JP4256007B2 - バイオセンサの製造方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、食品分析、医療分析、環境分析等の分野において、微量の液体試料を用いて、その試料中の特定成分を迅速、高精度、簡便に測定することができるバイオセンサおよびその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来のバイオセンサとして、例えば血液中のグルコース濃度を測定するものとして、次のグルコースセンサが提案されている。図１はグルコースセンサを示す分解斜視図を、図２はその要部断面図を示すものである。
【０００３】
このグルコースセンサは絶縁性基板１上に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを１０μｍの厚さでコーテイング法によって塗工し、８０〜１５０℃の乾燥炉で加熱乾燥して電極膜１５を形成する。次に、図１に示すようなＬ字形状の対極５と測定極４、および対極５’を形成するため、Ｖ字断面形状の刃物の金型で絶縁性基板の厚み方向にハーフカットして溝１６を設け、両極の電気的絶縁性を確保する。さらに、対極５と測定極４、および対極５’を部分的に覆って露出部分の面積を一定とし、かつ測定極用リード部２、対極用リード部３、３’の不要部を覆う様に絶縁性ペーストを印刷し、加熱処理をして絶縁層６（図１中の斜線部）を形成し、電極系を作製する。
【０００４】
この様にして電極系を作製した後、親水性高分子としてカルボキシメチルセルロース（以下、ＣＭＣと略す。）水溶液を電極系上に展開、乾燥して第一の層であるＣＭＣ層７を形成し、次に、酵素としてグルコースオキシダーゼ（以下、ＧＯＤと略す。）、ＣＭＣ及び電子受容体としてフェリシアン化カリウムを純水に溶解した溶液を調製し、これを第一層のＣＭＣ層７を覆うように展開し、乾燥させた第二の層であるＧＯＤ・ＣＭＣ・フェリシアン化カリウム層８を形成する。さらにそれらを覆うようにして、血液吸引を迅速・確実に行うために界面活性剤の溶液を展開し、乾燥させて第三の層である界面活性剤層９を形成して、反応試薬部１０を完成する。
【０００５】
そして切欠１３を有するスペーサ１１を介して、空気穴１４を有するカバー板１２で覆った構成となっている。
【０００６】
測定時には、スペーサ１１の切欠１３により形成されるキャピラリーの一端に試料液を点着すると、他端を空気穴１４とするキャピラリー内へ吸引され、第二層のＧＯＤとＣＭＣ、フェリシアン化カリウム、及び第一層のＣＭＣが試料液に溶解し、試料液中のグルコースとの間で酵素反応が進行して、フェリシアン化カリウムが還元され、フェロシアン化カリウムが生成する。一定時間後、フェロシアン化カリウムを測定極４で酸化し、このとき得られる酸化電流値をリード２、３、３’を介して計測することにより、試料液中のグルコース濃度が求められる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら上記従来のグルコースセンサでは、スペーサ１１の切欠１３により形成されるキャピラリーの入り口に試料液を点着させても吸引しなかったり、反応試薬部１０の途中で止まり測定出来ない場合がある。特に、血液を用いた場合には、血球や蛋白質、脂質などの成分によって試料液の粘性が高くなり、液抵抗が増大して毛細管吸引が進まない現象をもたらす。この様な吸引不良が生じた時には、測定値の精密度と正確度は信頼できず、測定者はこのグルコースセンサを廃棄して別の新しいセンサに交換する以外に対処の方法はなく、ユーザに大きな負担をかける等の問題を有していた。
【０００８】
この様な問題の原因は図２に示した様に、界面活性剤層９は絶縁性基板１の先端部分から試薬層の全体に至るまで形成されていなければならないが、界面活性剤の溶液をＧＯＤ・ＣＭＣ・フェリシアン化カリウム層８の上に分注した時、試薬層の全体、及びキャピラリーの先端にあたる部分まで拡散して十分に広く行き渡らない状態で乾燥してしまったことが上げられ、界面活性剤層９を必要な面積範囲に形成できていないことにある。
【０００９】
また、試料液が血液の場合には、界面活性剤によって血球破壊を起こさないことが望ましく、これは血球内にあるグルタチオンなどの還元性物質が酵素と電極反応に妨害影響を及ぼすためである。溶血しない界面活性剤としてはレシチン（ホスファチジルコリン）が知られているが、レシチンの溶解には有機溶媒であるトルエンやアルコール類を使用するため、分注と乾燥の工程で溶媒蒸気が室内に充満し、その毒性の問題からクリーンルームの排気設備や温度・湿度の作業環境を厳重に管理しなければならなかった。
【００１０】
水溶性の界面活性剤を使用する場合には、作業環境の問題はなくなるが、上記したような血球破壊を起こさない好適な材料は見いだされておらず、血液を測定対象から除いた食品や環境分析等の試料、また尿等の生体試料に含まれる特定成分のバイオセンサに限定されていた。
【００１１】
さらに、上記グルコースセンサでは、電極上に第一層のＣＭＣ層、第二層のＧＯＤ・ＣＭＣ・フエリシアン化カリウム層、第三層の界面活性剤層からなる３種類の試薬層を順次形成しなければならないため、製造工程が長く複雑になり製造コストが高くなる問題が有った。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明のバイオセンサは、上記欠点を解決したものであり、絶縁性の基板上に設けた少なくとも測定極と対極とからなる電極系と、前記測定極と対極の一部を臨ませて空間部を形成するように前記電極上に重ね合わされたスペーサと、前記空間部に形成した反応試薬部と、前記スペーサに重ね合わされたカバー板からなり、前記基板とスペーサ、およびカバー板とで囲まれる空間部が試料液通路であるキャピラリーを形成しており、前記反応試薬部が酸化還元酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び界面活性剤を含む構成からなっている。
【００１３】
さらに、本発明は前記キャピラリーの開口部に反応試薬部を露出して形成しており、界面活性剤の作用によってキャピラリーの内部へ確実に試料液を吸引することが可能になる。
【００１４】
また、本発明は血液を試料とする場合は血球破壊を起こさない界面活性剤を使用することにあり、好ましくは、非イオン系界面活性剤のポリエチレングリコール−ｐ−イソアルキルエーテルから選択されるトリトンＸ−４０５を含有することを特徴とする。
【００１５】
さらにまた、本発明は絶縁性の基板上に設けた少なくとも測定極と対極とからなる電極系を一定の距離をおいて左右対称に二組形成する工程、前記電極系の一部を臨ませて空間部を形成するように前記二組の電極上にスペーサを取り付ける工程、前記空間部に酸化還元酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び界面活性剤を含む反応試薬部を形成する工程、前記スペーサに重ね合わせてカバー板を取り付ける工程、前記反応試薬部の中央部を切断することによって二組に分割する工程からなり、前記基板とスペーサ、およびカバー板とで囲まれる空間部が試料液通路であるキャピラリーになり、該キャピラリーの開口部に反応試薬部が露出するように形成したバイオセンサの製造方法に関する。
【００１６】
この様なバイオセンサの構造と界面活性剤を含有した第二層とすることにより、従来の形成方法である３種類の試薬層を別々に積層して形成する必要がなくなるため製造工程が単純化すると共に、キヤピラリー内部へ確実に試料液の吸引が可能なバイオセンサを実現することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明において、電気絶縁性の基板には、ポリエチレンテレフタレートなどの合成樹脂板が用いられる。
【００１８】
測定極および対極を有する電極系は、この基板上にコーティング法やスクリーン印刷法、蒸着法などの公知の方法を用いて設けられる。例えば、該基板上にリード部を有する測定極と対極が互いに絶縁するように設けられる。上記リードおよび電極の材料としては、公知の導電性材料が使用される。例としては、カーボン、銀、白金、金、パラジウムが挙げられる。
【００１９】
次に、前記測定極と対極の一部を臨ませて空間部を形成するために前記電極上にスペーサを重ね合わせる。このスペーサには厚みが０．０５〜０．３ｍｍの市販されている両面テープを使用する。そして、この空間部の全面積に反応試薬部を形成したあと、前記スペーサにポリエチレンテレフタレートなどの合成樹脂板からなるカバー板を重ね合わせる。このような作製方法によって、前記空間部とカバー板とで囲まれる領域が試料液通路であるキャピラリーの構造をなし、前記キャピラリーの開口部に反応試薬部が露出するように形成して、試料液の流入部とする。
【００２０】
反応試薬部は第一層に親水性高分子層を形成し、第二層は酸化還元酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び界面活性剤を混合した溶液で形成される。
【００２１】
ここで使用する界面活性剤は試料液が血液の場合には、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルから選択されるトリトンＸ−４０５を含有する。トリトンＸ−４０５は、血球破壊を起こさない非イオン性の界面活性剤として好適に使用できる。
【００２２】
また、試料液が血液以外の場合には、前記トリトンＸ−４０５以外に同系列のトリトンＸ−１００やトリトンＸ−１１４など、また他の非イオン系界面活性剤であるポリオキシエチレンソルビタン（ツイーン２０、ツイーン４０、ツイーン８５）など、カチオン系界面活性剤のヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドやアルキルアミン塩など、アニオン系界面活性剤のオクタデシルアミノ酢酸など、酵素活性に影響を及ぼさないものであれば、特に制限されることはない。
【００２３】
トリトンＸ−４０５の含有量は、反応試薬部１平方センチメートル当たり、０．１２〜１．２ｍｇが好ましく、さらに好ましくは０．１５〜０．９ｍｇである。この最適量は、トリトンＸ−４０５の含有量が、反応試薬部１平方センチメートル当たり、０．１２ｍｇ未満では血液のヘマトクリット値（血球体積）が６０％を越えるような高粘性の試料液では吸引され難く、２秒以上の時間が必要になり、さらに反応試薬部を完全に覆わないで途中で吸引しなくなる現象が生じる。トリトンＸ−４０５の含有量が、反応試薬部１平方センチメートル当たり１．２ｍｇを上回る場合も吸引時間は２秒以上が必要になり、そして酵素反応が遅くなり応答電流値にバラツキを生じ易い。
【００２４】
また、血液測定以外で、粘性の低い試料液の場合では他の水溶性界面活性剤を使用できるが、トリトンＸ−１００やトリトンＸ−１１４では、上記と同じ範囲の０．１〜０．５ｍｇが好ましい。他の非イオン系やカチオン系、アニオン系界面活性剤でも、ほぼ同じ範囲の濃度が好ましいことが判っている。
【００２５】
また、反応試薬部にはグルコースを測定する場合には、酸化還元酵素としてＧＯＤを含有するが、好適なＧＯＤの含有量は、反応試薬部１平方センチメートル当たり、０．２〜１００ユニットが好ましく、さらに好ましくは、０．４〜３０ユニットである。ここで本明細書に用いられる用語「ユニット」とは、１μｍｏｌの基質を１分間で酸化させる酸化還元酵素の量をいう。
【００２６】
さらに、反応試薬部は種々の親水性高分子を含有し得る。上記に記載したＣＭＣ以外に、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース、なども使用でき、澱粉系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、ビニルアルコール系、ビニルピロリドン系、無水マレイン酸系など、水溶性であり、かつ酵素活性に影響をおよぼさないものであれば、特に制限されることはない。
【００２７】
また、反応試薬部は電子伝達体として、上記に示したフェリシアン化カリウム以外に、Ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、２．６−ジクロロフェノールインドフェノール、メチレンブルー、フェナジンメトサルフェート、β−ナフトキノン４−スルホン酸カリウムなどが使用できる。電子伝達体は、これらの１種またはそれ以上が用いられるが、特に、フェリシアン化カリウムを用いることが好ましい。
【００２８】
フェリシアン化カリウムの含有量は、反応試薬部１平方センチメートル当たり０．４〜３．６ｍｇが好ましく、さらに好ましくは０．６〜２．４ｍｇである。フェリシアン化カリウムの含有量が、反応試薬部１平方センチメートル当たり０．４ｍｇ未満では、測定可能なグルコース濃度の範囲が狭くなる。フェリシアン化カリウムの含有量が、反応試薬部１平方センチメートル当たり３．６ｍｇを上回ると反応試薬部の形成時に、反応試薬部が割れて応答電流値にバラツキを生じ易い。
【００２９】
【実施例】
次に、本発明のバイオセンサの製造方法の好ましい実施形態について、図面を用いて説明する。なお従来の構成と実質的に同じものについては、同一符号を付して説明する。
【００３０】
《実施例１》図３に本実施形態のバイオセンサの分解斜視図を、図４には本実施形態におけるバイオセンサの断面図を示している。図３に示すように、厚みが２５０μｍのポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板１の表面全面に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを１０μｍの厚さでコーティング法によって塗工し、８０〜１５０℃の乾燥炉で加熱処理して電極膜１５を形成した。
【００３１】
次にセンサの先端部に対極５と測定極４、および二つ目の対極５’を形成し、リード部をその延長上に測定極４を中央にして均等面積となるようなＬ字形状で、Ｖ字の断面を有する２本の刃物が一定の距離をおいて左右対称に二組からなる金型を、Ｘ−Ｚ駆動の裁断機のＺ軸に取り付けた。そして、絶縁性基板１の電極膜１５が上になるようにＸ軸方向に駆動する裁断機のテーブルに設置した。次に、絶縁性基板１が５ｍｍ／秒毎に移動して止まり、これに同期してＺ軸のＬ字形状でＶ字断面の刃物の金型が絶縁性基板１の厚み方向に対して深さ約２００μｍ、幅５０μｍで裁断する条件に調整した。このようにして絶縁性基板１に切断しない５０μｍの厚みを残すように、５ｍｍ間隔毎にＬ字形状の溝１６を電極膜１５に形成して、対極５と測定極４及び二つ目の対極５’に分割し、両極の電気的絶縁性を確保した。
【００３２】
次に、このＬ字形状に分割された左右対称の二組からなる電極系（対極５と測定極４及び対極５’）上を横断するように０．８ｍｍ幅の空間部１８を有するスペーサ１１を配置して、液体試料が適用される空間部１８に対極５と測定極４、及び対極５’、並びにこれら両電極に電圧を印加するための測定極用リード２、対極用リード部３、３’を形成した。
【００３３】
次いで、液体試料が適用される空間部１８に、例えばグルコースセンサの場合には、第一層に親水性高分子として０．２５Ｗ／Ｖ％−ＣＭＣを１．２μＬ分注し乾燥させてＣＭＣ層を形成した。このＣＭＣ層上に１２５０Ｕ／ｍｌ−ＧＯＤ、３．０Ｗ／Ｖ％−フェリシアン化カリウム、０．５Ｗ／Ｖ％−ＣＭＣ及び界面活性剤として０．５Ｗ／Ｖ％−トリトンＸ−４０５をそれぞれ水に溶解させた混合溶液を１．２μＬ分注し、乾燥させて反応試薬部を形成した。この反応試薬部内に含まれるトリトンＸ−４０５の量は、１平方センチメートル当たり、０．１５ｍｇであり、ＧＯＤおよびフェリシアン化カリウムの量は、それぞれ３７．５ユニットおよび０．９ｍｇであった。
【００３４】
そして二個の空気穴１４を備えたカバー板１２でスペーサ１１を覆い、反応試薬部１０の中央部（図３中のＡ−Ａ’の破線部）を切断することによって二組に分割した。この様にして作製したグルコースセンサは、図４の断面図に示すようにスペーサ１１とカバー板１２とで囲まれる空間部１８が試料液通路であるキャピラリーを形成しており、切断面のキャピラリー開口部１７に第１層であるＣＭＣ層７と第２層の界面活性剤を含むＧＯＤ・ＣＭＣ・フェリシアン化カリウム層１９からなる反応試薬部１０が露出した状態になる。
【００３５】
さらに、トリトンＸ−４０５の最適濃度を求めることを目的として、上記の組成でトリトンＸ−４０５の含有量だけを、０〜５．０Ｗ／Ｖ％の範囲で変化させた１２種類のグルコースセンサを作製した。
【００３６】
上記のように作製したグルコースセンサにおいて、その測定時には、キャピラリー開口部１７から毛細管作用によって試料液が導入され、反応試薬部１０が溶解して酸化還元反応が起こる。次いで、試料液の吸引後２５秒で、対極５、５’に対して測定極４にリード部２、３、３’を介して＋０．５Ｖの電圧を印加すると、グルコース濃度に依存した電流が得られ、血糖値が測定される。
【００３７】
実際に試料液として血液を用い、キャピラリー開口部１７に血液が吸引される瞬間から、反応試薬部１０の全体が血液で満たされるまでの時間を測定した。ここで用いた血液は、毛細管作用による吸引性能の確認を目的として、正常な成人男性のヘマトクリット値（血球体積）＝４５％よりもはるかに高粘性のヘマトクリット値＝６８％に調製した。
【００３８】
図５は、横軸にトリトンＸ−４０５の濃度、縦軸にヘマトクリット値＝６８％の血液が吸引されるのに要した時間を示している。図４に示すように、界面活性剤が添加されていない場合は、反応試薬部の全体を血液が満たすのに３．５秒の吸引時間を要したが、トリトンＸ−４０５濃度が０．５Ｗ／Ｖ％から３．０Ｗ／Ｖ％の範囲にあるときには、１．３秒から１．６秒の時間で迅速に吸引した。また、同一の血液試料について５０個のグルコースセンサを用いた実験でも吸引不良は一度も発生せず、繰り返し測定の再現性は平均値９８ｍｇ／ｄｌで変動係数（ＣＶ％）は３％以下の良好な応答が得られた。
【００３９】
《実施例２》トリトンＸ−４０５の代わりに０．５Ｗ／Ｖ％−トリトンＸ−１００を含有するグルコースセンサを作製した以外は、上記と同様にして、高粘性のヘマトクリット値＝６８％に調製した血液を用いて、吸引の確実性と吸引速度、およびグルコース濃度に対する応答電流を２０回測定した。吸引の確実性と速度はトリトンＸ−４０５の場合と同様に一度の失敗もなく、迅速な吸引性能であることを確認した。しかし、応答電流の再現性は悪く、変動係数（ＣＶ）は５％以上となった。さらに、この応答電流値は高値の傾向を示し、還元性物質の影響を受けていることを示唆させた。
【００４０】
なお、上記実施例ではグルコースセンサについて示したが、本発明は乳酸センサやアルコールセンサ、コレステロールセンサなど、酸化還元酵素の関与する反応系に用いることができる。酸化還元酵素として実施例ではグルコースオキシダーゼを用いたが、ピラノースオキシダーゼやグルコースデヒドロゲナーゼを用いることができる。また、ラクテートオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼなどを用いることもできる。
【００４１】
また、上記実施例では、測定極と対極のみの二電極系について述べたが、参照極を加えた三電極方式にすれば、より正確な測定が可能である。
【発明の効果】
【００４２】
以上の実施例から明らかな様に本発明によれば、界面活性剤層を別に形成させる必要がなくなり、キャピラリー内部へ確実に試料液が吸引できるバイオセンサを提供することができる。さらに、本発明の製造法によると界面活性剤溶液の分注と乾燥の工程が不要になるため製造工程の単純化が図られ生産性が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のグルコースセンサを示す分解斜視図
【図２】従来のグルコースセンサの要部断面図
【図３】本発明の一実施形態によるバイオセンサを示す分解斜視図
【図４】本発明の一実施形態によるバイオセンサの断面図
【図５】本発明の一実施形態おけるトリトンＸ−４０５濃度に対する血液の吸引時間の関係を示す図
【符号の説明】
１ 絶縁性基板
２、３、３’ リード部
４ 測定極
５ ５’ 対極
６ 絶縁層
７ ＣＭＣ層
８ ＧＯＤ・ＣＭＣ・フェリシアン化カリウム層
９ 界面活性剤層
１０ 反応試薬部
１１ スペーサ
１２ カバー板
１３ 切欠
１４ 空気穴
１５ 電極膜
１６ 溝
１７ キャピラリー開口部
１８ 空間部
１９ ＧＯＤ・ＣＭＣ・フェリシアン化カリウム・界面活性剤層

Claims (5)

1. （１）絶縁性の基板上に設けた少なくとも測定極と対極とからなる電極系を一定の距離をおいて左右対称に二組形成する工程、
   （２）前記電極系の一部を臨ませて空間部を形成するように前記二組の電極上にスペーサを取り付ける工程、
   （３）前記空間部に反応試薬部を形成する工程、
   （４）前記スペーサに重ね合わせてカバー板を取り付ける工程、
   （５）前記反応試薬部の中央部を切断することによって二組に分割する工程からなり、
   前記基板とスペーサ、およびカバー板とで囲まれる空間部が試料液通路であるキャピラリーになり、該キャピラリーの開口部に反応試薬部が露出するように形成したバイオセンサの製造方法。
2. 前記反応試薬部が酸化還元酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載のバイオセンサの製造方法。
3. 前記反応試薬部は、第一層として、親水性高分子層を形成し、第二層として、酸化還元酵素、電子伝達体、親水性高分子、及び界面活性剤を混合した溶液で形成することを特徴とする請求項２に記載のバイオセンサの製造方法。
4. 前記界面活性剤がポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルから選択されるトリトンＸ−４０５を含有することを特徴とする請求項２または３に記載のバイオセンサの製造方法。
5. 前記トリトンＸ−４０５の含有量が、反応試薬部１平方センチメートル当たり０．１５〜０．９ｍｇである請求項４に記載のバイオセンサの製造方法。

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