JP3611268B2 - バイオセンサおよびその製造方法 - Google Patents
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【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中の特定成分を迅速、高精度に、かつ簡便に定量することができるバイオセンサに関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、試料中の特定成分について、試料液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方式として、様々なバイオセンサが提案されている。
例えば、グルコースの定量方法として、グルコースオキシダーゼと酸素電極あるいは過酸化水素電極とを組み合わせた方式が一般に知られている。グルコースオキシダーゼは、基質であるβ−D−グルコースをD−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。この時、酸素が電子メディエーターの働きをする。この反応にともない、酸素は過酸化水素に還元される。このときの酸素消費量を酸素電極によって測定するか、または生成される過酸化水素の量を白金電極等を用いた過酸化水素電極によって測定することによりグルコースを定量することができる。
しかし、上記の方法では、酸素のない条件下では測定が不可能である。そこで、酸素を電子メディエーターとして用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、またはキノン誘導体等の金属錯体や有機化合物を電子メディエーターとして用いるタイプのグルコースセンサが開発されている。
このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子メディエーターの還元体を電極で酸化することにより、その酸化電流値からグルコース濃度が求められる。この手法は、グルコースに限らず他の基質の定量にも広く応用され、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質に対する測定が原理的には可能である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
上記したようなバイオセンサにおいては、電子メディエーターとして安定性に優れ、また大量生産に適するフェリシアン化カリウムを用いる場合が多い。
しかし、フェリシアン化物イオンと酵素間の二次反応速度は、比較的遅いという問題点があった。
本発明は、電子メディエーターと酵素間の二次反応速度が速く、短時間で高精度の測定ができるバイオセンサを提供することを目的とする。
【0004】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために本発明によるバイオセンサは、絶縁性の基板、前記基板上に設けられた少なくとも測定極と対極を有する電極系、前記電極系上またはその近傍に形成された反応層、および前記電極系上に設けられた親水性高分子層からなり、前記反応層は、前記親水性高分子層上に形成された酸化還元酵素を含む層と、前記酸化還元酵素を含む層と隔離して設けられた電子メディエーターを含む層と、を備え、前記電子メディエーターとしてフェロセン6フッ化リン酸塩およびフェロセン4フッ化ホウ酸塩からなる群より選ばれた少なくとも1種を用いる。
【0005】
【発明の実施の形態】
フェロセン6フッ化リン酸塩およびフェロセン4フッ化ホウ酸塩は、中性域では非常に不安定であるが、酸性溶液中では、極めて長時間安定に存在する。そのため、本発明によるバイオセンサの反応層は、これらフェロセン化合物を酸性溶液に溶解させ、この溶液を滴下乾燥させることにより形成するのが好ましい。従って、酸化還元酵素をはじめとする反応試薬系の他の成分が、酸性条件下で不安定である場合には、これらよりなる層を前記電子メディエーターを含む層とは分離して形成することが好ましい。この構成を採用することにより、反応試薬系全体を安定に保つことができ、かつより迅速に測定対象物の濃度を測定できるバイオセンサを得ることができる。
【0006】
大部分のフェロセン化合物は、還元体として市販されている。従って、電子メディエーターとしてフェロセンを用いる場合は、電極上にて還元体フェロセンを酸化体フェロセンに変換する必要がある。
本発明は、酸化型フェロセン化合物のフェロセン6フッ化リン酸塩およびフェロセン4フッ化ホウ酸塩を用いるので、これをそのまま反応層に適用できる。
これらの酸化型フェロセン化合物は、フェリシアン化カリウムを用いた場合よりも、応答速度が著しく速く、より高精度な測定を迅速に行うことが可能になる。
【0007】
これらの電子メディエーターは、その溶媒として、塩酸、硫酸、硝酸、酢酸、過塩素酸、メタンスルホン酸、トリフロロ酢酸等の酸性溶液が好適に用いられる。
この電子メディエーターを含む層と酸化還元酵素を含む層との配置に関してはいくつかの好ましい形態がある。
すなわち、酸化還元酵素を含む層を基板上に電極系に接して設け、電子メディエーターを含む層をこの層の隣接部にそれぞれ隔離して、またはカバー部材の試料液供給路に露出する面に設けるなどである。以下に、さらに詳しく説明する。
【0008】
まず、本発明による第1のバイオセンサは、基板上の電極系に接して親水性高分子層を設け、この親水性高分子層に接して、酵素類を含む層を設けてある。さらに前記基板に組み合わせて基板との間に試料液供給路を構成するカバー部材には、試料液供給路に露出する面に接して親水性高分子層を設け、この層に接して電子メディエーターを含む層を設けてある。また、必要に応じて脂質を含む層が前記酵素類を含む層および/または電子メディエーターを含む層を被覆している。
試料液供給路に露出するカバー側の面に接して設けられた親水性高分子層は、電子メディエーターを含む層が剥がれやすくなるのを防止するのに役立つ。
本発明による第2のバイオセンサは、基板上の電極系に接して親水性高分子層を設け、この親水性高分子層に接して、酵素類を含む層を設けてある。さらに前記酵素類を含む層の試料液供給路の開口部側に、この層とは接しないように電子メディエーターを含む層を設けてある。また、必要に応じて脂質を含む層が前記酵素類を含む層および電子メディエーターを含む層を被覆している。この脂質を含む層は、前記2つの層の近傍に設けられていてもよい。
上述のバイオセンサにおいて、親水性高分子層とこの層に接する電子メディエーターを含む層とを形成する代わりに、親水性高分子と電子メディエーターの混合物からなる層を設けてもよい。
【0009】
親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、水溶性セルロース誘導体(特にエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース)、ゼラチン、ポリアクリル酸およびその塩、デンプンおよびその誘導体、無水マレイン酸およびその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、またはポリ2ーヒドロキシエチルメタクリレートなどを用いることができる。
さらに、コレステロルエステラーゼには、シュードモナス類由来のものとほ乳類膵臓由来のものが挙げられる。
シュードモナス由来のコレステロルエステラーゼを用いる場合、界面活性剤として、n−オクチル−β−D−チオグルコシド、Lubrol PX、コール酸ナトリウム、ドデシル−β−マルトシド、DK−エステルを用いると良好な応答を示す。
また、ほ乳類膵臓由来のコレステロルエステラーゼものを用いる場合は、コール酸ナトリウムなどの、胆汁酸骨格を持つ界面活性剤を用いると、さらに良好な応答性が得られる。
試料溶液の反応層への導入を容易にする脂質には、レシチン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン等のリン脂質で、両親媒性脂質が好ましい。
酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二極電極系と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。
【0010】
【実施例】
図1は、反応層を除いたバイオセンサの分解斜視図である。電極系を形成した絶縁性基板1と、空気孔16を備えたカバー14およびスペーサー13を、図1中に一点鎖線で示すような位置関係をもって接着してバイオセンサを作製する。このようなバイオセンサでは、基板1とカバー14との間において、スペーサー13のスリット15の部分に試料液供給路を構成する空間部が形成され、その開口部となるスリット15の先端部18に、試料液を接触させるだけの簡易操作で、試料液は容易に試料液供給路を通じて反応層部分へ導入される。試料液の供給量はカバーとスペーサーによって生じる空間容積に依存するため、あらかじめ定量する必要はない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の高い測定が可能となる。ここで、カバーおよびスペーサーに透明な高分子材料を用いると、反応層の状態や試料液の導入状況を外部から容易に観察することができる。
図2は、スペーサー13とカバー14を重ね合わせたカバー部材の斜視図であり、図1とは上下逆に配置してある。このカバー部材と基板を組み合わせて、試料液供給路を構成する空間部が形成される。17は、この試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面を示す。
【0011】
図3は、本発明による第1のバイオセンサの縦断面図である。
1は、ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性基板を示す。この基板1上に、スクリーン印刷により銀ペーストを印刷してリード2と3を形成してある。そして、基板1上に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペーストを印刷することにより、測定極4と対極5を含む電極系を、また絶縁性ペーストを印刷することにより絶縁層6をそれぞれ形成している。絶縁層6は、測定極4および対極5の露出部分の面積を一定とし、かつリードを部分的に覆っている。前記電極系上に親水性高分子層7、および試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17に接して親水性高分子層12がそれぞれ形成されている。さらに、この親水性高分子層7に接して、酵素類を含む層8(8a)を形成し、脂質を含む層9でこれらの層を覆っている。また、親水性高分子層12に接して、電子メディエーターを含む層10を形成している。
図4は、図3における親水性高分子層12と電子メディエーターを含む層10の代わりに、親水性高分子と電子メディエーターからなる混合層11を形成している。
図5は、本発明における第2のバイオセンサの縦断面図である。
絶縁性基板1上にリード2と3、測定極4、対極5、絶縁層6、親水性高分子層7は、図3と同様にして形成したものである。そして、前記親水性高分子層7に接して、酵素類を含む層8を形成している。さらに、酵素類を含む層8と試料液供給路の開口部18との間に、親水性高分子層19を隔離して形成し、この層に接して、電子メディエーターを含む層20を形成してある。
酵素類を含む層8と電子メディエーターを含む層20を覆うように、脂質を含む層9が形成されている。
図6は、図5における脂質を含む層9を試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17に接して形成している。
以下に、具体的な実施例を詳しく説明する。
【0012】
《実施例1》
本発明における第1のバイオセンサの構成で、コレステロールセンサを形成した。
図3の基板1の電極系上に、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩(以下CMCと略す)の0.5wt%水溶液を滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させ、CMC層7を形成した。つづいて、ノカルジア由来のコレステロールオキシダーゼ(以下、コレステロールオキシダーゼをChODと略す。)を400units/ml、シュードモナス由来のコレステロールエステラーゼ(以下コレステロールエステラーゼをChEと略す)を1000units/ml、およびn−オクチル−β−D−チオグルコシドを1.2wt%をそれぞれ水に溶解させ、混合水溶液を作製した。この混合水溶液をCMC層7上に滴下し、50℃で15分間乾燥させChOD、ChEおよび界面活性剤の混合層8を形成した。
【0013】
この混合層8の上に、ホスファチジルコリンの0.5wt%トルエン溶液を5μl滴下して、乾燥させ、レシチン層9を形成した。
さらに、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17にも、CMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層12を形成した。つづいて、0.05規定塩酸にフェロセン4フッ化ホウ酸塩をその濃度が10mM/mlになるように溶解させて溶液Aを作製した。この溶液A5μlをCMC層12上に滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層10を形成した。
そして、カバー14およびスペーサー13を図1中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、コレステロールセンサを作製した。
このコレステロールセンサに、コレステロール標準液3μlを試料供給路の開口部18より供給した。そして、3分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ+0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定した。こうして、コレステロールセンサのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【0014】
《実施例2》
実施例1と同様にして、図4の基板1の電極系上に接して、CMC層7と混合層8とレシチン層9を形成した。つづいて、実施例1で作製した溶液AとCMCの0.5wt%水溶液を混合して溶液Bを作製した。そして、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17にこの溶液Bを5μl滴下し、常温空気中で乾燥させて、CMCと電子メディエーターからなる混合層11を設けた。こうして、実施例1と同様にして、コレステロールセンサを作製し、そのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【0015】
《実施例3》
本発明における第1のバイオセンサの構成で、グルコースセンサを形成した。実施例1と同様にして、図3の基板1の電極系上にCMC層7を形成した。つづいて、グルコースオキシダーゼ(以下GOxと略す)の100units/mlをCMC層7を覆うように4μl滴下し、50℃の乾燥機中で10分間乾燥させることにより、GOx層8aを形成した。
さらに、GOx層8aの上に実施例1と同様にして、ホスファチジルコリンの0.5wt%トルエン溶液を5μl滴下して乾燥させ、レシチン層9を形成した。
次に、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17にも、CMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層12を形成した。このCMC層12を覆うようにして、実施例1で作製した溶液Aを5μl滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層10を形成した。
こうして、実施例1と同様にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標準溶液に対する応答を測定した。
【0016】
《実施例4》
実施例3と同様にして、図4の基板1の電極系上に接して、CMC層7とGOx層8aとレシチン層9を形成した。つづいて、実施例1で作製した溶液Bを、試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面17に5μl滴下し、常温空気中で乾燥させて、CMCと電子メディエーターからなる混合層11を設けた。
こうして、実施例1と同様にして、グルコースセンサを作製し、そのグルコース標準溶液に対する応答を測定した。
【0017】
《実施例5》
本発明における第2のバイオセンサの構成で、コレステロールセンサを形成した。
実施例1と同様に、図5の基板1の電極系上にCMC層7、ChOD、ChEおよび界面活性剤の混合層8を形成した。さらに、このCMC層7に接した混合層8と試料液供給路の開口部18に相当する基板先端部の間に、これらの層と接触しないように、CMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層19を形成した。このCMC層19を覆うようにして、実施例1で作製した溶液Aを5μl滴下し、常温空気中で乾燥させて、電子メディエーターを含む層20を形成した。
次に、混合層8と電子メディエーターを含む層20を覆うように、スファチジルコリンの0.5wt%トルエン溶液を5μl滴下し、乾燥させ、レシチン層9を形成した。
こうして、実施例1と同様にして、コレステロールセンサを作製し、そのコレステロール標準溶液に対する応答を測定した。
【0018】
以上のいずれのバイオセンサも、各標準溶液に対する応答は、良好な直線性を示した。
【0019】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料液中の特定成分濃度を測定するバイオセンサにおいて、より短い時間で高精度の測定ができるバイオセンサを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応層を除いた分解斜視図である。
【図2】同バイオセンサのカバーとスペーサーを重ね合わせたカバー部材で、図1とは上下逆に配置した斜視図である。
【図3】同バイオセンサの要部の縦断面図である。
【図4】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【図5】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【図6】本発明の他の実施例のバイオセンサの要部の縦断面図である。
【符号の説明】
1 絶縁性基板
2 リード
3 リード
4 測定極
5 対極
6 絶縁層
7 CMC層
8 ChOD、ChEおよび界面活性剤の混合層
8a GOX層
9 脂質を含む層
10 電子メディエーターを含む層
11 CMCと電子メディエーターからなる混合層
12 CMC層
13 スペーサー
14 カバー
15 スペーサーのスリット
16 空気孔
17 試料液供給路を構成する空間部に露出するカバー側の面
18 試料液供給路の開口部
19 CMC層
20 電子メディエーターを含む層
Claims (8)
- 絶縁性の基板、前記基板上に設けられた少なくとも測定極と対極を有する電極系、前記電極系上またはその近傍に形成された反応層、および前記電極系上に設けられた親水性高分子層からなり、
前記反応層が、前記親水性高分子層上に形成された酸化還元酵素を含む層と、前記酸化還元酵素を含む層と隔離して設けられた電子メディエーターを含む層と、を備え、
前記電子メディエーターがフェロセン6フッ化リン酸塩およびフェロセン4フッ化ホウ酸塩からなる群より選ばれた少なくとも1種であることを特徴とするバイオセンサ。 - 前記基板に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の試料液供給路に露出する面に親水性高分子層を設け、
前記カバー部材上の親水性高分子層上に前記電子メディエーターを含む層が形成されている請求項1記載のバイオセンサ。 - 前記基板上の電極系の隣接部に、前記電極系上の親水性高分子層に隔離して別の親水性高分子層が設けられ、前記別の親水性高分子層上に前記電子メディエーターを含む層が形成されている請求項1記載のバイオセンサ。
- 前記基板に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を備え、
前記カバー部材の試料液供給路に露出する面に前記電子メディエーターを含む層が形成されており、かつ前記電子メディエーターを含む層に親水性高分子が混合されている請求項1記載のバイオセンサ。 - 前記酸化還元酵素を含む層の隣接部に隔離して前記電子メディエーターを含む層が形成されており、かつ前記電子メディエーターを含む層に親水性高分子が混合されている請求項1記載のバイオセンサ。
- 請求項2または3に記載のバイオセンサの製造方法であって、前記電子メディエーターを含む層を形成する工程が、電子メディエーターを酸性溶液に溶解させた溶液を滴下し乾燥させる工程からなることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
- 請求項4または5に記載のバイオセンサの製造方法であって、前記電子メディエーターを含む層を形成する工程が、親水性高分子および電子メディエーターを酸性溶液に溶解させた溶液を滴下し乾燥させる工程からなることを特徴とするバイオセンサの製造方法。
- 前記酸性溶液が塩酸であることを特徴とする請求項6または7に記載のバイオセンサの製造方法。
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