JP3487409B2 - コレステロールセンサ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中のコレステ
ロールおよびコレステロールエステルについて、迅速か
つ高精度な定量を簡便に実施することができるコレステ
ロールセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中の特定成分について、試料
液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方式
として、次のようなバイオセンサが提案されている（特
開平２−０６２９５２号公報）。このバイオセンサは、
絶縁性の基板上にスクリーン印刷等の方法で測定極、対
極および参照極からなる電極系を形成し、この電極系上
に、電極系に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子
受容体、必要に応じて加えた緩衝剤を含む酵素反応層を
形成したものである。基質を含む試料液を酵素反応層上
へ滴下すると、酵素反応層が溶解し、酵素と基質が反応
し、これに伴い電子受容体が還元される。酵素反応終了
後、この還元された電子受容体を電気化学的に酸化す
る。このとき得られる酸化電流値から試料液中の基質濃
度を求めることができる。このようなバイオセンサは、
測定対象物質を基質とする酵素を用いることにより、様
々な物質に対する測定が可能である。酸化還元酵素にコ
レステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒド
ロゲナーゼを用いれば、血清中のコレステロールを測定
するバイオセンサを構成することができる。

【０００３】各種医療機関で診断指針として用いられる
血清コレステロール値は、コレステロールとコレステロ
ールエステルの濃度を合計したものである。コレステロ
ールエステルは、コレステロールオキシダーゼによる酸
化反応の基質になることができないので、診断指針とし
ての血清コレステロール値を測定するためには、コレス
テロールエステルをコレステロールに変化させる過程が
必要である。この過程を触媒する酵素として、コレステ
ロールエステラーゼが知られている。しかし、血清中の
コレステロールエステルは、偽性ミセルの一種であるリ
ポ蛋白中に包摂されているので、酵素コレステロールエ
ステラーゼとの接触確率が低く、コレステロールに変化
する反応の進行は非常に遅い。そこで、このような場合
に適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロ
ールエステラーゼのコレステロールエステルとの接触確
率を向上し、触媒の活性を向上させうることが広く知ら
れている。例えば、特公平６−７１４４０号公報には、
呈色反応のよる測定法を用いたコレステロールセンサに
おいて、コレステロールエステル加水分解活性を有する
酵素とともに、界面活性剤であるアルキルフェノキシポ
リグリシドールを同一層中に展開する構成が提案されて
いる。

【０００４】しかし、特開昭６３−１３９２４２号公報
または特開平２−０６２９５２号公報に開示されたよう
な形態のバイオセンサに、界面活性剤を用いると、応答
が著しく不正確になる場合があった。これは、電極系の
構造に起因すると考えられる。すなわち、作用極および
対極の表面部分はカーボンペーストの印刷により形成さ
れているが、これら電極の下地およびリード部分は、導
電性を向上させるために銀ペーストの印刷により形成さ
れている。このような構造の電極系に、試料液に溶解し
た界面活性剤が接すると、界面活性剤はカーボン層に浸
潤し、その下地層の銀リードに接触する。そして、セン
サの応答電流測定時に、電極に電位を印加すると、銀リ
ード部が電気化学反応に関与し、その結果電流値の増加
を示す場合がある。従って、得られる応答電流値は、コ
レステロール濃度を正確に反映しないものになる。ま
た、カーボン電極に界面活性剤が浸潤すると、カーボン
層自体の変成により、電極活性の低下、すなわち電極／
溶液界面での電子伝達速度の低下が生じることも、応答
性の低下をもたらすものと考えられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題に
鑑み、界面活性剤の電極系への影響を緩和することによ
って、迅速なコレステロール濃度の測定が可能なコレス
テロールセンサを提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明のコレステロール
センサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた測定
極および対極を含む電極系、前記電極系を被覆する電極
被覆層、および前記電極被覆層上またはその近傍に配さ
れた反応試薬層を具備し、前記反応試薬層が少なくとも
コレステロールの酸化反応を触媒する酵素、コレステロ
ールエステル加水分解活性を有する酵素、および界面活
性剤を含み、前記電極被覆層が水溶性セルロース誘導体
および糖からなる群より選ばれた少なくとも１種からな
り、かつセンサに供給された試料液に溶解し、前記界面
活性剤が電極系に浸透するのを抑制するに十分な粘ちょ
う性を試料液に与える量、すなわち、前記電極被覆層の
量が電極の単位面積当たり０．４〜２．５ｍｇ／ｃｍ ²
であることを特徴とする。本発明は、別の観点において
は、さらに、前記基板との間に試料液を前記電極系に供
給する試料液供給路を形成するカバー部材を備え、前記
反応試薬が前記試料液供給路内に配されたコレステロー
ルセンサを提供する。本発明により、酵素活性を発現す
るために界面活性剤を必要とする酵素をコレステロール
センサ中で有効に機能させることができる。これによ
り、より短い時間で測定ができるコレステロールセンサ
が得られる。従って、本発明のセンサは、血液中のコレ
ステロール値の測定に有用である。

【０００７】本発明は、電極系の表面を適切な量の水溶
性セルロース誘導体および／または糖で被覆することに
より、コレステロールエステル加水分解活性を有する酵
素、例えばコレステロールエステラーゼの活性化に必要
な濃度の界面活性剤が、電極系に影響するのを緩和し、
コレステロール濃度を正確に反映した応答値が得られる
ことを見いだしたことに基づくものである。すなわち、
センサに試料液が供給されると、電極系上またはその近
傍にある反応試薬が試料液に溶解するとともに、電極系
を被覆している電極被覆層の水溶性セルロース誘導体お
よび／または糖が溶解する。水溶性セルロース誘導体お
よび糖は、その溶液に粘ちょう性を与え、これにより界
面活性剤は電極系へ浸潤しにくくなる。一方、電子受容
体は、水溶液が粘ちょうになっても界面活性剤に比べて
移動しやすいので、電極系では酵素反応の結果を容易に
測定することができる。上記のように、界面活性剤の移
動を抑制する効果を発揮させるには、一般的に、電極系
の単位面積当たりの水溶性セルロース誘導体および／ま
たは糖の被覆量が０．４〜２．５ｍｇ／ｃｍ² であれば
よいが、好ましくは０．８〜１．６ｍｇ／ｃｍ²の範囲
が適切である。水溶性セルロース誘導体および／または
糖によって、電極系の表面を完全に被覆するのが好まし
い。

【０００８】本発明のセンサは、特に血液中のコレステ
ロールの定量に向けられている。そのようなセンサの典
型的な例は後述の実施例に示される。センサチップ当た
りの試料液は約３μｌであり、電極系の面積は約１０ｍ
ｍ²である。このセンサチップに担持されるコレステロ
ールの酸化反応を触媒する酵素、およびコレステロール
エステル加水分解活性を有する酵素の適切な量は、それ
ぞれ０．１５〜１．５ｕｎｉｔおよび１．５〜６．０ｕ
ｎｉｔである。コレステロールエステル加水分解活性を
有する酵素の活性を向上させるための界面活性剤の適切
な量は、（０．７５〜１．０）×１０^-2μｇである。こ
の界面活性剤の電極系への影響を緩和するに必要な水溶
性セルロース誘導体および／または糖の量は、４０〜２
５０μｇ、さらに好ましくは８０〜１６０μｇである。
これらの値を電極系の単位面積当たりに換算すると、
０．４〜２．５ｍｇ／ｃｍ²、および０．８〜１．６ｍ
ｇ／ｃｍ²となる。また、上記のコレステロールの酸化
反応を触媒する酵素、コレステロールエステル加水分解
活性を有する酵素、および界面活性剤が試料液３μｌに
溶解したときの濃度は、それぞれ５０〜５００ｕｎｉｔ
／ｍｌ、（０．５〜２．０）ｋｕｎｉｔ／ｍｌ、および
０．２５〜１．０ｗｔ％となる。

【０００９】水溶性セルロース誘導体および／または糖
によって、電極系の表面を被覆するには、それらの水溶
液を電極系上に滴下し、乾燥させる方法が簡便である。
水溶性セルロール誘導体は、０．５〜２．０ｗｔ％水溶
液を用いるのが好ましい。水溶液の濃度がこの範囲より
高いと、粘性が高すぎて正確な量を滴下することが困難
になる。また、たとえ電極系上に被覆層を形成できて
も、剥離しやすい。一方、水溶性セルロース誘導体の濃
度が上記範囲より低いと、水溶液の滴下量を多くしなけ
ればならない。また、水溶液の粘性が低すぎて、滴下し
たとき水溶液が拡散してしまい、必要量を電極系上に担
持することが不可能になる場合がある。しかし、水溶液
を少量ずつ数回に分けて滴下し、乾燥すれば、上記濃度
範囲より低い水溶液でもよい。糖の場合も水溶性セルロ
ース誘導体の場合とほぼ同様の濃度の水溶液を用いるこ
とによって被覆層を形成することができる。しかし、糖
のみで形成した被覆層は、水溶性セルロース誘導体で形
成したそれに比べて剥離しやすいので、糖単独で被覆層
を形成せずに、水溶性セルロース誘導体と混合して用い
るのがよい。

【００１０】反応試薬は、少なくともその一部が電極被
覆層上に担持され、水溶性セルロース誘導体または糖を
含むことが好ましい。反応試薬層に含まれた水溶性セル
ロース誘導体および糖は、界面活性剤による電極系への
影響を軽減するのに役立つ。そして、反応試薬層に含め
る水溶性セルロース誘導体または糖は、コレステロール
の酸化反応を触媒する酵素とともに電極被覆層上に形成
し、コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素
および界面活性剤は、その層の上側またはカバー部材側
に配するなど電極被覆層から遠ざけるのが好ましい。水
溶性セルロース誘導体または糖を含む反応試薬層を形成
するには、酵素類と水溶性セルロース誘導体または糖の
混合水溶液を電極被覆層上に滴下し、乾燥させる方法を
とるのがよい。ここに用いる混合水溶液中の水溶性セル
ロース誘導体または糖の濃度は、０．１〜１．０ｗｔ％
であることが望ましい。この濃度範囲であれば、センサ
作製時に電極被覆層と反応試薬層とが完全に混合するこ
とはない。前記の濃度範囲より高いと、基質や電子受容
体の拡散が妨げられるなどして、応答性の低下がみられ
ることがあるので好ましくない。

【００１１】反応試薬層は、コレステロールの酸化反応
を触媒する酵素を含む層、界面活性剤を含む層、コレス
テロールエステル加水分解活性を有する酵素を含む層な
どの多層に形成してもよい。また、界面活性剤とコレス
テロールエステル加水分解活性を有する酵素は混合層に
して形成してもよい。この反応試薬層は、同じ構成のも
のを分割するか、構成部分を分けて複数箇所に形成する
ことができる。これらの層は、センサ内の種々の位置に
配置することが可能である。例えば、電極被覆層上や、
基板に組み合わされて基板との間に電極系に試料液を供
給する試料液供給路を形成するカバー部材の試料供給路
に露出する面、または電極系の横で、試料液供給路の開
口部側などに設けることができる。いずれの位置にあっ
ても、導入された試料液によって反応試薬層が容易に溶
解することが望ましい。ただし、界面活性剤を含む層
は、前記のように電極系と隔離して形成することによ
り、界面活性剤の電極系への影響を軽減するのが好まし
い。従って、多少コレステロールエステラーゼの活性が
低下しても、電極系上に形成された酸化還元酵素類が含
まれる層上にコレステロールエステル加水分解活性を有
する酵素を含む層を形成し、界面活性剤を含む層をその
層上や、カバー部材の試料液供給路に露出する面、また
は電極系の横に形成するのが好ましい。反応試薬層に
は、通常、電子受容体が含まれる。また、試料溶液が反
応試薬層へ導入されるのを容易にするため、電極系上に
形成された層などを被覆するように脂質を含む層を形成
することが好ましい。

【００１２】コレステロールの酸化反応を触媒する酵素
には、コレステロールオキシダーゼ、あるいはコレステ
ロールデヒドロゲナーゼおよびその補酵素であるニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドを用いることができ
る。コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素
には、コレステロールエステラーゼおよびリポ蛋白リパ
ーゼを用いることができる。水溶性セルロール誘導体と
しては、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロー
ス、ヒドロキシプロピルセルロースなどを用いることが
できる。糖としては、グルコース、フルクトース等の単
糖、トレハロース、スクロース、ラクトース、マルトー
ス等のオリゴ糖を用いることができる。界面活性剤とし
ては、ｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ポリエ
チレングリコールモノドデシルエーテル、コール酸ナト
リウム、ドデシル−β−マルトシド、シュークロースモ
ノラウレート、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデ
オキシコール酸ナトリウム、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グ
ルコンアミドプロピル）コールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス
（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールア
ミドおよびポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニ
ルエーテルなどから選択することができる。電子受容体
としては、フェリシアン化イオン、ｐ−ベンゾキノン、
フェナジンメトサルフェート、フェロセンなどが使用で
きる。この他、水溶性で、酵素−電極間の電子移動を媒
介しうる化合物を任意に用いることができる。脂質とし
ては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジルセリン等のリン脂質のような、両親媒性脂
質が好適に用いられる。また、電流の測定方法として
は、測定極と対極のみの二電極方式と、更に参照極を加
えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測
定が可能である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下に図面を参照して本発明の実
施形態を詳細に説明する。図１は、電極被覆層および反
応試薬層を除いたコレステロールセンサの分解斜視図で
ある。１はポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性
の基板を示す。この基板１上に、スクリーン印刷により
銀ペーストを印刷してリード２、３、および電極系の下
地を形成してある。基板１上には、さらに樹脂バインダ
ーを含む導電性カーボンペーストを印刷することにより
測定極４と対極５を含む電極系を形成し、絶縁性ペース
トを印刷することにより絶縁層６を形成してある。絶縁
層６は、測定極４および対極５の露出部分の面積を一定
とし、かつリードを部分的に覆っている。測定極４は一
辺１ｍｍの正方形であり、電極系の大きさを定める対極
５の外形は直径３．６ｍｍの円である。この絶縁性基板
１、空気孔１４を備えたカバー１２およびスペーサー１
１を図１中の一点鎖線で示すような位置関係をもって接
着し、コレステロールセンサを作製する。スペーサー１
１には、基板とカバーとの間に試料液供給路を形成する
ためのスリット１５が設けてある。１３は、その試料液
供給路の開口部に相当する。

【００１４】図２は、本発明の一実施例におけるコレス
テロールセンサの縦断面図である。図１と同様にして、
絶縁性基板１上に電極系を形成し、この電極系上に、水
溶性セルロース誘導体または糖からなる電極被覆層７、
コレステロールの酸化反応を触媒する酵素と電子受容体
と親水高分子を含む層８、コレステロールエステル加水
分解活性を有する酵素と界面活性剤を含む層９、および
脂質を含む層１０が形成されている。図３は、本発明の
他の実施例におけるコレステロールセンサの縦断面図で
ある。図２と同様にして、電極系、電極被覆層７、コレ
ステロールの酸化反応を触媒する酵素と電子受容体と親
水性高分子を含む層８を形成し、この層を脂質を含む層
１０で被覆している。そして、コレステロールエステル
加水分解活性を有する酵素と界面活性剤を含む層９をカ
バー１２の試料液供給路に露出する面に形成している。

【００１５】図４は、本発明の、さらに他の実施例にお
けるコレステロールセンサの縦断面図である。図２と同
様にして、電極系、電極被覆層１６を形成している。こ
の電極被覆層１６は水溶性セルロール誘導体と糖からな
る。層１６上に、コレステロールの酸化反応を触媒する
酵素と電子受容体とコレステロールエステル加水分解活
性を有する酵素と界面活性剤を含む層１７を形成し、こ
の層を脂質を含む層１０で被覆している。図５は、本発
明の、他の実施例におけるコレステロールセンサの縦断
面図である。図２と同様にして、電極系、電極被覆層７
を形成し、さらにコレステロールの酸化反応を触媒する
酵素と電子受容体と糖を含む層１８を形成し、この層を
脂質を含む層１０で被覆している。そして、コレステロ
ールエステル加水分解活性を有する酵素と界面活性剤を
含む層９をカバー１２の試料液供給路に露出する面に形
成している。

【００１６】

【実施例】以下、具体的な実施例を説明する。 《実施例１》図１の基板１の電極系上に、親水性高分子
カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下ＣＭ
Ｃと略す）の１．５ｗｔ％水溶液を１０μｌ滴下し、５
０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させ、ＣＭＣ層７を
形成した。つづいて、コレステロールの酸化反応を触媒
する酵素であるノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓ
ｐ．）由来のコレステロールオキシダーゼ（ＥＣ １．
１．３．６；以下ＣｈＯＤと略す）、電子受容体である
フェリシアン化カリウム、およびＣＭＣの０．２５ｗｔ
％水溶液を混合して混合水溶液Ａを調製し、この混合水
溶液ＡをＣＭＣ層７上に５μｌ滴下し、５０℃の温風乾
燥器中で１０分間乾燥させ、ＣｈＯＤ−フェリシアン化
カリウム−ＣＭＣ層８を形成した。さらに、シュードモ
ナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）由来のコレス
テロールエステラーゼ（ＥＣ ３．１．１．１３；以下
ＣｈＥと略す）および界面活性剤のポリオキシエチレン
−ｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）を混合して混合水溶液Ｂを調製し、この混合
水溶液ＢをＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム−ＣＭＣ
層８上に５μｌ滴下し、５０℃で１０分間乾燥してＣｈ
Ｅ−界面活性剤層９を形成した。混合水溶液Ｂ中のＴｒ
ｉｔｏｎＸ−１００の濃度は０．２５ｗｔ％である。

【００１７】上記において、ＣＭＣ層７上に前記混合水
溶液Ａを滴下した際、ＣＭＣ層７は一度吸水して膨潤
し、その後の乾燥過程で酵素などと一部混合された形で
層を形成する。しかし、混合水溶液Ａ中にもＣＭＣが含
まれているので、ＣＭＣ層７中のＣＭＣの大部分は膨潤
するにとどまり、また、攪拌等をともなわないため完全
な混合状態とはならず、電極系表面はＣＭＣのみによっ
て被覆された状態となる。このため、酵素および電子受
容体などが電極系表面に接触しない。従って、電極系表
面へのタンパク質の吸着や、フェリシアン化カリウムの
ような酸化能を有する物質の化学的作用による電極系の
特性変化が起こり難くなるものと考えられる。また、混
合水溶液Ｂ中の界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０も電極系表面までは到達せず、その結果、電極系表面
の変成が防止される。

【００１８】このＣｈＥ−界面活性剤層９の上に、これ
を覆うようにホスファチジルコリンの０．５％トルエン
溶液を５μｌ滴下し、乾燥させ、レシチン層１０を形成
した。このレシチン層を設けることで、試料溶液の導入
が円滑に行われるが、レシチン層１０は酵素反応自体に
は必須ではない。上記のようにしてＣＭＣ層７および、
ＣｈＯＤーフェリシアン化カリウムーＣＭＣ層８、Ｃｈ
Ｅ−界面活性剤層９、レシチン層１０からなる反応試薬
層を形成した後、カバー１２およびスペーサー１１を図
１中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着する
ことにより、図２に示す構成のコレステロールセンサを
作製した。

【００１９】こうして作製したコレステロールセンサ
に、試料液として、標準血清または生理食塩水３μｌを
試料供給路の開口部１３より供給し、３分後に対極を基
準にして測定極にアノード方向へ＋０．５Ｖのパルス電
圧を印加し、５秒後に作用極と対極間に流れる電流値を
測定した。同様にして、試料液をセンサ内に供給してか
ら６分後または９分後に、対極を基準にして作用極に電
圧を印加し、５秒後に作用極と対極間に流れる電流値を
測定した。その結果を図６に示す。図６に示されるよう
に、電極系が充分に保護されるため、反応試薬中に界面
活性剤が含まれていても、コレステロールの濃度が０の
生理食塩水に対する応答電流値は０に近くなり、応答特
性も優れた直線性を示した。

【００２０】《比較例１》図１の基板１の電極系上に、
ＣＭＣの０．５ｗｔ％水溶液を５μｌ滴下し、５０℃の
温風乾燥器中で１０分間乾燥させ、ＣＭＣ層を形成し
た。続いて、ＣｈＯＤとフェリシアン化カリウムの混合
水溶液Ｃを調製し、この混合水溶液ＣをＣＭＣ層上に５
μｌ滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥さ
せ、ＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム層を形成した。
この層上にＣｈＥの水溶液を滴下乾燥し、ＣｈＥ層を形
成した後、実施例１と同様にしてレシチン層１０を形成
した。こうして実施例１と同様にして、コレステロール
センサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加する
までの時間を変化させて、各試料中のコレステロールの
濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図７に
示す。図７に示されるように、反応試薬層中に界面活性
剤が含まれていないため、コレステロール濃度が０の生
理食塩水に対する応答電流値は０に近い。しかし、界面
活性剤が含まれていないために応答電流値は低い。

【００２１】《比較例２》図１の基板１の電極系上に、
比較例１と同様にして、ＣＭＣ層およびＣｈＯＤ−フェ
リシアン化カリウム層を形成した。この層上に実施例１
で用いた混合水溶液Ｂを５μｌ滴下し乾燥してＣｈＥ−
界面活性剤層を形成した。そして、このＣｈＥ−界面活
性剤層の上に実施例１と同様にしてレシチン層１０を形
成した。こうして実施例１と同様にして、コレステロー
ルセンサを作製し、試料液を供給してから電圧を印加す
るまでの時間を変化させて、各試料中のコレステロール
の濃度に対する応答電流値を測定した。その結果を図８
に示す。図８に示されるように、反応試薬層中に含まれ
る界面活性剤のため、コレステロール濃度が０の生理食
塩水に対する応答電流値は、１．５〜２．６μＡと大き
かった。また、標準血清に対しては、総コレステロール
濃度に依存した応答電流値は得られなかった。

【００２２】《実施例２》実施例１と同様に、電極系上
に、ＣＭＣ層およびＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム
−ＣＭＣ層を形成した。つづいて、シュードモナス由来
のＣｈＥ、および界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１
００の混合水溶液を、スペーサー１１とカバー１２を組
み合わせることにより生じる、カバー部材の試料液供給
路に露出する面に滴下し、乾燥させてＣｈＥ−界面活性
剤層を形成した。このようにＣｈＥと界面活性剤を、直
接電極系と接触しない位置に形成すると、電極系に及ぼ
す界面活性剤の影響を更に軽減することができる。上記
のようにして反応試薬層を形成した後、実施例１と同様
にカバー１２およびスペーサー１１を図１中、一点鎖線
で示すような位置関係をもって接着することにより、図
３の構成のコレステロールセンサを作製した。このよう
にして作製したコレステロールセンサによる、標準血清
に対する応答は、総コレステロール濃度に対して直線性
を示した。

【００２３】《実施例３》実施例１と同様の電極系上
に、ＣＭＣとスクロースの混合水溶液を５μｌ滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させ、ＣＭＣ−ス
クロース層を形成した。このときの混合水溶液中のＣＭ
Ｃ濃度は０．５ｗｔ％、スクロース濃度は５ｗｔ％であ
った。つづいて、ＣｈＯＤ、ＣｈＥ、およびフェリシア
ン化カリウムの混合水溶液を調製し、この混合水溶液を
ＣＭＣ−スクロース層上に５μｌ滴下し、５０℃の温風
乾燥器中で１５分間乾燥させ、ＣｈＯＤ−ＣｈＥ−フェ
リシアン化カリウム層を形成した。このＣｈＯＤ−Ｃｈ
Ｅ−フェリシアン化カリウム層を覆うように、界面活性
剤であるｎ−オクチル−β−Ｄ−チオグルコシド（以下
Ｏｔｇと略す）のエタノール溶液を滴下し、乾燥させ、
界面活性剤層を形成した。界面活性剤のエタノール溶液
を用いることにより、ＣｈＯＤ−ＣｈＥ−フェリシアン
化カリウム層、およびＣＭＣ−スクロース層を溶解する
ことなく界面活性剤層を形成することができるできる。
このような構成では、界面活性剤層により、試料溶液の
導入が容易になるので、実施例１のようなレシチン層１
０は不要である。上記のようにして反応試薬層を形成し
た後、実施例１と同様にカバー１２およびスペーサー１
１を図１中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接
着することにより、コレステロールセンサを完成させ
た。このようにして作製したコレステロールセンサによ
る、標準血清に対する応答は、総コレステロール濃度に
対して直線性を示し、総コレステロール濃度が０の生理
食塩水に対する応答は、親水性高分子層中のＣＭＣが本
実施例と等量でスクロースを含まないセンサと比較して
明らかに低かった。

【００２４】《実施例４》実施例１と同様に、電極系上
に、ＣＭＣ層を形成した。このＣＭＣ層を覆う様にＣｈ
ＯＤ、フェリシアン化カリウム、およびオリゴ糖である
トレハロースの混合水溶液を滴下し、乾燥させてＣｈＯ
Ｄ−フェリシアン化カリウム−トレハロース層を形成し
た。このように、酵素や電子受容体を含む層に糖を添加
することにより、層表面が平滑化され、それにより試料
液の導入時の気泡の混入を防ぐ効果もある。つづいて、
ＣｈＥ、および界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０の混合水溶液を、スペーサー１１とカバー１２を組み
合わせることにより生じる、カバー部材の試料液供給路
に露出する面に滴下し、乾燥させてＣｈＥ−界面活性剤
層を形成した。このように、電極系側に形成された反応
試薬層に糖が添加され、さらにＣｈＥと界面活性剤を、
直接電極系と接触しない位置に形成することにより、電
極系に及ぼす界面活性剤の影響を更に軽減することがで
きる。上記のようにして反応試薬層を形成した後、実施
例１と同様にカバー１２およびスペーサー１１を図１
中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着するこ
とにより、コレステロールセンサを作製した。このよう
にして作製したコレステロールセンサによる、標準血清
に対する応答は、総コレステロール濃度に対して直線性
を示した。

【００２５】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、酵素活性
を発現するために界面活性剤を必要とする酵素をコレス
テロールセンサ中で有効に機能させることができる。こ
れにより、より短い時間で測定ができるコレステロール
センサが得られ、血液中のコレステロール値測定におい
てその利用価値は極めて大きい。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるコレステロールセン
サの電極被覆層および反応試薬層を除いた分解斜視図で
ある。

【図２】同センサの要部を示す縦断面図である。

【図３】本発明の他の実施例におけるコレステロールセ
ンサの要部を示す縦断面図である。

【図４】本発明のさらに他の実施例におけるコレステロ
ールセンサの要部を示す縦断面図である。

【図５】本発明の他の実施例におけるコレステロールセ
ンサの要部を示す縦断面図である。

【図６】本発明の一実施例のコレステロールセンサの応
答特性を示す図である。

【図７】比較例のコレステロールセンサの応答特性を示
す図である。

【図８】他の比較例のコレステロールセンサの応答特性
を示す図である。

【符号の説明】

１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 測定極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ ＣＭＣ層 ８ ＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム−ＣＭＣ層 ９ ＣｈＥ−界面活性剤層 １０ レシチン層 １１ スペーサ １２ カバー １３ 試料供給路の開口部 １４ 空気孔 １５ スリット １６ ＣＭＣ−スクロース層 １７ ＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム−ＣｈＥ層 １８ 界面活性剤層 １９ ＣｈＯＤ−フェリシアン化カリウム−トレハロー
ス層

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平９−297121（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−285298（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−103933（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−94574（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−232219（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/327 C12Q 1/00 - 3/00

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絶縁性の基板、前記基板上に設けられた
   測定極および対極を含む電極系、前記電極系を被覆する
   電極被覆層、および前記電極被覆層上またはその近傍に
   配された反応試薬層を具備し、前記反応試薬層が少なく
   ともコレステロールの酸化反応を触媒する酵素、コレス
   テロールエステル加水分解活性を有する酵素、および界
   面活性剤を含み、前記電極被覆層が水溶性セルロース誘
   導体および糖からなる群より選ばれた少なくとも１種か
   らなり、かつセンサに供給された試料液に溶解し、前記
   電極被覆層の量が電極の単位面積当たり０．４〜２．５
   ｍｇ／ｃｍ ² であるコレステロールセンサ。
2. 【請求項２】 さらに、前記基板との間に試料液を前記
   電極系に供給する試料液供給路を形成するカバー部材を
   備え、前記反応試薬層が前記試料液供給路内に配された
   請求項１に記載のコレステロールセンサ。
3. 【請求項３】 前記反応試薬層の含有するコレステロー
   ルエステル加水分解活性を有する酵素、および界面活性
   剤のセンサチップ当たりの量が、それぞれ１．５〜６．
   ０ｕｎｉｔ、および（０．７５〜１．０）×１０^-2μｇ
   であり、電極被覆層の量が４０〜２５０μｇである請求
   項１に記載のコレステロールセンサ。
4. 【請求項４】 前記反応試薬層の含有するコレステロー
   ルの酸化反応を触媒する酵素のセンサチップ当たりの量
   が０．１５〜１．５ｕｎｉｔである請求項３に記載のコ
   レステロールセンサ。
5. 【請求項５】 前記反応試薬層が、前記電極被覆層上に
   形成された水溶性セルロース誘導体または糖を含む、コ
   レステロールの酸化反応を触媒する酵素の層、その層の
   上に形成された、コレステロールエステル加水分解活性
   を有する酵素および界面活性剤を含む層からなる請求項
   １に記載のコレステロールセンサ。
6. 【請求項６】 前記反応試薬層が、前記電極被覆層上に
   形成された水溶性セルロース誘導体または糖を含む、コ
   レステロールの酸化反応を触媒する酵素の層、および前
   記カバー部材の試料液供給路に露出する面に形成され
   た、コレステロールエステル加水分解活性を有する酵素
   および界面活性剤を含む層からなる請求項１に記載のコ
   レステロールセンサ。
7. 【請求項７】 コレステロールの酸化反応を触媒する酵
   素が、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロー
   ルデヒドロゲナーゼである請求項１に記載のコレステロ
   ールセンサ。
8. 【請求項８】 前記反応試薬がさらに電子受容体を含有
   する請求項１に記載のコレステロールセンサ。
9. 【請求項９】 前記コレステロールエステル加水分解活
   性を有する酵素が、コレステロールエステラーゼである
   請求項１に記載のコレステロールセンサ。
10. 【請求項１０】 前記電極被覆層の被覆量が前記電極系
    の単位面積当たり０．８〜１．６ｍｇ／ｃｍ²である請
    求項１に記載のコレステロールセンサ。
11. 【請求項１１】 前記電極系がカーボンからなる請求項
    １に記載のコレステロールセンサ。
12. 【請求項１２】 前記電極系が下地の銀層と、その上に
    形成されたカーボン層からなる請求項１に記載のコレス
    テロールセンサ。