JP3027306B2 - バイオセンサおよびその製造方法 - Google Patents
バイオセンサおよびその製造方法Info
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Description
に生体試料中の基質について、酵素反応を利用して迅速
かつ高精度な定量を実施することができるバイオセンサ
およびその製造方法に関する。
て、迅速かつ高精度な定量を実施可能な方式として、次
のようなバイオセンサが知られている(特開平3−20
2764号公報)。このバイオセンサは、絶縁性の基板
上に測定極および対極からなる電極系を形成し、電極系
上に親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容体を含む反
応層を形成し、さらにカバーとスペーサを組み合わせて
試料供給路を構成する空間部を形成したものである。基
質を含む試料液を試料供給孔に接触させると、前記空間
部の毛細管現象によって試料液がすみやかに反応層へ供
給され、反応層が溶解する。そして、酵素と基質が反応
し、さらに電子受容体が還元される。酵素反応終了後、
この還元された電子受容体を電気化学的に酸化し、この
時得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を求める
ことができる。また、このバイオセンサは、基板上に電
極系を形成する工程、反応層を形成する工程、およびカ
バーおよびスペーサを装着する工程によって作製され
る。
イオセンサは、カバーとスペーサによって形成される空
間部が、毛細管現象により試料液を吸い込む管状構造を
有するため、反応層はその全体が空間部内に露出してい
ない。従って、供給された試料は電極系の外形に略一致
している反応層の一部分にしか援触しない。そのため溶
解する反応層の面積が一定とならず、センサ応答再現性
の低下の原因になっていた。また、酸化還元酵素を含む
溶液を電極系上に滴下し乾燥させて反応層を形成する製
造法によると、滴下した際に溶液が電極系からはみ出す
など均一な反応層を形成することが困難であった。
は、絶縁性の基板、前記基板上に形成された測定極と対
極を含む電極系、少なくとも酸化還元酵素を含む反応
層、および前記基板に組み合わせたカバー部材によって
基板との間に形成された空間部を有し、この空間部は、
基板端部に開口し前記電極系へ試料を導く試料供給路を
構成し、かつ前記電極系に対応する部分において他の部
分より幅広くなっており、前記反応層のほぼ全体がこの
幅広い空間部内に露出しているものである。
性の基板上に測定極と対極を含む電極系を形成する工
程、端面に開放しかつ前記電極系に対応する部分が他の
部分より幅広くされた、試料を前記電極系へ導く試料供
給路を形成するスリットを有するスペーサを前記基板上
に密着させて前記電極系を含む露出部を区画する工程、
少なくとも酸化還元酵素を含む反応層形成用溶液を前記
露出部内に滴下し乾燥して反応層を形成する工程、およ
び前記スペーサに前記スリットを覆うカバーを密着させ
る工程を有する。また、本発明のバイオセンサの製造方
法は、絶縁性の基板上に測定極と対極を含む電極系を形
成する工程、端面に開放しかつ前記電極系に対応する部
分が他の部分より幅広くされた、試料を前記電極系へ導
く試料供給路を形成するスリットを有するスペーサを前
記基板上に密着させて前記電極系を含む露出部を区画す
る工程、少なくとも酸化還元酵素を担持させた担体から
なる反応層を前記露出部内に形成する工程、および前記
スペーサに前記スリットを覆うカバーを密着させる工程
を有する。
び/または親水性高分子を含むことが好ましい。反応層
は、一態様において少なくとも酸化還元酵素を担持した
担体から構成される。また、前記カバー部材は、端面に
開放したスリットを有するスペーサと前記スリットを覆
うカバーからなることが好ましい。さらに、前記空間部
の電極系上の部分の底面が、電極系の外形と略一致して
いることが好ましい。また、前記反応層は、前記電極系
上に電極系に接して形成されていることが好ましい。電
極系は、測定極とその周囲を囲むように配された、外形
が円形の対極からなり、前記スペーサがそのスリットに
前記対極の外形に合わせた円弧状のくりぬき部を有する
ことが好ましい。反応層は、前記電極系上において前記
スリットのくりぬき部を含む円形部分内に全体が位置す
ることが好ましい。
ほぼ全体が、スペーサおよびカバーで形成される空間部
内に露出しているので、反応層に含まれる諸成分のほぼ
すべてが反応に寄与することができる。従って、センサ
応答性および再現性が著しく向上する。また、上記の製
造方法によると、スペーサを基板に密着して反応層形成
部分を区画した後に反応層を形成する、すなわち反応層
形成用溶液を前記区画に滴下し乾燥させるか、あるい
は、諸成分を担持した担体を前記区画に配置することに
より、簡単に均一な反応層を形成することができる。こ
のように、諸成分を含む反応層が均一に形成でき、また
試料液に溶解する反応層が一定になるため、応答性が向
上し、高い再現性を有するバイオセンサが得られる。
く説明する。図1は本発明の一実施例におけるバイオセ
ンサの縦断面図である。また、図2は図1の斜め上方向
からみた分解斜視図である(反応層は図示せず)。この
バイオセンサの構造を以下に説明する。ポリエチレンテ
レフタレートからなる絶縁性の基板1は、その上にスク
リーン印刷により銀ペ−ストを印刷して形成したリ−ド
2、3を有する。基板1上には、リード2、3を形成し
た後に、樹脂バインダーを含む導電性カーボンペースト
を用いて電極系を構成する測定極4と対極5を、また絶
縁性ペーストを用いて絶縁層6をそれぞれ印刷により形
成してある。絶縁層6は、測定極4の露出部分の面積
(約1mm2)を一定とし、かつリ−ド2、3を部分的
に覆っている。
応層7が形成されている。反応層の構成については、以
下の具体例で詳しく説明する。基板1上には、スペーサ
8およびカバー9からなるカバー部材10が図2中、一
点鎖線で示すような位置関係をもって接着してある。こ
のスペーサとカバーによって、後述の試料供給路を構成
する空間部を画定するものである。スペーサ8は、図2
のように、試料供給路の開口(試料供給口11a)に相
当する右端部から長手方向に、カバー9の空気孔13に
対応する部分に至る略長方形のスリット11を有すると
ともに、電極系に対応する部分には電極系の外形に合わ
せた円弧状のくり抜き部12を有する。そして、反応層
7は、ほぼ全体がカバー部材10によって画定された空
間部に露出している。すなわち、スペーサ8のスリット
11におけるくりぬき部12を含む円形部分内にほぼ全
体が位置する。前記の円形部分の直径が対極5の直径に
略等しく、かつ円形部分いっぱいに反応層が形成されて
いるのが好ましい。そのような好ましい構成とするに
は、反応層を溶液、特に親水性高分子を含む水溶液の滴
下、乾燥により形成する場合、基板上にスペーサ8を組
み合わせた後反応層を形成するのが有利である。反応層
形成用溶液の滴下量や粘度を調製することによって、所
定の部分に所定の大きさの反応層を形成し、その後にカ
バー部材を組み合わせてもよい。上の例では、カバー部
材は、スペーサ8とカバー9の二部品で構成されている
が、例えば前記後者のような反応層形成方法によるとき
は、スペーサ8とカバー9とを一体に成形したものを用
いることができる。
説明する。まず、図2に示すように、リ−ド2、3、測
定極4と対極5からなる電極系および絶縁層6を設けた
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板を準
備する。なお、測定極4の露出部分の面積は約1mm2
である。この基板1の電極系上に、親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス(以下CMCと略す)の
0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形
成した。続いて、前記CMC層上に酵素としてフルクト
ースデヒドロゲナーゼ(以下FDHと略す)(東洋紡
製)1000Uおよび電子受容体としてフェリシアン化
カリウム33mgを、CMC0.5wt%を含むリン酸
−クエン酸緩衝液(0.2M Na2HPO4−0.1M
C3H4(OH)(COOH)3、pH=5.0)1m
lに溶解させた混合溶液を4μl滴下し、50℃の温風
乾燥器中で10分間乾燥させて反応層7を形成した。反
応層の外周部分は直径約3.6mmであり、対極の直径
に略一致している。
電子受容体の混合溶液をCMC層上に滴下すると、最初
に形成したCMC層は一度溶解し、その後の乾燥過程で
酵素などと混合された形で反応層7を形成する。しか
し、攪拌等をともなわないため完全な混合状態とはなら
ず、電極系表面を直に被覆するのはCMCのみとなる。
すなわち、酵素および電子受容体などが電極系表面に接
触しないために、電極系表面へのタンパク質の吸着や、
フェリシアン化カリウムのような酸化能を有する物質の
化学的作用による電極系の特性変化が起こり難くなる。
その結果、高精度なセンサ応答を有するフルクトースセ
ンサ得ることができる。最後に、スペーサ8およびカバ
ー9を図2中、一点鎖線で示すような位置関係をもって
接着した。このスペーサとカバーによって、後述の試料
供給路を構成する空間部を画定するものである。
ーを装着すると、基板上にカバーとスペーサによってで
きる空間部で試料供給路が構成され、この試料供給路の
毛細管現象によって、試料液はセンサ先端の試料供給口
11aに接触させるだけの簡単な操作で容易に反応層部
分へ導入される。試料液の供給量はカバーとスペーサに
よって生じる空間容積に依存するため、あらかじめ定量
する必要がない。また、反応層がすべて空間に露出して
いるので、試料液への溶解量が一定となり応答再現性が
向上する。さらに、測定中の試料液の蒸発を最小限に抑
えることができ、精度の高い測定が可能となる。上記の
ように作製したフルクトースセンサに、試料液としてフ
ルクトース水溶液3μ1を試料供給口11aより供給す
ると、試料液は毛細管現象によって速やかに空気孔13
部分まで達し、電極系上の反応層7が溶解した。
系の対極5を基準にして測定極4にアノード方向へ+
0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定
したところ、試料液中のフルクトース濃度に比例した応
答電流値が得られた。反応層7が試料液に溶解すると、
試料液中のフルクトースはFDHによって酸化され、5
−ケト−フルクトースが生成する。FDHによる酸化反
応で移動した電子によって、フェリシアン化カリウムが
フェロシアン化カリウムに還元される。次に、前記のパ
ルス電圧の印加により、生成したフェロシアン化カリウ
ムの酸化電流が得られ、この電流値は基質であるフルク
トースの濃度に対応する。
刷された基板を準備し、その基板上に、スペーサを図2
中、一点鎖線で示すような位置関係を持って接着した。
続いて、前記電極系上に親水性高分子としてCMCの
0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形
成した。続いて、前記CMC層上に酵素としてFDH1
000Uおよび電子受容体としてフェリシアン化カリウ
ム33mgを、CMC0.5wt%を含むリン酸−クエ
ン酸緩衝液(0.2M Na2HPO4−0.1M C3
H4(OH)(COOH)3、pH=5.0)1mlに溶
解させた混合溶液を4μl滴下し、50℃の温風乾燥器
中で10分間乾燥させて反応層7を形成した。反応層の
外周部分は直径約3.6mmであり、対極の直径に略一
致している。前記のように反応層7を形成した後、カバ
ー9を図2中、一点鎖線で示すような位置関係をもって
接着した。
サ8とカバー9を別々に接着するため、センサ生産工程
的には煩雑であるが、スペーサ9によって反応層の広が
りが一定に保たれるので、均一な反応層を形成すること
が可能である。上記のように作製したフルクトースセン
サに、試料液としてフルクトース水溶夜3μ1を試料供
給口11aより供給したところ、試料液は毛細管現象に
よって速やかに空気孔13部分まで達し、電極系上の反
応層7が溶解した。試料液を供給してから一定時間後
に、電極系の対極5を基準にして測定極4にアノード方
向へ+0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値
を測定したところ、試料液中のフルクトース濃度に比例
した応答電流値が得られた。
例2とすべて同じであるので、ここでは反応層7に関し
てのみ説明する。電極系が印刷された基板上に、実施例
2と同様に、スペーサ8を図2中、一点鎖線で示すよう
な位置関係をもって接着した後、CMCの0.5wt%
水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を形成した。続い
て、前記CMC層上に、酵素としてFDH1000U
を、CMC0.5wt%を含むリン酸−クエン酸緩衝液
(0.2M Na2HPO4−0.1M C3H4(OH)
(COOH)3、pH=5.0)1mlに溶解させた混
合溶液を4μl滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分
間乾燥させて第一層を形成した後、親水性高分子として
ポリビニルピロリドン(以下PVPと略す)の0.5w
t%エタノール溶液を前記第一層上に4μl滴下し、室
温で乾燥させて第二層を形成した。次に、電子受容体と
してフェリシアン化カリウム190mgを卵黄レシチン
1.0wt%を含むトルエン中に分散させたものを、前
記第二層上に3μl滴下し、室温で乾燥させて第三層を
形成した。
第二層、および第三層から構成されている。反応層の外
周部分は直径約3.6mmであり、対極の直径に略一致
している。本実施例では反応層7が3層構造になってお
り、製造方法としては実施例2より煩雑である。しかし
ながら、酵素を含む第一層と電子受容体を含む第三層
が、親水性高分子を含む第二層によって隔てられている
ので、酵素が電子受容体と接触することがなく、保存中
における酵素活性の低下が阻止される利点がある。上記
のように作製したフルクトースセンサに、試料液として
フルクトース水溶液3μ1を試料供給口11aより供給
したところ、試料液は毛細管現象によって速やかに空気
孔13部分まで達し、電極系上の反応層7が溶解した。
試料液を供給してから一定時間後に、電極系の対極5を
基準にして測定極4にアノード方向へ+0.5Vのパル
ス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定したところ、試
料液中のフルクトース濃度に比例した応答電流値が得ら
れた。
グルコ−スセンサについて説明する。初めにグルコ−ス
センサの作製方法について説明する。本実施例において
用いたグルコースセンサの構成は、反応層内の一部の成
分を除いて実施例1と同様である。基板の電極系上に、
親水性高分子としてCMCの0.5wt%水溶液を滴下
し、乾燥させてCMC層を形成した。続いて、前記CM
C層上に酵素としてグルコースオキシダーゼ(以下GO
Dと略す)、および電子受容体としてフェリシアン化カ
リウムを溶解させた混合溶液を4μl滴下し、50℃の
温風乾燥器中で10分間乾燥させて反応層7を形成し
た。反応層の外周部分は直径約3.6mmであり、対極
の直径に略一致している。GODおよび電子受容体の混
合溶液を滴下すると、最初に形成したCMC層は一度溶
解し、その後の乾燥過程で酵素などと混合された形で反
応層7を形成する。しかし、攪拌等をともなわないため
完全な混合状態とはならず、電極系表面を直に被覆する
のはCMCのみとなる。最後に、スペーサ8およびカバ
ー9を図2中、一点鎖線で示すような位置関係をもって
接着した。
サに、試料液としてグルコース水溶液3μ1を試料供給
口11aより供給すると、試料液は毛細管現象によって
速やかに空気孔13部分まで達し、電極系上の反応層7
が溶解した。試料液を供給してから一定時間後に、電極
系の対極5を基準にして測定極4にアノード方向へ+
0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定
したところ、試料液中のグルコース濃度に比例した応答
電流値が得られた。反応層7が試料液に溶解すると、試
料液中のグルコースはGODによって酸化されてグルコ
ノラクトンが生成する。GODによる酸化反応で移動し
た電子によって、フェリシアン化カリウムがフェロシア
ン化カリウムに還元される。次に、前記のパルス電圧の
印加により、生成したフェロシアン化カリウムの酸化電
流が得られ、この電流値は基質であるグルコースの濃度
に対応する。
ーサおよびカバーで形成される空間部内に露出されたタ
イプの実施例によるグルコースセンサをAとする。一
方、従来型の管状の空間部を有するグルコースセンサ、
すなわち、図2において、スリット11が円弧状のくり
ぬき部12を有しないスペーサを用いたグルコースセン
サをBとする。これらのセンサで得られたセンサ応答の
ばらつきを、変動係数で比較したところ、表1に示すよ
うに、前者のグルコースセンサにおいて変動係数の減
少、すなわち、ばらつきの減少が見られた。
説明する。実施例4と反応層7の構成以外はすべて同じ
であるので、ここでは反応層7に関してのみ説明する。
実施例4と同様の電極系が印刷された基板上にスペーサ
8を図2中、一点鎖線で示すような位置関係をもって接
着した後、酵素としてGODおよび電子受容体としてフ
ェリシアン化カリウムを含浸させた濾紙を反応層として
前記電極系上に配置し、カバー9を図2中、一点鎖線で
示すような位置関係をもって接着してグルコースセンサ
を作製した。反応層は、対極の直径に略等しい直径約
3.6mmの円盤状のものである。このグルコースセン
サに、試料液としてグルコース水溶液3μ1を試料供給
口11aより供給すると、試料液は毛細管現象によって
速やかに空気孔13部分まで達し、電極系上の反応層7
の酵素および電子受容体が溶解した。試料液を供給して
から一定時間後に、電極系の対極5を基準にして測定極
4にアノード方向へ+0.5Vのパルス電圧を印加し、
5秒後の電流値を測定したところ、試料液中のグルコー
ス濃度に比例した応答電流値が得られた。なお、GO
D、フェリシアン化カリウムに加えて、親水性高分子で
あるCMCを含浸させた濾紙を反応層として用いた場合
においても、同様の結果が得られる。
に電子受容体を添加したバイオセンサについて説明した
が、電子受容体を用いないバイオセンサも可能である。
すなわち、電極を白金、金等により構成し、電極系上に
酵素のみもしくは酵素と親水性高分子とを含む反応層を
形成し、酵素反応の結果生じる過酸化水素濃度や酵素反
応の結果消費される酸素濃度から基質濃度を求める方式
のバイオセンサにおいても、上記と同様の効果が得られ
る。また、上記実施例においては、電極系上に接して反
応層を配置しているが、電極系と反応層を密着させるこ
とに限定されることはなく、電極系と反応層の間、ある
いはカバーと反応層の間に空間を持たせて反応層を配置
してもよい。さらに、上記実施例においては、反応層は
すべて電極系上に形成されているが、これに限定される
ことはなく、反応層が、カバー部材により形成される空
間部内で、電極系上に略一致しない状態で、反応層のほ
ぼすべてが空間部内に露出されるように形成されてもよ
い。また、上記実施例においては、前記空間部の電極系
上の部分の底面が電極系の外形と略一致しているが、そ
れに限定されることはなく、前記空間部の電極系上の部
分の底面が電極系の外形と略一致しない場合において
も、カバー部材により形成される空間部内で反応層のほ
ぼすべてが空間部内に露出されていればよい。
素としてフルクトースデヒドロゲナーゼ(FDH)また
はグルコースオキシダーゼ(GOD)を用いたが、これ
らに限定されることはない。ヘキソキナーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ、グルコース−6−ホスフェイト
デヒドロゲナーゼの組み合せからなる酵素、あるいはグ
ルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼの組み
合せからなる酵素を前記FDHの替わりに用いても優れ
たセンサ応答がられた。また、酸化還元酵素として乳酸
オキシダーゼまたは乳酸デヒドロゲナーゼを用いた乳酸
センサ、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコー
スセンサ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステ
ロールデヒドロゲナーゼを用いたコレステロールセン
サ、ウレアーゼを用いた尿素センサ、グルコースオキシ
ダーゼ、インベルターゼの組合せフルクトースデヒドロ
ゲナーゼ、インベルターゼ、ムタロターゼの組合せを用
いたしょ糖センサにおいても、実施例にあげたフルクト
ースセンサと同様の効果が得られる。
子としてCMCおよびPVPを用いたが、これらに限定
されることはなく、ポリビニルアルコール、ゼラチンお
よびその誘導体、アクリル酸およびその塩、メタアクリ
ル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マ
レイン酸およびその塩、そして、セルロース誘導体、具
体的には、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセル
ロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメ
チルエチルセルロースを用いても同様の効果が得られ
る。一方、電子受容体としては、上記実施例に示したフ
ェリシアン化カリウムは安定性や反応速度の点などから
優れているが、これ以外にもp−ベンゾキノン、フェロ
センなども使用できる。また上記実施例においては、反
応層を構成する担体として濾紙を用いたが、これに限定
されることはなく、ニトロセルロースやセルローストリ
アセテートのような不溶性高分子を用いてもよい。ま
た、前記親水性高分子を担体として用いてもよい。すな
わち、少なくとも酵素を溶解させた親水性高分子の溶液
の乾固物を反応層として用いてもよい。さらに、上記実
施例においては、測定極と対極からなる二電極系につい
て述べたが、参照極を加えた三電極方式とすると、より
精度の高い測定が可能である。
ると、反応層が均一で、しかもその全体が反応に関与す
るので、高い信頼性を有するバイオセンサを得ることが
できる。
の縦断面図である。
分解斜視図である。
Claims (8)
- 【請求項1】 絶縁性の基板、前記基板上に形成された
測定極と対極を含む電極系、少なくとも酸化還元酵素を
含む反応層、および前記基板に組み合わせたカバー部材
によって基板との間に形成された空間部を有し、この空
間部は、基板端部に開口し前記電極系へ試料を導く試料
供給路を構成し、かつ前記電極系に対応する部分におい
て他の部分より幅広くなっており、前記反応層のほぼ全
体がこの幅広い空間部内に露出していることを特徴とす
るバイオセンサ。 - 【請求項2】 前記カバー部材が、試料供給口となる端
面が開放したスリットを有するスペーサと前記スリット
を覆うカバーからなる請求項1記載のバイオセンサ。 - 【請求項3】 前記電極系が、測定極とその周囲を囲む
ように配された外形が円形の対極からなり、前記スペー
サがそのスリットに前記対極の外形に合わせた円弧状の
くりぬき部を有する請求項2記載のバイオセンサ。 - 【請求項4】 前記反応層は、前記電極系上において前
記スリットのくりぬき部を含む円形部分内に全体が位置
する請求項3記載のバイオセンサ。 - 【請求項5】 前記反応層が、電子受容体および親水性
高分子を含む請求項1〜4のいずれかに記載のバイオセ
ンサ。 - 【請求項6】 絶縁性の基板上に測定極と対極を含む電
極系を形成する工程、端面に開放しかつ前記電極系に対
応する部分が他の部分より幅広くされた、試料を前記電
極系へ導く試料供給路を形成するスリットを有するスペ
ーサを前記基板上に密着させて前記電極系を含む露出部
を区画する工程、少なくとも酸化還元酵素を含む反応層
形成用溶液を前記露出部内に滴下し乾燥して反応層を形
成する工程、および前記スペーサに前記スリットを覆う
カバーを密着させる工程を有することを特徴とするバイ
オセンサの製造方法。 - 【請求項7】 絶縁性の基板上に測定極と対極を含む電
極系を形成する工程、端面に開放しかつ前記電極系に対
応する部分が他の部分より幅広くされた、試料を前記電
極系へ導く試料供給路を形成するスリットを有するスペ
ーサを前記基板上に密着させて前記電極系を含む露出部
を区画する工程、少なくとも酸化還元酵素を担持させた
担体からなる反応層を前記露出部内に形成する工程、お
よび前記スペーサに前記スリットを覆うカバーを密着さ
せる工程を有することを特徴とするバイオセンサの製造
方法。 - 【請求項8】 前記電極系が、測定極とその周囲を囲む
ように配された外形が円形の対極からなり、前記スペー
サがそのスリットに前記対極の外形に合わせた円弧状の
くりぬき部を有する請求項6または7記載のバイオセン
サの製造方法。
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