JP3214188B2 - バイオセンサおよびその製造法 - Google Patents
バイオセンサおよびその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料液中の特定成分に
ついて迅速かつ高精度な定量を実施することができ、更
に保存信頼性の高いバイオセンサおよびその製造法に関
する。
ついて迅速かつ高精度な定量を実施することができ、更
に保存信頼性の高いバイオセンサおよびその製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、試料液中の特定成分につい
て、迅速かつ高精度な定量を実施可能な方式としては、
特開平３−２０２７６４号公報に開示されているバイオ
センサがある。
て、迅速かつ高精度な定量を実施可能な方式としては、
特開平３−２０２７６４号公報に開示されているバイオ
センサがある。
【０００３】以下、同バイオセンサについて説明する。
図３は同バイオセンサの一例を示す断面図である。絶縁
性の基板１上にスクリーン印刷等の方法で測定極４およ
び対極５からなる電極系を形成し、更に、絶縁層６を形
成した後に、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵
素と電子受容体からなる反応層１３を形成したものであ
る。
図３は同バイオセンサの一例を示す断面図である。絶縁
性の基板１上にスクリーン印刷等の方法で測定極４およ
び対極５からなる電極系を形成し、更に、絶縁層６を形
成した後に、上記電極系上に親水性高分子と酸化還元酵
素と電子受容体からなる反応層１３を形成したものであ
る。
【０００４】基質を含む試料液を反応層１３上へ滴下す
ると反応層が溶解し、酵素と基質が反応し、更に電子受
容体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電
子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化
電流値から試料液中の基質濃度を求めるものである。
ると反応層が溶解し、酵素と基質が反応し、更に電子受
容体が還元される。酵素反応終了後、この還元された電
子受容体を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化
電流値から試料液中の基質濃度を求めるものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このような従来の構成
のバイオセンサでは、酵素と電子受容体とが同一反応層
中に存在するため、試料液が供給されると速やかに反応
開始されるという利点があった。しかしながら、酵素は
生体材料であるため電子受容体等の化学化合物との混在
状態では酵素の活性が低下し、センサの応答特性が低下
する。そこで、酵素と電子受容体を別々の層へ分離させ
る構成が考えられるが、酵素および電子受容体は何れも
水溶性であるため、完全な分離状態にすることが困難で
あった。
のバイオセンサでは、酵素と電子受容体とが同一反応層
中に存在するため、試料液が供給されると速やかに反応
開始されるという利点があった。しかしながら、酵素は
生体材料であるため電子受容体等の化学化合物との混在
状態では酵素の活性が低下し、センサの応答特性が低下
する。そこで、酵素と電子受容体を別々の層へ分離させ
る構成が考えられるが、酵素および電子受容体は何れも
水溶性であるため、完全な分離状態にすることが困難で
あった。
【０００６】本発明は従来の構成のバイオセンサの利点
を活かしつつ、このような問題点を解決するもので、迅
速かつ高精度で保存信頼性の高いバイオセンサを提供す
るものである。
を活かしつつ、このような問題点を解決するもので、迅
速かつ高精度で保存信頼性の高いバイオセンサを提供す
るものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明は、絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極
からなる電極系を設け、前記電極系に両親媒性の脂質で
修飾された酵素を主体とする層と、電子受容体を主体と
する層の二層からなる反応層を設けたものである。
に本発明は、絶縁性の基板上に少なくとも測定極と対極
からなる電極系を設け、前記電極系に両親媒性の脂質で
修飾された酵素を主体とする層と、電子受容体を主体と
する層の二層からなる反応層を設けたものである。
【０００８】
【作用】両親媒性の脂質で修飾されることによって酵素
は有機溶媒に可溶、水に不溶になる。そのため、有機溶
媒に溶解している両親媒性の脂質で修飾された酵素を含
む溶液を電極上に滴下し乾燥して形成した層と、電子受
容体を含む水溶液を滴下し乾燥して形成した層をいずれ
の順序で設けても、各々の層に含まれている酵素および
電子受容体が影響を受けることなく、均一な層を作製す
ることが可能である。従って、混在物による酵素の活性
低下が阻止されるため、本発明の構成のバイオセンサは
高い保存信頼性が得られる。
は有機溶媒に可溶、水に不溶になる。そのため、有機溶
媒に溶解している両親媒性の脂質で修飾された酵素を含
む溶液を電極上に滴下し乾燥して形成した層と、電子受
容体を含む水溶液を滴下し乾燥して形成した層をいずれ
の順序で設けても、各々の層に含まれている酵素および
電子受容体が影響を受けることなく、均一な層を作製す
ることが可能である。従って、混在物による酵素の活性
低下が阻止されるため、本発明の構成のバイオセンサは
高い保存信頼性が得られる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。
【００１０】（実施例１） 図１は本発明のバイオセンサの一実施例として作製した
グルコースセンサの断面図である。また図２は図１の分
解斜視図である。
グルコースセンサの断面図である。また図２は図１の分
解斜視図である。
【００１１】以下、グルコースセンサの作製方法につい
て説明する。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷
しリ−ド２、３を形成した。次に、樹脂バインダーを含
む導電性カーボンペーストを用いて電極系のうち測定極
４を、続いて絶縁性ペーストからなる絶縁層６をそれぞ
れ印刷した。
て説明する。ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁
性の基板１に、スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷
しリ−ド２、３を形成した。次に、樹脂バインダーを含
む導電性カーボンペーストを用いて電極系のうち測定極
４を、続いて絶縁性ペーストからなる絶縁層６をそれぞ
れ印刷した。
【００１２】絶縁層６は測定極４の露出部分の面積（約
１ｍｍ2）を一定とし、かつリ−ド２、３を部分的に覆
っている。最後に測定極と同一のカーボンペーストを用
いて対極５を印刷した。
１ｍｍ2）を一定とし、かつリ−ド２、３を部分的に覆
っている。最後に測定極と同一のカーボンペーストを用
いて対極５を印刷した。
【００１３】次に、前記電極系上に親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５ｗｔ％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭＣ層を形成
した。つづいて、前記ＣＭＣ層上に電子受容体としてフ
ェリシアン化カリウム３３ｍｇをＣＭＣ０．５ｗｔ％を
含むリン酸緩衝液（０．２Ｍ：Ｋ2ＨＰＯ4−０．２Ｍ：
ＫＨ2ＰＯ4）１ｍｌに溶解させた溶液を４μｌ滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて第一層７を
形成した。次に、両親媒性の脂質で修飾したグルコース
オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略
す）７５０Ｕをベンゼン１ｍｌに溶解させた溶液を第一
層上に４μｌ滴下し室温で乾燥させて第二層８を形成し
た。ここで、両親媒性の脂質で酵素を修飾する方法につ
いて簡単に説明する。ＧＯＤを０．１ＭＫＣｌを含む酢
酸緩衝液（０．０２Ｍ：ＣＨ3ＣＯＯＨ−０．０２Ｍ：
ＣＨ3ＣＯＯＫ）に溶解させた溶液を、両親媒性の脂質
の水溶液に混合し４℃で２４時間静置した後、凍結乾燥
法により分離し脂質修飾酵素を得る。
カルボキシメチルセルロ−ス（以下ＣＭＣと略す）の
０．５ｗｔ％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭＣ層を形成
した。つづいて、前記ＣＭＣ層上に電子受容体としてフ
ェリシアン化カリウム３３ｍｇをＣＭＣ０．５ｗｔ％を
含むリン酸緩衝液（０．２Ｍ：Ｋ2ＨＰＯ4−０．２Ｍ：
ＫＨ2ＰＯ4）１ｍｌに溶解させた溶液を４μｌ滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて第一層７を
形成した。次に、両親媒性の脂質で修飾したグルコース
オキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略
す）７５０Ｕをベンゼン１ｍｌに溶解させた溶液を第一
層上に４μｌ滴下し室温で乾燥させて第二層８を形成し
た。ここで、両親媒性の脂質で酵素を修飾する方法につ
いて簡単に説明する。ＧＯＤを０．１ＭＫＣｌを含む酢
酸緩衝液（０．０２Ｍ：ＣＨ3ＣＯＯＨ−０．０２Ｍ：
ＣＨ3ＣＯＯＫ）に溶解させた溶液を、両親媒性の脂質
の水溶液に混合し４℃で２４時間静置した後、凍結乾燥
法により分離し脂質修飾酵素を得る。
【００１４】これら第一層、第二層からなる反応層は直
径約３．６ｍｍのほぼ円形であり、対極の外周部に略一
致している。
径約３．６ｍｍのほぼ円形であり、対極の外周部に略一
致している。
【００１５】上記の反応層形成工程において、リン酸塩
および電子受容体の混合溶液を滴下すると、親水性高分
子からなるＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥過程で
混合された形で第一層７を形成する。従って、試料溶液
との溶解反応も迅速に行なわれる。また、親水性の層を
形成した後、両親媒性の脂質で修飾された酵素の有機溶
媒溶液を滴下するので、酵素を脂質で修飾した際に残っ
ている脂質を分離精製する必要がない。
および電子受容体の混合溶液を滴下すると、親水性高分
子からなるＣＭＣ層は一度溶解し、その後の乾燥過程で
混合された形で第一層７を形成する。従って、試料溶液
との溶解反応も迅速に行なわれる。また、親水性の層を
形成した後、両親媒性の脂質で修飾された酵素の有機溶
媒溶液を滴下するので、酵素を脂質で修飾した際に残っ
ている脂質を分離精製する必要がない。
【００１６】なお、上記実施例では両親媒性の脂質で修
飾した酵素を用いたが、酵素を修飾後未使用の脂質も含
めて有機溶媒に溶解させ抽出する手法で分離された酵素
を用いても、同様の工程で反応層を作製することがで
き、高精度なバイオセンサを得られることができた。
飾した酵素を用いたが、酵素を修飾後未使用の脂質も含
めて有機溶媒に溶解させ抽出する手法で分離された酵素
を用いても、同様の工程で反応層を作製することがで
き、高精度なバイオセンサを得られることができた。
【００１７】前記のようにして反応層を形成した後、カ
バー１０およびスペーサー９を図２中、一点鎖線で示す
ような位置関係をもって接着した。カバーに透明な材料
を用いると、反応層の状態や試料液の導入状況を外部か
ら極めて容易に確認することが可能である。
バー１０およびスペーサー９を図２中、一点鎖線で示す
ような位置関係をもって接着した。カバーに透明な材料
を用いると、反応層の状態や試料液の導入状況を外部か
ら極めて容易に確認することが可能である。
【００１８】また、カバーを装着するとカバーとスペー
サーによって出来る空間部の毛細管現象によって、試料
液はセンサ先端の試料供給孔１１に接触させるだけの簡
易操作で容易に反応層部分へ導入される。
サーによって出来る空間部の毛細管現象によって、試料
液はセンサ先端の試料供給孔１１に接触させるだけの簡
易操作で容易に反応層部分へ導入される。
【００１９】試料液の供給量はカバーとスペーサーによ
って生じる空間容積に依存するため、予め定量する必要
がない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑え
ることができ、精度の高い測定が可能となる。
って生じる空間容積に依存するため、予め定量する必要
がない。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑え
ることができ、精度の高い測定が可能となる。
【００２０】上記のように作製したグルコースセンサ
に、試料液としてグルコース水溶液３μｌを試料供給孔
１１より供給した。試料液は毛細管現象によって速やか
に空気孔１２部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。
に、試料液としてグルコース水溶液３μｌを試料供給孔
１１より供給した。試料液は毛細管現象によって速やか
に空気孔１２部分まで達し、電極系上の反応層が溶解し
た。
【００２１】試料液を供給してから一定時間後に電極系
の対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋０．
５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した
ところ、試料液中のグルコース濃度に比例した応答電流
値が得られた。
の対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋０．
５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した
ところ、試料液中のグルコース濃度に比例した応答電流
値が得られた。
【００２２】反応層が試料液に溶解すると、試料液中の
グルコースはＧＯＤによる酸化を受ける。ＧＯＤによる
酸化反応で移動した電子によってフェリシアン化カリウ
ムがフェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記
のパルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カ
リウムの酸化電流が得られ、この電流値は基質であるグ
ルコースの濃度に対応する。
グルコースはＧＯＤによる酸化を受ける。ＧＯＤによる
酸化反応で移動した電子によってフェリシアン化カリウ
ムがフェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記
のパルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カ
リウムの酸化電流が得られ、この電流値は基質であるグ
ルコースの濃度に対応する。
【００２３】（実施例２） 上記実施例１と第一層７および第二層８の組成以外は全
て同じであるので、ここでは省略して第一層７および第
二層８に関してのみ説明する。
て同じであるので、ここでは省略して第一層７および第
二層８に関してのみ説明する。
【００２４】上記（実施例１）と同様に作製した電極系
上にＣＭＣ０．５ｗｔ％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭ
Ｃ層を形成した。次に、前記ＣＭＣ層上に両親媒性の脂
質で修飾したＧＯＤ７５０Ｕをベンゼン１ｍｌに溶解さ
せた溶液を４μｌ滴下し室温で乾燥させて第一層７を形
成した。このとき使用する両親媒性の脂質で修飾された
酵素は、実施例１で記述した方法で得られたものである
が、次に電子受容体を含む水溶液を展開する工程がある
ので、酵素を修飾する際に使用されなかった過剰の脂質
は水洗、凍結乾燥を繰り返すことによって除去しておく
必要がある。続いて電子受容体としてフェリシアン化カ
リウム３３ｍｇをＣＭＣ０．５ｗｔ％を含むリン酸緩衝
液（０．２Ｍ：Ｋ2ＨＰＯ4−０．２Ｍ：ＫＨ2ＰＯ4；ｐ
Ｈ＝７．４）１ｍｌに溶解させた溶液を４μｌ滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて第二層８を
形成した。これら第一層、第二層からなる反応層の外周
部分は直径約３．６ｍｍであり、対極の直径に略一致し
ている。
上にＣＭＣ０．５ｗｔ％水溶液を滴下、乾燥させてＣＭ
Ｃ層を形成した。次に、前記ＣＭＣ層上に両親媒性の脂
質で修飾したＧＯＤ７５０Ｕをベンゼン１ｍｌに溶解さ
せた溶液を４μｌ滴下し室温で乾燥させて第一層７を形
成した。このとき使用する両親媒性の脂質で修飾された
酵素は、実施例１で記述した方法で得られたものである
が、次に電子受容体を含む水溶液を展開する工程がある
ので、酵素を修飾する際に使用されなかった過剰の脂質
は水洗、凍結乾燥を繰り返すことによって除去しておく
必要がある。続いて電子受容体としてフェリシアン化カ
リウム３３ｍｇをＣＭＣ０．５ｗｔ％を含むリン酸緩衝
液（０．２Ｍ：Ｋ2ＨＰＯ4−０．２Ｍ：ＫＨ2ＰＯ4；ｐ
Ｈ＝７．４）１ｍｌに溶解させた溶液を４μｌ滴下し、
５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて第二層８を
形成した。これら第一層、第二層からなる反応層の外周
部分は直径約３．６ｍｍであり、対極の直径に略一致し
ている。
【００２５】実施例１に対し、実施例２では電極系表面
と電子受容体を含む層が離れているのでフェリシアン化
カリウム、Ｈ2ＰＯ4-のような酸化能を有する物質の化
学的作用による電極系の特性変化が起こり難くなるもの
と考えられ、その結果、高精度なセンサ応答を有するバ
イオセンサを得ることができる。
と電子受容体を含む層が離れているのでフェリシアン化
カリウム、Ｈ2ＰＯ4-のような酸化能を有する物質の化
学的作用による電極系の特性変化が起こり難くなるもの
と考えられ、その結果、高精度なセンサ応答を有するバ
イオセンサを得ることができる。
【００２６】上記のように作製したグルコースセンサ
に、試料液としてグルコースス水溶液３μｌを試料供給
孔１１より供給した。試料液は毛細管現象によって速や
かに空気孔１２部分まで達し、電極系上の反応層が溶解
した。
に、試料液としてグルコースス水溶液３μｌを試料供給
孔１１より供給した。試料液は毛細管現象によって速や
かに空気孔１２部分まで達し、電極系上の反応層が溶解
した。
【００２７】試料液を供給してから一定時間後に電極系
の対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋０．
５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した
ところ、試料液中のグルコース濃度に比例した応答電流
値が得られた。
の対極５を基準にして測定極４にアノード方向へ＋０．
５Ｖのパルス電圧を印加し、５秒後の電流値を測定した
ところ、試料液中のグルコース濃度に比例した応答電流
値が得られた。
【００２８】また上記実施例では親水性高分子としてＣ
ＭＣを用いたが、これに限定されることはなく、他のセ
ルロース系、ビニルアルコール系、ビニルピロリドン
系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン系、無水マ
レイン酸系、アクリルアミド系などをそれぞれ用いても
同様の効果が得られた。
ＭＣを用いたが、これに限定されることはなく、他のセ
ルロース系、ビニルアルコール系、ビニルピロリドン
系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン系、無水マ
レイン酸系、アクリルアミド系などをそれぞれ用いても
同様の効果が得られた。
【００２９】一方、電子受容体としては、上記実施例の
フェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノン、フ
ェロセン化合物なども使用できる。
フェリシアン化カリウム以外に、ｐ−ベンゾキノン、フ
ェロセン化合物なども使用できる。
【００３０】さらに、上記実施例では測定極と対極から
なる２電極系について述べたが、参照電極を加えた３電
極方式とするとより精度の高い測定が可能である。
なる２電極系について述べたが、参照電極を加えた３電
極方式とするとより精度の高い測定が可能である。
【００３１】
【発明の効果】以上のように本発明によると、高い信頼
性を有するバイオセンサを得ることができる。
性を有するバイオセンサを得ることができる。
【図１】本発明のバイオセンサであるグルコースセンサ
の断面図
の断面図
【図２】本発明のバイオセンサの一実施例として作製し
たグルコースセンサのうち反応層を除き、図１の斜め上
方向からみた分解斜視図
たグルコースセンサのうち反応層を除き、図１の斜め上
方向からみた分解斜視図
【図３】従来のバイオセンサの一実施例ととして作製し
たグルコースセンサの断面図
たグルコースセンサの断面図
１ 絶縁性の基板 ２、３ リード ４ 測定極 ５ 対極 ６ 絶縁層 ７ 第一層 ８第二層 ９ スペーサー １０ カバー １１ 試料供給孔 １２ 空気孔１３ 反応層
フロントページの続き (72)発明者 山本 智浩 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (72)発明者 池田 信 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (56)参考文献 特開 平４−295755（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−202764（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−212050（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−114747（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/327
Claims (3)
- 【請求項１】絶縁性の基板上に形成した測定極と対極を
主体とする電極系と前記電極系上に形成した反応層から
なり、前記反応層が両親媒性の脂質で修飾された酵素を
主たる成分とする層および電子受容体を主たる成分とす
る層の少なくとも２層を形成することを特徴とするバイ
オセンサ。 - 【請求項２】絶縁性の基板上に少なくとも作用極および
対極を主体とする電極系を設ける工程、前記絶縁性の基
板上に親水性高分子の水溶液を展開し乾燥させる工程、
前記親水性高分子層上に電子受容体を含む水溶液を展開
し乾燥させて親水性高分子と電子受容体を含む第一層を
設ける工程、前記第一層上に酵素を含む有機溶媒溶液を
展開し乾燥させて酵素を含む第二層を設ける工程を順次
経過して製造することを特徴とするバイオセンサの製造
法。 - 【請求項３】絶縁性の基板上に少なくとも作用極および
対極を主体とする電極系を設ける工程、前記絶縁性の基
板上に親水性高分子の水溶液を展開し乾燥させる工程、
前記親水性高分子層上に酵素を含む有機溶媒溶液を展開
し乾燥させて酵素を含む第一層を設ける工程、前記第一
層上に電子受容体を含む水溶液を展開し乾燥させて電子
受容体を含む第二層を設ける工程を順次経過して製造す
ることを特徴とするバイオセンサの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25285793A JP3214188B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-10-08 | バイオセンサおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25285793A JP3214188B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-10-08 | バイオセンサおよびその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07110313A JPH07110313A (ja) | 1995-04-25 |
| JP3214188B2 true JP3214188B2 (ja) | 2001-10-02 |
Family
ID=17243142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25285793A Expired - Fee Related JP3214188B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-10-08 | バイオセンサおよびその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3214188B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005046001A (ja) * | 2001-06-15 | 2005-02-24 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 脂質修飾酵素の製造方法およびバイオセンサ |
| CN100523800C (zh) | 2003-05-15 | 2009-08-05 | 松下电器产业株式会社 | 传感器 |
| WO2007108388A1 (ja) * | 2006-03-17 | 2007-09-27 | Gunze Limited | バイオセンサの製造方法、及びバイオセンサ |
| WO2008007499A1 (fr) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Panasonic Corporation | Puce a dosage immunologique electrochimique |
| CN103454321B (zh) * | 2013-03-28 | 2015-09-09 | 利多(香港)有限公司 | 生物传感器及其制造方法 |
| CN103412012B (zh) * | 2013-03-28 | 2015-09-09 | 利多(香港)有限公司 | 生物传感器 |
-
1993
- 1993-10-08 JP JP25285793A patent/JP3214188B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07110313A (ja) | 1995-04-25 |
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