料液に溶解し、試料液中の基質との
間で酵素反応が進行し電子受容体が還元される。反応終
了後、電極系に電圧を印加して電子受容体の還元体を酸
化し、このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質
濃度を求める。

発明が解決しようとする課題 この様な従来の構成では、試料液中に血球などの固形
成分が含まれている場合、粘度が高いため反応が遅れた
り，電極表面へ付着して電極反応が影響されて応答がば
らついた。また、従来バイオセンサの製造において、酵
素反応層はあらかじめ親水性高分子層を形成後酵素の水
溶液を塗布乾燥しさらに電子受容体の層を形成している
ため反応する際、各層が溶解するのに時間を要し反応開
始が遅れるため、測定時間が短縮できないという問題が
あった。

課題を解決するための手段 本発明は上記課題を解決するために、絶縁性の基板上
に少なくとも測定極と対極からなる電極系を設け、酵素
と電子受容体と試料液の反応に際しての物質濃度変化を
電気化学的に前記電極系で検知し、試料液中の基質濃度
を測定するバイオセンサにおいて、前記電極系の表面に
酸化還元酵素と親水性高分子および電子受容体の混合物
からなる酵素反応層を形成したことを特徴とする。

また、固形物を含む試料に対しては、その上に濾過層
を付加するものであり、また酵素反応層については、親
水性高分子溶液を塗布し、さらに親水性高分子と酵素と
電子受容体の混合溶液を塗布乾燥することを特徴とす
る。

作用 本発明によれば、電極系をも含めたディスポーザブル
タイプのバイオセンサを構成することができ、試料液を
センサに添加することにより、極めて容易に基質濃度を
測定することができる。しかも、試料の添加時に濾過層
において血球などの固形成分を除去し応答への影響がな
くなり、安定した応答が得られる。さらに、酵素反応層
を形成する際、酵素と電子受容体を混合しているため試
料液が供給されると速やかに溶けて反応が始まるため、
測定時間が短縮でき、バイオセンサの製造工程も簡易に
できる。

実施例 以下、本発明の一実施例について説明する。

＜実施例１＞ バイオセンサの一例として、グルコースセンサについ
て説明する。第１図および第２図は、グルコースセンサ
の一実施例について示したもので、バイオセンサの斜視
図と縦断面図である。ポリエチレンテレフタレートから
なる絶縁性の基板１に、スクリーン印刷により導電性カ
ーボンペーストを印刷し、加熱乾燥することにより、対
極２、測定極３からなる電極系を形成する。

次に、電極系を部分的に覆い、各々の電極の電気化学
的に作用する部分となる２′、３′（1mm²）を残すよう
に、絶縁性ペーストを前記と同様に印刷し、加熱処理し
て絶縁層４を形成する。

この電極系（２′、３′）の表面を覆うようにセルロ
ース系の親水性高分子の一種であるCMC（カルボキシメ
チルセルロース）の水溶液を塗布し、さらに、CMC水溶
液に酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼ（GO
D）と電子受容体であるフェリシアン化カリウムを溶か
したものを滴下し、40度で15分加熱乾燥して酵素反応層
５を形成し上記において、電極上では最初に展開したCM
C水溶液を乾燥させることなく、CMC、GODおよびフェリ
シアン化カリウムからなる混合物溶液をさらに滴下する
ことでこれら２つの水溶液が混ざり合い、これを乾燥す
ることにより電極系上には上記混合物からなる反応層が
形成される。

上記のように構成したグルコースセンサに試料液とし
てグルコース標準液を酵素反応層５に５μ１滴下し、１
分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ＋0.5V
の定電圧を印加し５秒後の電流を測定する。グルコース
標準液によりフェリシアン化カリウムが溶解し、グルコ
ースが酵素反応層において酸化される際、フェロシアン
化カリウムに還元される。そこで、上記の定電圧の印加
により、生成されたフェロシアン化カリウムの濃度に基
づく酸化電流が得られ、この電流値は基質であるグルコ
ースの濃度に対応する。応答電流を測定したところ900m
g/dlという高濃度まで良好な直線性が得られた。従来の
積層により酵素反応層を形成した場合には、900mg/dlま
で直線性を得るには、反応時間を２分必要とした。

これは、反応層が積層されているため、試料が供給さ
れ各層が溶解してから反応が始まるため、反応の開始が
遅れているのが原因と考えられる。そこで、酵素と親水
性高分子および電子受容体を混合し、酵素反応層を25度
で乾燥させたところあらかた乾燥するのに25分かかっ
た。45度で15分加熱乾燥して形成した酵素反応層と25度
で25分乾燥した酵素反応層のバイオセンサについて応答
を調べたところグルコース濃度が100mg/dlにおいては加
熱した方が30秒で反応が終了するのに比べ加熱しない方
は１分近く反応が終了するのにかかった。

これは加熱した場合は乾燥が速やかに行なわれるため
フェリシアン化カリウムの粒子が細かい状態で均一に分
布しているのに比べ、加熱しない場合は乾燥に長時間要
するため、フェリシアン化カリウムが大きな結晶に成長
し、これにより溶解速度が低下し反応速度が減少したと
考えられる。

また、40度に加熱した場合900mg/dlまで直線性が得ら
れるため、短時間の加熱では酵素の活性に影響はない。
加熱の温度を100度まで変化させ湿度は20％以下にはコ
ントロールしてバイオセンサを作製しグルコース濃度60
0mg/dlにたいする１分後の応答を調べたところ、第３図
に示すように、30度以上加熱すると応答電流が増加し、
70度までは初期応答の劣化はみられなかった。80度以上
に加熱すると応答が低下したが、これは酵素が熱により
失活するためである。

また、酵素反応層を形成する際、乾燥に要する時間
は、25度では25分かかったが、70度では５分と短縮でき
た。一方、ドライエアーを流した雰囲気の中で乾燥すれ
ば25度でも15分で乾燥し、応答速度が改善され加熱温度
を40度で作製したセンサと同様の応答が得られた。これ
は、乾燥気体により水分の蒸発が促進されたため、フェ
リシアン化カリウムなどの粒径が細かい状態で形成でき
たためである。

ドライエアーの代わりに窒素やアルゴンを流しても同
様の効果が得られた。さらに、加熱と併用することによ
り、70度まで加熱しなくても50度で５分と短時間に乾燥
が終了し酵素活性への影響も軽減できた。さらに、乾燥
時間が長くなると酵素反応層が電極表面から剥離する現
象がみられたが、ドライエアーを導入して乾燥時間を短
縮することで剥離を防ぐことができた。

＜実施例２＞ 実施例１と同様に電極を形成後、電極系を覆うように
CMCの0.5％水溶液を塗布乾燥し第４図に示すように親水
性高分子層（CMC層）６を形成した。さらに、CMC0.5％
水溶液1gに酸化還元酵素としてグルコースオキシダーゼ
（GOD）10mgと電子受容体のフェリシアン化カリウム20m
gを溶かしたものを滴下し、40度で10分乾燥して酵素反
応層５を形成した。実施例１では、CMCを乾燥させない
でGODやフェリシアン化カリウムを滴下しているため、
酵素反応層がCMC層の広がりと同様に広がった。

そのため、酵素や電子受容体の単位面積当りの担持量
を一定にするにはCMCの広がりを制御する必要が生じた
が、CMCを一旦乾燥すると同量の酵素反応層の成分を滴
下すれば、ほぼ同じ面積に広がるため、そろった酵素反
応層を形成することが可能になった。これは、センサを
大量に生産する際メリットとなる。

また、一度CMCを乾燥することにより、酵素反応層を
乾燥するときの液量が少なくなるため、40℃７分で乾燥
が終了した。乾燥時間が短いほどフェリシアン化カリウ
ムの粒径が細かく反応時に速やかに溶解できるため、短
時間の測定が可能となった。また、加熱時間を短縮する
ことにより酵素への影響も小さくなるため、酵素反応層
の劣化を抑え、保存特性を維持するのに有効であった。
さらに、ドライエアーの導入を併用することにより、実
施例１と同様に乾燥時間の短縮ができた。

＜実施例３＞ 実施例１と同様にセンサを作製し、グルコース標準液
のかわりに血液を用いたところ、直線性の得られる濃度
範囲は変わらなかったが、直線性の傾きが20％低下し、
応答のばらつきが増加した。血漿成分では直線性の傾き
は変化しないため、これは、血球成分が電極付近に付着
して電極反応に影響を与えたり、試料の粘度が高いため
に応答速度が低下したためと考えられる。さらに、血球
とフェリシアン化カリウムの接触により僅かながら溶血
がみられた。そこで、酵素反応層の上に、ポリビニルピ
ロリドン（PVP）の１％エタノール溶液を塗布、乾燥し
て第５図の７に示すような濾過層を形成した。PVP層に
血液を滴下するとその水分によりPVP層が膨潤し血球の
電極部への影響を緩和でき、直線性の傾きが改善され
た。

濾過層を形成する際、親水性高分子としてPVPの他に
もゼラチンやメチルセルロースなども使用でき、澱粉
系、カルボキシメチルセルロース系、ゼラチン系、アク
リル酸塩系、ビニルアルコール系、ビニルピロリドン
系、無水マレイン酸系のものが好ましい。これらの高分
子は容易に水溶液とすることができるので、適当な濃度
の水溶液を塗布、乾燥することにより、必要な厚さの薄
膜を形成することができる。

さらに、エタノールの様な有機溶媒に溶解し塗布する
と、酵素反応層を乱す事なく濾過層を形成でき、応答の
ばらつきも改善できた。濾過層を形成する際、酵素反応
層を実施例２の製法で作製すると酵素反応層の広がりが
制御されているため濾過層の広がりも制御が容易となっ
た。

濾過層の材料を溶かす有機溶媒としては、トルエンや
エタノール、石油エーテルなど、GOD活性および印刷電
極への影響の少ないものであればよい。

＜実施例４＞ 実施例１と同様に酵素反応層まで形成したセンサに濾
過層としてポリスチレンの0.05％トルエン溶液を塗布、
乾燥した。ポリスチレンの膜は、水溶性ではないため、
血液により溶解することはない。

また、酵素反応層の表面のおうとつに対し、ポリスチ
レンの濃度が低いため多孔性の薄膜が形成でき、血球の
濾過が可能となった。ポリスチレンの濃度を１％まで高
めると厚膜となり、多孔度も下がるため血球の濾過に時
間がかかり反応の遅れがみられるため、薄膜にする必要
がある。ポリスチレンのかわりにポリカーボネートでも
多孔性の薄膜が形成でき血球が濾過できたが、ポリスチ
レンの方がトルエンにたいする溶解が大きいため濃度の
調整が容易であった。水に溶けないで有機溶媒に溶け多
孔性の薄膜を形成する材料としては、酢酸セルロース
や、硝酸セルロースのようなセルロース類やポリ塩化ビ
ニルも使用できた。

＜実施例５＞ 実施例１と同様に酵素反応層まで形成したセンサにポ
リスチレン１％トルエン溶液に1gにSiO₂を10mg混合した
液を滴下し乾燥させて濾過層を形成した。血液を供給す
ると、ポリスチレンは溶けないが、SiO₂が混合して隙間
ができているため、血漿成分が濾過されて酵素反応層に
到達した。SiO₂のかわりにAl₂O₃をもちいても同様な濾
過層が形成できた。実施例４のように多孔性の薄膜にす
ると速やかに血球が濾過できるが層が薄いため壊れ易い
欠点があるが、厚膜にしSiO₂等の微粒子を加えることで
濾過のスピードを低下することなく壊れにくいセンサを
形成することができた。

＜実施例６＞ 実施例１と同様に酵素反応層まで形成したセンサにポ
リスチレン0.01％トルエン溶液に0.1％レシチン（ホス
ファチジルコリン）を添加した液を滴下し乾燥させて濾
過層を形成した。さらに、第６図に示すように樹脂製の
カバー８を設置した。カバー８と基板１の隙間は0.3mm
に設定した。血液をカバーの先端部につけると、濾過層
中のレシチンにより速やかにセンサ上に吸い込まれ濾過
層全面に広がった。濾過層中に界面活性剤としてレシチ
ンを加えることで、血液を速やかに広げることが可能に
なった。レシチンの代わりにポリエチレングリコールア
ルキルエーテル（商品名：トリトンＸ）を用いたところ
0.5％以上あればレシチンと同様な効果が得られた。界
面活性剤としては、前記の例のほかに、オレイン酸やポ
リオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルやシクロデ
キストリンなどが使用できる。カバーを設置することで
カバーと基板に挟まれた容積を制御することによりサン
プル量を微量にすることができた。さらに、カバーで囲
むことにより、外気と遮断できるため、カバー内の試料
の蒸発を防ぐことが出来た。

なお、本発明のバイオセンサは上記実施例に示したグ
ルコースセンサに限らず、アルコールセンサやコレステ
ロールセンサなど、酸化還元酵素の関与する系に用いる
ことができる。酸化還元酵素として実施例ではグルコー
スオキシダーゼを用いたが、他の酵素、たとえばアルコ
ールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサ
ンチンオキシダーゼ、等を用いることができる。また、
電子受容体として、上記実施例に用いたフェリシアン化
カリウムが安定に反応するので適しているがＰ−ベンゾ
キノンを使えば、反応速度が大きいので高速化に適して
いる。また、2.6−ジクロロフェノールインドフェノー
ル、メチレンブルー、フェナジンメトサルフェート、β
−ナフトキノン４−スルホン酸カリウム、フェロセン等
が使用できる。

発明の効果 このように本発明のバイオセンサは、絶縁性の基板上
に電極系を印刷し、酸化還元酵素と親水性高分子および
電子受容体からなる混合溶液を塗布乾燥することで酵素
反応層を形成し、さらに、濾過層を設け、あらかじめ生
体試料中に存在する固形成分を除去して極めて容易に生
体試料中の基質濃度を測定することができ、測定精度を
向上させたものである。また、濾過層を形成するとき界
面活性剤を添加することにより、試料の展開を良好にで
きる。しかも、酵素反応層は、酵素と電子受容体を混合
して形成しているため、両者が近接しており、反応速度
が向上し、製造工程が簡略化できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例のバイオセンサの斜視図、第
２図，第４図，第５図および第６図は同バイオセンサの
縦断面図、第３図はバイオセンサの応答特性図、第７図
は従来例のバイオセンサの縦断面図である。 １……基板、２……対極、３……測定極、４……絶縁
層、５……酵素反応層、６……親水性高分子層、７……
濾過層、８……カバー、９……酵素層、10……電子受容
体層。

フロントページの続き (72)発明者 吉岡 俊彦 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (72)発明者 飯島 孝志 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも測定極と対極からなる電極系を
   設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還
   元酵素と親水性高分子および電子受容体の混合物からな
   る酵素反応層を設け、前記酸化還元酵素と電子受容体と
   試料液の反応に際しての物質濃度変化を電気化学的に前
   記電極系で検知し前記基質濃度を測定するバイオセン
   サ。
2. 【請求項２】少なくとも測定極と対極からなる電極系を
   設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還
   元酵素と親水性高分子および電子受容体の混合物からな
   る酵素反応層を設け、その上に、濾過層を付加し、前記
   酸化還元酵素と電子受容体と試料液の反応に際しての物
   質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知し前記基質
   濃度を測定するバイオセンサ。
3. 【請求項３】濾過層が親水性高分子からなることを特徴
   とする請求項２記載のバイオセンサ。
4. 【請求項４】濾過層が多孔性の高分子層であることを特
   徴とする請求項２記載のバイオセンサ。
5. 【請求項５】濾過層が界面活性剤を含むことを特徴とす
   る請求項２記載のバイオセンサ。
6. 【請求項６】少なくとも測定極と対極からなる電極系を
   設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還
   元酵素と親水性高分子および電子受容体からなる酵素反
   応層を設け、前記酵素と電子受容体と試料液の反応に際
   しての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知す
   るバイオセンサにおいて、前記電極系上に親水性高分子
   溶液を塗布しその上に親水性高分子と酸化還元酵素と電
   子受容体の混合液を塗布、乾燥して酵素反応層を形成す
   ることを特徴とするバイオセンサの製造法。
7. 【請求項７】少なくとも測定極と対極からなる電極系を
   設けた絶縁性の基板を備え、前記電極系の表面に酸化還
   元酵素と親水性高分子および電子受容体からなる酵素反
   応層を設け、前記酵素と電子受容体と試料液の反応に際
   しての物質濃度変化を電気化学的に前記電極系で検知す
   るバイオセンサにおいて、前記電極系上に親水性高分子
   溶液を塗布、乾燥しその上に親水性高分子と酸化還元酵
   素と電子受容体の混合液を塗布、乾燥して酵素反応層を
   形成することを特徴とするバイオセンサの製造法。
8. 【請求項８】酵素反応層を形成後さらに高分子溶液を塗
   布して乾燥し濾過層を形成することを特徴とする請求項
   ６または７記載のバイオセンサの製造法。
9. 【請求項９】酵素反応層を30度から70度の雰囲気中で形
   成することを特徴とする請求項６または７記載のバイオ
   センサの製造法。
10. 【請求項１０】酵素反応層を乾燥気体中で形成すること
    を特徴とする請求項６または７記載のバイオセンサの製
    造法。